AULA 7 Recursos de apoio diagnóstico

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CITOPATOLOGIA 
Recursos de apoio diagnóstico 
 
Profa. Natália Helena Mendes Gonçalves 
http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjW5suBlsvKAhWHIpAKHWN6De4QjRwIBw&url=http%3A%2F%2Fwww.cursogratisonline.com.br%2Ffaculdade-unip-universidade-paulista%2F&psig=AFQjCNF-LS0HkyOquas2EHgd0rmXaIynxQ&ust=1454024621241705
• Aplicação 
• Excelente desempenho para identificação de 
lesões precursoras cervicais de baixo grau - que 
apresentam menor celularidade e na detecção 
de lesões precursoras cervicais de alto grau. 
• Incontestável superioridade na obtenção de 
amostras satisfatórias; 
• Concentra as células em áreas menores da 
lâmina, de maneira homogênea, reprodutível e 
individualizada. 
 
Citologia em Meio Líquido 
• TÉCNICA 
• Amostra cérvico-vaginal é imediatamente transferida para um 
frasco contendo uma solução conservante a qual, além das 
células, conserva também o DNA, o RNA e as proteínas, 
permitindo a realização de testes adjuntos. 
• Todos os interferentes (sangue, muco, células inflamatórias) são 
eliminados da amostra. 
• Líquido é tratado para remover outros elementos, tais como 
muco e hemácias antes de uma camada única de células serem 
depositadas sobre uma lâmina por um equipamento; 
• Ao final do processo, tem-se uma lâmina com a amostra disposta 
numa camada fina, limpa e com apenas 13mm de diâmetro. 
 
Citologia em Meio Líquido 
Citologia em Meio Líquido 
• Preparo do paciente 
• 1. A coleta deve ser realizada fora do período menstrual da 
paciente. 
2. Não fazer uso de pomadas, cremes ou duchas vaginais nos 
dois dias que antecedem à coleta da amostra. 
3. Abstinência sexual nos 3 dias que antecedem à coleta. 
4. Não realizar exame colposcópico imediatamente anterior à 
coleta da amostra de material endocervical. 
5. Não realizar ultrassonografia trans-vaginal antes da coleta 
da amostra. 
 
• Coleta 
• Escova cervical, e/ ou espátula; 
• A amostra é depositada num pequeno vidro 
contendo meio de transporte. 
Citologia em Meio Líquido 
• VANTAGENS: 
• Análise mais fácil; 
• Diminui erros na maneira de confeccionar a lâmina; 
• Maior sensibilidade e especificidade 
• Ensaios com DNA, RNA, tais como a 
detecção/genotipagem do DNA de HPV, ou a 
detecção das proteínas E6/E7. 
 
Desvantagem 
• Custo maior 
Citologia em Meio Líquido 
• Resultados mais seguros 
• Maior acuidade do diagnóstico das lesões 
precursoras e do carcinoma cervical, bem 
como de lesões precursoras de outros sítios 
da região anogenital. 
• Tempo de rastreamento e de obtenção de 
resultados reduzidos 
• Mais clareza na visualização e interpretação 
de células de importância diagnóstica 
• Alta Produtividade 
Vantagens da Citologia em 
meio Líquido 
• EM APENAS UMA AMOSTRA: 
• Teste HPV (DNA, PCR) e genotipagem 
• Agentes Patogênicos 
• Clamydia 
• Neisseria 
• Ureaplasma 
• Mycoplasma 
• Streptococcus agalactiae 
• Herpes 1/2 
 
Vantagens da Citologia em 
meio Líquido 
• Teste Papanicolaou convencional 
• Redução da incidência de câncer cervical; 
• Limitações de amostragem ou preparação de 
lâminas: 
• Apenas uma pequena porção da amostra retirada da paciente é 
transferido para a lâmina Papanicolaou convencional. 
• Essas limitações podem levar a imprecisões e diagnósticos 
equívocos quando se utiliza esta metodologia. 
 • A tecnologia possibilita resultados mais precisos e se 
comparado com citologia de lâmina convencional temos 47% vs 
80% de precisão diagnóstica. 
 
