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RESUMO – OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM 3 
 
Livro: Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações / Capítulo 5 
IMUNOPRECIPITAÇÃO 
 As técnicas de imunoprecipitação são para identificar e até quantificar precipitados resultantes da interação 
antígeno anticorpo. 
 Necessário: molécula antigênica multivalente quanto ao número de epítopos e anticorpos policlonais (derivados 
de diferentes linhagens de células B e se dirigem a epítopos específicos no antígeno) 
 O máximo de precipitação é observado quando as quantidades de antígenos e de anticorpos são iguais, não 
tendo excesso ou presença diminuída de um ou de outro. 
 A precipitação será máxima na zona de equivalência (quantidade de Ac = Quantidade de Ag). À medida que se 
adiciona antígeno, o imunocomplexo se desfaz. 
 
 
 
 
 Pró-zona: zona de excesso de Ac (falta de Ag). Proporciona resultado falso-negativo para a pesquisa de Ac, 
portanto deve ser utilizada diferentes diluições do Ac diante da concentração fixa do Ag. 
 Pós-zona: zona de excesso de Ag (falta de Ac). 
 Métodos de turbidimetria e nefelometria são mais sensíveis que o olho humano para visualizar os 
imunocomplexos. 
 Meio gelificado facilita a leitura e reduz os volumes necessários para interação nas técnicas de precipitação. 
(porem requer de horas a dias) 
 
1. IMUNODIFUSÃO 
 Baseia-se na difusão de substâncias solúveis por movimentos moleculares ao acaso em meio gelificado como o 
ágar ou gel de agarose. 
 Enquanto as moléculas estão livres continua ocorrendo difusão, até que se formem imunocomplexos de 
elevado peso molecular e que, devido ao tamanho, ficam imobilizadas no gel, permitindo a visualização do 
imunocomplexo como turvação nítida, que é o imunoprecipitado. 
 Eficiência do teste depende de: concentração ideal de cada um dos componentes, especificidade e avidez dos 
soros imunes e a escolha dos extratos antigênicos. 
 Fatores que interferem no grau de qualidade da imunodifusão: qualidade, grau de pureza e homogeneidade do 
meio gelificado e temperatura e umidade do ambiente onde vai fazer a difusão. 
 Há 4 combinações dessa técnica: 
 Simples: Ac ou Ag está fixado ao gel enquanto o outro migra até a formação do imunocomplexo. 
 Dupla: Ac e Ag migram simultaneamente, um em direção ao outro. 
 Linear ou unidimensional: com o movimento direcionado para uma direção por corrente elétrica ou 
pela gravidade e forma de aplicação. 
 Radial: o movimento ao acaso em todas as direções, a partir do orifício no qual se coloca a amostra. 
 
IMUNODIFUSÃO SIMPLES LINEAR 
 O Ac é incorporado ao meio gelificado e a mistura é 
colocada em um tubo até atingir cerca de 40mm de altura. 
 Após a gelificação, coloca-se o Ag no topo da coluna, 
em concentração maior que a do Ac. 
 Os tubos são selados e mantidos a temperatura 
constante, observados em uma semana quanto à formação da 
linha de precipitação na zona de equivalência. 
 A concentração do antígeno adicionado é proporcional 
à espessura da linha de precipitação e à distância percorrida 
pelo antígeno até formar o imunocomplexo. 
 
