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Fisiologia Médica 2, Fernando Blum
Universidade de Brasília
Aula 12 - Grupos sanguíneo, ABO e Rh
Introdução
A imunohematologia relaciona-se à medicina transfusional, pois seus conceitos estão atrelados aos grupos sanguíneos e aos anticorpos circulantes, os quais impedem uma pessoa seja sempre doadora de outra. Isso faz com que tenhamos sempre condições fisiológicas e patológicas envolvendo as transfusões.
Além do sistema ABO e Rh, mais conhecidos, há diversos outros grupos sanguíneos de relevância transfusional para a imunohematologia.
Antígenos eritrocitários
Os antígenos eritrocitários são polimorfismos (variações fenotípicas) na estrutura da superfície da membrana eritrocitária que podem ser reconhecidos pelo sistema imune induzindo a formação de anticorpos (Ac).
Do desconhecimento desse conceito advém a problemática da indução da formação de anticorpos antieritrocitários, os quais podem levar a reações hemolíticas transfusionais.
Os antígenos eritrocitários originam os grupos sanguíneos. 
O sistema ABO, por exemplo, é formando pelos antígenos A, B e H.
Há aproximadamente 280 antígenos identificados, os quais compõem cerca de 33 grupos sanguíneos.
A maioria dos antígenos eritrocitários é componente intrínseco da membrana (exceto Lewis e Chido-Rogers que são adsorvidos do plasma).
Em condições patológicas certos antígenos bacterianos e drogas podem aparecer como antígenos na superfície das hemácias, implicando processos hemolíticos no caso de infecções ou de uso de fármacos relacionados.
Grupos sanguíneos
Para um Ag formar um sistema de grupo sanguíneo:
Deve ser definido por um aloanticorpo humano.
No sistema Rh, por exemplo, a pessoa Rh negativo é capaz de formar um aloanticorpo, o anti-Rh, responsável pela doença hemolítica do recém-nascido (DHRN).
Ter caráter herdado.
No sistema ABO, por exemplo, o filho de um casal em que ambos são A não pode ser B.
O gene que o codifica ter sido identificado e sequenciado. 
Localização no cromossomo conhecida.
Existem, no momento, 33 grupos sanguíneos, embora ainda haja antígenos eritrocitários ainda não classificados.
Um sistema de grupo sanguíneo contém antígenos controlados por um único gene (ou por múltiplos loci estreitamente ligados) de modo que a recombinação gênica raramente ocorre e o sistema é geneticamente distinto. 
Uma pessoa dificilmente terá seu grupo sanguíneo alterado, a não ser que tenha a medula transplantada.
Importância dos antígenos eritrocitários
Nas transfusões sanguíneas.
Dependendo do grupo sanguíneo, a pessoa possui anticorpos naturais contra determinados antígenos eritrocitários. No sistema ABO, por exemplo, uma pessoa A possui naturalmente anticorpos anti-B, de modo que caso receba um transfusão com sangue do grupo B, sofrerá uma reação hemolítica transfusional.
Alguns grupos sanguíneos resultam em reações hemolíticas tardias, por ser necessária uma exposição primária e consequente sensibilização imunohematológica. No sistema Rh, por exemplo, uma pessoa Rh negativa não possui naturalmente anticorpos anti-D. A primeira transfusão com sangue Rh positivo não terá complicações, mas na segunda haverá um reação hemolítica transfusional. 
Incompatibilidade materno-fetal.
Permitiu o conhecimento do sistema Rh, no ano de 1939, em uma mãe O, com filho A. Houve uma reação hemolítica transfusional, permitindo a comprovação da existência desse sistema.
Transplante de órgãos.
Principalmente de órgãos sólidos, embora não seja limitante para a medula. 
Receptores de bactérias e parasitas.
Os receptores conhecidos como antígenos do grupo sanguíneo Duffy são fundamentais para que o Plasmodium vivax. Em regiões com grandes concentrações de Plasmodium vivax, os pacientes tendem a ser Duffy negativo.
Associação com doenças: 
Rh null e anemia hemolítica.
Síndrome McLeod (acantocitose hereditária, distrofia muscular tipo Duchene e retinite pigmentosa) fraca expressão dos antígenos do sistema Kell.
Constituição química dos Ag de grupos sanguíneos
Não são necessariamente carboidratos e proteínas, embora constituam maioria.
Carboidratos: ABO, P, Lewis, Hh e Coleção Ii.
Proteínas: Rh, Kell, Kidd, MNS, Duffy, Diego, Gerbich, Cromer, Lutheran e Colton. 
Grupos sanguíneos relevantes para a medicina transfucional: ABO, Rh, Duffy e Kell.
Antígenos de grupos sanguíneos na membrana eritrocitária
A membrana eritrocitária é repleta de antígenos, os quais formam os grupos sanguíneos. Alguns são carboidratos, integrando a membrana, e outros são proteínas, atuando como receptores transmembrana e atravessando-a uma ou múltiplas vezes. Desempenham diferentes funções.
