1 - Tecnicas Histologicas

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TÉCNICAS
HISTOLÓGICAS
HISTOLOGIA
• É o estudo das células e dos
tecidos do corpo e de como
essas estruturas se
organizam para constituir os
órgãos.
• Em razão das pequenas
dimensões das células, seu
estudo é realizado com auxílio
de microscópios.
Preparação de espécimes para exame microscópico
• A pequena dimensão das células e dos componentes da matriz extracelular (MEC)
contida entre as células faz com que a histologia dependa do uso de microscópios.
• Pesquisas em química, fisiologia, imunologia e patologia são fundamentais para um
conhecimento adequado da biologia das células, dos tecidos e dos órgãos e de como
seus vários componentes interagem na saúde e na doença.
MACROSCOPIA
BIOPSIA
1.Biópsia cirúrgica: através de uma incisão cirúrgica no órgão ou tecido.
2.Biópsia endoscópica: para órgãos ocos, como estômago e intestino.
3.Biópsia por agulha: é obtida pela punção do órgão (fígado, pulmão),
sem precisar abrir a cavidade natural.
4.Cirurgia ampla: corresponde a peças grandes (tumores) ou órgãos
(mama e útero).
5.Necrópsia: pós morte para verificar a causa do óbito.
Solução de Formaldeído a 4%; 
Glutaraldeído.
Fixação
• Ao se remover qualquer material (órgão ou tecido) de um organismo se
inicia um processo de autólise (autodigestão).
• A fixação evita a autólise celular e impede a proliferação de
microrganismos, preservando a morfologia do tecido e fornecendo
maior resistência para as etapas seguintes.
Fixação
Fixação
• FINALIDADES:
• Evitar a digestão dos tecidos por enzimas existentes nas próprias
células (autólise) ou em bactérias;
• Endurecer os fragmentos; 
• Preservar em grande parte a estrutura e a composição molecular dos 
tecidos
• Na fixação química, os tecidos são imersos em soluções de agentes desnaturantes ou de
agentes que estabilizem as moléculas ao formar pontes com moléculas adjacentes.
• Essas soluções são chamadas de fixadores.
Fixação
Solução de Formaldeído a 4% 
Glutaraldeído.
• Como demora algum tempo para que o fixador se difunda de maneira rápida e completa
pelo interior dos fragmentos, um grande fragmento deve ser cortado em outros menores
antes de ser imerso no fixador.
• Dessa maneira, torna-se mais fácil a penetração do fixador no fragmento e garante-se
melhor preservação da sua estrutura.
• De modo alternativo, pode ser utilizada a perfusão intravascular do fixador, o qual, então,
alcança o interior dos tecidos rapidamente pelos vasos sanguíneos, resultando em uma
fixação melhor.
Fixação
Química da fixação histológica
• A fixação química é um processo complexo e não muito bem elucidado.
• Formaldeído e glutaraldeído são conhecidos por reagir com os grupos amina (NH2 )
das proteínas.
• No caso do glutaraldeído, a sua ação fixadora é reforçada pelo fato de ser um
dialdeído que promove a formação mais eficiente de ligações cruzadas entre proteínas
das células e da matriz extracelular.
Fixação física por congelação
• Um modo completamente diferente de preparar secções de tecidos ocorre após submeter os
tecidos a um congelamento rápido. Dessa maneira, os tecidos são fixados por congelação,
tornando-se rígidos e, assim, prontos para serem seccionados.
• Esse método possibilita a preparação rápida de cortes sem passar pelo longo procedimento de
desidratação e inclusão descrito anteriormente.
• É habitualmente utilizado em hospitais para que seja possível analisar, em poucos minutos,
espécimes obtidos durante procedimentos cirúrgicos.
• Congelar tecidos é também muito útil para o estudo histoquímico de enzimas e de outras
proteínas em cortes histológicos; isso porque o congelamento, ao contrário da fixação química, não
inativa a maioria das enzimas e mantém muitas proteínas em suas conformações naturais e em seus
locais originais.
• Quando se deseja estudar lipídios contidos nos tecidos, aconselha-se o uso de secções
congeladas, já que a imersão de tecidos em solventes como xilol dissolve essas substâncias.
Inclusão
O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou 
embebição em parafina.
FINALIDADE DO PROCESSO DE INCLUSÃO: formar o bloco de 
parafina para que a peça anatômica/biopsia possa ser seccionada 
(cortada).