IMUNODIFUSÃO SIMPLES RADIAL 
 Técnica quantitativa de Ac ou Ag. Serve para 
dosagem de IgM, IgG, IgA e proteínas séricas, frações 
do sistema complemento e proteínas de fase agua. 
 Uma quantidade padronizada do Ac específico 
é incorporada ao meio gelificado e a mistura é 
colocada sobre uma placa ou lâmina. 
 Após gelificação são feitos orifícios no ágar 
para colocar o Ag em volumes precisos, além da 
amostra padrão com concentrações conhecidas do Ag 
a ser quantificado. 
 O Ag se difunde de acordo com seu tamanho 
molecular e encontra o Ac imobilizado no gel, 
formando o imunocomplexo. 
 A medida que mais Ag chega, o precipitado se 
dissolve (zona de excesso de Ag/pós zona) e o Ag migra mais encontrando novas moléculas de Ac. 
 Após algumas horas de difusão, encontra-se a zona de equivalência e forma-se um halo bem definido de 
precipitado. 
 O diâmetro(D) do halo de precipitação formado é medido e a área desse halo é diretamente proporcional à 
concentração do antígeno. 
 Utiliza-se o diâmetro elevado ao quadrado (D2) para facilitar a confecção da curva padrão e os cálculos 
das amostras desconhecidas. 
IMUNODIFUSÃO DUPLA RADIAL 
 Os dois componentes (Ag e Ac) difundem-se radialmente em todas as direções, a partir de orifícios no meio 
gelificado, e se encontram formando linhas ou arcos de precipitação correspondentes ao imunocomplexos 
possíveis nessa interação, ou seja, cada arco corresponde a um par de imunocomplexo Ag-Ac. 
 Essa técnica permite a comparação simultânea, por exemplo, de vários sistemas antigênicos contra o mesmo 
sistema de anticorpo. 
 Método semiquantitativo, de baixa sensibilidade e requer o uso de extratos antigênicos em concentração 
elevada, da ordem de mg/dL, e soros policlonais de elevada avidez. 
 
 
 
 
 
 
 
2. IMUNOELETROFORESE 
 Combina eletroforese e a difusão dupla em meio 
gelificado, em tempos distintos, com alto poder resolutivo. 
 A eletroforese evidencia alguns componentes ou 
frações antigênicas por diferenças de carga elétrica nesses 
componentes, conceituada como sendo a migração de 
moléculas carregadas em um solvente condutor sob a 
influência de um campo elétrico. 
 Permite a discriminação de um número maior de 
componentes da mistura de um extrato antigênico ou 
material biológico, utilizando a especificidade dos 
anticorpos para cada uma das subfrações de cada 
componente já fracionado por diferenças na carga elétrica. 
 O ponto isoelétrico (pI) da proteína é fator 
importante que, dependendo do meio que ocorre a 
eletroforese, irá determinar a migração das moléculas. 
 A imunodifusão dos componentes antigênicos se faz 
contra soros policlonais monoespecíficos ou poliespecíficos 
para o extrato total, formando um arco de precipitação na 
zona/linha de equivalência. 
 É um método qualitativo que pode ser utilizado para 
detectar substâncias solúveis imunogênicas utilizando 
anticorpos específicos, desde que os imunocomplexos 
formados tenham tamanho suficiente para formar as linhas 
de precipitação. 
 
 
 
 
3. IMUNOFIXAÇÃO 
 Ocorre em dois 
estágios e combina 
eletroforese e 
imunoprecipitação, e é 
mais sensível que a 
imunoeletroforese. 
 A amostra é 
aplicada em seis 
posições diferentes do 
gel de agarose, seguido 
da separação 
eletroforética de acordo 
com a carga. 
 Os soros 
monoespecíficos 
contendo anticorpos 
específicos anti-IgG, -
IgA, -IgM, -cadeia kappa e –cadeia lambda são adicionados individualmente sobre cada posição respectiva, 
seguido da aplicação da solução fixadora de proteínas. 
 A imunofixação é utilizada para a detecção precoce de gamopatias monoclonais, a identificação de gamopatias 
biclonais e o diagnóstico de doenças de cadeias pesadas e auxilia o diagnóstico e a monitorização de outras 
doenças linfoploriferativas. 
 
4. ELETROIMUNODIFUSÃO 
 A migração do Ag e do Ac é dirigida por um campo elétrico, aumentando a velocidade de formação do 
imunocomplexo e a sensibilidade em relação a difusão natural. 
 É empregada na detecção e quantificação de Ag e Ac. 
 
ELETROIMUNODIFUSÃO SIMPLES LINEAR 
 O Ac incorporado ao meio gelificado é 
colocado sobre a superfície de uma lâmina e o Ag é 
adicionado em um orifício, o sistema então é 
submetido a eletroforese. 
 A partir do orifício forma-se um cone de 
precipitação cuja área varia de acordo com a 
concentração do Ag na amostra. 
 Utilizando padrões de concentração 
conhecida, a técnica permite quantificar o Ag, mas 
não é útil para dosagem de imunoglobulinas por 
apresentarem pequena mobilidade eletroforética. 
 