 O sistema ABO, por exemplo, não tem uma função específica. O sistema Rh é transportador de amônia, de modo que caso haja deficiência desses antígenos, há possibilidade de anemia hemolítica por dificuldades osmolares relacionadas à deficiência nesse transporte. 
Classificação funcional dos Ag de grupos sanguíneos
Transportadores ou canais.
Receptores, ligantes exógenos para bactérias, parasitas e vírus.
Moléculas de adesão.
Enzimas.
Proteínas estruturais: manutenção da forma discoide e bicôncava da hemácia.
Moléculas com função no sistema do complemento: pode ser ativado na superfície da hemácia e, caso a pessoa não possua uma boa função de desativação do sistema imune, desenvolve a hemoglobinúria microcítica norturna. 
Transportadores ou canais
Muitos dos grupos sanguíneos são transportadores ou canais, dentre os quais os mais relevantes são o Kidd, transportador de ureia, e o Rh, transportador de amônia.
Receptores, ligantes exógenos para bactérias, parasitas e vírus
Muitos dos grupos sanguíneos são receptores, ligantes exógenos para bactérias, parasitas e vírus, dentre os quais os mais relevantes são o Duffy, que internaliza o Plasmodium vivax, o Gerbich, que internaliza o Plasmodium falciparum, de importância para a malária, e o Globosídeo P, que internaliza o Parvovírus B19.
A África, em regiões com alta incidência dessa bactéria, é o continente com mais pessoas Duffy negativo.
Moléculas de adesão
Muitos dos grupos sanguíneos são moléculas de adesão, dentre os quais o mais relevante é o CD44.
Enzimas
Muitos dos sistemas sanguíneos são enzimas, dentre os quais os mais relevantes são o sistema ABO, uma glicosil transferase que permite a montagem dos grupos A e B a partir do antígeno H, e Kell, uma zincometaloproteinase que participa da regulação do tônus vascular.
O sistema ABO, de maior relevância transfusional, ainda não possui uma função fisiológica definida.
Proteínas estruturais
Muitos dos grupos sanguíneos são proteínas estruturais, dentre os quais o mais relevante é o Gerbich, que atribui propriedades mecânicas e elásticas à membrana eritrocitária.
Relaciona-se à esclerocitose hereditária, relativamente comum, em que a proteína Gerbich encontra-se alterada, suscetibilizando hemólise em meios hipo-osmolares. 
Molécula com função no sistema do complemento
Muitos dos grupos sanguíneos são moléculas com função no sistema complemento, dentre os quais o mais relevante é o DAF, cuja proteína de membrana, CD55, inativa o sistema complemento.
A ausência desse grupo sanguíneo é adquirida, não hereditária, resultando na hemoglobinúria macrocítica noturna (HMN), na qual há reação hemolítica contínua por incapacidade de inativação do sistema complemento. Nesse caso, o sistema complemento, componente fundamental do nosso sistema de imunidade inata e humoral, induz a formação do complexo de ataque à membrana (MAC), que permanece constitutivamente ativo. Isso se dá justamente porque o sistema complemento não respeita a mecanismos selfie e não-selfie, requerendo ser inativado pela célula.
Principais grupos sanguíneos e seus antígenos
Ao dizermos que uma pessoa é Rh negativa, isso significa que ela não possui o antígeno D, embora possua outros antígenos Rh, os quais permitem manter a função transportadora de amônia. 
Ao dizermos que uma pessoa é Rh nulo, isso significa que ela não possui nenhum antígeno Rh.No sistema Rh, a não expressão do antígeno D não leva a expressão do antígeno d, mas simplesmente a não expressão do D. Ele é, por si só, determinante do positivo e do negativo. 
	Grupos sanguíneos
	Antígenos mais importantes
	ABO
	A, B, AB, O
	Rh
	D, C, c, E, e
	MNS
	M, N, S, s, U
	Lewis
	Lea, Leb
	P
	P1, P2
	Lutheran
	Lua, Lub
	Kell
	K, k, Kpa, Kpb
	Duffy
	Fya, Fyb
	Kidd
	Jka, Jkb
Sistemas de grupo sanguíneo ABO e H
O sistema ABO é o mais importante na medicina transfusional.
Histórico
O sistema ABO é o mais importante na medicina transfusional, tendo sido o primeiro a ser descoberto justamente por uma incompatibilidade tranfusional importante, que resultava em um percentual expressivo de mortes. Percebeu-se, nesse contexto, a existência de um componente imunohematológico relevante envolvendo as transfusões.
Em 1900, austríaco Karl Landsteiner (médico imunologista), realizou teste sorológico (aglutinação hemácia-soro) em sangue dos membros de seu laboratório. Entre alguns havia reação, entre outros não. A partir de suas observações, chegou ao seguinte modelo: 
3 padrões de aglutinação.
2 antígenos (A e B).
2 anticorpos (anti-A e anti-B).
A, B, O (ohne A, ohne B).
Um indivíduo não contém anticorpos contra o seu próprio antígeno
Em 1910, Dungern e Hirszfeld constataram que se tratava de heranças mendelianas e que A e B eram dominantes sobre O.
