AULA METODO CROMATOGRÁFICO 3

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Cromatografia líquida
Você vai entender os princípios da cromatografia líquida, sua classificação, o uso do diagrama de blocos e
as características principais de cada componente do sistema cromatográfico. Além disso, vai compreender
a fase estacionária, os modos cromatográficos, os detectores convencionais e a espectrometria de
massas.
Profa. Monica Padilha
1. Itens iniciais
Propósito
A cromatografia líquida (CL) é a técnica mais utilizada na indústria farmacêutica para o desenvolvimento e
controle de qualidade de fármacos. Para obter sucesso na operação de um equipamento e no
desenvolvimento ou na otimização de um método analítico, é indispensável que os profissionais atuantes na
área conheçam os princípios da técnica, assim como os fundamentos que sustentam a separação por CL.
Objetivos
Reconhecer as diferenças entre CL, CLAE e CLUE, além da função dos principais componentes dos 
equipamentos.
Identificar as características da fase estacionária, os principais modos cromatográficos e os métodos 
de detecção utilizados.
Introdução
Você já ouviu falar em cromatografia? Você, como farmacêutico, certamente, vai se deparar com essa técnica
em algum momento de sua carreira.
Aqui, vamos aprender a reconhecer as diferenças entre as cromatografias clássica, de alta e de ultra
eficiência, além de vermos quais são os componentes principais desses equipamentos e a função de cada um
deles. Vamos ainda identificar as características principais da fase estacionária, os modos cromatográficos
existentes, como a cromatografia por exclusão e a troca iônica. Por último, trataremos dos detectores, que são
mais utilizados na cromatografia líquida, e de suas características.
A cromatografia é a técnica analítica mais utilizada na indústria farmacêutica, além de ser utilizada em
diversos outros setores, como pesquisa, indústria petroquímica, alimentos, ambiental e outras. Vamos
aprender sobre essa técnica!
• 
• 
Mikhail Semenovich Tswett.
Cromatografia líquida em coluna no laboratório.
1. Princípios e instrumentação da CLAE
Entendendo a cromatografia líquida
Evolução da cromatografia líquida
A cromatografia líquida (CL) é uma técnica cromatográfica em que a fase móvel (FM) é um líquido e a fase
estacionária (FE) é um sólido ou um líquido retido sobre um sólido. Na CL, o analito interage com a FM e com a
FE. Para a análise por CL, a amostra deve ser solúvel na FM. A separação ocorre devido a diferentes
interações do analito com a FM e a FE.
A cromatografia líquida (CL) foi inicialmente
descrita pelo botânico russo Mikhail
Semenovich Tswett, que, no início do século
XX, separou pigmentos coloridos presentes em
extratos de folhas verdes de plantas utilizando
um tubo de vidro preenchido com carbonato de
cálcio.
 
Tswett, apesar da existência de outros relatos
na mesma época, foi o primeiro a compreender
e interpretar o processo cromatográfico, sendo
considerado o pai da cromatografia moderna.
Décadas depois dos trabalhos de Tswett,
enormes avanços foram concretizados,
possibilitando a evolução da cromatografia
líquida para uma técnica com maior eficiência, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE, em inglês, high
performance liquid chromatography, HPLC) e, posteriormente, com a redução do tamanho da partícula de fase
estacionária, a cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE, em inglês, ultra high performance liquid
chromatography, UHPLC).
Na cromatografia líquida clássica, praticada até
o início da década de 1970, a coluna
cromatográfica era um tubo de vidro aberto,
recheado com material adsorvente.
 
Trabalhavam a pressões ambientes ou baixas
pressões. As dimensões da coluna dependiam
da quantidade de amostra utilizada.
 
Após a ativação do material adsorvente, ou
seja, a estabilização da coluna com a passagem
da fase móvel (FM) com fluxo constante, a
amostra era aplicada cuidadosamente no topo
da coluna. As frações eluídas são coletadas
manualmente, em intervalos de tempo pré-
determinados.
 
A detecção em cada fração coletada é feita por técnicas auxiliares, como a espectrofotometria ou a
gravimetria, entre outras.
Para compreender melhor a cromatografia clássica, confira a imagem!
Cromatografia líquida clássica.
A principal diferença entre a CLC e a CLAE está no diâmetro das partículas do material adsorvente. Compare e
entenda!
Com as dimensões reduzidas das partículas de fase estacionária em CLAE, apenas o uso da pressão
atmosférica é insuficiente para promover o deslocamento da fase móvel utilizada no sistema. Por isso, nessa
técnica, há a necessidade da utilização de bombas cromatográficas para a eluição da fase móvel, atingindo
pressões muito superiores à pressão atmosférica. Consequentemente, a instrumentação de um cromatógrafo
líquido de alta eficiência foi desenvolvida para permitir mais eficiência da técnica beneficiando resolução,
quantificação, detecção e sensibilidade, com redução no tempo de análise.
Comentário
Com a evolução na tecnologia de confecção de novas fases estacionárias com partículas porosas,
esféricas e de diâmetros reduzidos, ocorrida a partir dos anos 1960, a CLAE é novamente impulsionada
na busca de aumentar sua capacidade de separação e poder de resolução. Posteriores avanços nessa
técnica foram impulsionados pelo desenvolvimento contínuo de novas partículas de FE, capazes de
gerar colunas mais seletivas e estáveis, tanto química quanto mecanicamente – objetivo que é
perseguido até os dias atuais. 
Com a redução do tamanho das partículas de FE, a pressão requerida para impulsionar a FM pelo sistema era
muito superior às pressões de trabalho compatíveis com os sistemas de CLAE, ou seja, pressões na faixa de
5000 PSI.
PSI
É uma medida de pressão, assim como atm. 1 PSI equivale à aproximadamente 0,068 atm.
Nesse momento, houve uma corrida por parte das empresas de instrumentação analítica que buscavam
desenvolver bombas capazes de trabalhar com pressões ainda maiores, até cerca de 15.000 PSI, dando
CLC 
Inicialmente, utilizava partículas irregulares,
com diâmetros variáveis, de 40 a 50 µm,
enquanto hoje se utilizam partículas
menores, na faixa de 30 a 40 µm. 
CLAE 
Atualmente, utiliza micropartículas
com diâmetros de 3; 5 ou 10 µm,
preferencialmente esféricas. 
origem à cromatografia líquida de ultraeficiência (CLUE, em inglês, ultra performance liquid chromatography,
UPLC). 
Por volta dos anos 2000, análises por CLAE, com colunas de partículas esféricas porosas de 2,5 ,
geravam cerca de 1600 pratos teóricos por centímetro de comprimento. Poucos anos depois do
estabelecimento de partículas de 2,5 , foram desenvolvidas partículas esféricas porosas de . A
utilização de partículas de 1,7 , com o consequente aumento de pressão no sistema, garante maior
capacidade de resolução e eficiência, além de proporcionar análises mais rápidas, sendo possível diminuir o
tamanho das colunas. As colunas com diâmetros de partículas inferiores a só podem ser utilizadas
em sistema CLUE.
A imagem a seguir apresenta uma comparação hipotética entre cromatogramas obtidos com CL, CLAE e
CLUE, evidenciando a diferença na quantidade de amostra, no tamanho de partícula de FE, na eficiência
cromatográfica, no tempo de análise e na pressão do sistema. Confira!
Cromatogramas hipotéticos obtidos por CL, CLAE e CLUE.
Na sequência, vamos entender como a separação cromatográfica ocorre.
Princípios da separação cromatográfica
A separação cromatográfica é baseada na migração diferencial e nos processos de alargamento de banda. A
migração diferencial é resultado das diferentes interações do analito e demais componentes de uma amostra
com a FM e a FE. 
A migração diferencial é dependente de dois fatores, e as modificações em algum desses fatores leva a
mudanças na seletividade dos processos cromatográficos. Veja quais são esses fatores!
Natureza das fases
Móvel e estacionária.
Temperatura da coluna
Do forno da coluna.
