VIROLOGIA VETERINÁRIA

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VIROLOGIA GERAL
INTRODUÇÃO
A partir dos estudos de C. Woese (1977), a classificação dos organismos passou a dispor de um sistema baseado principalmente em aspectos evolutivos (filogenética), a partir da comparação das sequências de rRNA de diferentes organismos. Com esta proposta de classificação, os organismos são subdividos em 3 domínios, o domínio Archaea, Bactéria e Eucarya, empregando-se dados associados ao caráter evolutivo. Não
O domínio Archaea são organismos procariotos que, frequentemente são encontrados em ambientes cujas condições são bastante extremas (semelhantes às condições ambientais primordiais na Terra), sendo por isso, muitas vezes considerados como sendo “ancestrais” das bactérias. O domínio Bactéria corresponde a um enorme grupo de procariotos, representadas pelos organismos patogênicos, e bactérias encontradas nas águas, solos, ambientes em geral. E o Eucarya no âmbito microbiológico, compreende as algas, protozoários e fungos (além das plantas e animais).
De acordo com a organização estrutural, as células podem ser classificadas em procariontes ou eucariontes. A célula procarionte se caracteriza pela ausência da cariomembrana individualizando o núcleo celular, não possuem compartimentos membranosos e não apresentam algumas organelas além do diminuto tamanho em relação a uma célula eucariota. Já as células eucarióticas se caracterizam pela presença de m sistema interno de membranas, que formar compartimentos funcionais no citoplasma celular (sistema de endomembranas), e geralmente são maiores além de mais complexas. 
Os vírus são os microrganismos menores e mais simples que existem. São muito menores do que células eucariotas e procariotas e, ao contrário destas, possuem uma estrutura simples e estática. Não estão incluídos em nenhum sistema de classificação dos seres vivos, entretanto são capazes de infectar tanto organismos procariotos quanto eucariotos.
Diferente da maioria das bactérias, fungos e protozoários, os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios. Esses agentes não possuem a maquinaria necessária para a produção de energia metabólica e para a síntese de proteínas e, por isso, necessitam das funções e do metabolismo celular para se multiplicar. Fora de uma célula viva os vírus são estruturas químicas. A sua atividade biológica só é adquirida no interior de células vivas.Não há criação em meio artificial sem cultivo celular. 
Não se perpetua sem células.
	
ESTRUTURA VIRAL
A unidade fundamental – o indivíduo – dos vírus é denominada partícula vírica, partícula viral ou simplesmente vírion (partícula viral completa), e estes apresentam algumas propriedades víricas gerais como:
O vírion consiste em um genoma de ácido nucleico empacotado em um envoltório proteico (capsídeo), podendo ou não ter uma membrana revestindo este envoltório (envelope). A função primordial dos envoltórios virais (capsídeo e envelope) é proteger o genoma de danos físicos, químicos ou enzimáticos durante a transmissão entre células e entre hospedeiros. O vírion também deve conter algumas enzimas essenciais ou acessórias ou outras proteínas para facilitar a replicação inicial no interior da célula.
Genoma Viral
O genoma é responsável por conter a informação genética necessária para a replicação (multiplicação) viral. O genoma dos vírus é constituído por moléculas de ácido ribonucleico (RNA) ou desoxirribonucleico (DNA), nunca pelos dois. Por isso, esses agentes são comumente denominados de vírus RNA ou vírus DNA. Em geral, os vírus das diversas famílias contêm apenas uma cópia do genoma por vírion (são haploides). Uma exceção são os retrovírus, que possuem duas cópias idênticas do genoma (são diploides). Único microrganismo que contém informação genética codificada em moléculas do tipo RNA.
A extensão, estrutura, organização genômica e o número de genes contidos no genoma variam amplamente entre os diferentes vírus. Os menores vírus animais (circovírus) possuem uma molécula de DNA com aproximadamente 1.700 nucleotídeos como genoma; os vírus maiores possuem um genoma DNA com mais de 350.000 nucleotídeos (poxvírus). A partir de 2003 vírus com tamanho genômico bem maiores foram descritos, como o mimivírus, megavírus, samba vírus e pandoravírus. 
Mimivírus = 1.181.404 nt (vírus descoberto em 2003 (infecta protozoários)).
Megavírus = 1.260.000 nt (vírus descoberto em 2011 (Oceano Pacífico Chile)).
Samba vírus = 1.213.607 nt (vírus descoberto no Brasil em 2014)
Pandoravírus = 2.473.870 nt (descoberto em 2013 (infecta amebas marinhas)).
O número de genes – e consequentemente o número de proteínas codificadas – também varia entre os diferentes vírus. Alguns vírus de plantas codificam apenas uma proteína, enquanto o genoma dos poxvírus codifica mais de 100. Em geral, o genoma dos vírus é muito compacto e codifica apenas as proteínas essenciais para assegurar a sua replicação e transmissão.
O tipo e estrutura do genoma de muitos vírus diferem do padrão clássico observado nos ácidos nucléicos de eucariotas e procariotas. Nesses organismos, o genoma é constituído por moléculas de DNA de cadeia dupla (ds, double-stranded); enquanto os RNAs possuem fita simples (ss, single-stranded). Os genomas dos vírus apresentam variações de tipo e estrutura, que incluem desde genomas de DNA de fita simples (ssDNA) até RNA de fita dupla (dsRNA). 
O genoma dos hepadnavírus é uma molécula de DNA de cadeia parcialmente dupla (aproximadamente 3/4), o restante possui cadeia simples. As extremidades da cadeia completa fazem um pareamento de bases entre si, conferindo à molécula a topologia circular (a cadeia de DNA não é contínua).
Capsídeo Viral
O capsídeo (também chamado de cápsula) é a camada proteica que recobre externamente o genoma. Nos vírus que não possuem envelope, o capsídeo representa o único envoltório do ácido nucléico viral (infeccioso nesta forma não envelopada). 
Além dessa cobertura proteica, o genoma de alguns vírus encontra-se associado com uma ou mais proteínas de origem viral (p. ex.: adenovírus e reovírus) ou da célula hospedeira (poliomavírus e papilomavírus). As proteínas que estão associadas ao genoma geralmente possuem caráter básico, sendo formadas predominantemente por aminoácidos com carga positiva. Essa estrutura, geralmente compacta (genoma + proteínas associadas), é denominada core ou núcleo. O conjunto formado pelo core + capsídeo é comumente denominado NUCLEOCAPSÍDEO.
A função do capsídeo é proteger o material genético e proporcionar a transferência do vírus entre células e entre hospedeiros. Nos vírus sem envelope, a superfície externa do capsídeo é responsável pelas interações iniciais dos vírions com a célula hospedeira no processo de penetração do vírus. Nesses vírus, as proteínas localizadas na superfície do capsídeo também interagem com componentes do sistema imunológico e são alvos importantes para anticorpos com atividade neutralizante.