Geralmente é precedido por duas etapas: 
- Desidratação 
- Clareamento
Inclusão
Desidratação 
é a retirada de água utilizando etanol
• A água contida nos tecidos é inicialmente extraída pela passagem dos
fragmentos por diversos banhos de soluções de concentrações
crescentes de etanol (normalmente desde etanol 70% em água até
etanol 100%).
• Após a desidratação, o etanol dos fragmentos deve ser substituído por
uma substância intermediária (geralmente um solvente orgânico), que é
miscível tanto em etanol como no meio que foi escolhido para inclusão
(parafina ou resina).
• Para a inclusão em parafina, as substâncias intermediárias mais comumente
usadas são o xilol e o toluol.
• Quando os fragmentos de tecidos são embebidos no solvente orgânico, eles
ficam transparentes ou translúcidos.
• Em seguida, são colocados em parafina derretida (56 a 60°C).
• O calor causa a evaporação do solvente orgânico e os espaços existentes
dentro dos tecidos tornam-se preenchidos com parafina. Depois de os
fragmentos serem retirados da estufa, a parafina solidifica e eles se tornam
rígidos.
Clareamento
• Após a etapa do clareamento, o material pode ser colocado em parafina
derretida (56 a 60°C).
• O calor causa a evaporação do solvente orgânico e os espaços existentes
dentro dos tecidos tornam-se preenchidos com parafina.
• Depois de os fragmentos serem retirados da estufa, a parafina solidifica e
eles se tornam rígidos.
• OU SEJA: a finalidade da inclusão é formar o bloco de parafina para obter o corte (fase da microtomia).
• Antes da impregnação de parafina, é necessário passar pelas etapas de desidratação e clareamento
(diafanização). Esse processo é feito por um Processador Histológico/Histotecnológico (máquina).
• REMUSO:
• Desidratação
• Consiste na remoção da água dos tecidos utilizando uma série de soluções alcoólicas em concentrações
diferentes, chegando até o álcool 100%.
• Clarificação ou diafanização
• Essa etapa remove totalmente o álcool.
• Para remover o álcool e preparar o tecido para a penetração da parafina, utiliza-se o xilol.
• Conforme o xilol penetra o tecido, em substituição ao álcool, o material se torna mais claro, transparente.
Por essa razão, é denominada de clarificação.
• Após desidratar e clarear podemos incluir.
Inclusão
• Os fragmentos de tecidos e órgãos
devem, após a fixação, ser infiltrados
com substâncias que lhes
proporcionem uma consistência rígida.
• As substâncias mais utilizadas para
esse fim são a parafina e algumas
resinas de plástico.
• A parafina é habitualmente utilizada
para microscopia de luz, e as resinas,
para microscopia de luz e eletrônica.
• Mesmo após a fixação e desidratação, as amostras de tecido são muito frágeis.
• Acontece então a impregnação do tecido com uma substância de consistência firme. Assim o
tecido é endurecido, o que facilita o corte em camadas finas.
• A parafina é a mais utilizada neste procedimento. Além do fácil manuseio e bons resultados,
endurece em poucos minutos e preenche os lugares anteriormente ocupados pela água.
Forma-se um bloco de parafina, que contém o espécime em seu interior.
• Os cassetes histológicos são utilizados durante todos os processos, até mesmo na inclusão.
Eles permitem escrever o número de registro do material, identificando o espécime.
• Também são importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrótomo.
Inclusão
https://www.youtube.com/watch?v=xIyXA3c3oxU
https://www.youtube.com/watch?v=4DJm4NLECQs
https://www.youtube.com/watch?v=xIyXA3c3oxU
https://www.youtube.com/watch?v=4DJm4NLECQs
Corte
Os tecidos e órgãos são
espessos e não possibilitam a
passagem adequada da luz para
a formação de uma imagem.
Por essa razão, antes de serem
examinados ao microscópio,eles
devem ser fatiados em secções
ou cortes histológicos muito
delgados que são colocados
sobre lâminas de vidro.
Micrótomo
• Para a realização da microtomia, o bloco precisa estar resfriado e fixo no
micrótomo para obter uma fatia fina do material.
• Os cortes obtidos devem ser levados com o auxílio de uma pinça ao banho-
maria à temperatura aproximada de 40 a 50ºC para que as fitas de parafina
se distendam sobre a água, evitando a formação de dobras no tecido.