• Citologia em base líquida é um aprimoramento do 
Papanicolaou, 
• Implementada em praticamente 100% das rotinas de 
países como EUA e Inglaterra, e ganhando cada vez 
mais importância em diversos países da Europa e da 
Ásia; 
• Hospitais universitários, centros de pesquisa e 
excelência como a Fundação Oncocentro de São Paulo 
e os principais laboratórios de patologia do Brasil . 
Citologia em Meio Líquido 
Citologia em Meio Líquido 
Citologia em Meio Líquido 
MICOPLASMAS 
• Bactérias desprovidas de parede celular 
• Não se coram ao Gram 
• Família: Mycoplasmataceae possui 2 Gêneros: 
• Mycoplasma / Ureaplasma 
• Mycoplasma hominis e Mycoplasma genitalium 
• Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum 
• Podem ser isolados do trato genital em adultos – 
comensais ou patógenos 
• Mycoplasma genitalium 
• Uretrites, endometrites e cervicites 
• Detecção: Biologia Molecular 
 
• Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e 
Ureaplasma parvum 
• Vaginites e uretrites 
• Aborto espontâneo 
• Infecções extragenitais: pulmões, sítios estéreis (líquido 
sinovial, SNC) – Pacientes imunocomprometidos 
 
 
 
MICOPLASMAS 
Material clínico 
• Meio de transporte específico: A3 
• Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e 
Ureaplasma parvum 
• Cultura em meio Líquido específico: M42 / U9 
• Ágar A7 
• O teste por meio de PCR é hoje o método de análise 
mais utilizado para identificar micoplasmas em cultura 
TÉCNICAS DE BIOLOGIA 
MOLECUCAR - HPV 
• Permite a detecção de DNA vírico em fragmentos de 
biopsia ou escovado cervical, e possuem elevada 
especificidade e sensibilidade. 
• HPV possui no seu genoma vários genes expressos. 
• E6 e E7, foram classificados como oncogenes pela sua 
capacidade de induzir a transformação maligna das 
células infectadas. 
• Codificam oncoproteínas que têm como alvo as proteínas 
p53 e Rb respectivamente, que são proteínas codificadas 
por genes supressores tumorais. 
• Os genes E6 e E7 induzem a divisão celular e evitam a 
apoptose. 
ANTICORPOS E SUAS APLICAÇÕES 
DIAGNÓSTICAS 
 
• Anticorpos são proteínas que reconhecem um antígeno de 
forma específica e com alta afinidade. 
• Os anticorpos são utilizados para a detecção específica. 
https://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Antibody.svg
http://3.bp.blogspot.com/-rLOo7LEYpMc/TazjIeh_B0I/AAAAAAAAAEc/9j6NEX37yu8/s1600/Ih.jpg
Captura Híbrida 
 
• DETECÇÃO DE DNA - HPV 
• Antes dos primeiros sintomas de HPV 
• Material: raspagem de uma pequena amostra do muco vaginal no colo 
do útero, vagina ou vulva – mulher 
• raspagem de uma pequena amostra do muco vaginal no colo do útero, 
vagina ou vulva 
• BIOPSIA (colo uterino, vulva, pênis, anus, etc). 
• Uretra – homem 
• Coleta: através de uma escova especial e remetida ao laboratório em um 
recipiente próprio. 
• Quantifica indiretamente a carga de vírus presente e o soro tipo (18 tipos 
do HPV) 
• Exame útil no diagnóstico e acompanhamento da infecção pelo 
Papilomavírus Humano 
• A Captura Híbrida não identifica os tipos virais do HPV, e sim os grupos 
virais. 
• O teste possui dois pools de sondas, uma para os vírus de baixo risco 
(não oncogênicos ou seja, que não causam o câncer) que pesquisa os 
tipos virais 6, 11, 42, 43 e 44; e outra para os vírus de alto risco 
(oncogênicos ou que podem causar o câncer) que pesquisa os tipos 
virais 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68. 
• A Captura Híbrida contém sondas gênicas de 70% dos tipos de HPV de 
baixo risco e 99% dos oncogênicos. 
 