Em 1924, Bernstein avaliou o traço genético e identificou 1 locus com 3 alelos, sendo A e B autossômicos codominantes e O autossômico recessivo.
	Fenótipo
	A
	B
	AB
	O
	Genótipo
	AA - AO
	BB- BO
	AB
	OO
Entre 1920 e 1960, Watkins, Morgan e Kabat constataram a expressão dos antígenos em tecidos e secreções, o que constitui um conhecimento de relevância transfusional para compatibilidade. Além disso, identificaram a natureza química do grupo sanguíneo, oligossacarídeo, além dos antígenos ABH propriamente, que compõem os grupos sanguíneos.
Sistema ABO
Mais importante para transfusão.
Larga distribuição:
Tecidos.
Fluidos.
Plaquetas.
Células endoteliais.
Importante nos transplante órgãos sólidos.
Gene ABO: cromossomo 9q. 
Locus ABO: 3 alelos.
Antígenos principais (N=3): A, B, O.
Fenótipos principais (N=4): A, B, AB, O.
Genótipos principais (N=6): AA, AO, BB, BO, AB, OO.
Codifica glicosiltransferase: transferência de resíduos específicos de açúcar.
São oligossacarídeos que atuam como enzimas e permitem que certos carboidratos sejam colocados sobre o antígeno H, base do sistema ABO.
N-acetil-galactosamina na posição 1-3 do antígeno H, gerando o antígeno A.
Galactose na posição 1-3 do antígeno H, gerando o antígeno B.
Os genes A e B controlam a expressão das substâncias A e B.
Base molecular: gene H
Cromossomo 19q.
Alelos: H e h.
99% população: HH ou Hh.
No fenótipo hh não há antígeno H. É raro, mas mais comum na Índia, sendo por isso denominado fenótipo O Bombay.
O gene H codifica enzima (1,2) fucosil-transferase, que adiciona uma fucose (Fuc) à galactose terminal (Gal) de uma substância precursora, isto é, das cadeias do tipo I ou do tipo II, formando o antígeno H.
O gene H controla, portanto, a expressão do antígeno H, necessária para a expressão dos grupos A e B.
Uma pessoa com o tipo sanguíneo O não consegue formar os tipos sanguíneos A e B, por não possuir as enzimas específicas para montagem desses antígenos. Possui, no entanto, a fucosil transferase, a qual transforma a substância precursora, tipo I ou tipo II, na substância ou antígeno H.
Antígenos não estão restritos apenas à membrana eritrocitária (tipo II), mas também em órgãos sólidos (tipo I) e em solúveis (tipo I).
Fenótipo O Bombay (Oh)
Genótipo: hh (Oh).
Fenótipo: não tem substância H e não expressa A ou B, nem nos eritrócitos nem nas substâncias solúveis, apesar de genotipicamente poderem ser A ou B.
Anticorpos: anti-A, anti-B, anti-H.
A pessoa com fenótipo O Bombay não pode, portanto, ser transfundida com sangue do grupo O que contenha o antígeno H, uma vez que possui anti-H.
Anti-H (IgM) reativo a 37ºC: reação hemolítica grave.
Haverá casos em que o paciente é identificado como com sangue do grupo O e faz reação hemolítica gravíssima quando transfundido com sangue do grupo O.
<0,01% população brasileira (chega a 1:10.000 Índia).
Substância precursora
Substância precursora tipo I forma antígeno H presente nos fluidos corporais (plasma, saliva, lágrima, urina, leite, esperma, líquido amniótico, etc.), exceto LCR.
A formação dos grupos sanguíneos segue o modelo descrito abaixo, para a substância precursora tipo II, diferindo apenas pelo gene e pelas transferases formadas, ainda que com as mesmas atividades. 
Substância precursora tipo II forma antígeno H presente na membrana eritrocitária.
O gene H, 19q, codifica enzima (1,2) fucosil-transferase, que adiciona uma fucose (Fuc) à galactose terminal (Gal) da substância precursora tipo II, formando o antígeno H tipo II.
Grupo A: o gene ABO, 9q, codifica a enzima (1,3) N-acetil-galactosaminil transferase, que adiciona uma N-acetil-galactosamina na posição 1-3 do antígeno H, gerando o antígeno A. Há expressão natural de anticorpo anti-B.
Grupo B: o gene ABO, 9q, codifica a enzima (1,3) galactosil-transferase, que adiciona uma galactose na posição 1-3 do antígeno H, gerando o antígeno B. Há expressão natural de anticorpo anti-A.
Grupo AB: o gene ABO, 9q, codifica a enzima (1,3) N-acetil-galactosaminil transferase, que adiciona uma N-acetil-galactosamina na posição 1-3 do antígeno H, gerando o antígeno A, bem como a enzima (1,3) galactosil-transferase, que adiciona uma galactose na posição 1-3 do antígeno H, gerando o antígeno B. Não há expressão de anticorpos.
Tipo O: deficiente em ambas enzimas citadas anteriores, expressando apenas o antígeno H e, naturalmente, os anticorpos anti-A e anti-B. 