Os processos de alargamento de banda, presentes na CLAE, ocorrem devido aos processos de difusão por
turbilhonamento, difusão longitudinal
Detector seletivo: absorbância no UV-VIS
	IR
	UV
	VIS
	Detectores universais
	Detector de índice de refração
	Espectrometria de massas: modos de aquisição
	Etapa 1
	Etapa 2
	Etapa 3
	Verificando o aprendizado
	2. Seleção de colunas e métodos de detecção
	Fase estacionária
	Conteúdo interativo
	Dica
	Comentário
	Óxidos metálicos
	Alumina
	Titânia
	Zircônia
	Fases estacionárias com polímeros imobilizados
	Coluna: o coração do sistema cromatográfico
	Conteúdo interativo
	Atenção
	Atenção
	Modos cromatográficos: fases reversa e normal
	Cromatografia de fase reversa
	Cromatografia de fase normal
	Modos cromatográficos: fases reversa e normal
	Conteúdo interativo
	Modos cromatográficos: troca iônica e exclusão
	Conteúdo interativo
	Cromatografia de troca iônica
	Atenção
	Cromatografia de exclusão (CE)
	Comentário
	Modos cromatográficos: interação hidrofílica e quiral
	Conteúdo interativo
	Cromatografia de interação hidrofílica
	Comentário
	Cromatografia quiral
	Atenção
	Verificando o aprendizado
	3. Conclusão
	Considerações finais
	Explore +
	Referências
e transferência de massa do analito entre FM e FE. 
A retenção do analito na fase estacionária pode ser explicada por um processo de competição ou pela
interação. Entenda!
Em ambos os modelos, a interação do soluto com a FE é constante e a retenção é diretamente dependente da
composição da FM. Portanto, na CLAE, a retenção depende das afinidades entre soluto e FM, soluto e FE, e
FM e FE.
As forças intermoleculares regem as associações do soluto com FM e FE. As interações que mais refletem o
que acontece na CLAE são as ligações de hidrogênio, a força de Van der Waals, as atrações eletrostáticas e
as interações por elétrons π e hidrofóbicas.
A FE utilizada na CL pode ser sólida ou líquida, e o modo de interação entre a FE e o analito pode ser
classificado da seguinte forma:
Adsorção
Em se tratando de FE sólida.
Partição
Em se tratando de FE líquida.
É importante ressaltar que algumas separações utilizam simultaneamente os dois modos de interação.
Quando a interação do analito com a FE sólida ocorre na superfície, o processo é denominado adsorção;
quando o analito se difunde no interior da FE líquida, o processo é denominado partição.
O que é e para que serve a cromatografia líquida?
Confira, neste vídeo, a evolução da cromatografia líquida e as diferenças entre a cromatografia clássica,
líquida de alta eficiência e líquida de ultra eficiência, assim como suas vantagens e desvantagens.
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Componentes da CLAE: sistema e fase móvel
Confira, neste vídeo, quais são os componentes da CLAE e as características da fase móvel.
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O sistema
O diagrama de blocos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência é constituído por reservatório de fase
móvel, bomba, injetor, forno para coluna, coluna, detector e um sistema informatizado de registro e controle. 
Na competição 
O soluto disputa com a FM pelos sítios de
interação (afinidade) na FE, e não há,
portanto, interação entre analito e FM. 
Na interação 
A FM é depositada sobre a FE e o soluto
interage com o filme líquido de FM
sobre a superfície da FE. Nesse caso, a
retenção depende de interações da FM
com a FE. 
Existem sistemas mais completos, com módulos auxiliares, cujo objetivo é aumentar a praticidade e o
rendimento de obtenção de resultados. Os módulos auxiliares são gabinete e recipiente para solvente,
desgaseificador em linha, injetor automático, coletor de fração, sistema automático de preparação e
tratamento de amostra, e sistema de controle, aquisição e manipulação de dados (computador). Confira!
Reservatório de FM.
Bomba.
Injetor.
Coluna.
Detector.
Sistema de registro e controle.
Fase móvel
O reservatório de FM é um frasco de vidro borossilicato (garrafa), graduado com capacidade variável,
podendo chegar a 4 litros, que fica disposto em um gabinete localizado na parte superior do equipamento.
Esse frasco possui um sistema de rosca com anel antigota em polipropileno e diâmetro de boca de 45 mm. É
comum que o gabinete tenha capacidade para quatro frascos, que são preenchidos por um líquido ou por uma
mistura de líquidos (geralmente, solventes orgânicos, água ultrapurificada e/ou solução-tampão).
Módulo de reservatório de FM e garrafas de FM em
destaque.
Esses frascos alimentam, cada um, uma
tubulação de polipropileno que conduz o líquido
existente dentro do frasco para a bomba
presente no cromatógrafo (pelas linhas
independentes de alimentação denominadas A,
B, C e D). O líquido contido na garrafa poderá
ser um dos componentes da fase móvel ou a
própria FM.
O solvente que compõe a fase móvel deve
possuir pureza adequada e deve estar livre de
material particulado ou bolhas de ar. Em CLAE,
é obrigatório o uso de solventes orgânicos com
grau de pureza compatível com o detector utilizado. Para detectores convencionais, utiliza-se o solvente grau
HPLC. A água utilizada para compor a fase móvel também deve ser água ultrapurificada, água do tipo I. 
Tanto o solvente orgânico quanto a água devem ser filtrados adequadamente e suas misturas desgaseificadas
antes do uso. A fase móvel deve ser desgaseificada para evitar a formação de bolhas de ar quando são
utilizadas mistura de água ultrapura com solvente orgânico. A desgaseificação pode ser feita fora de linha
(off-line) em ultrassom por aproximadamente 15 minutos, ou em linha (on-line) por aspersão de um gás inerte,
geralmente hélio, ou por sistema de desgaseificação integrado.
Em geral, as fases aquosas, compostas por água ultrapurificada ou solução-tampão, são filtradas em sistemas
apropriados, com membranas de nylon ou de acetato de celulose. Os solventes orgânicos são filtrados com
membranas de Teflon hidrofóbico ou de celulose. Para evitar que materiais particulados entrem no sistema,
são usadas membranas para filtração. Os diâmetros dos poros das membranas mais utilizadas são de 0,22 ou 
. Confira na imagem o sistema para filtração de FM e o filtro que deve ser colocado.
Sistema para filtração de FM. O filtro específico deve ser colocado na parte superior
do funil antes da montagem do sistema.
A fase móvel é impulsionada pela ação de uma bomba cromatográfica, que impulsiona o líquido através de um
fluxo constante. Dentro da garrafa de solvente existe um filtro na entrada da linha de condução. Esses filtros
podem ser de aço inox 316 e de polietileno de alta densidade. Eles devem ser lavados sempre que houver
troca de solventes ou de soluções em uma mesma garrafa de fase móvel ou quando for possível perceber a
formação de bolhas a partir desse filtro. Na CLAE, um tópico que merece atenção é a fase móvel.
Você sabia que o sucesso ou o fracasso da sua análise pode estar diretamente relacionado ao modo
com que você prepara a fase móvel? 
A qualidade da fase móvel, a preparação, o uso e a conservação são de fundamental importância para o
sucesso da análise. A presença de partículas, microrganismos (fungos) ou gases dissolvidos interferem direta
ou indiretamente na limpeza e permeabilidade dos filtros do sistema, na vida útil das colunas principais e das
colunas de guarda e na resposta e no desempenho dos detectores. 
Atenção
É preciso ter bastante cuidado ao realizar o preparo de fases móveis compostas pelas misturas metanol
e água ou acetonitrila e água. A mistura metanol/água é exotérmica e, portanto, ocorrerá o aquecimento
da solução, com contração do volume total da mistura e formação de bolhas. Essa mistura deve passar
por desgaseificação e só deve ser colocada no equipamento quando atingir a temperatura ambiente. Se
formos preparar uma fase móvel contendo acetonitrila e água, ocorrerá a expansão do volume total e
resfriamento da solução, por tratar-se de uma mistura endotérmica. Nesse caso, também é
indispensável a retirada das bolhas e o uso da solução apenas é permitido após atingir a temperatura
ambiente. 
Uma importante prática que deve ser adotada em relação aos reservatórios de solvente do CLAE é a
rotulagem. A etiqueta dos frascos deve conter informações detalhadas sobre a composição da FM, o valor de
pH (quando aplicável), a data de preparação, o prazo de validade e o nome do responsável pelo preparo.