Captura Híbrida 
• O exame de captura híbrida para HPV deve 
ser feito por todas as mulheres que tiveram 
alguma alteração no papanicolau ou que 
estejam dentro do grupo de risco do HPV, 
exemplo: muitos parceiros sexuais. 
 
• É um teste de biologia molecular qualitativo e 
quantitativo, que amplifica e detecta o sinal 
dos híbridos formados pela reação enzima-
substrato. A leitura do resultado é feita por 
quimioluminescência. 
Captura Híbrida 
• Reagindo com sonda gênica especifica, o material para análise 
forma híbridos de RNA/DNA que são capturados por 
anticorpos que revestem as paredes da microplaca. 
• A seguir, os híbridos imobilizados, reagem com anticorpos 
específicos conjugados, formando um substrato estável que é 
posteriormente detectado por quimioluminescência ultra-
sensível. 
• Os valores lidos pelo quimioluminômetro são transmitidos a 
um computador,dotado de software específico, que analisa os 
números recebidos e faz os cálculos de validação do ensaio e a 
quantificação dos controles positivos, negativos e amostras. 
• O software executa o relatório final do teste e sua impressão, 
não havendo margem de erro nos cálculos. 
 
Captura Híbrida 
Imuno ‐ histoquímica 
• Refere ao processo de localizar antígenos em tecidos, 
explorando o princípio da ligação específica de 
anticorpos a antígenos no tecido biológico. 
 
• A técninca imuno histoquímica é amplamente utilizada 
no diagnóstico de células anormais, tais como aquelas 
encontradas em neoplasias. 
https://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Immunohistochemistry.png
• Direto 
• Anticorpo marcado conjugado reagindo diretamente 
com o antígeno na amostra de tecido. 
• Essa técnica utiliza apenas um anticorpo e o 
procedimento é, portanto, simples e rápido. 
• Indireto 
• Anticorpo primário não-marcado (primeira camada) 
que reagem com o antígeno do tecido, e um anticorpo 
secundário marcado (segunda camada) que reagem 
com o anticorpo primário. 
• A segunda camada de anticorpos pode ser marcada 
com corante fluorescente ou uma enzima. 
 
Imuno ‐ histoquímica 
• Anticorpo é conjugado a uma enzima, como uma peroxidase, 
que pode catalisar uma reação que produzirá coloração. 
Alternativamente, o anticorpo pode também ser marcado com 
um fluoróforo, como fluoresceína, rodamina entre outros. 
Imuno ‐ histoquímica 
• Reconhece antígenos e assim identificar e classificar células 
específicas dentro de uma população celular 
morfologicamente heterogênea. 
• A visualização do complexo antígeno-anticorpo é possível pela 
adição de um cromógeno conjugado ao anticorpo e enzima 
que pode então ser observado ao microscópio. 
• Procedimento: 
• Dependendo do propósito e da espessura da amostra, cortes 
finos (cerca de 4-40 μm) são feitos no tecido de interesse, ou, 
se o tecido não for muito espesso e for penetrável, é utilizado 
inteiro. Os cortes são geralmente realizados através do uso de 
um micrótomo, e colocados em lâminas. 
• Fixação do tecido é realizada em formalina e embebição em 
parafina 
 
Imuno ‐ histoquímica 
APLICAÇÕES DIAGNÓSTICAS 
• Vários anticorpos são utilizados para o diagnóstico das mais 
específicas situações: 
• Fatores Prognósticos de Câncer de Mama (ex. p53) 
• Perfil Hormonal em adenoma de hipófise 
• Imunofenotipagem de linfomas e sarcomas 
• Detecção de sítio primário de adenocarcinoma 
• Caracterização de neoplasia indiferenciada 
• Fatores prognósticos de câncer 
• Detecção de agentes infecciosos 
 