Tipo O Bombay: não produz as transferases citadas, não expressando sequer o antígeno H. Há expressão natural de anticorpos anti-A, anti-B e anti-H, capaz de hidrolisar hemácias não-Oh.
No caso de transfusão não-compatível, a hemólise é imediata, uma vez que as bactérias intestinais expressam antígenos A e B, sensibilizando o organismo.
Uma pessoa programada genotipicamente para o grupo sanguíneo A, mas que, no entanto, possui um defeito na expressão do gene 19q ou na síntese da α(1,2) fucosiltransferase, manifestará fenotipicamente o grupo sanguíneo O Bombay.
Determinação dos grupos sanguíneos
As tipagens direta e indireta são obrigatórias.
Tipagem direta: visa determinar o antígeno das hemácias do paciente, pelo uso de soros comerciais conhecidos (anti-A, anti-B e anti-AB). 
Aglutinação indica presença do antígeno.
Tipagem reversa: visa determinar o anticorpo presente no soro ou plasma do paciente, pelo uso de hemácias comerciais conhecidas (A1 e B e, opcionalmente, A2 e O).
Aglutinação indica presença do anticorpo anti-n.
Determinação do grupo sanguíneo fundamentado no padrão de aglutinação.
Não liberar resultado da tipagem sem que a discrepância entre as tipagens direta e reversa tenha sido resolvida.
Leitura do tubo
Verificar padrões de aglutinação por cruzes:
Qual o grupo sanguíneo abaixo
Avaliar padrões de aglutinação para aplicação de anti-A, anti-B, anti-AB, heme A e heme B.
Aglutinação:
Direta: anti-A e anti-AB.
Reversa: B.
Grupo sanguíneo: A.
Aglutinação:
Direta: anti-B e anti-AB.
Reversa: A.
Grupo sanguíneo: B.
Aglutinação:
Direta: anti-A, anti-B, anti-AB.
Reversa: -
Grupo sanguíneo: AB.
Aglutinação:
Direta: -
Reversa: A e B.
Grupo sanguíneo: O.
Tipagem em cartão (gel)
Permite a visualização mais clara dos padrões de aglutinação.
Grupo sanguíneo A+:
Resultados esperados na tipagem
	Direta
	Reversa
	Conclusão
	Anti-A
	Anti-B
	Anti-AB
	Hem A
	Hem B
	
	0
	0
	0
	+4
	+4
	O
	+4
	0
	+4
	0
	+4
	A
	0
	+4
	+4
	+4
	0
	B
	+4
	+4
	+4
	0
	0
	AB
Frequência fenotípica no Brasil
	População estudada
	Caucasóides
	NegróidesMulatos Negros
	Total
	O
	46,52
	53,20
	47,94
	49,23
	A
	39,45
	29,63
	31,96
	33,71
	B
	11,51
	13,78
	16,60
	13,93
	AB
	2,52
	3,39
	3,50
	3,13
Subgrupos ABO
Existem outros subgrupos, mas os subgrupos de A são mais relevantes clinicamente.
Subgrupos de A: A1 e A2 sorologicamente diferenciam-se pelo comportamento frente a extratos vegetais, lecitinas.
Lecitina anti-A1 de Dolichos biflorus. 
Lecitina anti-H de Ulex europeaus.
Fenótipo A1: aglutina 4+ com lecitina anti-A1 e não reage com lecitina anti-H.
Fenótipo expresso em aproximadamente 80%da população brasileira.
O fato de não reagir com anti-H decorre da conformação, que impossibilita o acesso da lecitina anti-H.
 Fenótipo A2: não reage com lecitina anti-A1 e aglutina 2+ com lecitina anti-H.
O fato de aglutinar com anti-H decorre da conformação, que possibilita o acesso da lecitina anti-H.
Manifesta-se como um paciente O.
Qual a conduta transfusional para um paciente do subgrupo A2?
Transfusão de hemácias A2 ou de concentrado de hemácias O.
Qual a justificativa para os achados? Como confirmá-lo?
	Prova direta
	Prova reversa
	Anti-A
	Anti-B
	Anti-AB
	HA1
	HB
	H0
	3+
	0
	4+
	1+
	4+
	0
Direta: A.
Reversa: O.
Discrepância entre as provas direta e reversa - subgrupo sanguíneo A2.
Aplicar lecitina anti-A1, esperando que não reaja, e anti-H, esperando que aglutine.
Considerar como do grupo sanguíneo O.
Base molecular: subgrupo ABO
Mutações no Gene ABO originam subgrupos:
Diferente padrão de aglutinação.
Discrepância entre tipagem direta e reversa.
Além dos alelos A1, B e O, existem outros alelos ou subgrupos: subgrupos de A (A1, A2, A3, Ax, Aend, Am) e de B (B3, Bx, Bm).
Gene A1 = selvagem.
A1 = 80% da população.
Raramente tem relevância clínico.
A2 ~ 20% da população
Discrepância na tipagem ou prova cruzada positiva.
Presença de anti-A1.