Componente: bomba
Confira, neste vídeo, a importância da bomba para o sistema cromatográfico.
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Você sabia que o preço do equipamento é muito influenciado pelo tipo de bomba?
Pois bem, a bomba é o componente do equipamento responsável por impulsionar a fase móvel para o sistema.
Ela deve ter precisão e exatidão que garantam a confiabilidade do fluxo cromatográfico, normalmente no
intervalo de a , sendo usual . As bombas para CLAE utilizam tubulações
de aço inox, poli(éter-éter-cetona) (em inglês polyether ether ketone, PEEK) ou titânio para suportar as altas
pressões do sistema. 
As bombas podem ser dos tipos seringa ou recíproca, de pistão simples ou de pistão duplo, confira!
Bombas tipo seringa
São bombas com ausência de pulso e deslocamento
contínuo do fluxo, com capacidade de até 500
mL. Elas são pouco utilizadas, pois a bomba deve ser desligada para acréscimo ou troca de solvente
para a fase móvel, e o retorno para as condições iniciais de fluxo é lento. Além disso, não permite
gradiente.
Bombas recíprocas
São as bombas mais utilizadas em CLAE, também conhecidas como bombas de pistão reciprocante.
O pistão, movido por um motor, é responsável pelo movimento de aspirar a fase móvel da garrafa de
solvente para sua câmara e empurrar o conteúdo dessa câmara em direção à coluna. Esse movimento
cíclico gera fluxo pulsante, que é eliminado pelo sistema de amortecimento de pulso ou dois pistões
sincronizados para aspirar e empurrar o fluxo, minimizando o pulso proveniente desse movimento.
O espaço entre a parede da câmara e o pistão é vedado pelo selo do pistão. Na entrada e na saída da
câmara, há duas esferas, que estão contidas nas válvulas de retenção (check valves). Cada pistão
possui duas check valves que permitem a passagem do fluxo em um só sentido, direcionando a
entrada ou a saída da FM da câmara. Normalmente, os pistões e as check valves são de safira, inertes
à fase móvel utilizada.
Para entender melhor o sistema de bomba recíproca, observe as imagens a seguir.
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abaixo.
 Sistema contendo amortecimento de pulso.
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Sistema com dois pistões sincronizados.
Bombeamento isocrático ou por gradiente
As bombas podem operar no modo isocrático ou gradiente. O modo de operação está relacionado à mudança
na composição da fase móvel ou do fluxo durante a corrida cromatográfica. No modo isocrático, não existe
mudança durante a corrida cromatográfica. No modo gradiente, ocorre variação da composição da fase móvel
ao longo da corrida.
Atenção
Geralmente, o modo gradiente é utilizado na busca de separação de diversas substâncias em uma
mistura complexa. Nesse caso, como ocorre variação da polaridade da FM ao longo do tempo, a
possibilidade de obtenção de resolução adequada para uma abordagem qualitativa e quantitativa
aumenta também. É importante ressaltar que, após a corrida, a condição inicial da análise é
reestabelecida, e é necessário um tempo para estabilização entre uma corrida e outra. 
O modo isocrático é mais vantajoso para análises de rotina, por não ser necessário condicionar a coluna entre
as injeções das diversas amostras. Entretanto, em 90% dos casos envolvendo misturas complexas a
separação das substâncias não ocorre com resolução adequada, não sendo possível sua utilização.
A imagem a seguir mostra a aplicação de um gradiente para efetuar a adequada separação de uma mistura
contendo cinco componentes. Antes de avançarmos, observe os três cromatogramas a seguir!
Cromatograma A - Simulação de cromatogramas da mesma amostra em modo
isocrático e gradiente.
Cromatograma B - Simulação de cromatogramas da mesma amostra em modo
isocrático e gradiente.
Cromatograma C - Simulação de cromatogramas da mesma amostra em modo
isocrático e gradiente.
No cromatograma (a), a separação foi feita no modo isocrático com a fase móvel composta por 70% de 
solvente forte B, e é possível observar que há coeluição e tempos de retenção baixos nos quatro primeiros
picos. Para aprimorar a resolução e prolongar os tempos de retenção, pode ser necessário reduzir a
concentração do solvente mais forte na fase móvel.
Solvente forte
O termo solvente forte refere-se ao solvente com maior força de eluição.
No cromatograma (b), então, foi utilizado modo isocrático com 30% de B, e é possível observar que a
resolução entre os primeiros picos melhorou. Entretanto, o pico 5 apresentou um tempo de retenção elevado,
prejudicando o formato do pico e aumentando significativamente o tempo de análise. Esse acréscimo no
tempo de retenção resultou em um sinal de base mais alargado, com perda de simetria e sensibilidade.
Nesse contexto, uma alternativa apropriada para alcançar a separação eficaz de todos os componentes da
mistura no menor tempo de análise possível seria manter a proporção de 30% de B até antes da eluição do
quarto componente, e gradualmente, variar a proporção de B até atingir 70% de B, condição na qual o último
pico é eluído mais rapidamente da coluna (c). Nesse caso, a amostra foi eluída com FM contendo 30% de B
por 8 minutos e, em seguida, houve um aumento na concentração de 10% de B por minuto na FM até que a
concentração de 70% fosse obtida e mantida por 3 minutos para obtenção de um cromatograma com boa
resolução e baixo tempo de retenção.
Você imagina o que uma simples bolha de ar pode causar ao CLAE?
Em CLAE, uma bolha de ar ou um contaminante do solvente podem gerar picos inesperados no
cromatograma, denominados picos espúrios. Gradientes de baixa pressão favorecem a formação de bolhas de
ar durante a mistura de solventes da FM, principalmente em misturas exotérmicas, como a mistura água-
metanol. A formação das bolhas causa aumento de ruído e perdas de sensibilidade e de repetitividade, além
de poderem ser responsáveis pela formação de caminhos preferenciais na fase estacionária.
Gradientes de baixa pressão
O emprego de uma única bomba restringe a aplicação do gradiente de baixa pressão, no qual a
combinação de um ou mais solventes provenientes dos recipientes das garrafas de fase móvel é
realizada no compartimento de mistura (misturador ou mixer) localizado antes da bomba.
Componentes: injetor, forno, detector e coletor de fração
Injetor
Os sistemas de injeção, manual ou automático, têm como objetivo a introdução da amostra na coluna. Quanto
mais larga for a banda inicial de amostra, quando introduzida na coluna, mais largo será o pico dos compostos
separados no final da coluna, prejudicando a eficiência da separação cromatográfica.
Para proceder com a injeção manual, utilizam-se válvulas de injeção, conhecidas como válvulas de seis vias.
Esses injetores possuem volume de injeção fixados pelo volume da alça de amostragem (loop) utilizada, que
pode ser instalada e removida com facilidade e rapidez, de modo que o volume de amostra introduzida na
coluna possa ser trocado de uma análise para outra. O loop usualmente é feito de um tubo de aço inoxidável,
mas com diâmetro interno um pouco maior dos empregados nas conexões do equipamento. A alça de
amostragem tem volume conhecido e é conectada externamente à válvula de injeção. Em escala analítica,
esses volumes variam normalmente de 5 a 50 µL. 
São utilizadas seringas de injeção com agulhas obrigatoriamente de ponta reta para evitar danos ao selo do
injetor (rotor seal). As seringas devem ter o volume maior que o volume do loop utilizado na análise, para que,
no momento da injeção, se garanta que todo o loop será rinçado e preenchido com o material a ser injetado.
Confira esses dispositivos nas imagens!
Válvula de injeção .
Alguns modelos de loop (volumes diferentes).
Válvula de seis vias abertas e rotor seal.
No momento da mudança da posição do braço da válvula para injeção (inject), ocorre a injeção de fato, com o
deslocamento do fluxo da fase móvel em direção à alça e o direcionamento de seu conteúdo para a coluna.
Atenção
O ato de mover o braço da válvula da posição load para a posição inject deve ser realizado com a agulha
da seringa inserida na válvula e em um movimento contínuo. O giro da válvula deflagra o início da
contagem de tempo da análise e a aquisição dos sinais vindos do detector para a composição do
cromatograma. 
Confira nas imagens a seguir a seringa de CLAE, com ponta reta e a seringa na válcula de injeção manual!
