Metodos de estudo

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MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA 
 1 - GENERALIDADES: O objetivo principal da Histologia é descobrir as relações estruturais que 
deverão contribuir para o entendimento dos processos vitais do organismo vivo. As estruturas (células, 
tecidos e órgãos) são examinadas por transparência, sendo raras as estruturas suficientemente delgadas 
para serem estudadas inteiras ao microscópio. 
 Os métodos empregados pelos histologistas são extremamente diversificados e, embora, grande parte 
do conteúdo do curso de histologia possa ser estruturado em termos de microscopia óptica, a interpretação 
mais detalhada da ultraestrutura fica a cargo da microscopia eletrônica de transmissão, em virtude de sua 
maior ampliação e seu maior poder de resolução. 
2 - MÉTODOS DE PREPARAÇÃO: Os métodos de preparação alinham-se em dois grupos: 
 2.1 - Exame a fresco ("in vivo"): Consiste na observação de células vivas com a finalidade de: verificar 
diferentes tipos de movimentos, estrutura celular, a atividade fagocitária, os aspectos de reprodução 
celular, aspectos de ingestão e excreção de substâncias metabólicas. Ex.: Estudo do esperma com a 
finalidade de observar a mobilidade do espermatozóide; mesentério e cauda de girino. 
 2.2. - Métodos de estudo após a morte: É o método mais comumente utilizado em Histologia, que 
permite a obtenção de preparados histológicos permanentes (lâminas) para o estudo ao microscópio. 
 Os órgãos, porém, na sua maioria são muito espessos e precisam ser reduzidos a cortes finos, 
suficientemente transparentes para serem analisados ao microscópio de luz. Compreende as preparações 
fixadas e coradas de tecidos ou órgãos. Este é o método de uso corrente na Histologia. O material é 
submetido a uma seqüência de tratamentos (técnica histológica) a fim de adquirir condições de ser 
analisado ao microscópio de luz. 
 Obviamente, o que se deseja é levar ao microscópio um preparado no qual os tecidos estejam 
perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando 
vivos. Mas, apesar dos cuidados tomados, este objetivo não é 
alcançado, observando-se em todos os preparados histológicos certos artefatos conseqüentes ao 
processamento que sofreram. 
3 - TÉCNICAS HISTOLÓGICAS: 
 3.1 - Colheita do material: Para fins citológicos e obtenção de boas preparações histológicas, o material 
deve ser retirado de um animal anestesiado ou imediatamente após a sua morte. 
 Os tipos de colheitas são: 
 a - Biópsia: remoção de tecido vivo para posterior análise histológica. 
 b - Necrópsia: remoção do tecido morto para posterior análise histológica. 
 c – Punção. 
 d - Escarificação: raspagem. 
 3.2 - Fixação: A fixação tem como objetivo evitar a destruição das células por suas próprias 
enzimas (autólise) ou por bactérias. As peças histológicas (tecidos) devem ser adequadamente tratados 
imediatamente após a sua retirada, visando além disso endurecer os tecidos tornando-os mais resistentes 
às etapas subsequentes. 
 3.2.1 - Qualidades de um bom fixador: 
 a - ter um bom poder de penetração; 
 b - matar instantaneamente as células; 
 c - endurecer a peça para facilitar a obtenção de cortes: 
 d - deve matar microorganismos que eventualmente contaminam as peças; 
 e - deve conservar o máximo possível da estrutura celular; 
 f - deve facilitar a posterior coloração dos cortes; 
 g - deve insolubilizar as proteínas, pois estas são as principais responsáveis pela estrutura 
das células e tecidos. 
 3.2.2 - Agentes fixadores 
 Em Histologia, utiliza-se quase exclusivamente a fixação química, por meio das substâncias 
chamadas fixadores. 
 Fixadores simples: cloreto de mercúrio, ácido pícrico, aldeído fórmico, tetróxido de ósmio e 
glutaraldeído. 
 Misturas fixadoras: Bouin, líquido de Helly, Gendre, Zenker, alcool-éter. 
 Tamanho das peças: devem ser pequenas, variando de 3 mm a 1 cm. 
 O volume do fixador: deve ser de 20 vezes o volume da peça. 
 3.3 - Lavagem da Peça: A peça deve ser lavada em água corrente durante 24 horas, a fim de remover o 
fixador. 
 3.4 - Inclusão: A peça deve ser incluída, afim de se obter cortes suficientemente finos para serem 
observados ao microscópio. Os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por substância de consistência 
firme. Ex.: gelatina, celoidina. Parafina e resinas epoxi. 
 Para a inclusão da peça fixada em parafina é necessário proceder a: 
 1 - Desidratação: retirada da água presente nos tecidos, pela passagem em álcoois crescentes: 70, 
80, 90 e Absoluto. 