Os capsídeos são formados pela associação de subunidades proteicas denominadas protômeros, que se constituem nas suas unidades estruturais. A associação dessas proteínas pode formar estruturas tridimensionais bem definidas, geralmente na forma de pequenas saliências visíveis na superfície dos vírions. Essas estruturas constituem-se nas unidades morfológicas do capsídeo, também denominadas capsômeros. Cada capsômero pode ser formado por uma única proteína, pela associação de moléculas de uma mesma proteína ou por diferentes proteínas.
Com base na organização destes capsômeros, pode-se classificar o capsídeo viral em capsídeo helicoidal, icosaédrico e complexo. Os capsídeos helicoidais são formados por múltiplas cópias de uma mesma proteína. Essas proteínas se associam entre si e com o ácido nucléico, revestindo externamente o genoma. Essa associação resulta em uma estrutura espiralada alongada, flexível ou relativamente rígida. 
Os vírus animais que possuem nucleocapsídeos helicoidais possuem genoma RNA de sentido negativo e são todos envelopados.Vírus da raiva
Nos rabdovírus,o nucleocapsídeo adota uma forma bem definida, semelhante a um projétil de arma de fogo, no interior do qual se aloja o genoma espiralado.
O icosaedro se constitui em uma estrutura quase esférica com uma cavidade interna. Os capsídeos icosaédricos (também denominados cúbicos) são formados pela associação de 20 unidades triangulares planas idênticas, unidas entre si em 12 vértices e arranjadas ao redor de uma esfera imaginária. O icosaedro representa a otimização estrutural para a construção de um envoltório resistente, compacto e com máxima capacidade de armazenamento, podendo ser composto por múltiplas cópias de uma mesma proteína. Adenovírus
A maioria dos vírus animais possui capsídeos icosaédricos ou helicoidais, mas alguns (poxvírus, iridovírus e bacteriófagos) possuem capsídeos com arquitetura mais complexa, assimétrica, denominados genericamente de capsídeos complexos, e estão associados a alguns fagos. 
Envelope Viral
Os vírions de várias famílias possuem os nucleocapsídeos recobertos externamente por uma membrana lipoprotéica denominada envelope. O envelope é formado por uma camada lipídica dupla, derivada de membranas celulares. Nessas membranas estão inseridas um número variável de proteínas codificadas pelo genoma viral. Na maioria dos vírus, o envelope está justaposto externamente ao nucleocapsídeo, entretanto em algumas famílias existe um espaço de espessura variável entre o capsídeo e o envelope, que é preenchido por uma substância proteica amorfa, denominado tegumento.
Sensíveis a solventes orgânicos = precisam de todas as suas camadas para serem infeciosos.
NÃO está presente em todos o vírus.
Vírus envelopados são menos resistentes às variações físicas e químicas quando comparados aos vírus não envelopados.
Os lipídios que constituem o envelope são derivados das membranas da célula hospedeira, e as proteínas são codificadas pelo genoma viral. A estrutura lipídica dupla dos envelopes é bem semelhante entre os diferentes vírus. No entanto, a espessura e composição dessa camada variam de acordo com a membrana celular que os originou. 
As glicoproteínas que compõe o envelope viral, principalmente por meio de sua região extracelular, desempenham várias funções na biologia do vírus, incluindo: a) ligação aos receptores celulares; b) fusão do envelope com a membrana celular; c) penetração celular e d) transmissão do vírus entre células. Nas etapas finais do ciclo replicativo, algumas glicoproteínas do envelope auxiliam no egresso das partículas recém-formadas, permitindo a sua liberação a partir da membrana celular (neuraminidase nos ortomixovírus). As glicoproteínas do envelope também desempenham um importante papel na interação do vírus com o sistema imunológico e se constituem em alvos importantes para anticorpos neutralizantes.
Os vírus que não apresentam envelope são denominados não-envelopados, já os que apresentam são chamados de vírus envelopados, estes devido ao envelope apresentam morfologia pouco definida, e por isso são denominados vírus pleomórficos.
	
Proteínas Virais
O genoma dos vírus codifica duas classes principais de proteínas: estruturais e não-estruturais. As proteínas estruturais são aquelas que participam da construção e arquitetura da partícula vírica, ou seja, estão presentes como componentes estruturais dos vírions. Enquadram-se nessa classe as proteínas do nucleocapsídeo e do envelope. As proteínas do tegumento e as proteínas da matriz também se constituem em proteínas estruturais. Dentre as funções destas proteínas estão a fixação inicial do vírus na célula hospedeira, sua utilidade como determinantes antigênicos (disparo da resposta imune), além de apresentar papel fundamental no processo replicativo viral.
As proteínas não-estruturais são aquelas codificadas pelo genoma viral e produzidas no interior da célula hospedeira durante o ciclo replicativo, mas que não participam da estrutura das partículas víricas. São geralmente proteínas com atividades enzimáticas e/ou regulatórias que participam das diversas etapas do ciclo replicativo do vírus e de sua interação com as organelas e macromoléculas da célula hospedeira. São exemplos de proteínas não-estruturais as enzimas polimerases de DNA (DNA polimerase) e RNA (RNA polimerase), enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos (timidina quinase, ribonucleotídeo redutase etc.), fatores de transcrição e regulação da expressão gênica entre outras.
Propriedades Físico-químicas
Vários agentes físicos e químicos podem afetar a integridade funcional e infectividade dos vírions, incluindo a temperatura e o pH. A ação deletéria da temperatura sobre a viabilidade dos vírus possui importância durante a manipulação e remessa de material clínico para o diagnóstico, como também para a preservação de estoques virais na rotina laboratorial. Além disso, pode ser um fator limitante para a sua disseminação entre hospedeiros. Temperaturas de 55 a 60°C desnaturam as proteínas de superfície, sobretudo as do envelope, em poucos minutos, tornando os vírions incapazes de interagir produtivamente com receptores celulares e iniciar a infecção. Temperaturas ambientais altas também afetam negativamente a infectividade dos vírus.
Os vírus envelopados são geralmente muito mais sensíveis à ação deletéria de altas temperaturas sobre a infectividade. Alguns vírus, como os paramixovírus, são particularmente susceptíveis a temperaturas ambientais e também perdem a infectividade quando submetidos a congelamento e descongelamento. A conservação de vírus em suspensão líquida por longos períodos deve ser realizada a temperaturas de -70°C ou em nitrogênio líquido (-196°C). Outra forma segura e eficiente de armazenar vírus por longos períodos sem perder infectividade é por meio de liofilização (dessecação a temperaturas de congelamento) e conservação do material liofilizado (pó) a 4°C ou -20°C.
Para vírus em suspensão, temperaturas de 4 a 6°C são compatíveis com a preservação da infectividade apenas por horas ou poucos dias; temperaturas de 4° ou -20°C não são indicadas para conservação por longos períodos. A resistência a diferentes condições de pH varia amplamente; alguns vírus sem envelope (rotavírus, alguns picornavírus) mantêm a infectividade mesmo em condições de pH ácido e são chamados de ácidoresistentes; outros, sobretudo os envelopados, são inativados já em pH um pouco abaixo do neutro (5 a 6) e são chamados de ácido-lábeis. Agentes químicos que possuem ação desnaturante sobre proteínas e/ou solventes e detergentes lipídicos possuem ação deletéria sobre a infectividade dos vírus e muitos são utilizados como desinfetantes de materiais, equipamentos e ambientes. Em geral, os vírus sem envelope são muito mais resistentes a agentes químicos e condições ambientais do que os vírus com envelope.