Diagnóstico: lecitina anti-A1 e anti-H.
Transfusão de hemácias A2 ou de concentrado de hemácias O.
A3, Ax, Ael, Am < 0,1% da população.
Qual a justificativa para os achados? Como confirmá-lo?
	Prova direta
	Prova reversa
	Anti-A
	Anti-B
	Anti-AB
	HA1
	HB
	H0
	4+
	0
	4+
	0
	0
	0
Direta: A.
Reversa: AB.
Discrepância entre provas direta e reversa – provável depressão na produção de anticorpos.
Quando os anticorpos naturais ou isohemoaglutininas (IgM) podem estar diminuídas ou ausente?
É possível que um paciente apresente antígeno B na saliva, mas não na superfície eritrocitária. Isso decorre do fato de as transaminases que formam os grupos sanguíneos nesses locais relacionarem-se a diferentes genes. Como resultado, não é produzido anti-B.
Condições que deprimem produção de anticorpos:
Imunossupressão.
Idade.
Hipogamaglobulinemia.
Medicamentos em uso.
Qual hemácia transfundir?
Transfusão de concentrado de hemácias A.
Não transfundir demais tipos sanguíneos, pois é possível que atue como estímulo para ativação imune.
Quando os anticorpos naturais ou isohemoaglutininas (IgM) podem estar diminuídas ou ausentes?
As mesmas citadas, mas agora incluindo condições patológicas:
Recém-nascido.
Idoso.
Hipo ou agamaglobulinemia.
Leucemias agudas e linfomas.
Transplante de medula óssea.
Imunossupressores.
Anticorpo: estrutura Ig
Possui uma cadeia leve e uma pesada, incluindo a região de ligação com o antígeno (região Fab) e a região na qual as células se conectam ao anticorpo (região Fc).
Objetiva-se, na medicina tranfusional, utilizar a estrutura do anticorpo para identificar os grupos sanguíneos, a fim de evitar processos hemolíticos.
Anticorpos
Naturais: contra antígenos não presentes no organismo e sem necessidade de contato prévio (contato com epítopos semelhantes a microorganismos ou ao ambiente).
 Anticorpos do sistema ABO (aglutininas).
Imunes: formados a partir da exposição ao antígeno após ativação do sistema imune. 
Após transfusão ou gravidez (Rh).
Aloanticorpos: contra antígenos reconhecidos como não próprios ao indivíduo, mas da mesma espécie. 
Aloimunização por transfusão sanguínea
Autoanticorpos: contra antígenos do próprio indivíduo.
AHAI e doenças auto-imunes.
Regulares: a ocorrência é esperada. 
ABO.
Irregulares: a ocorrência não esperada. 
Após transfusão ou gravidez.
Completos: aglutinam hemácias no meio salino. 
IgM, como no caso de anticorpos naturais do sistema ABO.
Incompletos: reagem com o antígeno, mas não aglutinam hemácias, necessitam de meio artificial que promova a aglutinação para visualização da reação antígeno-anticorpo. 
IgG.
Frios: reagem melhor a baixas temperaturas (4ºC a 18ºC).
IgM, como no caso de anticorpos naturais do sistema ABO.
Quentes: reagem bem à temperatura corporal (37ºC).
IgG, como no caso de anticorpos dos sistemas Rh, Kell e Kidd.
Alguns IgM têm atividade a 37ºC.
Aglutinação e potencial zeta
Superfície hemácias tem carga negativa, em razão da carboxila do ácido siálico.
Observa-se uma suspensão em meio salino (com íons livres) a partir de cátions que formam um invólucro de carga positiva. A força de repulsão resultante é denomina potencial zeta.
Os conceitos de anticorpos completos e incompletos citados acima refletem, respectivamente, a capacidade e a incapacidade de superar o potencial zeta sem meio artificial que promova a aglutinação para visualização da reação antígeno-anticorpo. 
Fatores que neutralizam o potencial zeta, levam a aglutinação.
Anticorpos completos.
É um conceito imunohematológico importante na medida em que não é possível afirmar em um teste simples, a temperatura ambiente, sem adição de uma substância que permita a identificação de um anticorpo incompleto, que o paciente não possui determinado anticorpo. Deve-se aquecer a amostra e adicionar alguma substância que supere o potencial zeta e permita a avaliação precisa.
Eritrócitos não sensibilizados em SF0,85% se repelem.
Eritrócitos sensibilizados com anticorpo incompleto não alcançam potencial zeta crítico para aglutinar.
Eritrócitos sensibilizados com anticorpo incompleto não alcançam potencial zeta crítico para aglutinar
Eritrócitos sensibilizados com anticorpo completo alcançam potencial zeta crítico para aglutinar.
O soro de Coombs é uma anti-imunoglobulina humana (dirigida contra a fração Fc da Ig). Se a IgG estiver ligada à membrana eritrocitária, o acréscimo do soro de Coombs permite a efetivação da ponte entre diferentes hemácia para aglutinação (Coombs positivo). 