ELETROIMUNODIFUSÃO DUPLA LINEAR 
 Utiliza-se pares de orifícios feitos noágar, um para o 
Ag e outro para o Ac, ambos submetidos a eletroforese. 
 O movimento eletroforético e a 
eletroendosmose(migração das moléculas de imunoglobulinas 
menos eletronegativas para o ânodo/polo negativo enquanto 
o Ag é arrastado por corrente elétrica em direção ao 
cátodo/polo positivo) concentram rapidamente Ag e Ac na 
região entre os orifícios e a mobilidade eletroforética do Ag e 
Ac deve ser diferente. 
 Entre os dois orifícios se forma a linha do precipitado. 
 Essa técnica é semiquantitativa e é cerca de 10 vezes 
mais sensível que imunodifusão dupla. 
 
5. AUTOMAÇÃO DOS ENSAIOS DE IMUPRECIPITAÇÃO 
NEFELOMETRIA 
 É a medida da luz dispersa em ângulos distintos 
aos da incidência (normalmente de 15 a 90º). 
 Segundo os princípios de nefelometria, as 
reações de precipitação entre Ag e Ac em soluções 
diluídas produzem aumento da reflexão da luz que pode 
ser diretamente medida pela dispersão da luz incidente. 
 A quantidade e a natureza da dispersão 
dependem da forma e do tamanho das partículas, da 
concentração e do comprimento de onda da luz e do 
índice de refração do meio. 
 
 
 
TURBIDIMETRIA 
 É a medida da diminuição da intensidade da luz incidente quando passa 
através de uma suspensão de partículas. 
 Está sujeita as mesmas condições dos sistemas nefelométricos. A diferença é 
que o sinal de detecção é a absorbância e não a intensidade da luz dispersa. 
 Reações podem ser medidas em espectrofotômetros. 
 
 
 
Livro: Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações / Capítulo 6 (54-61) 
 
IMUNOENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO 
 Similar a precipitação, diferindo na adsorção do Ag ou do Ac a micropartículas insolúveis ou células e permitindo 
a leitura visual e rápida. 
 A característica principal é que um dos componentes (Ag ou Ac) é apresentado na forma insolúvel em 
suspensão, de forma natural em células, ou adsorvido artificialmente a micropartículas e células. 
 O teste ocorre quando há a formação de agregados suficientemente grandes de micropartículas ou células com 
múltiplos determinantes antigênicos (ou anticorpos) interligados por pontes moleculares de anticorpos (ou 
antígenos). Esses agregados facilitam a visualização dos imunocomplexos. 
 A técnica pode ser feita em tubo, lâmina ou em placa de microcavidades. 
 Assim como na imunoprecipitação, a proporção ideal de concentração de anticorpo e de antígeno é fator 
interferente no teste, ou seja, proporções fora da zona de equivalência pode gerar resultados falso negativos, 
por não haver a formação de agregados suficientemente grandes para serem detectados. Esse efeito é 
eliminado empregando-se diluições seriadas do soro. 
 A técnica não diferencia a classe do Ac aglutinante. 
 As reações de aglutinação, embora semiquantitativas, são mais sensíveis que as de precipitação, necessitando 
de uma quantidade de anticorpos 500 vezes menor, pois as partículas amplificam a reação. 
 As reações de aglutinação são muito empregadas para o diagnóstico laboratorial de doenças causadas por vírus, 
bactérias, protozoários e fungos, doenças autoimunes, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos 
sanguíneos dos sistemas ABO e Rh, etc 
AGLUTINAÇÃO DIRETA OU ATIVA 
 O Ag faz parte naturalmente da célula ou partículas 
antigênicas e haverá aglutinação dessas células promovidas por 
anticorpos contra esses antígenos. 
 Hemácias, bactérias, fungos, protozoários podem ser 
aglutinados diretamente por anticorpos. 
 Os testes para detectar anticorpos específicos são 
realizados empregando-se diluições em série do anticorpo, 
frente a uma quantidade constante de antígeno. 
 Após um período de incubação, a aglutinação se 
completa e o resultado é geralmente expresso como o título do 
anti-soro, isto é, a máxima diluição em que ocorre a aglutinação. 
 Ex.: Ags do grupo sanguíneo (sistema ABO e Rh). 
 
 INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA 
 Utiliza-se a propriedade de alguns antígenos virais aglutinarem espontaneamente determinados tipos de 
hemácias. 
 O ensaio é útil para identificar a presença de Acs que são inibidores dessa aglutinação e estão presentes no soro 
do paciente com essa infecção. 
 Esses testes também podem ser chamados de inibição da hemaglutinação direta, e o antígeno viral é chamado 
de hemaglutinina. 
AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVA 
 O teste de aglutinação indireta ou passiva emprega a adsorção de anticorpos ou de antígenos solúveis proteicos 
na superfície de hemácias ou partículas inertes(látex, bentonita, “sepharose”, leveduras, etc.) que não 
interferem na interação antígeno-anticorpo. 
 Hemácias ou partículas inertes podem ser sensibilizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os 
antígenos solúveis, por adsorção via agentes químicos, como ácido tânico, cloreto de cromo e por conjugação 
do antígeno, por meio de ligações químicas covalentes, fornecendo reagentes estáveis 
 Aglutinação Passiva Reversa: suportes com antígeno adsorvido são utilizado na pesquisa de Ac 
específicos, enquanto o teste com suporte revestido de Ac (Aglutinação Passiva Reversa) é empregado 
na determinação semiquantitativa de pesquisa de antígeno, hormônios e outras substâncias que não 
seja o anticorpo. Ex.: Proteína C Reativa (PCR). 
 
Antígenos ligados a partículas (hemaglutinação) 
 Hemácias estão entre os melhores suportes de antígenos para os testes de aglutinação, pois há uma série de 
antígenos que pode ser ligada à sua superfície para fornecer um sistema indicador sensível na detecção de anticorpos. 
Além disso, os testes em placa permitem que a determinação do ponto final da reação seja feita diretamente. Hemácias 
possuem uma superfície complexa, o que facilita a ligação de muitos antígenos e, frequentemente, acarreta a presença 
de anticorpos heterófilos no soro de muitos animais. Tais anticorpos devem ser removidos antes da execução do teste. 
O teste em placa utiliza pequenas quantidades de reagentes e é considerado positivo quando se verifica a formação de 
tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa em “V”, e negativo quando as hemácias sedimentam formando um 
“botão” compacto. O título da amostra testada será a máxima diluição em que ainda se observa a formação do tapete. 
Há vários sistemas comerciais para a pesquisa de anticorpos que utilizam esta técnica, entre eles, os sistemas de 
Trypanossoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, etc. 
 
 
 
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA/PASSIVA 
 O teste consiste na adição de Ag solúvel à amostra 
contendo Ac visando o bloqueio dos respectivos sítios de 
ligação. 
 Quando essa mistura é colocada em contato com partículas sensibilizadas com o mesmo antígeno, a aglutinação 
não é observada. 
 O Ac da amostra em solução apresenta maior facilidade (acessibilidade) de interagir com o Ag na solução do que 
com Ags adsorvidos a micropartículas ou células. Ex.: pesquisa de ß-HCG. 
 
FLOCULAÇÃO 
 Variante da aglutinação indireta, ocorre quando a interação direta de anticorpos específicos com o antígeno 
leva a formação de imunocomplexos em meio líquido, detectáveis com o auxílio de lupa ou microscopia óptica. 
 É o fundamento do VDRL que utiliza uma suspensão antigênica alcoólica de cardiolipina, cristais de colesterol e 
lecitina, preparada em salina tamponada, e é empregada para a pesquisa de anticorpos anticardiolipina (Ac não 
treponêmico), chamados de reaginas, frequente na sífilis. 
 Os anticardiolipina presentes na amostra interagem com a cardiolipina da suspensão antigênica. 
 Os imunocomplexos formados ficam depositados sobre os cristais de colesterol, que é refringente, 
formando grumos que são visíveis no microscópio óptico. 
 As amostras reagentes são tituladas em diluições seriadas, e a última diluição que apresenta floculação 
representa o títulodo soro. 
 Para evitar o fenômeno de pró-zona, o teste deve ser feito na triagem com a amostra sem diluir e diluída a 1:10. 
Simultaneamente. Esse fenômeno acontece quando há elevada concentração/títulos muito elevados de 
anticorpos que proporcionam resultados falsos negativo em ensaios com a amostra pouco diluída (efeito 
prozona).