TAXONOMIA VIRAL
Taxonomia Viral é a ciência da identificação, nomenclatura e classificação dos vírus. De acordo com os vários critérios adotados, os vírus são classificados hierarquicamente em ordens, famílias, subfamílias, gêneros e espécies. O sufixo virales é utilizado para designar a ordem. Para a denominação de família, utiliza-se o sufixo viridae; para subfamília, utiliza-se virinae; e para gênero, o sufixo virus.
Os critérios para classificação dos vírus em Ordem, Família, Subfamília e Gênero envolve o tipo de ácido nucleico e organização do genoma que este vírus apresenta, sua estratégia de replicação e a estrutura do vírion. Para classificação em espécie deve se levar em conta a homologia da sequência dos genomas, os hospedeiros naturais desse vírus, seu tropismo tecidual e celular, sua patogenicidade, formas de transmissão além de suas propriedades físico químicas.
O uso de abreviações das espécies virais é permitido desde que cumpridas as regras de nomenclatura impostas pelo ICTV. 
vírus da raiva rabies virus (RABV)
rotavírus Rotavirus (RV)
vírus da imunodeficiência humana Human immunodeficiency virus (HIV)
vírus da febre aftosa Foot and mouth disease virus (FMDV)
herpesvírusbovino Bovine herpesvirus (BoHV)
Até hoje, o ICTV (International Committee on Taxonomy of Virus) é o órgão que determina as regras a serem seguidas para a classificação dos vírus até o nível de espécie. Esse comitê se reúne periodicamente, com o fim de revisar e atualizar os critérios de classificação, de modo que as novas descobertas biológicas e moleculares possam ser incorporadas aos critérios taxonômicos já existentes. Com isso, a classificação dos vírus nas diversas hierarquias tornou-se dinâmica e pode ser alterada à medida que novas informações biológicas ou moleculares assim o justifiquem.
CICLO REPLICATIVO VIRAL
O ciclo replicativo viral compreende uma série de etapas que inicia com interação inicial do vírus e a célula hospedeira até a liberação das novas partículas virais (progênie viral), visando produzir progênie viral viável para perpetuação e disseminação dos vírus na natureza. As alterações da fisiologia celular, associadas com as infecções virais – que podem resultar em doença e até em morte do hospedeiro –, são meras consequências das interações do vírus com as células; interações que são absolutamente necessárias para o agente atingir esse objetivo.
Os vírus são os organismos mais simples que existem: os mais simples são compostos por uma molécula de ácido nucléico envolta por uma camada proteica. Quando estão fora de células vivas, os vírus são estruturas químicas, desprovidas de qualquer atividade biológica. Não possuem metabolismo próprio, não são capazes de produzir autonomamente nem os componentes mínimos para a sua multiplicação. Por isso, necessitam utilizar as organelas e o metabolismo celular para replicar o seu genoma e produzir as proteínas necessárias para a construção de novas partículas víricas. Esses agentes só adquirem atividade biológica dentro de células vivas. Mesmo os vírus mais complexos e evoluídos são dependentes de processos biológicos celulares para a sua multiplicação. Por isso, os vírus são, tradicionalmente, classificados como parasitas intracelulares obrigatórios.
O termo tropismo refere-se à predileção do vírus por determinadas células, tecidos ou órgãos do hospedeiro para se multiplicar. O principal fator celular – mas não o único – determinante da susceptibilidade e do tropismo é a presença de moléculas específicas na superfície celular, denominadas genericamente de receptores virais. Os receptores virais são moléculas da membrana plasmática que desempenham funções diversas na biologia das células, das quais os vírus se utilizam para se ligar e iniciar a infecção.
A multiplicação dos diferentes vírus apresenta várias etapas em comum, apesar da diversidade estrutural, do tipo e da organização genômica e das diferentes estratégias de replicação. Essas etapas ocorrem de forma ordenada e sequencial e envolvem interações complexas entre as proteínas e o genoma viral com organelas e macromoléculas celulares. O ciclo replicativo de todos os vírus inclui necessariamente as etapas de adsorção, penetração, desnudamento, Biossíntese viral (eclipse viral), montagem, maturação e Liberação da progênie viral. 
Adsorção
A primeira etapa da replicação é a ligação específica das partículas víricas na superfície das células hospedeiras – evento denominado adsorção –. Essa ligação é mediada por proteínas da superfície dos vírions (viral attachment proteins, VAPs) que interagem com os receptores na superfície das células. Nos vírus sem envelope, a função de ligação é exercida pelas proteínas do capsídeo; nos vírus envelopados, pelas glicoproteínas do envelope.
Os receptores celulares para os vírus são geralmente proteínas (glicoproteínas) ou carboidratos (presentes em glicoproteínas ou em glicolipídios da membrana). Em comparação com os receptores proteicos, os carboidratos são menos específicos, pois podem estar presentes em uma variedade de moléculas de membrana. Alguns vírus são estritamente dependentes de um receptor específico (exemplos: rinovírus, poliovírus, vírus da febre aftosa [FMDV]) enquanto outros podem utilizar receptores alternativos para iniciar a infecção (exemplo: herpesvírus, alguns togavírus). A capacidade de utilizar mais de um receptor para iniciar a infecção pode representar uma vantagem evolutiva, pois oferece a esses vírus a possibilidade de infectar diferentes tipos de células e/ou hospedeiros. 
Na maioria dos casos, a presença dos receptores determina o espectro de hospedeiros e o tropismo do vírus, pois aquela determinada célula apresentara receptores capazes de interagir com o vírus. 
Raiva: neurotrópico
Hepatite: hepatotrópico
HIV: linfotrópico (LT CD4)
Rotavírus: enterotrópico
Consequentemente, a presença e distribuição dos receptores também são determinantes fundamentais da patogenia da infecção. O número de receptores na superfície de uma célula parece ser extremamente variável. Essas moléculas podem ser raras e específicas de algumas células ou abundantes e amplamente distribuídas em várias células.
O processo de adsorção é independente de energia e do metabolismo celular.
Penetração
A penetração é a etapa subsequente à adsorção e envolve a transposição da membrana plasmática, permitindo a introdução do nucleocapsídeo (genoma viral + proteínas) no interior da célula (Fase em que ocorre a internalização da partícula viral), local onde ocorrerão a expressão gênica e a replicação do genoma. Em geral, os vírus penetram nas células utilizando um (ou alternativamente mais de um) dos seguintes mecanismos: a) penetração por fusão na superfície celular; b) penetração após endocitose (mediada por clatrina, caveolina ou agrupamentos de lipídios).