Testes em imunohematologia
Teste de Coombs direto: teste da anti-globulina humana direto (TAD) - pesquisa de anticorpos fixos à membrana eritrocitária, por adição direta do soro de Coombs.
DHRN, anemias autoimunes, transfusões incompatíveis.
Para identificar anticorpo, fazer eluição.
Teste de Coombs indireto: pesquisa de anticorpos irregulares (PAI) - detecta a presença de anticorpos livres no soro ou plasma, por adição de hemácia humana e do soro de Coombs.
Sensibilização materna por gravidez.
Pesquisa de anticorpos irregulares (PAI)
É sinônimo de Coombs indireto.
É feita com uma técnica específica e bem determinada, publicada em portaria do Ministério da Saúde.
Há hemácias comerciais cujos antígenos eritrocitários de relevância para a medicina transfusional expressos são conhecidos.
Adiciona-se a hemácia comercial no soro do paciente, centrifuga-se, adiciona-se albumina, aquece-se a amostra a 37º e adiciona-se soro de Coombs para detecção de IgG. Se aglutinar, há IgG.
Pode ser utilizado também para potencializar análise de IgM. 
A albumina, assim como o soro de Coombs, tem como finalidade superar o potencial zeta.
Paciente pode ser Coombs tanto direto positivo indireto positivo, como no caso de paciente com autoanticorpo, em um quadro de anemia hemolítica autoimune, por exemplo.
Paciente pode ser Coombs tanto direto negativo e indireto positivo, como no caso de paciente com aloanticorpo, em uma aloimunização por transfusão sanguínea, por exemplo.
Qual a justificativa para os achados? Como confirmá-lo?
	Provadireta
	Prova reversa
	Anti-A
	Anti-B
	Anti-AB
	HA1
	HB
	H0
	4+
	4+
	4+
	4+
	4+
	4+
Direta: AB.
Reversa: O.
Discrepância entre prova direta e reversa – provável anticorpo frio irregular interferindo em tipagem.
Realizar PAI.
Qual a justificativa para os achados? Como confirmá-lo?
Provável anticorpo frio, pois reage em todas as provas de maneira importante.
Realizada pesquisa de anticorpo irregular, obtém-se PAI positivo.
Direta: incubar a 37° para realizar nova tipagem, pois a dissociação do anticorpo irregular permitirá a análise correta.
Reversa: tratar com glicina ou autoadsorção a frio, a qual consiste em isolar o plasma do paciente ainda com anticorpos, adicionar hemácias, permitindo que os anticorpos presente se associem a elas, resfriá-los a 4ºC, remover as hemácias e avaliar o plasma sem anticorpos.
Geralmente são autoanticorpos, nesse caso a frio, já que não está causando reação hemolítica no paciente.
Qual a justificativa para os achados? Como confirmá-lo?
	Prova direta
	Prova reversa
	Anti-A
	Anti-B
	Anti-AB
	HA1
	HB
	H0
	0
	0
	0
	4+
	4+
	4+
Fenótipo: O Bombay (Oh).
Antígenos adquiridos
É possível que indivíduo A incorpore temporariamente antígeno B à membrana eritrocritária em quadros clínicos infecciosos – resulta de deacetilação do antígeno A, por enzima bacteriana. Resulta em tipagem direta com anti-B de fraca intensidade.
Infecção por Proteus mirabilis.
Neoplasias (carcinoma de cólon).
Sepse.
Translocação E.coli.
Perda ou enfraquecimentos dos antígenos ABO
Relaciona-se a condições que envolvam translocação do cromossomo 9, como estresse hematopoiético (talassemias), leucemias, etc.
Sistema ABO: anticorpos
Anticorpos: anti-A e anti-B.
Ac detectados com menos de 3 a 6 meses não confiáveis, uma vez que até esse período quase todos os anticorpos são IgG de transferência materna (via placenta).
Início: 3 anos.
Pico: 5 a 10 anos.
Grupo A ou B:
Anti-A e anti-B são IgM e poucos são IgG.
Grupo O:
Anti-A e anti-B são IgG e IgM.
Nota ABO: DHRN geralmente leve, geralmente mãe é O, visto que IgG passa placenta. Por ser IgG, os títulos não são muito altos, de modo que a hemólise não é tão importante como a mediada por IgM. Fototerapia é suficiente para resolução do quadro, sem ser necessário recorrer a transfusões.
Título de anti-A é maior que título de anti-B.
Reação hemolítica transfusional
Reação hemolítica transfusional imediata (RHTI):
Durante ou horas após.
Intravascular mediadas por complemento (MAC), sendo geralmente, portanto por IgM, já que IgG dificilmente consegue ativar o complemento.
ABO.
Reação hemolítica transfusional tardia (RHTT):
Dias ou semanas após.
Extravascular, mediada pela região Fc do anticorpo e por c3b. Não ativa o sistema complemento, sendo o sistema fagocítico que retira as hemácias, as quais são destruídas no baço, pelo reconhecimento desses elementos marcadores.
Rh.
RHTI ao ABO
Grave, com alta mortalidade.
Principal causa: troca de bolsas e não erro de tipagem.