 
PCR – REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE 
Polymerase Chain Reaction 
• Método de amplificação DNA sem o uso de um organismo 
vivo; 
• Comum em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas 
para diversas tarefas como: 
• Sequenciamento de genes ; 
• Diagnóstico de doenças hereditárias; 
• Identificação de "impressão digital" genética (usado em 
testes de paterninade e na medicina forense); 
• Detecção de diagnóstico de doenças infecciosas 
(Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e 
seus genótipos, HIV, Vírus da Hepatite B) 
• Criação de organismos transgênicos 
PROCEDIMENTO 
• Situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. 
• Método muito sensível de análise; 
• Cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou 
tornar errôneo o resultado. 
• Utilizar mecanismos da replicação in vitro. 
• Extrair o material genético da célula ou outro material a ser 
estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. 
• Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-
se trabalhar com o RNA (ARN); 
• Adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que 
contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as 
bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers 
(também chamados de oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima 
Taq-polimerase em uma solução tampão. 
• Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de 
temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para 
cada reação (fragmento a ser amplificado) 
 
• Desnaturação (quebra das pontes de hidrogênio) 
• Temperatura é elevada de 94 a 96°C por pouco tempo para que haja 
a separação da dupla cadeia de DNA; 
• Anelamento 
• Temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade 
de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os 
primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA 
(anelamento). 
• Extensão 
• Temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar 
sintetizando a nova molécula (extensão). 
• em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 
25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é 
exponencial. 
 
PROCEDIMENTO 
TERMOCICLADOR 
https://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Pcr_machine.jpg
RT- PCR 
• A reação em cadeia de polimerização em 
tempo real combina a metodologia de PCR 
convencional com um mecanismo de 
detecção e quantificação por fluorescência. 
• A metodologia permite que os processos de 
amplificação, detecção e quantificação de 
DNA sejam realizadas em uma única etapa, 
agilizando a obtenção de resultados e 
diminuindo o risco de contaminação da 
amostra e dando maior precisão. 
 
 
• Metodologia de PCR + Sistema de detecção de 
sinais fluorescentes 
• Funciona baseado no aumento da fluorescência 
indicando aumento de material genético específico 
amplificado; 
• Detecção, quantificação e amplificação de DNA em 
uma única etapa 
• Agilidade na obtenção de resultados 
• Técnica quantitativa - Quantificação do número de 
moléculas produzidas a cada ciclo 
 
RT- PCR 
Vantagens 
 PCR em Tempo Real 
• Coleta de dados na fase exponencial (ciclo a ciclo) 
• •SEM manipulação pós-PCR 
• •Resultados quantitativos 
• •Requer concentrações reduzidas de DNA 
• •Tempo de reação reduzido 
• •Maior reprodutibilidade, sensibilidade e precisão 
• PCR convencional 
• •Coleta de dados na fase final da reação 
• •Manipulação pós-PCR 
• •Preparação de gel de agarose - visualização 
• •Resultados qualitativos 
• •Requer concentrações maiores de DNA 
• •Maior tempo para obter resultados 
 
 
Aplicação 
• Todas as aplicações da PCR tradicional 
•Quantificação de carga viral 
•Quantificação de expressão gênica 
•Detecção de agentes infecciosos 
•Caracterização de agentes (Genotipagem) 
 
• Paciente do sexo masculino, 35 anos, casado, 
residente em Maceió/AL, foi atendido no ambulatório 
da cidade com queixa de tumoração sob a língua e 
dificuldade de engolir alimentos. Paciente relata 
prática de sexo oral e anal, fumante, etilista, iniciou a 
vida sexual ao 13 anos. Após exame clínico o médico 
evidenciou tumores na língua e amigdala de aspecto 
vegetante e couve - flor. 
• Apesar da clínica, o médico solicitou alguns exames 
para confirmação do diagnóstico. 
• Qual provavél diagnóstico? 
• Qual (is) exame (s) você sugeria para o paciente 
realizar? 
 
CASO CLÍNICO 1 
Foto - Paciente 
http://1.bp.blogspot.com/-0Ht1xPiJxRE/VY_3QP2iFHI/AAAAAAAAByk/ukSl8-Zxj4I/s1600/Papiloma%2B6.jpg
Biópsia 
Diagnóstico laboratorial 
• hibridização in situ, 
• imunohistoquímica, 
• PCR 
 
• Tratamento 
• excisão cirúrgica simples 
• Agentes ceratolíticos (agentes ácidos) ou por 
meio da crioterapia ou laserterapia