Endocitose: Esse mecanismo é característico da penetração de vários vírus envelopados (p. ex.: flavivírus e ortomixovírus) e de alguns vírus sem envelope (p. ex.: adenovírus, picornavírus e reovírus), onde os vírus internalizados em endossomos. A via endocítica parece ser o caminho mais adequado para a internalização dos vírus, pelos seguintes aspectos: a) a endocitose é um processo fisiológico comum à maioria das células; b) somente ocorre em células com transporte de membrana ativo, evitando a penetração em eritrócitos e plaquetas, onde a infecção seria improdutiva; c) os vírions podem se ligar em qualquer local da superfície celular para serem internalizados; d) a endocitose assegura a internalização e o transporte dos vírions aos locais de expressão gênica e replicação; e) a penetração a partir dos endossomos reduz os riscos de detecção pelo sistema imunológico, pois não deixa proteínas virais expostas na superfície celular; e f) o ambiente endossomal se acidifica gradativamente, o que auxilia na ativação dos mecanismos de fusão e penetração.
Fusão de Membranas: Alguns vírus com envelope (p. ex.: retrovírus, paramixovírus e herpesvírus) penetram na célula após fusão do envelope com a membrana plasmática, evento que ocorre na superfície celular. A fusão resulta em um canal entre o interior da partícula e o compartimento citoplasmático, através do qual o nucleocapsídeo penetra no citoplasma. A fusão entre as membranas do envelope e a plasmática requer a ação de proteínas de fusão presentes no envelope dos vírions.
Desnudamento
O termo desnudamento (do inglês uncoating) refere-se à série de eventos que ocorrem imediatamente após a penetração, em que os componentes do nucleocapsídeo são parcial ou totalmente removidos, resultando na exposição parcial ou completa do genoma viral.
A remoção das proteínas do nucleocapsídeo é necessária para a exposição do genoma às enzimas e fatores responsáveis pela transcrição (vírus DNA e RNA de cadeia negativa) ou tradução (vírus RNA de cadeia positiva). No ciclo replicativo de alguns vírus, a replicação do genoma ocorre após o desnudamento completo do genoma. Em outros vírus, a remoção parcial das proteínas do nucleocapsídeo já é sufi ciente para a ocorrência das etapas seguintes do ciclo.
Nos vírus que penetram por fusão com a membrana plasmática, a remoção do envelope, que ocorre pela fusão faz parte do desnudamento.Em alguns vírus RNA de cadeia positiva (togavírus), a remoção das proteínas do nucleocapsídeo ocorre logo após a penetração, pela sua interação com o RNA dos ribossomos. Nos vírus pH dependentes, a acidificação dos endossomos desencadeia a fusão e também pode facilitar a dissociação das proteínas do genoma. Isso resulta na liberação do nucleocapsídeo ou do genoma desprovido de proteínas diretamente no citoplasma (decapsidação espontâneo).
Biossíntese Viral
Esta fase não é visível a microscopia eletrônica e envolve os eventos de replicação, tradução e transcrição do genoma viral. A síntese de proteínas virais pela maquinaria celular (Ribossomos) é o evento central da multiplicação dos vírus. O genoma viral codifica diferentes proteínas que devem desempenhar pelo menos três funções básicas: a) assegurar a replicação do genoma; b) subverter funções celulares em seu benefício e c) empacotar os genomas recém replicados em novas partículas víricas. Os vírus não possuem metabolismo próprio e são inteiramente dependentes da maquinaria celular para a produção de suas proteínas. Ou seja, as informações genéticas contidas no genoma dos vírus são decodificadas em proteínas virais pelo aparato de síntese proteica da célula hospedeira.
Classe I: Vírus DNA fd e Replicação Intranuclear
Os genes desses vírus são transcritos pela maquinaria celular de transcrição, pois possuem as regiões regulatórias (promotores, enhancers), que são reconhecidas pela RNApolII e pelos fatores de transcrição da célula hospedeira. Os genes são classificados em duas ou mais classes e são transcritos sequencialmente sob regulação temporal restrita.
A replicação do genoma dos poliomavírus e papilomavírus é realizada quase que exclusivamente por fatores e enzimas celulares (Genoma pequeno - Utilizam integralmente as enzimas celulares); já os herpesvírus (genoma extenso) codificam várias proteínas com funções replicativas (DNA polimerase, proteína de ligação no DNA, helicase e quinases de nucleotídeos).
Classe II: Vírus DNA fs e Replicação Intranuclear
A replicação do genoma dos parvovírus e circovírus é realizada predominantemente por enzimas e fatores da célula hospedeira. A primeira etapa da replicação é a síntese da cadeia complementar de DNA. O DNA de fita dupla (linear nos parvovírus, circular nos circovírus) é, então, transcrito pela RNA polII celular, originando os mRNAs para a síntese de proteínas virais. A replicação dos parvovírus está intimamente associada com a fase S do ciclo celular, demonstrando a dependência de fatores celulares presentes nesta fase.
Classe IV: Vírus RNA fs polaridade + e Replicação Intracitoplasmática
O genoma desses vírus é constituído por uma molécula de RNA de polaridade positiva, logo o genoma viral (RNA fs+) serve de RNAm, pois possui a mesma polaridade, portanto, o RNA genômico viral é prontamente reconhecido como RNAm pelos ribossomos e traduzido no citoplasma. Por isso são conhecidos como vírus com genoma infeccioso.
Utilizando o RNA genômico como molde, a replicase sintetiza uma cópia de RNA de sentido antigenômico (polaridade negativa) com a extensão completa do genoma. Esse RNA antigenômico serve de molde para a síntese de moldes para a síntese de cópias de RNA de sentido genômico.
Classe V: Vírus RNA fs polaridade - e Replicação Intracitoplasmática
Esses vírus possuem um genoma RNA de sentido negativo (Genoma Viral não pode ser diretamente traduzido pois possui polaridade oposta - ao RNAm +), não-segmentado (paramixovírus, rabdovírus e filovírus) ou segmentado (ortomixovírus, buniavírus e arenavírus) e trazem a replicase viral nos vírions (RNA polimerase dependente de RNA). Nos vírus com o genoma não-segmentado, os genes são transcritos individualmente, originando mRNAs que são traduzidos nas proteínas estruturais e NS. Nos vírus com o genoma segmentado, cada segmento contém um (ou dois) gene(s), que também são transcritos individualmente.
Nas etapas iniciais da infecção, a transcrição é direcionada para a síntese de mRNAs para a produção de proteínas virais. Em fases tardias do ciclo, o modo de transcrição deve ser alterado, de modo a produzir os RNAs intermediários de replicação (RI) de sentido antigenômico.
A replicação ocorre via síntese de RNAs de sentido antigenômico, que servem de molde para a síntese de RNAs de sentido genômico. As moléculas de RNA de sentido genômico servem de molde para novos ciclos de transcrição, replicação e serão posteriormente encapsidadas.
Classe VI: Vírus RNA fs + diplóide de Replicação Intracitoplasmática e Intranuclear
A replicação do genoma dos retrovírus inclui etapas que ocorrem no citoplasma (logo após a penetração do nucleocapsídeo na célula hospedeira) e no núcleo (após a integração do material genético viral no genoma da célula). O genoma desses vírus é composto por duas moléculas idênticas de RNA de sentido positivo que, no entanto, não são traduzidas pelos ribossomos.