Anticorpos naturais hemolisam hemácias do doador, ativando a coagulação, com risco de coagulação intravascular disseminada (CIVD).
Clínica: caracterizada por dor torácica, no local da infusão, abdômen e flancos, hipotensão, febre, hemoglobinúria, insuficiência renal, choque e trombose.
Sensação de morte iminente – o paciente arranca a bolsa imediatamente.
RHT tardia
Resulta geralmente de processos mediados por IgG e por anticorpos imunes. Envolve possível relato de transfusão equivocada ou gestação prévia.
Clínica: caracterizada por febre, icterícia, queda de hemoglobina e recuperação transfusional insatisfatória.
Sistema de grupo sanguíneo Rh
Após o sistema ABO é o mais importante na prática transfusional.
Importância na DHRN.
Reações transfusionais hemolíticas.
Sistema Rh
Descoberto por Levine e Stetson em 1939, em caso de feto natimorto de mulher com RTH após receber sangue do marido, sendo que ambos eram O. Ela era, portanto, Rh negativo, enquanto o marido era positivo, ficando, pois, com anticorpos anti-D elevados.
Expresso somente em linhagem eritróide (não são encontrados nos fluídos), de modo que não tem importância para transplante de órgãos.
Presentes no feto a partir da 8ª semana.
Codificado por 2 genes altamente homólogos no cromossomo 1p. 
Gene RHD (não possui alelos, apenas D): antígeno D.
Gene RHCE (alelos Ce, cE, ce, CE): antígenos C/c e E/e. 
Maior e mais complexo, apresentando até o momento 49 antígenos. Os mais importantes transfusionalmente, presentes em 99% da população, são D, C, c, E, e.
CDe é o haplótipo mais frequente nos brasileiros (38%).
Todos apresentam reação hemolítica importante, embora o D seja o mais expressivo, devido a sua alta imunogenicidade.
Hemácias Rh-positivas: presença de D.
Hemácias Rh-negativas: ausência de D.
Imunogênico: 80% dos indivíduos que recebem transfusão D positivos desenvolvem anti-D.
Quem não tem antígeno D nas hemácias (ao contrário do ABO) não forma anticorpos anti-D regularmente, e sim após hemotransfusões e gestação.
Indivíduos Rh positivos (D positivos) possuem os dois genes (RHD e RHCE).
Em caucasianos, o fenótipo D negativo reflete deleção do gene RHD. Em outras populações D negativo, o gene RHD está presente, porém não funcionante (mutado). Isso evidencia, geneticamente, a diversidade causal em diferentes grupos populacionais.
O fenótipo D é dominante, de modo que, havendo D, mesmo que um dos haplótipos seja deletado, a pessoa será D.
Antígenos do sistema Rh estão localizados em duas proteínas não glicosiladas que transpassam 12 vezes a membrana, possuindo diversos epítopos reconhecíveis pelo sistema imune. Essas proteínas, como já citado, atuam como transportadoras de amônia.
Para a expressão dos antígenos do Rh é necessária a expressão da proteína RhAG, codificada a partir do gene RhAG no cromossomo 6p. Permite a possibilidade de expressão completa do antígeno D, C/c e E/e.
Mutações na RhAG resultam no fenótipo Rh null regulador, com perda de expressão dos antígenos Rh. Difere do Rh negativo, que é simplesmente a não expressão de D.
Antígeno D-parcial
Normalmente as pessoas possuem Rh positivo ou negativo, conforme a expressão ou não expressão de D. Há, no entanto, variantes de D, de relevância transfusional.
Antígeno D tem cerca de 37 epítopos, facilmente reconhecíveis pelo sistema imune. Algumas pessoas RhD positivo podem ter um ou mais epítopos ausentes, gerando diferentes categoriais de D parcial: DII, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, DHAR.
Causa: mutações pontuais RHD ou rearranjo gênico entre RHD e RHCE, implicando alterações da proteína RhD no segmento extracelular.
Essas pessoas podem desenvolver aloanticorpos anti-D (IgG, 37ºC) contra os epítopos ausentes ao entrar em contato, por transfusão, com hemácias RhD positivo normais. Podem resultar em DHRN, devendo por isso ser transfundidas com sangue RhD negativo. Gestantes com antígeno D-parcial devem ser prevenidas com imunoglobulina anti-D, a fim que o sistema imune não seja sensibilizado.
Antígeno D-fraco
Trata-se uma alteração quantitativa, não qualitativa, na qual o paciente não forma anticorpo anti-D. Se for transfundido sangue Rh positivo, ele não é sensibilizado. 
Causa: mutações pontuais missenses do RHD que resultam em trocas de aminoácidos no segmento transmembrana ou intracelular da proteína RhD.
Não há alteração dos epítopos extracelular, de modo que o sistema imune não desenvolve anticorpos contra essas hemácias.
Do ponto de vista transfusional, pacientes com fenótipo D-fraco podem recebem sangue RhD positivo ou RhD negativo, mas os doadores devem ser considerados RhD-positivos.
Receptores RhD-negativos de hemácias RhD-fraco desenvolvem aloanticorpos anti-D. 