• Em seguida, os cortes são pescados com lâminas previamente limpas
• Dicas: Nunca coloque o material biológico em contato direto com o molde,
sempre coloque um pouco de parafina antes de inserir o seu fragmento e
depois, termine de preencher o molde com a parafina. Desta forma, evita-se a
aderência do material no metal do molde e a subsequente formação de
buracos no bloco de parafina.
Corte
• Os blocos de parafina que contêm
os tecidos são então levados a um
micrótomo, onde são seccionados
por uma lâmina de aço ou de vidro,
de modo a fornecer cortes de 1 a
10 micrômetros de espessura.
• Após serem seccionados, os
cortes são colocados para flutuar
sobre uma superfície de água
aquecida e, depois, sobre lâminas
de vidro, onde aderem e serão, em
seguida, corados.
https://www.youtube.com/watch?v=duKTFcoylFc
https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/40530/1/Manual%20de%20T%C3%A9cnic
a%20Histol%C3%B3gica%20de%20Rotina%20e%20de%20Colora%C3%A7%C3%B5es.%20
SANTOS%20et%20al.%2C%202021.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=duKTFcoylFc
https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/40530/1/Manual%20de%20T%C3%A9cnica%20Histol%C3%B3gica%20de%20Rotina%20e%20de%20Colora%C3%A7%C3%B5es.%20SANTOS%20et%20al.%2C%202021.pdf
https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/40530/1/Manual%20de%20T%C3%A9cnica%20Histol%C3%B3gica%20de%20Rotina%20e%20de%20Colora%C3%A7%C3%B5es.%20SANTOS%20et%20al.%2C%202021.pdf
https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/40530/1/Manual%20de%20T%C3%A9cnica%20Histol%C3%B3gica%20de%20Rotina%20e%20de%20Colora%C3%A7%C3%B5es.%20SANTOS%20et%20al.%2C%202021.pdf
Coloração
Coloração
• Para ser estudada ao microscópio, a maioria dos cortes histológicos deve ser corada,
porque, com poucas exceções, os tecidos são incolores.
• Com essa finalidade, foram desenvolvidos métodos de coloração que tornam
evidentes os vários componentes dos tecidos, das células e da MEC.
• A seletividade com que os corantes coram os componentes dos tecidos pode ser
maior ou menor.
• Muitos corantes se comportam como substâncias de caráter ácido ou básico e
tendem a formar ligações eletrostáticas (salinas) com componentes ionizados dos
tecidos.
• Os componentes dos tecidos que se coram bem com corantes básicos são chamados de
basófilos, e os que têm grande afinidade com corantes ácidos, de acidófilos. O azul de
toluidina e o azul de metileno são exemplos de corantes básicos.
• Outros corantes, como a hematoxilina, comportam-se como corantes básicos e se ligam
às estruturas basófilas das células e dos tecidos.
• Os principais componentes dos tecidos que reagem com corantes básicos o fazem por
conter ácidos na sua composição – ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos e glicoproteínas
ácidas.
• Por outro lado, corantes ácidos (tais como orange G, eosina, fucsina ácida) coram
principalmente os componentes acidófilos dos tecidos, como, por exemplo, mitocôndrias,
grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno.
Coloração
• Dentre todos os corantes, a combinação
de hematoxilina e eosina (HE) é a mais
utilizada.
• A hematoxilina cora em azul ou violeta o
núcleo das células e outras estruturas
ácidas (tais como porções do citoplasma
ricas em ácido ribonucleico [RNA] e a
matriz extracelular da cartilagem hialina).
• A eosina, por outro lado, cora o
citoplasma e o colágeno em cor-de-
rosa.
CAMADA DE QUERATINA
• https://www.youtube.com/watch?v=Jv_sYhj05b4
• https://www.youtube.com/watch?v=NPOqiPyaxo0
• Protoloco de coloração HE – Hematoxilina e Eosina – varia de lab para lab.
https://www.youtube.com/watch?v=Jv_sYhj05b4
https://www.youtube.com/watch?v=NPOqiPyaxo0
PERGUNTAS DE
TÉCNICAS 
HISTOLÓGICAS
A microtomia consiste em executar cortes bem finos com espessura de 3 a 6
micrômetros para a passagem de luz e observação do tecido ao microscópio. Sobre
o processo de microtomia, assinale a alternativa incorreta.
A Antes do procedimento da microtomia, é importante colocar os blocos de parafina em
estufa a 60ºC
B Para a realização da microtomia, o bloco precisa estar resfriado e fixo no micrótomo
para obter uma fatia fina do material.