 2 - Diafanização: consiste em impregnar a peça por solvente de parafina, ou seja, xilol, benzol ou 
toluol. 
 3 - Impregnação ou embebição: mergulha-se a peça em parafina fundida (60oC) no interior de uma 
estufa. Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam e os espaços anteriormente ocupados por eles são 
ocupados pela parafina. 
 4 - Inclusão propriamente dita e confecção do bloco de parafina com a peça envolvida pela mesma. 
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 3.5 - Microtomia: A microtomia consiste na obtenção de cortes delgados por meio de uma navalha de 
aço do micrótomo. A espessura média dos cortes é de 3 a 8 micrômetros (mm). 
 Etapas subsequentes: 
 a - Banho Maria a 370 C, com objetivo de não formar dobras no preparo. 
 b - Adaptação na lâmina 
 c - Adesão do corte na lâmina: levar a estufa a temperatura de 37 a 400C. 
 3.6 - Coloração: é realizada com a finalidade de obter contraste e evidenciar os vários componentes 
estruturais na delgada fatia de tecido e ao nível do microscópio. 
 A maioria dos corantes usados em Histologia comportam-se como ácidos ou bases. 
 Para se corar um corte embebido em parafina deve-se proceder da seguinte maneira: 
 a - Desparafinar o corte com xilol 1 e xilol 2 
 b - Hidratar o corte com álcoois decrescentes: Absoluto - 90 - 70 e água destilada. 
 c - Coloração propriamente dita. 
 d - Montagem - tem a finalidade de encerrar o corte entre a lâmina e a lamínula, afim de protegê-lo e 
conservá-lo. A substância usada como meio de montagem é o Bálsamo. 
 e - Estufa - O xilol evapora, o bálsamo seca e a lamínula adere a lâmina. 
 f - Rotulagem - colocação de uma etiqueta na lâmina com as principais referências do material. 
 3.6.1 - Agentes Corantes: Hematoxilina/Eosina (H/E), Fucsina, Tricrômico de Mallory, 
Tricrômico de Masson, Tricrômico de Gomori, Tricrômico de Shorr, Corante de Leishman, Floxina, etc. 
 A maior parte dos materiais examinados pela primeira vez no curso de Histologia, é composta por 
cortes em parafina corados com Hematoxilina e Eosina (H/E). 
 A Eosina é um corante ácido e a Hematoxilina, embora não seja um corante básico, tem 
propriedades muito semelhantes às dos corantes básicos. 
 Corante básico é a molécula que tem carga positiva (ou cargas positivas) na porção que 
possui cor, e, corante ácido é a molécula que tem carga negativa na sua porção que possui cor. A cor do 
corante não tem relação com o fato de o corante ser ácido ou básico. 
 O fenômeno em que determinado corante (como o azul de toluidina) muda de cor após reagir com 
determinado componente tecidual é denominado metacromasia. 
 3.7 - Exceções: 
 a - Para o tecidos mineralizados (osso, dentina, cemento), logo após a fixação, a peça terá que ser 
descalcificada. 
 Agentes descalcificadores: EDTA e Morse (Citrato de Sódio a 20% e Ácido fórmico 50% em 
partes iguais). 
 b - Do material obtido por punção ou raspado, realiza-se uma extensão ou esfregaço, que em 
seguida deverá ser fixado e depois corado, montado e rotulado. 
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 3.8 - Outros Métodos Usados em Histologia:- Radioautografia: permite a localização de substâncias radioativas nos tecidos. 
 - Cultura de tecidos: cultivo "in vivo" para estudos de metabolismo de células. 
 - Centrifugação fracionada: permite isolar quaisquer organelas e inclusões celulares, para 
determinar sua composição química e estudar suas funções in vitro. 
 - Cariometria e citometria: permite verificar o volume do núcleo e da célula respectivamente. 
 - Histometria: permite contar as diferentes estruturas de um tecido por unidade de superfície. 
 - Histoquímica: tem por base a localização de compostos ou radicais químicos em áreas específicas 
de um tecido ou em componentes celulares. Ex.: íons, lipídios, proteínas. 
 - Interpretação dos cortes: estudar um corte histológico ao microscópio, é preciso ter em mente que 
a estrutura das células e tecidos está alterada pela técnicas histológicas. E, também de que a delgada 
espessura dos cortes cria um obstáculo ao estudo tridimensional dos tecidos e órgãos, nos limitando à 
visualizar em apenas duas dimensões. Torna-se assim, necessário o estudo de cortes realizados em 
diferentes direções ou em cortes seriados. 
 Outra dificuldade encontrada é de que quando se cora um preparado, apenas algumas estruturas 
são evidenciadas. Por isso é necessário o estudo de várias lâminas, coradas por diferentes técnicas, para se 
ter uma idéia completa da composição e estrutura do tecido ou órgão em exame. 
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