Seringa de CLAE, com ponta reta.
Seringa na válvula de injeção manual.
Os injetores automáticos dos sistemas de CLAE são módulos confeccionados para armazenar uma ou mais
bandejas com capacidade de cerca de 100 amostras condicionadas em vials (frascos de injeção), com
capacidade de 2 mL. Confira nas imagens!
Módulo de um injetor automático.
Diferentes modelos de
vials de 2 mL.
Forno
É um módulo que não é essencial ao funcionamento do CLAE. Sua função é armazenar a coluna de modo a
manter a temperatura dela estável, o que reflete no aumento da repetitividade das análises. Confira o módulo
do forno fechado e aberto com as colunas!
Módulo do forno fechado.
Módulo do forno aberto.
A completa solubilização da amostra na fase móvel é um importante fator em CLAE. Geralmente, os fornos
cromatográficos variam desde a temperatura ambiente até aproximadamente 60ºC. O aumento de
temperatura diminui a viscosidade da fase móvel, diminuindo ligeiramente a pressão do sistema e o tempo de
retenção dos picos cromatográficos, podendo alterar a seletividade da análise. 
Detectores
São responsáveis pela análise qualitativa e quantitativa da amostra e devem ser compatíveis com as
características físico-químicas do analito. Os detectores em CLAE são classificados em dois tipos:
Detectores seletivos
São utilizados de acordo com as características
da amostra.
Detectores universais
Não dependem da natureza da amostra.
Para uma melhor compreensão, podemos definir os detectores universais como aqueles que respondem a
qualquer composto da amostra que não seja a fase móvel, como o índice de refração, ou o espectrômetro de
massas, no modo varredura linear ou SCAN.
Em relação aos detectores seletivos, devemos considerar aqueles que respondem a um grupo de
componentes presentes no efluente da coluna, como o de absorbância no UV-VIS ou o espectrômetro de
massas no modo monitoramento de íons selecionados ou monitoramento de reações múltiplas.
Coletor de fração
Permitem o direcionamento do fluxo de saída do detector para tubos de armazenamento. Essa coleta é feita
em intervalos de tempo estipulados pelo analista. Confira!
Exemplo de coletor de fração.
Componentes: injetor, forno, detector e coletor de fração
Acompanhe, neste vídeo, as etapas importantes na análise cromatográfica. Vale conferir!
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Sistemas de detecção: detectores seletivos e universais
Conheça, neste vídeo, os fatores que influenciam a detecção de substâncias separadas por cromatografia.
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Detectores mais utilizados
São os responsáveis pela identificação e quantificação de um ou mais analitos em misturas complexas.
Espera-se que os sistemas de detecção apresentem sensibilidade, seletividade, exatidão, precisão, faixa
linear e custo.
Os principais detectores utilizados em CLAE são: 
Absorbância no UV-VIS
Índice de refração
Fluorescência
Espalhamento de luz por evaporação
Infravermelho
Eletroquímica
Espectrometria de massas
Ressonância magnética nuclear
Abordaremos em detalhes os detectores de absorbância no UV-VIS e o índice de refração. 
Detector seletivo: absorbância no UV-VIS
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Trata-se de um espectrofotômetro UV-VIS, com uma célula de fluxo, acoplado ao cromatógrafo. O analito na
célula de detecção fica exposto à radiação eletromagnética em comprimentos de onda pré-determinados.
Caso seja utilizado detector de comprimento de onda fixo, deve-se optar pelo uso do comprimento de onda
de máxima absorção por parte do analito, para se trabalhar com a maior sensibilidade possível, fundamental
na análise quantitativa.
Dessa forma, este tipo de detector é seletivo para moléculas contendo grupamentos cromóforos. Um
cromóforo é definido como um sistema que contém os elétrons responsáveis pela absorção da radiação. As
substâncias que apresentam absorção adequada no UV são todas as que possuem uma ou mais ligações
duplas (elétrons π), assim como as que possuem elétrons não compartilhados ou não ligados, como as
olefinas, os compostos aromáticos e os compostos contendo grupos como =C=O; =C=S; -N=O; -N=N- e
outros. A absortividade aumenta com o aumento da insaturação e com a conjugação.
As três regiões mais importantes do espectro eletromagnético para uso na análise de compostos orgânicos
são as seguintes:
IR
Infravermelho.
UV
Ultravioleta.
VIS
Visível.
O uso do infravermelho para detecção em CL tem sido bastante limitado porque a maioria dos solventes
empregados como fase móvel apresentam várias bandas de absorção nessa região, interferindo na análise. A
flexibilidade da escolha do solvente na região ultravioleta (UV) e visível (VIS) é muito maior, tornando a região
de maior interesse em CL. 
A tabela a seguir contém uma relação dos solventes mais empregados como fase móvel em CL e o
comprimento de onda máximo que deve ser empregado (comprimento de onda de corte). A partir desse valor,
o solvente apresenta absorção nessa região do espectro, o que pode comprometer a análise. Confira!
Solvente Comprimento de onda (nm)
Água 190
Acetonitrila 200
Acetona 330
Benzeno 278
Tetracloreto de carbono 263
Clorofórmio 245
Ciclohexano 200
Ciclopentano 200
Acetato de etila 256
Hexano 200
Metanol 205
Solvente Comprimento de onda (nm)
Pentano 200
Tetraidrofurano 212
Tolueno 284
Tabela: Comprimentos de onda de corte para solventes utilizados em CLAE. 
Monica Padilha
Os espectrofotômetros de comprimento de onda variável utilizam lâmpadas de emissão contínua, com
monocromadores que determinam o comprimento de onda incidente na amostra. Assim, podemos utilizar o
comprimento de onda mais adequado para a análise. 
As lâmpadas mais comuns são as de deutério, que emitem, na região do ultravioleta, de 190 a 380 nm e de
tungstênio, que emitem, na região do visível, de 380 a 780nm. Alguns desses sistemas de detecção permitem
a coleta de dados em até quatro canais, ou seja, permitem a aquisição de dados para a geração de até quatro
cromatogramas da análise em comprimentos de onda diferentes. A imagem a seguir mostra o perfil
cromatográfico de uma amostra que teve o adoçante sacarina identificado pelo detector UV-Vis.
Perfil cromatográfico de uma amostra de refrigerante diet de limão, com ênfase na
identificação espectral detalhada do adoçante sacarina no espectro.
Os detectores com arranjo de diodos (DAD, em inglês, diode array detector) são espectrofotômetros que
fornecem a curva espectral de cada ponto do cromatograma, dentro da faixa de emissão da lâmpada, além
dos cromatogramas obtidos em todo o intervalo selecionado pelo analista.
Detectores universais
Detector de índice de refração
Trata-se de um detector universal. O índice de refração é uma característica física definida de determinado
composto, e a escolha do eluente com índice de refração diferente dos compostos a serem analisados faz
com que qualquer composto possa ser avaliado com esse detector.
Lembre-se que refração é a mudança na direção de uma onda de um feixe luminoso ao atravessar a
fronteira entre dois meios com diferentes índices de refração. 
O detector de índice de refração é composto por uma célula de vidro dividida em duas câmaras, de amostra e
de referência. O fluxo de fase móvel que sai da coluna de CLAE passa através da câmara de amostra,
enquanto a câmara de referência é preenchida apenas com fase móvel. Quando o eluente que passa pela
célula de amostra não contiver o analito, o conteúdo das duas câmaras é o mesmo. Nessa situação, quando
um feixe de luz incide sobre as câmaras, o feixe observado não sofre desvio.
Quando o eluente contiver quaisquer componentes diferentes dos da fase móvel, ocorrerá um desvio do feixe
devido à diferença nos índices de refração nos dois líquidos e o sinal do fotodiodo duplo será desbalanceado.
A partir da medida dessa diferença entre os dois detectores, identifica-se a presença dos componentes de
uma amostra. Como a detecção é obtida pela comparação entre as câmaras de amostra e referência, só é
possível utilizar esse detector no modo isocrático. Confira as imagens!
Exemplo de detector de IR.
Esquema da célula de detecção.