C Os cortes obtidos devem ser levados com o auxílio de uma pinça ao banho-maria à
temperatura aproximada de 40 a 50ºC para que as fitas de parafina se distendam sobre a
água, evitando a formação de dobras no tecido.
D Os cortes são pescados com lâminas previamente limpas e identificadas
E O aparelho utilizado na microtomia denominase de micrótomo rotativo e se utiliza de
uma navalha para executar os cortes, que podem ser de diversas espessuras
Sobre o processo de microtomia, assinale a alternativa incorreta.
A Antes do procedimento da microtomia, é importante colocar os blocos de parafina em
estufa a 60ºC X Para a realização da microtomia, o bloco precisa estar resfriado e fixo no
micrótomo para obter uma fatia fina do material
B Para a realização da microtomia, o bloco precisa estar resfriado e fixo no micrótomo
para obter uma fatia fina do material √
C Os cortes obtidos devem ser levados com o auxílio de uma pinça ao banho-maria à
temperatura aproximada de 40 a 50ºC para que as fitas de parafina se distendam sobre a
água, evitando a formação de dobras no tecido √
D Os cortes são pescados com lâminas previamente limpas e identificadas √
E O aparelho utilizado na microtomia denomina-se de micrótomo rotativo e se utiliza de
uma navalha para executar os cortes, que podem ser de diversas espessuras √
Nas lâminas coradas pela hematoxilina-eosina, as
alterações nucleares características das células
malignas são evidenciadas pelo corante eosina.
Certo
Errado
• A preparação de amostras para microscopia depende de vários fatores, como a natureza da 
amostra, técnica utilizada e microscópio empregado no procedimento. Boa parte do procedimento 
é padrão, e a fixação tem a função de:
• AAA Degradar o material, principalmente membranas celulares para possibilitar a coloração dos 
elementos celulares.
B B Desidratar o material, principalmente quando se utiliza microscopia eletrônica
C C Facilitar visualizar estruturas pouco visíveis ou destaca-las no emaranhado de elementos.
• D D Preservar o material biológico da amostra, otimizando a microscopia.
• E E Incorporar a amostra em um material transparente, como resina ou parafina.
• A preparação de amostras para microscopia depende de vários fatores, como a natureza da 
amostra, técnica utilizada e microscópio empregado no procedimento. Boa parte do procedimento 
é padrão, e a fixação tem a função de:
• AAA Degradar o material, principalmente membranas celulares para possibilitar a coloração dos 
elementos celulares.
B B Desidratar o material, principalmente quando se utiliza microscopia eletrônica
C C Facilitar visualizar estruturas pouco visíveis ou destaca-las no emaranhado de elementos.
• D D Preservar o material biológico da amostra, otimizando a microscopia.
• E E Incorporar a amostra em um material transparente, como resina ou parafina.
• A fixação é um processo que mantém a arquitetura e constituição química do tecido,
preserva suas proteínas e inativa as enzimas proteolíticas causadoras de autólise.
Assim, preserva o tecido de forma semelhante a quando estava no organismo do
paciente. Com relação à técnica histopatológica, marque a opção INCORRETA.
• A O bloco de parafina deve ser aparado até que o fragmento do tecido seja exposto.
• B A temperatura do banho-maria deve estar em mais ou menos 50°C.
• C Os cortes histológicos obtidos a partir do micrótomoe fixados na lâmina de vidro já
estão prontos para análise.
• D No banho-maria, o tecido é estendido para retirar as pregas que comumente se
formam. Em seguida, faz-se a etapa da pesca do tecido com a lâmina de vidro.
• E Os blocos de parafina podem ser arquivados e utilizados novamente para a confecção
de novas lâminas, quando necessário.
• A fixação é um processo que mantém a arquitetura e constituição química do tecido, preserva
suas proteínas e inativa as enzimas proteolíticas causadoras de autólise. Assim, preserva o
tecido de forma semelhante a quando estava no organismo do paciente. Com relação à
técnica histopatológica, marque a opção INCORRETA.
• A O bloco de parafina deve ser aparado até que o fragmento do tecido seja exposto. √
• B A temperatura do banho-maria deve estar em mais ou menos 50°C. √
• C Os cortes histológicos obtidos a partir do micrótomo e fixados na lâmina de vidro já estão
prontos para análise. X falta a coloração do tecido.