No início da infecção, a molécula de RNA genômico é convertida em uma molécula de cDNA pela enzima viral transcriptase reversa (RT, DNA polimerase dependente de RNA), que, em seguida, é convertida em uma molécula de DNA de fita dupla. Essa molécula, denominada provírus, ingressa no núcleo e é integrada no genoma da célula hospedeira, pela atividade integrase da polimerase viral, por isso as infecções oriundas desses vírus são denominadas infecções vitalícias. A integração do provírus no genoma celular assegura a perpetuação das informações genéticas do vírus no hospedeiro, e é absolutamente necessária para a continuação do ciclo replicativo.
A próxima etapa é a transcrição dos genes virais pela RNApolII e fatores de transcrição celulares. A transcrição parcial do genoma produz mRNAs que serão processados por splicing e serão traduzidos nas glicoproteínas do envelope. A transcrição completa do genoma origina mRNAs com duas finalidades: servirem de molde para a tradução em proteínas (RT, proteína da matriz, do capsídeo) ou constituírem o RNA genômico para a morfogênese da progênie viral. Considerando-se que a transcrição do provírus que produz o RNA genômico é realizada pela maquinaria celular de transcrição, sem a participação de nenhum fator viral, o genoma dos retrovírus é o único genoma viral a ser sintetizado exclusivamente por enzimas e fatores celulares.
Montagem
A montagem do vírion é análoga a um quebra-cabeça tridimensional entrelaçado. O vírion é construído a partir de partes pequenas, facilmente fabricadas, que abrigam o genoma em um pacote funcional (formação do capsídeo). Cada parte do vírion tem estruturas de reconhecimento que permitem ao vírus formar interações proteína-proteína, proteína-ácido nucleico e proteína-membrana (para os vírus envelopados) apropriadas. O processo de montagem começa quando as partes necessárias são sintetizadas e a concentração de proteínas estruturais na célula é suficiente para dirigir o processo termodinamicamente.
O sítio e o mecanismo de montagem do vírion na célula dependem de onde a replicação do genoma ocorre e se a estrutura final é um capsídeo desnudo ou um vírus envelopado. A montagem dos vírus DNA, exceto dos poxvírus, ocorre no núcleo e requer o transporte das proteínas do vírion para dentro do núcleo. A montagem dos vírus RNA e dos poxvírus ocorre no citoplasma.
Os vírus com capsídeo podem ser montados como estruturas vazias (procapsídeos) a serem preenchidas com o genoma (p. ex., picornavírus) ou podem ser montados em volta do genoma. Os nucleocapsídeos dos retrovírus, dos togavírus e dos vírus RNA de fita negativa são montados em volta do genoma e, subsequentemente, são abrigados em um envelope. O nucleocapsídeo helicoidal dos vírus RNA de fita negativa inclui a RNA polimerase RNA-dependente necessária à síntese do mRNA na célula-alvo.
Nos vírus envelopados, as glicoproteínas virais recém-sintetizadas e processadas são transportadas para as membranas celulares pelo transporte vesicular. A aquisição de um envelope ocorre após a associação do nucleocapsídeo com as regiões contendo glicoproteínaviral das membranas da célula hospedeira, em um processo chamado brotamento. As proteínas de matriz nos vírus RNA de fita negativa revestem e promovem a adesão dos nucleocapsídeos à membrana modificada por glicoproteína. À medida que mais interações ocorrem, a membrana envolve o nucleocapsídeo e o vírus brota da membrana.
O tipo de genoma e a sequência de proteína das glicoproteínas determinam o sítio de brotamento. A maioria dos vírus RNA brota da membrana plasmática e o vírus é liberado da célula ao mesmo tempo. Os flavivírus, coronavírus e bunyavírus adquirem seu envelope pelo brotamento na membrana do retículo endoplasmático e na membrana de Golgi e podem permanecer associados à célula nestas organelas. O nucleocapsídeo do vírus herpes simples é montado no núcleo e brota para dentro e então para fora do retículo endoplasmático. O nucleocapsídeo é mergulhado dentro do citoplasma, as proteínas virais associam-se ao capsídeo e então o envelope é adquirido pelo brotamento em uma membrana de rede trans-Golgi decorada com as 10 glicoproteínas virais. O vírion é transportado para a superfície celular e liberado por exocitose, na lise da célula ou transmitido por pontes célula-célula.
Maturação
A maturação corresponde à aquisição da capacidade infecciosa das partículas virais recém montadas, o processo de maturação pode ser intracelular (quando o vírus já adquire capacidade infecciosa dentro da célula) ou por brotamento em membranas celulares (vírus só adquire capacidade infecciosa ao sair (egressar) da célula hospedeira).
Intracelular
Alguns vírus (principalmente os desprovidos de envelope) completam o processo de mor morfogênese das partículas (e a consequente maturação) integralmente no citoplasma (vírus RNA) ou no núcleo (vírus DNA). Dessa forma, a progênie viral infecciosa pode ser encontrada nesses compartimentos, mesmo com a célula ainda íntegra, ou seja, a maturação ocorre previamente ao egresso. Esses vírus geralmente são liberados quando ocorre a destruição das células infectadas.
Brotamento de Membranas. 
No ciclo replicativo dos vírus envelopados (processo exclusivo desses vírus), as glicoproteínas do envelope recém-sintetizadas são inseridas em membranas celulares, isto é, na membrana do retículo endoplasmático rugoso (RER), no aparelho de Golgi ou na membrana plasmática. Os nucleocapsídeos recém-formados interagem com a proteína da matriz e/ou com extremidades citoplasmáticas dessas glicoproteínas e inserem-se (ou projetam-se) através da membrana, incorporando o envoltório. Esse envoltório (envelope) é composto pela membrana lipídica dupla, contendo as glicoproteínas virais inseridas. O processo de aquisição do envelope é denominado brotamento, pois o nucleocapsídeo literalmente brota para o interior do RER, do Golgi ou para o exterior da célula
Os vírus que realizam brotamento em membranas celulares, como forma de adquirir o envelope e completar a sua morfogênese/maturação, podem ser liberados por exocitose sem induzir necessariamente à lise da célula. Os vírus RNA de sentido negativo, alguns vírus RNA de sentido positivo (togavírus) e os retrovírus completam a morfogênese e a maturação somente no momento da liberação dos vírions na superfície da célula. Nesses casos, não é possível detectar progênie viral infecciosa no interior das células. 
Os vírus de outras famílias realizam o brotamento no RER e/ou no aparelho de Golgi. Vírions infecciosos podem ser encontrados em vesículas citoplasmáticas derivadas desses compartimentos, nas quais são transportados até a membrana plasmática, onde são liberados por exocitose. Independente de como realizam sua maturação esses vírus adquirem sua capacidade infecciosa somente após a aquisição do envelope.
