RELATORIO BIOQ.DNA CEBOLA

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Data: 16/11/2016
 
Bioquímica Fundamental e Experimental 21106NI_1
ALUNOS: Drielli Bubniak, Jéssica Muchinski, Maria Carolina e Michele Lau.
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO DNA DA CEBOLA
1. OBJETIVO
A extração das moléculas de DNA de células do bulbo da cebola.
2. METODOLOGIA
Qualquer ser vivo possui DNA dentro do núcleo de suas células. DNA
é a sigla para ácido desoxirribonucleico, composto orgânico cujas moléculas
contêm instruções genéticas que coordenam o desenvolvimento e
funcionamento de um organismo vivo. A purificação do DNA da cebola utiliza a
metodologia descrita a seguir, mas qualquer extração segue o mesmo principio.
Para a análise do DNA de células eucarióticas, a primeira etapa
importante é o seu isolamento que consta de três etapas principais: a ruptura
das membranas celulares para liberação do material genético, o
desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos, DNA e
proteínas, e a separação do DNA dos demais componentes celulares. Para a
realização do processo, um detergente, ou solução de lise, deve ser usado
para dissolver a membrana lipídica e desintegrar o núcleo e os cromossomos
das células da cebola num processo denominado rompimento celular, a fim de
liberar o DNA na solução. 
O processo ocorre, pois a solução de lise altera o pH e a concentração
do meio externo, lisando a célula. As proteínas presentes são desnaturadas por
componentes da solução de lise, separando essas moléculas do DNA. Para
que as moléculas de DNA se aglutinem, proporcionando melhor observação
laboratorial, o etanol é adicionado. Além da mistura se homogeneizar, o etanol
proporciona a formação de um emaranhado filamentoso branco de DNA que
pode ser analisado visualmente, porém a observação das hélices só é possível
através do uso de aparelhos sofisticados. Muitas pesquisas de Biologia
Molecular começam com a extração de ácidos nucleicos. A lise celular libera as
moléculas em uma fase aquosa que é separada dos restos celulares por
centrifugação. As proteínas são removidas da fase aquosa por solventes
orgânicos (fenol, clorofórmio). O álcool também desidrata as moléculas de
DNA, fazendo com que elas se aglutinem formando um aglomerado visível.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
10 gramas de Cebola;
8 ml de etanol 95%;
3,0 ml difenilamina ;
Papel filtro;
Tubos de ensaio;
Funil banho-maria a 100ºC.
4. RESULTADOS 
A adição do etanol 95% possibilita uma maior desidratação das
moléculas, aglutinando-as e forma uma camada na superfície por ser menos
denso que a solução aquosa. É observada uma precipitação composta por
emaranhados esbranquiçados (o DNA), visto que também é um material menos
denso que os outros componentes celulares. A reação do precipitado dissolvido
em água com o reativo de difenilamina é essencial para a identificação e
determinação do DNA. Em meio ácido, o material é hidrolisado liberando a
desoxirribose e, esta, através do grupo CHO livre, reage com a difenilamina
obtendo a formação de um composto azulado, com absorção de luz na faixa de
600nm. 
Essa hidrólise ácida é importante, pois remove de forma seletiva as
bases púricas (adenina e guanina), preservando as ligações fosfodiésteres
entre os nucleotídeos. O aquecimento em banho-maria favorece a
desnaturação das moléculas de DNA. 
A partir da análise realizada, foram obtidos os seguintes resultados:
Tubo 1- Com precipitado, água e reativo após banho maria.
No tubo 1, pode-se observar a reação da difenilamina com a desoxirribose,
formando o composto levemente azulado.
Tubo 2- Com água e reativo após banho maria.
Enquanto no tubo 2, composto apenas por água e difenilamina, não houve
reação.
5. DISCUSSÃO
Os ácidos nucleicos, principalmente os de eucariotos em sua grande
maioria estão associados a uma serie de proteínas e outras substâncias
químicas, estas que, caso não sejam removidas podem comprometer os dados
quantitativos e qualitativos do estudo. Por isto antes das reações de
caracterização se faz necessário o uso de métodos que purificam o DNA, RNA
e outros ácidos nucleicos.
6. CONCLUSÃO
No geral, toda extração de ácidos nucleicos, por exemplo, se baseia
em quatro etapas básicas, presentes em qualquer protocolo de extração; lise
das membranas lipídicas, purificação, precipitação e reidratação. Existem
diferentes protocolos de extração de DNA e RNA que variam em função da
espécie e do tecido a ser utilizado, mas, para isolar os ácidos nucleicos é
preciso sempre liberá-los das células e dissociá-los do complexo DNA proteína.