Por ser um detector universal, a grande vantagem do detector de índice de refração reside no fato de que
responde a todos os solutos. No entanto, essa característica é contrabalançada por ele ser
pouco sensível,
além da necessidade de reequilibrar o detector cada vez que se produz uma pequena mudança na
composição da fase móvel. Essa é uma grande limitação desse detector, uma vez que impossibilita seu uso
com gradiente de eluição, onde a composição da fase móvel muda durante a análise para efetuar a separação.
Espectrometria de massas: modos de aquisição
Atualmente, o mais importante e versátil detector para a análise de traços (concentrações na faixa de 
 e ) de compostos orgânicos em misturas complexas é o espectrômetro de massas (EM). O
acoplamento da CL com o espectrômetro de massas com fonte de ionização do tipo electrospray (ESI)
possibilita a análise de uma série de compostos que até então estavam sendo negligenciados por falta de
capacidade analítica. Trata-se de compostos polares e com mais que de massa molecular.
O dalton (símbolo: Da) é uma unidade de medida de massa utilizada em bioquímica e física molecular
para expressar massas atômicas e moleculares em uma escala mais conveniente. O dalton é equivalente
a 1/12 da massa de um átomo de carbono-12, que é usado como padrão.
É um detector universal que fornece a massa molar dos analitos e permite a elucidação estrutural das
substâncias. É um detector destrutivo, não sendo permitido coletar os analitos após a detecção. O
espectrômetro de massas também pode ser usado como um detector seletivo e específico, fixando-se o
monitoramento de um íon molecular ou de fragmentos específicos do analito.
A imagem a seguir apresenta um sistema de CLAE acoplado a um detector de massas em série. Observe!
Cromatógrafo líquido acoplado a espectrômetro de massas.
Na CLAE/EM, ocorre a ionização dentro da fonte de íons, que, após serem gerados, são direcionados ao
analisador de massas. Na sequência, confira as próximas etapas do processo.
1
Etapa 1
Uma vez no analisador de massas, os íons são separados com auxílio de diferentes campos
(elétricos, magnéticos ou uma combinação de ambos), de acordo com a relação entre a massa da
espécie e sua respectiva carga elétrica (relação massa/carga ou ).
2
Etapa 2
Do analisador de massas, os íons são direcionados para um detector, geralmente um multiplicador
de elétrons, o qual gera uma corrente elétrica que será analisada por um software.
3
Etapa 3 
O software produzirá em seguida um gráfico da razão contra a abundância do fragmento,
gerando o que conhecemos como espectro de massas.
Se a análise for em série, como ocorre no triplo quadrupolo, é incluída uma nova etapa de fragmentação do íon
precursor e separação dos íons produtos, antes da chegada do íon precursor ao multiplicador de elétrons.
Nessa configuração, o espectrômetro de massas funciona como um detector específico, monitorando apenas
as transições formadas a partir da fragmentação do íon precursor, gerando íons produtos, o que se denomina 
monitoramento de reações múltiplas (MRM).
A ESI ocorre à pressão ambiente, e é extremamente suave, gerando íons intactos, denominados 
íons pseudomoleculares ( ou ). Há também a possibilidade de formação de adutos,
associações entre os íons moleculares e espécies iônicas, como , e 
, provenientes de modificadores adicionados à fase móvel.
Verificando o aprendizado
Questão 1
A cromatografia líquida é uma técnica analítica amplamente utilizada para separar, identificar e quantificar
componentes presentes em uma mistura líquida. Essa técnica é especialmente valiosa em química analítica,
bioquímica, farmacologia e em muitos outros campos. Com relação à cromatografia líquida, assinale a opção
correta.
A
O poder de resolução da técnica cromatográfica aumenta quanto menor as partículas da fase estacionária e
maior a pressão no sistema.
B
A cromatografia líquida de alta eficiência tem maior poder de resolução que a cromatografia líquida de
ultraeficiência.
C
O controle da temperatura do forno, é fundamental nas separações com o uso dessa técnica.
D
A cromatografia líquida de ultraeficiência apresenta baixa resolução.
E
A cromatografia líquida de alta eficiência apresenta separações rápidas e com baixo poder de resolução.
A alternativa A está correta.
Na cromatografia líquida, o poder de resolução é influenciado positivamente pela diminuição do tamanho
das partículas da fase estacionária e pelo aumento da pressão no sistema. Partículas menores
proporcionam maior área superficial para interação, enquanto a pressão elevada favorece uma separação
mais eficiente e rápida dos analitos.
Questão 2
Um ponto importante para garantir o sucesso da análise por cromatografia líquida é o preparo da fase móvel.
Para garantir que ela esteja adequada para uso, é correto afirmar que
A
a fase móvel pode ser preparada com solvente grau analítico quando se utiliza cromatografia no modo normal.
B
a fase móvel deve ser filtrada, deve estar livre de bolhas ou partículas em suspensão e deve ser preparada
com solvente de pureza adequada.
C
a fase móvel não precisa ser filtrada se for preparada com água ultrapura.
D
a fase móvel pode apresentar bolhas se for utilizado o modo gel exclusão.
E
a fase móvel pode conter partículas em suspensão, pois o filtro inserido dentro do recipiente de solvente não
deixa que essas partículas entupam a coluna.
A alternativa B está correta.
A fase móvel, independentemente do modo cromatográfico que esteja sendo utilizado, deve ser sempre
filtrada, não pode conter qualquer tipo de partícula em suspensão e deve ser preparada com solvente grau
HPLC ou de pureza superior. A adoção de práticas diferentes dessas, podem comprometer o bom
funcionamento do equipamento, além de danificá-lo.
2. Seleção de colunas e métodos de detecção
Fase estacionária
Acompanhe, neste vídeo, a composição da fase estacionária e as suas principais características.
Conteúdo interativo
Acesse a versão digital para assistir ao vídeo.
É constante o investimento em tecnologia voltada ao desenvolvimento de colunas para CLAE e CLUE com
maior poder de separação e menor tempo de análise. O material mais utilizado no desenvolvimento de novas
partículas de FE é a sílica, devido principalmente à estabilidade química e térmica, à alta pureza e à
porosidade.
Podemos descrever a sílica gel como um polímero inorgânico, em que átomos de silício são conectados entre
si por átomos de oxigênio, formando grupos siloxanos (O-Si-O) em seu interior, em um arranjo tetraédrico. Na
superfície da sílica, há diversos grupos silanóis (Si-OH) distribuídos aleatoriamente, formando os silanóis
livres, silanóis vicinais e silanóis geminais, podendo apresentar ligações de hidrogênio nas extremidades.
Confira a estrutura química da sílica na imagem!
Estrutura química da sílica.
Os fabricantes de colunas de CLAE/CLUE modificam a superfície da sílica em reações com ligações
covalentes entre o silanol residual e diversos reagentes, gerando as fases estacionárias química ligadas.
Nesse tipo de fase, a sílica é o suporte sólido, tendo sua superfície quimicamente modificada, o que garante a
esse material potencial para ser utilizado em diversos modos cromatográficos. 
A organossilanização deve ocorrer em condições anidras, ou seja, a reação covalente dos grupos silanóis com
um agente silanizante, gerando uma superfície modificada quimicamente, apta para ser usada como fase
estacionária.
Dica
Colunas que possuem suporte de sílica, ou que têm a própria sílica como fase estacionária, devem ser
utilizadas com pH da fase móvel situado entre 2 e 8. A sílica é um ácido fraco, com pKa próximo a 9.
Logo acima de pH 8, a sílica torna-se solúvel e, abaixo de pH 2, a ligação entre a superfície modificada e
o suporte de sílica é quebrada pela hidrólise da ligação siloxano. 
É importante destacar as características da sílica que mais afetam sua utilização como fase estacionária,
confira!
 
Formato.
Tamanho da partícula.
Diâmetro do poro.
Área superficial.
Acidez.
Presença de metais.
Percentual de grupos silanóis na superfície.
Resistência mecânica.
Estabilidade.
Em relação ao formato da partícula, é importante ressaltar
que as partículas de sílica esféricas apresentam
resultados mais eficientes do que as partículas irregulares devido à melhor compactação da fase estacionária,
diminuindo a irregularidade nos caminhos gerados entre as partículas no processo de empacotamento da
coluna e aumentando a superfície de contato com o analito.