• D No banho-maria, o tecido é estendido para retirar as pregas que comumente se formam.
Em seguida, faz-se a etapa da pesca do tecido com a lâmina de vidro. √
• E Os blocos de parafina podem ser arquivados e utilizados novamente para a confecção de
novas lâminas, quando necessário.√
A parafina é um meio de inclusão usual nas preparações histológicas. Sobre o uso de 
parafina, assinale a alternativa correta.
•A O processo de desidratação é necessário, pois a parede celular impede a penetração da 
parafina nas células.
•B A utilização de parafina é recomendada no processo de inclusão de tecidos, o qual prevê a 
desidratação e a diafanização (ou clarificação), antes da microtomia.
•C Os banhos de parafina devem ser realizados em estufas de CO2 para prevenir a formação 
de bolhas de ar.
•D A parafina é recomendada na preparação histológica para a visualização de amostras ao 
microscópio estereoscópico.
•E Durante o uso do banho-maria, a temperatura da água deve estar sempre 10 °C acima do 
ponto de fusão da parafina.
A parafina é um meio de inclusão usual nas preparações histológicas. Sobre o uso de parafina, assinale a 
alternativa correta.
•A O processo de desidratação é necessário, pois a parede celular impede a penetração da parafina nas células. X
desidratação é para retirar água. Água não se mistura com a parafina. JÁ A CLARIFICAÇÃO elimina completamente o
álcool contido na peça e permite a penetração da parafina nos espaços deixados pela água e pela gordura no tecido. 
•B A utilização de parafina é recomendada no processo de inclusão de tecidos, o qual prevê a desidratação e a 
diafanização (ou clarificação), antes da microtomia (CORTE). √ DESCREVE CORRETAMENTE AS
ETAPASANTES DA IMPREGNAÇÃODA PARAFINA
•C Os banhos de parafina devem ser realizados em estufas de CO2 para prevenir a formação de bolhas de ar. X
usa-se o processador automático, chamado histotécnico. Processo a vácuo.
•D A parafina é recomendada na preparação histológica para a visualização de amostras ao microscópio 
estereoscópico. X é usado para aplicações de baixa ampliação, permitindo a observação de objetos que normalmente
são visíveis a olho nu.
•E Durante o uso do banho-maria, a temperatura da água deve estar sempre 10 °C acima do ponto de fusão da 
parafina. X parafina derrete
	Slide 1: TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
	Slide 2: HISTOLOGIA
	Slide 3: Preparação de espécimes para exame microscópico
	Slide 4: MACROSCOPIA
	Slide 5: BIOPSIA
	Slide 6
	Slide 7: Solução de Formaldeído a 4%; Glutaraldeído.
	Slide 8: Fixação
	Slide 9: Fixação
	Slide 10: Fixação
	Slide 11: Fixação
	Slide 12: Química da fixação histológica
	Slide 13: Fixação física por congelação
	Slide 14
	Slide 15: O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição em parafina. FINALIDADE DO PROCESSO DE INCLUSÃO: formar o bloco de parafina para que a peça anatômica/biopsia possa ser seccionada (cortada). Geralmente é precedid
	Slide 16: Desidratação é a retirada de água utilizando etanol
	Slide 17
	Slide 18
	Slide 19
	Slide 20
	Slide 21: Inclusão
	Slide 22: Inclusão
	Slide 23
	Slide 24: https://www.youtube.com/watch?v=xIyXA3c3oxU https://www.youtube.com/watch?v=4DJm4NLECQs 
	Slide 25
	Slide 26: Os tecidos e órgãos são espessos e não possibilitam a passagem adequada da luz para a formação de uma imagem. Por essa razão, antes de serem examinados ao microscópio, eles devem ser fatiados em secções ou cortes histológicos muito delgados q
	Slide 27
	Slide 28
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	Slide 30
	Slide 31
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	Slide 33: https://www.youtube.com/watch?v=duKTFcoylFc https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/40530/1/Manual%20de%20T%C3%A9cnica%20Histol%C3%B3gica%20de%20Rotina%20e%20de%20Colora%C3%A7%C3%B5es.%20SANTOS%20et%20al.%2C%202021.pdf 
	Slide 34
	Slide 35: Coloração
	Slide 36: Coloração
	Slide 37
	Slide 38
	Slide 39
	Slide 40: PERGUNTAS DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
	Slide 41
	Slide 42
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	Slide 45
	Slide 46
	Slide 47
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