Variantes do antígeno D
Perguntas
Você pode transfundir sangue D-fraco para o paciente RhD negativo?
NÃO! Pode levar à formação de anticorpo anti-D.
Você deve considerar o indivíduo D-fraco RhD...?
Positivo!
Qual o tipo de hemácia RhD que deve ser transfundidaem um paciente RhD parcial?
Hemácias RhD negativas.
Receptores RhD-fraco podem ser transfundidos com sangue RhD positivo?
Sim, na maioria dos casos, exceto se também forem D-parcial.
Síndrome do Rh nulo (null)
Alterações nos genes RHD e RHCE, resultam na ausência de ambas proteínas na membrana eritrocitária.
Síndrome do tipo “regulador”: mutação no gene RHAG, cujo produto (transportador da amônia) tem papel na expressão das proteínas do Rh na superfície da célula. 
Síndrome do tipo “amorfo”: ausência dos genes RHD e RHCE.
Clínica: hemólise em meios hipo-osmolares, anemia crônica, aumento da fragilidade osmótica, estomatócito, e eventualmente esferócitos.
Anticorpo anti-Rh
Geralmente:
Alo-anticorpos: após transfusões e gestações.
Possível ocorrência natural.
Maioria IgG, geralmente não fixam complemento, reativos a 37ºC e exacerbados pelo tratamento das hemácias por enzimas em análise do grupo sanguíneo.
São clinicamente significantes, por risco de hemólise extravascular: DHRN e reações transfusionais hemolíticas.
Frequências: Anti-D > c > E > C > e.
Podem aparecer autoanticorpos anti-Rh em doenças autoimunes, principalmente nas doenças hemolíticas autoimunes. O mais frequente é o anti-e.
Tipagem Rh
Semelhante à técnica para ABO direta, requerendo controle.
Aglutinação indica RhD na membrana.
Não-aglutinação nem sempre quer dizer que RhD não está na membrana, podendo ser RhD fraco.
Obrigatório por lei pesquisar de D-fraco, por PAI até fase de soro de Coombs.
O controle nunca deve aglutinar, se aglutinar invalida o teste.
Causas de controle positivo: rouleaux, aglutininas frias, autoanticorpos. 
Realizar teste de Coombs direto.
Pesquisa do D-fraco
O antígeno D fraco se apresenta como uma expressão enfraquecida de D, reagindo de maneira variável com os antissoros anti-D comerciais. Ele normalmente é determinado através do teste da antiglobulina humana (AGH), cuja técnica é resumida abaixo:
Incubar os dois tubos a 37ºC por 30 minutos.
Centrifugar.
Leitura:
Teste positivo: aglutinação no tubo D.
Terminar o teste
Teste negativo: não aglutinação no tubo D.
Continuar o teste
Larvar as hemácias.
Soro de Coombs (AGH) - anti-IgG.
Centrifugar.
Leitura.
Incompatibilidade materno fetal: doença hemolítica do recém nascido (DHRN)
Sistema ABO: forma mais frequente (15%), embora pouco grave, pois a maioria dos anticorpos é IgM e a placenta só permite o trânsito de IgG.
Mãe O apresenta certo grau de IgG anti-A, levando recém- nascido A a condições de icterícia em que é necessário fototerapia. 
Como os títulos de anti-B são mais baixos e expressão fetal de B é menor, a incompatibilidade materno fetal para esse grupo sanguíneo é mais rara.
DHRN: 
Leve/moderada: 10%.
Grave: <1%.
O sistema Rh é o que mais manifesta formas graves (20%), em especial no que diz respeito aos anticorpos anti-D. Além dele, sistema Kell também é de importância clínica nas condições de incompatibilidade materno fetal.
Mecanismo da eritroblastose fetal:
Na primeira gestação há contato da hemácia do feto com o sistema imune da mãe, induzindo a formação de anticorpos anti-IgM, que não afetam esse primeiro feto, e depois à formação de plasmócitos, resultando na memória IgG. Na segunda gestação já se observa a IgG migrando para o feto, via placentária, levando a processo hemolítico.
A prevenção se dá por administração de anti-IgG para a mãe, na tentativa de diminuir o contato da hemácia fetal com sistema imune da mãe – da 24ª semana até 3 dias pós-parto.
Clínica: icterícia e risco de kernicterus (encefalopatia bilirrubínica).
Tratamento: 
Fototerapia.
Transfusão exsanguínea (EXT): corrigir anemia, reduzir anticorpos maternos, trocar hemoglobinas e plasma sensibilizados por não-sensibilizados e remover bilirrubina. 
Como escolher sangue para EXT?
Hemácias devem ser compatíveis com o soro (anticorpos) da mãe. O plasma fresco congelado deve ser compatível com as hemácias do recém-nascido.
No caso de uma mãe O negativo, que possui, portanto, anticorpos anti-A, anti-B e anti-D, e de um recém-nascido A positivo, a hemácia transfundida deve ser O negativa e o plasma deve ser A+, sem anticorpos anti-A e anti-D.