As sílicas do tipo microsphere totalmente porosas estão disponíveis em vários diâmetros de partícula e de
poro. Possuem diâmetro de partícula de 3 a 10 µm e diâmetros de poros entre 7 e 12 nm (narrow pore) e de 15
a 100nm (wide pore).
As sílicas micropeliculares possuem um núcleo sólido revestido com uma camada de fase estacionária. Poros
com maior diâmetro, de 400 a 800 nm, são encontrados em partículas de perfusão, muito utilizadas para
análise de proteínas. Confira!
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Sílica micropelicular.
A diminuição do diâmetro da partícula de sílica aumenta a superfície de contato, a pressão necessária para
fluir a FM e a eficiência das separações cromatográficas. Os diâmetros de partícula de sílica de 3 a 5 µm são
normalmente utilizados para colunas com 10 a 15 cm de comprimento. Os diâmetros de 7 a 10 µm são para
colunas de 25 a 60 cm de comprimento.
O percentual de grupamentos silanóis livres, assim como a presença de metais, aumenta a acidez da sílica. Os
centros ácidos da sílica, os silanóis, são responsáveis pela reatividade do material. As sílicas ácidas são
classificadas como sílicas tipo A, enquanto as básicas são as sílicas tipo B. Quanto menor a presença de
metais, mais pura a sílica e mais cara a coluna confeccionada a partir dessa sílica de alta pureza.
Comentário
As sílicas possuem características que contribuem para o aumento da estabilidade química e térmica e
para redução no tempo das análises. As sílicas de alta pureza e híbridas contribuem para o aumento
dessa estabilidade e para a redução de acidez. Com a necessidade de manter as características da sílica
e proporcionar análises mais rápidas, foram desenvolvidas as sílicas denominadas superficialmente
porosas e monolíticas. 
A sílica de alta pureza (tipo B) possui teor reduzido de metais (Zn, Al, Ni, Fe, Na, K, Mg, Ca, La, Ti, Zr, Cu e Cr)
em torno de 0,1 a 0,3%. Conforme dito, a proximidade de impurezas metálicas intensifica a acidez dos
grupamentos silanóis. A contaminação com metais também pode levar a interações indesejadas com solutos
devido à formação de quelatos, interações essas diferentes da prevista a partir do grupo funcional introduzido
na reação de organossilanização. A presença de metais gera outros mecanismos de retenção, promovendo a
formação de cauda ou a perda de simetria do pico cromatográfico, principalmente para os analitos básicos. As
colunas com sílica do tipo B, por terem teor reduzido de metais, são ideais para a separação de substâncias
básicas.
A acidez é acentuada pela presença de grupamentos silanóis livres (sílica tipo A), aumentando a retenção e a
cauda de solutos básicos. Idealmente, os silanóis livres devem ser capeados ou com radicais silila ou por
impedimento estérico, por capeamento com o radical isobutila, ou pelo capeamento promovido pelo uso de
trietilamina na FM (especificamente quando estamos trabalhando com a cromatografia de fase reversa que
será vista mais adiante).
As sílicas híbridas são geradas pela mistura de monômeros puros, formando partículas com grupos
organossilanos incorporados na sua estrutura e superfície, resultando em partículas de sílica com ligações
silício-hidrogênio (Si-H), silício-metil (Si-CH3) e com pontes de etano (Si-CH3-CH3-Si). 
Confira, a seguir, a estrutura química das sílicas híbridas.
Estrutura química das sílicas híbridas.
Colunas confeccionadas com sílica híbrida possuem maior resistência mecânica, alta eficiência e maior
estabilidade química, suportando valores de pH na faixa de 1 a 12 e gerando sinais simétricos para compostos
básicos. Essa tecnologia foi direcionada para a confecção de partículas com 1,7 µm de diâmetro, usadas
especialmente em cromatografia líquida de ultraeficiência (CLUE). Devido à diminuição do diâmetro das
partículas, a CLUE trabalha com bombas cromatográficas que suportam altas pressões (até 15.000 psi). 
Óxidos metálicos
Alumina, titânia e zircônia são os óxidos metálicos mais utilizados como fase estacionária quimicamente
ligadas para colunas. Dependendo do valor de pH da FM, eles se comportam como trocadores iônicos
anfóteros, catiônicos ou aniônicos. O uso como suporte é comprometido com a dificuldade de modificação
química ou organofuncionalização da superfície. Vejamos um pouco sobre cada um desses óxidos metálicos!
1
Alumina
Foi o primeiro óxido metálico utilizado como FE. Apesar da estabilidade química superior à sílica,
suportando FMs com uma faixa de pH de 1 a 12, a alumina possui desempenho cromatográfico
inferior.
2
Titânia
Foi o material menos explorado e, apesar do desempenho semelhante à zircônia, há pouca
informação sobre o seu uso como FE.
3
Zircônia
Apresenta alta estabilidade química e térmica, suporta valores de pH na FM entre 1 e 14 e
temperaturas de até 200ºC.
Obs.: Alumina, titânia e zircônia estão disponíveis com pouca variedade em colunas comerciais. 
Fases estacionárias com polímeros imobilizados
As colunas com polímeros imobilizados como FEs podem ser utilizadas com valores de pH de fase móvel
extremos, variando de 1 a 13 unidades. Dessa forma, podem ser utilizadas na separação de ácidos e bases
fortes que não possam ser levados à forma neutra no intervalo de trabalho das colunas de sílica, que são
restritas a valores de pH entre 2 e 8.
São colunas de poliestireno com alta porosidade produzidas com diversos diâmetros de poro, atendendo a
separações de moléculas de diversos tamanhos. Dependendo do tamanho do poro, podem ser utilizadas para
análises de macromoléculas.
Normalmente, são utilizados em modos cromatográficos com a fase móvel contendo água (polar). A fase de
poliestireno cruzado com divinilbenzeno apresenta alta resistência mecânica e boa repetitividade. 
Coluna: o coração do sistema cromatográfico
Confira, neste vídeo, uma coluna cromatográfica e os cuidados que ela necessita. Entenda como é feita a
escolha da coluna a ser utilizada e as principais diferenças entre colunas preparativas e semipreparativas. 
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Na cromatografia líquida, a coluna é considerada o coração do sistema cromatográfico, uma vez que é nela
que a separação ocorre efetivamente. Geralmente, o material do tubo externo que compõe a coluna é o aço
inoxidável polido. Existem colunas feitas com tubos poliméricos de PEEK ou de titânio. Após preparo dos
tubos, os tubos são lavados para eliminação de gorduras e secos para receberem a fase estacionária
apropriada.
Atenção
O cuidado com o preparo do tubo e o uso de fases estacionárias de alta qualidade com partículas
uniformes de pequeno tamanho permitem o empacotamento e a produção de colunas de elevada
eficiência. Os materiais utilizados são resistentes a altas pressões e inertes à fase móvel. 
A FE é mantida dentro da coluna entre dois filtros internos (frits) postos nas extremidades do tubo. Os frits são
feitos de aço inoxidável sinterizado, com poros de para fases estacionárias de diâmetro de e de 
 para partículas menores. O tipo de material de recheio e as dimensões das colunas são bastante
variáveis. As características do material de preenchimento das colunas estão relacionadas ao modo
cromatográfico.
Idealmente, devemos utilizar as colunas de guarda logo após o injetor, com o objetivo de proteger a coluna
principal de um possível entupimento, proveniente de micropartículas e contaminantes dos solventes ou
amostras mal filtrados ou não filtrados. O uso da coluna de guarda aumenta o tempo de vida útil da coluna
principal. As colunas de guarda possuem o mesmo tipo de fase estacionária da coluna principal, com
comprimento (inferior) e diâmetro interno variando de acordo com a coluna principal a ser protegida. Confira a
imagem!
Coluna
de guarda à esquerda e coluna principal à direita (elipse maior).
As colunas analíticas devem gerar cromatogramas repetitivos, eficiência de separação e poder de resolução
adequado, apresentando sinais simétricos, com formato gaussiano. Para isso, a fase estacionária deve ser
homogeneamente compactada, evitando a formação de caminhos preferenciais.