 
Liberação da Progênie Viral 
Os vírus podem ser liberados das células por lise celular, por exocitose ou pelo brotamento da membrana plasmática. Os vírus com capsídeos desnudos são geralmente liberados após a lise da célula (rompimento da membrana plasmática). A liberação de muitos vírus envelopados ocorre após o brotamento da membrana plasmática sem matar a célula. A lise e o brotamento da membrana plasmática são formas eficientes de liberação. Os vírus que brotam ou adquirem sua membrana no citoplasma (p. ex., flavivírus, poxvírus) permanecem associados à célula e são liberados por exocitose ou lise celular. Os vírus que se ligam aos receptores de ácido siálico (p. ex., ortomixovírus e alguns paramixovírus) também podem possuir uma neuraminidase. A neuraminidase remove potenciais receptores de ácido siálico das glicoproteínas do vírion e da célula hospedeira para impedir a aglutinação e facilitar a liberação.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL 
A elaboração do diagnóstico laboratorial das infecções víricas animais depende de ações coordenadas do veterinário de campo e dos técnicos de laboratório. Os resultados dos testes laboratoriais, isoladamente, possuem pouco significado se não forem interpretados à luz de conhecimentos de epidemiologia, patogenia e imunologia das doenças.
A coleta, transporte e acondicionamento adequados do material a ser examinado são críticos para o sucesso do diagnóstico laboratorial. Se as técnicas laboratoriais já apresentam dificuldades intrínsecas, a sua realização com material em condições impróprias dificulta a realização das técnicas e reduz a probabilidade de obter o diagnóstico correto. Por essa razão, amostras cuja coleta e acondicionamento tenham sido inadequados possuem um valor limitado para a realização do diagnóstico.
Os métodos de diagnóstico virológico podem ser classificados em diretos e indiretos. Os métodos diretos são utilizados para detectar o vírus, antígenos ou ácidos nucléicos virais. A detecção pode ser realizada diretamente em amostras clínicas ou após a multiplicação do agente em cultivos celulares, ovos embrionados ou animais susceptíveis. Os métodos indiretos detectam anticorpos específicos contra o vírus, isto é, detectam a resposta do hospedeiro à infecção e, por isso, a sua denominação. Dependendo do método a ser usado, diferentes amostras podem ser utilizadas, é através das suspeitas criadas pelo profissional baseado em seus conhecimentos sobre a enfermidade que ditaram a amostra a ser usada.
Biopsia de pele
Secreção nasal
Saliva
Raspado da conjuntiva ocular
Sangue (Total ou Soro [sem anticoagulante])
Fezes/Urina
Métodos Diretos
Detecção direta da partícula viral íntegra ou de seus constituintes como o genoma ou proteínas/glicoproteínas de seus envoltórios.
Microscopia eletrônica
A técnica de microscopia eletrônica (ME) permite a visualização das partículas víricas em material clínico ou após a sua amplificação em cultivo celular. A simples observação das características morfológicas dos vírions (morfologia, diâmetro, estrutura do capsídeo e envelope), aliada com a sua distribuição no material examinado (núcleo ou citoplasma), permite, algumas vezes, a identificação definitiva do agente. Por isso, a ME constitui-se em um dos métodos mais notáveis de diagnóstico de infecções víricas. O método é particularmente útil para infecções entéricas (rotavírus, coronavírus, astrovírus), cutâneas (poxvírus, herpesvírus) e também para a identificação de vírus de difícil multiplicação em cultivo celular (torovírus, hepadnavírus, circovírus, alguns adenovírus, astrovírus, coronavírus e rotavírus). O diâmetro, a morfologia dos vírions e detalhes da sua superfície são os aspectos principais observados no diagnóstico por ME.
Dentre as amostras clínicas mais comumente submetidas à ME estão o material fecal (fezes ou conteúdo intestinal), fluidos ou escaras de lesões cutâneas ou mucosas, tecidos coletados na necropsia, células ou sobrenadante de cultivos previamente inoculadas com o material suspeito. A realização de ME em tecidos de animais infectados também pode indicar o local da célula onde ocorre a replicação do vírus, podendo fornecer informações sobre a patogenia dessas infecções. Como a ME requer grande quantidade de vírus para poder detectá-lo, resultados negativos nessatécnica não indicam necessariamente a ausência de vírus na amostra.
Dentre as propriedades deste método destacam-se a rapidez de execução, a possibilidade de reconhecimento da morfologia viral (às vezes, a identificação da família e espécie do vírus) e a possibilidade de detecção de vírus viáveis e também aqueles que eventualmente já estejam inviáveis no material submetido. A ME também é muito útil para detectar vírus que não replicam eficientemente em cultivo celular. As maiores restrições referem-se a sua baixa sensibilidade, aplicabilidade restrita a alguns vírus, equipamento caro e necessidade de pessoal altamente treinado.
Inoculação em ovos embrionados
Os tecidos de embriões de galinha representam sistemas ideais para a multiplicação de vários vírus. Por isso, ovos embrionados têm sido utilizados para o isolamento e também para o cultivo de alguns vírus de aves e de mamíferos. Dependendo do vírus suspeito, o material pode ser inoculado por diversas vias e em diferentes estágios de desenvolvimento do embrião. Após a inoculação, a viabilidade do embrião é monitorada diariamente em um ovoscópio. Em caso de morte, realiza-se a necropsia do embrião à busca de alterações macroscópicas.
As principais propriedades desse método são: boa sensibilidade, facilidade de manipulação e custo relativamente baixo. As maiores restrições se referem à dificuldade de obtenção de ovos embrionados livres de patógenos, contaminação bacteriana e/ou fúngica e impossibilidade de automação. Além disso, a sua aplicação é restrita aos vírus que se multiplicam em embriões de galinha.Observação de lesões na membrana corioalantóide: lesões esbranquiçadas ou hemorrágicas
Inoculação em animais
Com o advento dos cultivos celulares, a inoculação de animais para o diagnóstico de infecções por vírus foi sendo gradativamente substituída. Além das questões operacionais (custo, espaço, dificuldade de manutenção de animais com este propósito), o uso de animais tem sido restrito por questões éticas. 
No entanto, esse método ainda possui aplicação em alguns casos específicos, geralmente associados com outras técnicas de diagnóstico, como por exemplo no protocolo para o diagnóstico de raiva animal. Em casos suspeitos de raiva, pesquisa-se inicialmente a presença de antígenos em fragmentos de cérebro por IFA. Este teste é seguido pela inoculação de um macerado do cérebro suspeito em camundongos lactentes (6-10 dias de idade), o que constitui a prova biológica, permitindo o diagnóstico defi nitivo da enfermidade.
Os camundongos são inoculados pela via intracerebral com o material suspeito e monitorados por até 28 dias. A presença do vírus rábico no material resulta no desenvolvimento de doença neurológica severa e morte entre o 8 e 21 dias após a inoculação. A confirmação da identidade do agente pode ser realizada por imunofluorescência do cérebro dos camundongos que morreram.
Inoculação em cultivo celular
Como os vírions frequentemente estão presentes em pequenas quantidades no material clínico, a inoculação em células susceptíveis permite a sua multiplicação para posterior identificação. A maior restrição para a utilização do isolamento com fins diagnósticos é o tempo necessário para se obter o resultado final – pode levar até semanas.
O ICC é aplicável a maioria dos vírus de interesse veterinário e possui boa sensibilidade. O material suspeito é inoculado em células animais cultivadas “in vitro” (monocamada celular) e a replicação do vírus é evidenciada pela produção de efeito citopático (alterações celulares provocadas pela atividade viral) ou pela detecção de proteínas ou ácidos nucléicos virais nas células inoculadas.