Atenção
Deve-se ter bastante cuidado ao manipular as colunas. Quedas, pancadas ou qualquer tipo de choque
físico precisam ser evitados. Não devemos expor as colunas a elevações ou quedas bruscas de
temperatura. O fluxo da fase móvel também não deve ser aumentado de maneira brusca, assim como, ao
final de uma análise, o fluxo deve ser reduzido vagarosamente. 
As colunas semipreparativas possuem comprimento de até , com diâmetro interno de 4,6 a e
diâmetro de partícula de . São utilizadas para isolamento/coleta de pequenas frações do material
eluído, com injeção de amostras na ordem de mg.
As colunas preparativas possuem comprimento de até 300 mm e diâmetro interno de até 50mm. São
utilizadas para isolamento de compostos em maior escala do que os obtidos por colunas semipreparativas. O
objetivo é isolar o analito para posterior identificação e quantificação.
Modos cromatográficos: fases reversa e normal
Os modos cromatográficos são classificados de acordo com a natureza das interações do soluto com a FM e a
FE. Quando a fase estacionária é um sólido, a cromatografia é denominada de cromatografia líquido-sólido
(CLS). Quando é utilizado um líquido como FE, a cromatografia realizada é denominada de cromatografia
líquido-líquido (CLL). 
Independentemente da característica física da fase estacionária (líquida ou sólida), os modos cromatográficos
podem ser classificados em cromatografia de fase reversa, de fase normal, de interação hidrofílica, de troca
iônica, de exclusão, de imunoafinidade e quiral, dentre outros. 
Cromatografia de fase reversa
É o modo cromatográfico mais utilizado em CLAE e CLUE. A FM é geralmente composta por uma mistura de
fase aquosa e solvente(s) orgânico(s). A força de eluição dos solventes mais utilizados em CFR é: água
trocadoras de ânions 
Apresentam em suas estruturas grupos
iônicos positivos, imobilizados sobre a
superfície da fase.
Colunas trocadoras de cátions 
Apresentam em suas estruturas grupos
iônicos negativos, imobilizados sobre a
superfície da fase estacionária.
É utilizada na purificação de substâncias de tamanhos diferentes. A separação é função do diâmetro dos
poros da fase estacionária, promovendo uma seleção por tamanho de acordo com a entrada ou não do analito
nos poros da FE. As moléculas maiores são excluídas dos poros da fase estacionária, pois elas eluem mais
rapidamente.
Em seguida, eluem as moléculas de tamanho intermediário, que são parcialmente excluídas e, finalmente, as
menores, que entram no poro, ficando mais tempo retidas e, com isso, apresentam maior tempo de retenção. 
A seguir, podemos ver nas imagens (a) e (b) a ilustração dos poros da fase estacionária excluindo moléculas
de maior tamanho. Na imagem (c), vemos a separação de proteínas baseada em seus tamanhos, com aquelas
de maior tamanho tendo menor tempo de retenção.
Imagem A - FE com poros e substâncias de diferentes tamanhos.
Imagem B - Poros da fase estacionária excluindo moléculas de maior tamanho.
Imagem C - Separação de proteínas baseada em seus tamanhos.
A CE também é utilizada para estimar a massa molecular de proteínas, de acordo com a ordem de eluição. Ela
pode ser classificada como filtração em gel ou permeação em gel, quando a FM é aquosa ou orgânica,
respectivamente. O analito deve ser solúvel na fase móvel, que deve possuir a menor viscosidade possível. A
própria sílica gel ou diversos tipos de polímeros é utilizada como fase estacionária. Já as interações entre
analito e FE são indesejáveis. E a função da FE na CE é somente disponibilizar os poros para a separação por
exclusão por tamanho.
Ao entrar em contato com a FM, a FE incha, formando um gel. Em seguida, a FE preserva suas ligações
cruzadas, que geram os poros disponíveis para a separação e que são preenchidos pela própria FM. Os géis
devem ter inércia química, baixo teor de íons e alta estabilidade química, térmica e mecânica, sendo capazes
de suportar pequenas variações de pH na FM, pequenas variações de temperatura e não sofrer deformações
com a passagem do fluxo de FM.
Comentário
O gel de dextrano (nome comercial Sephadex) é muito utilizado como fase estacionária. O dextrano é um
polissacarídeo de unidades de glicose, quimicamente estável e disponível com variados graus de
ligações cruzadas. Além do dextrano, também são utilizados como FEs, géis de poliacrilamida, ágar e
agarose, entre outros. 
Modos cromatográficos: interação hidrofílica e quiral
Confira, neste vídeo, as principais características e diferenças entre a cromatografia líquida de interação
hidrofílica e quiral.
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Cromatografia de interação hidrofílica
O conceito HILIC foi inicialmente introduzido por Apert, em 1990, como uma abreviação para hydrophilic
interaction liquid chromatography (cromatografia líquida por interação hidrofílica), referindo-se a uma
categoria de fase estacionária empregada na separação de solutos polares, que é o mais recente e promissor
modo de cromatografia líquida desenvolvido. 
Esse tipo de fase tem origem em algumas dificuldades encontradas na separação de amostras polares em
cromatografia de fase reversa (CFR) e em cromatografia de fase normal (CFN). Na CFR, os analitos muito
hidrofílicos eluem rapidamente, e a pouca afinidade pelas fases estacionárias mais comuns em CFR pode levar
à coeluição com substâncias não retidas, impedindo a análise cromatográfica. Na CFN, as amostras de
elevada polaridade podem também ser difíceis de analisar devido à dificuldade de solubilização na FM apolar. 
Comentário
A cromatografia líquida de interação hidrofílica (CIH, na sigla em português), de um modo geral, é
bastante parecida com a cromatografia líquida em fase normal. Nesse tipo de separação, são
empregadas fases estacionárias hidrofílicas (como em fase normal), e fases móveis contendo água,
tampão e uma concentração elevada de solvente orgânico miscível com água, típicas de fase reversa. A
cromatografia com interação hidrofílica combina os mecanismos de adsorção e partição entre a fase
móvel e a fase estacionária. 
O mecanismo de separação em CIH proposto no trabalho original de Apert preconiza a formação de uma
camada de água difusa na superfície polar da FE, em contraposição a uma FM deficiente em água,
promovendo a formação de equilíbrios entre essa camada de água, a superfície da FE e a FM, criando um
sistema de extração líquido-líquido, no qual o princípio de separação se baseia.
Compostos polares não ionizados e ionizáveis podem ser separados pela CIH, uma vez que a FM utilizada
pode ser de uma solução contendo altas proporções de solventes orgânicos, como acetonitrila ou metanol, e
baixas quantidades de água ou podem ser utilizados tampões.
Geralmente, a fase móvel utilizada na CIH para separação de compostos não ionizáveis consiste em uma
solução com acetonitrila e uma pequena proporção de água. De modo geral, qualquer solvente polar aprótico
que seja miscível com água pode ser usado como fase móvel em CIH.
Solvente polar aprótico
Tipo de solvente que é polar, mas não tem a capacidade de formar ligações de hidrogênio. A polaridade
nesses solventes ocorre devido à diferença de eletronegatividade entre os átomos que compõem a
molécula, resultando na formação de um dipolo. 
Uma vantagem da CIH, quando comparada à CFN está na possibilidade de trabalhar no modo
gradiente. Geralmente, o gradiente é iniciado com pequena quantidade de água e elevada
quantidade de solvente orgânico, diminuindo a quantidade de solvente orgânico ao longo do
gradiente e aumentando a quantidade de água.
A CIH é amplamente utilizada na análise de moléculas pequenas, especialmente as polares, destacando-se na
análise de compostos de caráter básico. Moléculas de tamanho intermediário ou maiores, como toxinas,
aminoácidos, peptídeos, carboidratos e proteínas também têm sido analisadas por essa técnica.
Em relação às fases estacionárias utilizadas em CIH, pode-se utilizar sílica pura, especialmente quando for
sílica do tipo C. Esse tipo de sílica possui, em sua superfície, grupos não polares de Si – H (hidreto de silício)
no lugar dos grupos polares Si – OH, comuns nos outros tipos de sílica (tipos A e B), o que a torna menos
polar. 
A sílica do tipo C pode ser utilizada na CIH na separação de compostos de caráter ácido e básico. O hidreto é
menos polar que a hidroxila e apresenta pouca atração pela água, aumentando a reprodutibilidade da retenção
em fases móveis orgânicas e aquosas.
Podem ser também utilizadas fases quimicamente ligadas, como fases apresentando grupos amida ligados à
sílica e fases apresentando grupo diol ligados à sílica. 
Cromatografia quiral
A CLAE começou a ser utilizada na resolução de racematos (ou misturas racêmicas) por volta dos anos 1960,
após o uso do processo de derivatização de enantiômeros com reagentes quirais, que formam
diastereoisômeros dos analitos. Esses diasteroisômeros apresentam variação na seletividade em fase reversa
e na fase normal.
Nos anos 1980, a resolução de misturas racêmicas se tornou mais rápida com o desenvolvimento de fases
estacionárias quirais, a princípio desenvolvidas por Pirkle. 
A separação de enantiômeros em fases estacionárias quirais envolve a formação reversível de um
diastereoisômero quando os enantiômeros da amostra interagem com a FE. Reagentes quirais
adicionados à fase móvel permitem que o mesmo efeito possa ser obtido, quando se utiliza uma fase
estacionária não quiral.
O uso de aditivos quirais à fase móvel que reagem com o analito quiral durante o processo cromatográfico
também promove a formação de diastereoisômeros por um processo de derivatização quiral. Pode-se usar,
por exemplo, uma amina quiral (R ou S) solúvel na fase móvel para a separação de misturas racêmicas de
ácidos carboxílicos.
Atenção
A cromatografia
quiral é utilizada para resolução de misturas racêmicas, através da separação
enantiomérica, com o uso de fase estacionária quiral, fase móvel quiral com colunas aquirais, de fase
reversa ou fase normal, derivação quiral do analito, precedida da análise cromatográfica, e assim
formando um diastereoisômero para posterior análise cromatográfica em colunas aquirais, geralmente,
de fase reversa. 
O método de escolha para resolução de racematos é a utilização de colunas quirais, por ser o método mais
rápido, com menos etapas envolvidas.
As colunas utilizadas possuem fases estacionárias quirais em suporte de sílica. A seleção enantiomérica pode
ocorrer pelos seguintes agentes, confira!
 
Mecanismos de interação eletrostática.
Atrações por elétrons π.
Ligações hidrogênio.
Efeitos estéricos.
Afinidade por cavidade quiral.
Interações dipolo-dipolo.
São várias fases estacionárias quirais comerciais, disponíveis no mercado. São, geralmente, colunas com alto
custo e com reprodutibilidade e estabilidade variáveis.
Dentre os mais variados tipos de FE quiral desenvolvidos, os mais utilizados são: as fases estacionárias de
Pirkle, os derivados de polissacarídeos adsorvidos em sílica gel, como os carboidratos, as colunas de
proteínas e as fases estacionárias de ciclodextrinas. 
Verificando o aprendizado
Questão 1
Na cromatografia líquida, a coluna de guarda desempenha um papel essencial na proteção da coluna principal,
garantindo a integridade do processo analítico. Considerando a importância da coluna de guarda em
cromatografia líquida, escolha a alternativa que descreve corretamente uma característica fundamental dessa
coluna.
A
A coluna de guarda é dispensável em cromatografia líquida, sendo seu uso opcional para análises mais
simples.
B
A coluna de guarda é frequentemente preenchida com a mesma fase estacionária da coluna principal.
C
• 
• 
• 
• 
• 
• 
A coluna de guarda deve ser posicionada após a coluna principal para garantir uma separação eficiente.
D
A coluna de guarda é utilizada apenas em cromatografia gasosa, não sendo aplicável em cromatografia
líquida.
E
A coluna de guarda é projetada para suportar altas pressões, mas não desempenha um papel significativo na
retenção de contaminantes.
A alternativa B está correta.
A escolha de uma fase estacionária semelhante à da coluna principal na coluna de guarda é crucial para
garantir uma retenção eficiente de impurezas específicas. Isso assegura que contaminantes com
características semelhantes aos analitos de interesse sejam retidos, preservando a qualidade e a
integridade da análise cromatográfica.
Questão 2
A cromatografia líquida é uma técnica analítica poderosa, oferecendo uma variedade de modos que permitem
a separação eficiente de diferentes compostos. Analise as afirmativas a seguir sobre modos cromatográficos
em cromatografia líquida.
 
I. Na cromatografia de exclusão, os componentes mais volumosos eluem mais rapidamente da coluna.
 
II. A cromatografia de fase reversa utiliza uma fase estacionária mais polar que a fase móvel.
 
III. A cromatografia de troca iônica baseia-se na interação entre íons da amostra e íons presentes na fase
estacionária.
 
Assinale a(s) alternativa que apresenta a(s) afirmação(ões) corretas.
A
I, apenas.
B
II, apenas.
C
III, apenas.
D
I e II.
E
I e III.
A alternativa E está correta.
Na cromatografia de exclusão, os componentes mais volumosos são eluídos mais rapidamente, sendo essa
uma característica fundamental desse modo cromatográfico. Na cromatografia de fase reversa, utiliza-se
sempre uma fase estacionária mais apolar que a fase móvel. A cromatografia de troca iônica é baseada na
interação entre íons da amostra e íons presentes na fase estacionária, sendo eficaz na separação de íons
inorgânicos.
3. Conclusão
Considerações finais
Neste conteúdo, exploramos a evolução da cromatografia líquida, iniciando pela cromatografia líquida clássica
(CL), em que a fase móvel atuava pela ação da gravidade, passando pela líquida de alta eficiência (CLAE) e
chegando à líquida de ultraeficiência (CLUE). 
Vimos os princípios da separação que regem o fenômeno e destacamos a função de cada componente que
compõem o equipamento, além de termos visto os cuidados que devem ser tomados com cada um deles. Um
enfoque especial foi dedicado à fase estacionária, elucidando como o tamanho das partículas desempenha
um papel crucial no sucesso da análise.
Exploramos, ainda, a coluna cromatográfica, discutindo seus diversos modos de operação, tais como fase
reversa, fase normal, troca iônica, gel de exclusão e interação hidrofílica. Foram apresentados ainda os
detectores convencionais mais usados, bem como o espectrômetro de massas. 
Explore +
Para aprofundar seus conhecimentos, confira algumas indicações!
 
Leia o artigo Quantificação de canabinoides em extratos medicinais de cannabis por cromatografia líquida de
alta eficiência, de Virgínia M. Carvalho e colaboradores, para compreender a importância dessa técnica na
indústria e pesquisa farmacêutica.
 
Veja como a CLAE auxilia na pesquisa de contaminantes em amostras de água lendo o artigo Uso da cafeína
como indicador de poluição por esgoto doméstico em corpos d’água urbanos, de João Miguel Merces Bega.
Referências
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polar compounds. Journal of Chromatography A, v. 499, p. 177-196, 1990.
 
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SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental. Trad. 5. ed. São Paulo: Bookman,
São Paulo, 2002.
	Cromatografia líquida
	1. Itens iniciais
	Propósito
	Objetivos
	Introdução
	1. Princípios e instrumentação da CLAE
	Entendendo a cromatografia líquida
	Evolução da cromatografia líquida
	Comentário
	Princípios da separação cromatográfica
	Natureza das fases
	Temperatura da coluna
	Adsorção
	Partição
	O que é e para que serve a cromatografia líquida?
	Conteúdo interativo
	Componentes da CLAE: sistema e fase móvel
	Conteúdo interativo
	O sistema
	Fase móvel
	Atenção
	Componente: bomba
	Conteúdo interativo
	Bombas tipo seringa
	Bombas recíprocas
	Conteúdo interativo
	Conteúdo interativo
	Bombeamento isocrático ou por gradiente
	Atenção
	Você imagina o que uma simples bolha de ar pode causar ao CLAE?
	Componentes: injetor, forno, detector e coletor de fração
	Injetor
	Atenção
	Forno
	Detectores
	Detectores seletivos
	Detectores universais
	Coletor de fração
	Componentes: injetor, forno, detector e coletor de fração
	Conteúdo interativo
	Sistemas de detecção: detectores seletivos e universais
	Conteúdo interativo
	Detectores mais utilizados