A escolha das células é crítica para o sucesso do procedimento, pois cada vírus possui afinidade (tropismo) por um tipo celular (linhagem celular) específico. Como regra, deve-se preferir células da espécie animal de origem do material. Amostras oriundas de bovinos devem ser inoculadas em células de origem bovina, e assim por diante. Alguns vírus são estritamente espécie-específicos e somente se multiplicam em células da espécie homóloga; outros são capazes de replicar em células de diferentes espécies (o BVDV, por exemplo, replica em células de bovinos, ovinos, suínos, carnívoros, primatas etc.).
Os cultivos celulares são inoculados (incubação em temperatura controlada (variável conforme o vírus pesquisado)) com o material suspeito e devem ser monitorados diariamente (monitoramento do efeito viral sobre a monocamada celular (tapete celular) é feita pelo microscópio) para o aparecimento de alterações morfológicas que caracterizam o ECP (efeito citopático). O não aparecimento de ECP ao final de 4 a 5 dias deve ser seguido da reinoculação do sobrenadante do cultivo em cultivos frescos (subcultivados 18 a 24 h antes). Cada etapa de inoculação e monitoramento, que leva entre 4 e 5 dias, é denominada passagem.
A replicação da maioria dos vírus animais em cultivo celular produz ECP característico do seu gênero ou espécie. Esses vírus são denominados citopáticos (ou citopatogênicos, CP). Por isso, com frequência, é possível identificar o agente viral pelo tipo de ECP produzido, aliado com o histórico clínico-patológico. Exemplos de efeitos citopáticos: vacuolização citoplasmática, formação de células gigantes multinucleadas (sincícios), arredondamento celular e lise celular, corpúsculo de inclusão intracitoplasmático ou intranuclear. Promover lise celular e consequentemente liberação das partículas virais
Esta técnica exige obrigatoriamente a infecciosidade e integridade da partícula viral (mimetiza a infecção natural), portanto, determinadas temperaturas, pH e exposição a condições ambientais que sejam prejudiciais à viabilidade do agente podem afetar negativamente o teste, por isso coleta, transporte e armazenamento das amostras são fatores determinantes para o sucesso do diagnóstico. Algumas limitações da técnica são o custo elevado para manutenção das linhagens celulares, demora na obtenção dos resultados.
Técnica de hemaglutinação (HA)
Alguns vírus possuem a capacidade de se ligar a moléculas da membrana plasmática de eritrócitos de determinadas espécies animais e provocar a sua aglutinação (in vitro). Essa atividade, denominada hemaglutinação (HA), pode ser utilizada como indicador da presença desses vírus em amostras clínicas. A hemaglutinação é o resultado da ligação de glicoproteínas da superfície dos vírions, denominadas genericamente hemaglutininas, com receptores da superfície dos eritrócitos. Os vírus que possuem essa atividade são chamados de hemaglutinantes.
Para se realizar a técnica, há a necessidade das amostras podendo conter o vírus, e obrigatoriamente de sangue para testar o poder aglutinante do vírus, porém para algumas espécies (ex: cães e gatos) é difícil ter um estoque de sangue para os testes, por isso se faz uso de sangue de espécies doadoras de hemácias, desde que o vírus apresente a capacidade de aglutinar o sangue “doado”. Ex:
Parvovírus canino aglutina hemácias de suínos
Coronavírus bovino aglutina hemácias de camundongo
Influenzavirus aglutina hemácias de galinhas
Algumas vantagens da técnica, são o fato da mesma ser rápida, barata e de fácil execução, porém há restrições como o fato de ser aplicável somente a alguns tipos virais (presença de proteínas hemaglutinantes na superfície do vírion) e haver necessidade de espécies doadoras de hemácias.
Avaliação histopatológica
Avaliação do tecido para pesquisa de células infectadas por vírus. Realiza-se a formação de corpúsculos de inclusão (acúmulo de constituintes virais no interior da célula (massa replicativa viral)): são encontrados no interior da célula infectada, são muito maiores do que a partícula viral individual e podem se localizar no núcleo (Ex: herpesvirus) ou no citoplasma (poxvirus, raiva, cinomose) ou em ambos os compartimentos celulares (sarampo). 
Corpúsculo de inclusão de alguns vírus é bem característico, constituindo uma importante ferramenta de diagnóstico. Ex: Corpúsculo de Negri intracitoplasmáticoem células neuronais (Vírus da Raiva).
Ensaio Imunoenzimático (Elisa)
O teste imunoenzimático (ELISA) pode ser utilizado para a detecção de antígenos virais. A técnica baseia-se na imobilização da reação antígeno-anticorpo em um suporte sólido (placas de poliestireno), seguida de uma reação colorimétrica. No ELISA de captura direto para detecção de antígenos virais, placas de 96 cavidades (de fundo chato) são recobertas com anticorpos específicos para um determinado agente. A amostra suspeita da presença viral (sangue, secreções ou leite) é adicionada e incubada por um determinado tempo.
Nesse período, ocorre a captura do antígeno (amostras positivas) pelo anticorpo fixado na placa. Após essa etapa, são realizadas lavagens para a remoção de substâncias inespecíficas. A seguir adiciona-se um segundo anticorpo, específico para o vírus, conjugado com uma enzima. Novamente os anticorpos que não se ligaram são removidos por lavagens. A confirmação da presença do antígeno viral é evidenciada pela adição de substrato que irá se ligar à enzima e evidenciar através de uma reação colorimétrica (reação da enzima com o substrato) o resultado positivo.
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Imunofluorescência direta
A imunofluorescência (IFA) é uma técnica de detecção de antígenos e baseia-se na reação de anticorpos específicos com o antígeno presente no material suspeito. Os anticorpos são conjugados com uma substância que emite luminosidade fluorescente (fluoresceína) quando exposta à luz ultravioleta (UV). A presença do antígeno no material é revelada pela emissão de luminosidade fluorescente.
Após a fixação (pode ser um imprint do tecido em lâminas de microscópio), incuba-se o material com o anticorpo específico marcado com o fluorocromo. Posteriormente, sucessivas lavagens são realizadas para a remoção do anticorpo não-ligado. O material é, então, examinado ao microscópio de luz UV. A coloração verde-maçã ou vermelha, visualizada contra um fundo escuro, indica a presença de antígenos virais na amostra.
Ex: diagnóstico da raiva (imprint de cérebros suspeitos em lâminas de microscopia).
Eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA)
A eletroforese consiste na migração e separação de moléculas (proteínas, ácidos nucleicos) de acordo com o peso molecular sob a influência de um campo elétrico, cujo o objetivo da técnica é separar os fragmentos do RNA genômico de acordo com o peso molecular. 
Um exemplo de aplicação da técnica é a detecção do genoma do Rotavírus. Uma característica dos rotavírus é a presença de sorogrupos, que são correlacionados com diferenças na extensão desses segmentos. Essas diferenças irão produzir um padrão de migração na eletroforese, e isso será utilizado para a identificação do agente e classificação em sorogrupos. A técnica possui boa sensibilidade e especificidade quando comparado com outras técnicas de detecção dos rotavírus.
Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
A reação da polimerase em cadeia (PCR) é uma técnica altamente específica e sensível, que consiste na síntese in vitro de uma grande quantidade de cópias de um segmento de DNA existente na amostra (mimetizando o processo de replicação natural). Ou seja, consiste em amplificar o número de moléculas a partir de uma molécula-alvo original, denominada template ou molde. Essa amplificação pode ser realizada a partir de uma quantidade mínima do ácido nucléico-alvo; uma PCR bem padronizada, teoricamente, é capaz de detectar e amplificar até uma única cópia do molde existente na amostra.
A região-alvo a ser amplificada é delimitada por primers, que são oligonucleotídeos sintéticos de aproximadamente 20 nucleotídeos. Esses primers hibridizam com suas regiões complementares, que se localizam nas cadeias opostas do DNA, nas regiões flanqueadoras da sequência alvo. Os primers são sintetizados de acordo com a sequência a ser amplificada, e a sua especificidade depende do seu grau de conservação e complementaridade com a sequência-alvo. A reação de PCR envolve a realização de vários ciclos (entre 30 e 40) de desnaturação (separação da fita dupla), hibridização dos primers e polimerização da cadeia de DNA a partir dos primers, pela enzima DNA polimerase. 
A cada ciclo o número de moléculas correspondentes à sequência-alvo duplica e, no final da reação, acumulam-se milhões de cópias idênticas correspondentes à sequência-alvo inicial. Essas moléculas, denominadas genericamente de produtos de PCR (ou amplicons), podem, então, ser detectadas visualmente em géis de agarose, corados com brometo de etídio, sob luz UV. Os produtos de PCR podem também ter a sua identidade confirmada por hibridização com sondas específicas.
A técnica de RT-PCR (reverse transcriptase PCR) consiste na amplifi cação de segmentos de RNA. Através da transcrição reversa, realizada pela ação da enzima transcriptase reversa, uma cópia de DNA complementar (cDNA) é sintetizada a partir da RNA viral (genoma ou produto intermediário do processo de replicação). Essa nova molécula sintetizada será usada como template (molde) para a reação de PCR convencional.
Métodos Indiretos
A detecção de anticorpos no soro é muito utilizada com fins diagnósticos em Virologia. As infecções víricas induzem uma resposta imunológica específica, mediada por anticorpos (além de células), que persiste por um tempo variável e que pode ser detectada por diversas técnicas. Os anticorpos produzidos contra um determinado vírus são estritamente específicos para este agente. Por isso, as técnicas de detecção de anticorpos são também específicas, permitindo distinguir a resposta sorológica produzida contra vírus diferentes.
Da mesma forma, as técnicas sorológicas podem ser altamente sensíveis, capazes de detectar quantidades mínimas de anticorpos e de identificar quase a totalidade dos animais que os possuem. Variações dessas técnicas permitem não só a detecção, mas também a quantificação dos anticorpos presentes no soro. Os níveis de anticorpos são geralmente expressos como títulos, que representam a recíproca da maior diluição do soro, na qual os anticorpos – ou o seu efeito – podem ser detectados.
Soroneutralização
O teste de soro-neutralização (SN) é utilizado para se detectar anticorpos que possuem capacidade de neutralizar a infectividade do vírus. O teste é geralmente utilizado com soro sanguíneo, mas pode ocasionalmente utilizar outros fluidos corporais que possuam anticorpos. Nesse teste, examina-se o soro suspeito frente a um vírus-padrão previamente conhecido e quantificado.
O teste é realizado em microplacas de 96 cavidades (fundo chato), nas quais se incubam diluições crescentes do soro-teste com uma quantidade constante do vírus por um determinado tempo. Após esse período, durante o qual os anticorpos presentes no soro se ligam e neutralizam o vírus, são adicionadas as células de cultivo. As placas, contendo a mistura soro-vírus-células, são incubadas a 37ºC em atmosfera com 5% de C02 por 48 a 96 h. A presença de anticorpos neutralizantes na diluição testada previne a produção de ECP pelo vírus nos cultivos. O aparecimento de ECP indica a ausência de anticorpos neutralizantes suficientes para neutralizar o vírus, na respectiva diluição. Não apresenta sensibilidade a ponto de diferenciar Ac vacinais dos oriundos do contato com o Ag infeccioso
 
ELISA Indireto
Os testes do tipo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) são realizados em microplacas de poliestireno de 96 cavidades e utilizam anticorpos marcados com enzimas (peroxidase ou fosfatase alcalina). Embora tenham sido originalmente planejados para a detecção de antígenos (pela ligação específica de anticorpos marcados), a sua maior utilização atual tem sido para a detecção de anticorpos.
 
Inibição da Hemaglutinação (HI)
Ao contrário da reação de HA, que somente revela uma atividade biológica do vírus, a reação de HI é uma prova sorológica e, dessa forma, pode ser empregada tanto para a identificação do agente como para o diagnóstico sorológico de infecçõespor esses vírus. O princípio da HI baseia-se na capacidade de anticorpos se ligarem nas hemaglutininas virais e inibirem a sua atividade hemaglutinante. A HI realizada com um soro-padrão conhecido frente a um material positivo recém-detectado na HA possibilita a identificação do agente. Por exemplo, a detecção de atividade hemaglutinante em líquidos provenientes de fetos suínos abortados indica a presença de vírus. A inibição dessa atividade hemaglutinante com um soro-padrão para o parvovírus suíno (PPV) indica que o agente presente nos fluidos é o PPV.
Resumidamente, o soro-teste (puro ou em diluições crescentes) é incubado com uma quantidade predeterminada do vírus padrão em questão (4 ou 8 unidades hemaglutinantes) por uma hora, seguido da adição de uma suspensão de eritrócitos de uma determinada espécie animal, e outra incubação de 1-2 horas. Ao final procede-se a leitura: a presença de anticorpos contra o vírus padrão impede a sua atividade hemaglutinante, e os eritrócitos rolam formando um botão circular de borda bem definida no fundo da cavidade da placa. A ausência de anticorpos resulta na atividade hemaglutinante do vírus, provocando a aglutinação dos eritrócitos e a sua precipitação, formando uma camada difusa, recobrindo todo o fundo da cavidade da placa.
Imunofluorescência indireta (IFI) 
Imunodifusão em gel de ágar (IDGA)
O princípio da imunodifusão em gel de ágar (IDGA) é insolubilização e precipitação de complexos formados pela reação antígeno-anticorpo (ligação do antígeno com o anticorpo específico Ag-Ac). Esses complexos podem ser visualizados sob a forma de linhas de precipitação no gel de agarose.
Pela sua simplicidade e praticidade, pode ser implementada em qualquer laboratório. É particularmente útil para inquéritos sorológicos de grandes populações animais, sobretudo, pela sua praticidade e custo baixo. Essa técnica tem sido utilizada para o diagnóstico sorológico de várias viroses mas possui aplicação particular para o vírus da Anemia Infecciosa Equina (teste de Coggins), este é o teste oficial para diagnóstico da AIE (somente em laboratórios credenciados pelo Ministério da Agricultura).