AULA 07 - Métodos

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LORRANE BRAGA RANGEL LXIX - UFG 
Isolamento viral – Cultura celular 
 Os vírus só conseguem se multiplicar em 
sistemas vivos 
 Cultura em células → inocula-se os vírus em 
uma camada simples de células 
 Método clássico e demorado 
 Observação da propagação viral em culturas 
de células permissivas 
 O efeito citopático observado se refere a 
alterações na morfologia em células individuais 
ou grupos de células induzidas pela infecção 
viral, as quais são observadas ao microscópio 
óptico 
Coleta: Cuidados → espécime, tempo de infecção e 
conservação 
 Ex: vírus respiratórios → aspirado de 
nasofaringe, coleta até 7 dias de infecção e 
colocar em gelo 
Processamento: eliminação de bactérias, fungos e 
resíduos celulares 
 Faz uma centrifugação e coloca em cultura 
celular → efeito citopático (multiplicação do 
vírus) 
Identificação: faz a identificação da presença do vírus; 
exemplo → imunofluorescência 
Efeito citopático: alteração morfológica na 
monocamada celular devido a multiplicação viral 
 É indicativo da replicação viral 
 Dá uma indicação sobre o vírus que foi isolado 
 
Métodos rápidos 
 Detecção de antígeno viral 
 Detecção de anticorpos 
 Observação de partículas virais 
 Pesquisa de ácido nucleico vital 
Detecção de antígeno viral 
Imunofluorescência indireta 
 Os anticorpos marcados são chamados de 
conjugados 
 Isotiocianato de fluoresceína → mais usado 
 Utiliza anticorpos marcados com corantes 
fluorescentes para revelar a formação de um 
imunocomplexo vírus-anticorpo 
A IF indireta é uma técnica usada para a identificação 
de antígeno ou detecção de anticorpo 
 Vírus respiratórios 
Primeira etapa: 
 O soro do paciente (ou anticorpos específicos) 
é adicionado a células infectadas fixadas a uma 
lâmina de microscópio 
 Após a incubação, as lâminas são lavadas para 
remover os anticorpos não ligados 
Segunda etapa: 
 Um anticorpo anti-imunoglobulina conjugado 
com fluoresceína é adicionado 
 O tipo do conjugado é determinado pela 
espécie do anticorpo usado na primeira etapa 
 Após a incubação e lavagem, o esfregaço é 
observado no microscópio de fluorescência 
Se o soro do paciente apresentar anticorpos 
específicos para o vírus fixado à lâmina na primeira 
etapa, estes se ligarão ao antígeno e o conjugado irá 
se ligar ao complexo, possibilitando a observação da 
fluorescência 
Vantagens: 
 Mais barata que a direta e com sensibilidade 
maior 
 Não é preciso obter um antissoro conjugado 
com o corante fluorescente para cada tipo de 
vírus 
Imunofluorescência direta: 
 Identificação de antígenos viris 
 Um conjugado de especificidade conhecida é 
adicionado a células infectadas por vírus que 
estão fixadas a uma lâmina de microscópio 
 
 
 
 
 
 
 
 
LORRANE BRAGA RANGEL LXIX - UFG 
ELISA 
 Ensaio imunoenzimático 
 Detecção de antígeno viral 
 Envolve anticorpos conjugados com 
enzimas 
o Conjugado: anticorpo + enzima 
 Ex: HBsAg – hepatite B 
 O resultado é observado por mudança de cor 
produzida pela ação da enzima sobre o seu 
substrato 
 Baseia-se na detecção do imunocomplexo fixo 
em um suporte, usando para isso um anticorpo 
conjugado a uma enzima 
 Adiciona peróxido de hidrogênio 
 Reação colorimétrica 
 Quanto mais antígeno, mais forte vai ficar a cor 
 A enzima mais usada é a peroxidase 
Método: 
1- A superfície do poço é coberta com um 
anticorpo 
2- Adição dos antígeno → se tiver ele vai se ligar 
com o anticorpo 
3- Adição de anticorpos de ligação enzimática que 
vão se ligar ao complexo anticorpo-antígeno 
4- Um substrato específico da enzima é 
adicionado → reação → mudar de cor 
 
Imunocromatografia – teste rápido 
 Baseia-se no fluxo lateral da amostra que 
ocorre por capilaridade em uma membrana de 
nitrocelulose 
 Anticorpos são imobilizados em uma 
membrana de nitrocelulose formando linhas 
teste (anticorpo antivírus) e controle (anticorpo 
anti-detector) 
 A amostra é adicionada a um local do cassete 
que contém um anticorpo específico para o 
vírus pesquisado conjugado a ouro coloidal 
(detector) 
o Esse anticorpo é diferente daquele 
usado na linha-teste e se liga a um 
epítopo diferente no vírus 
 Se o vírus estiver presente ele vai reagir com o 
conjugado (anticorpo – ouro coloidal) formando 
um imunocomplexo 
 Esse imunocomplexo vai migrar através da 
membrana e irá reagir com outro anticorpo 
vírus-específico imobilizado na linha teste do 
cassete, produzindo uma banda visível 
 Os conjugados não ligados continuam migando 
até a linha-controle na qual irão reagir com o 
anticorpo antidetector 
 O teste é positivo quando as duas linhas se 
tornam visível 
 
Detecção de anticorpos 
 Pesquisa no soro 
 Certas infecções virais produzem IgM em fase 
aguda e posteriormente produzem IgG. Assim, 
um teste que revele a presença de IgM indica 
que a fase aguda da infecção, ou seja, o vírus 
está presente no corpo. O IgM pode ser 
detectado por ELISA ou por 
imunocromatografia (teste rápido). 
 IgM – fase aguda (ex: rubéola, sarampo) 
 Dengue → ELISA, imunocromatografia 
 IgG 
 
Soroconversão (ex: rubéola, sarampo) 
 Quando não tem teste para IgM 
 Soros pareados 
 Coleta o sangue separa o soro e congela, 15 a 
21 dia depois coleta outra amostra 
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 Se o título da segunda amostra for 4 vezes 
maior que o da primeira = soroconversão 
(aumento significativo) → indica que o 
indivíduo está atualmente infectado com o vírus 
 Em caso de infecções passadas da o mesmo 
título 
Observação de partículas virais 
 Algumas infecções produzem materiais ricos 
em partículas viriais, como as fezes 
 Microscopia eletrônica ou imunocroscopia 
eletrônica 
Microscopia eletrônica 
 Ex: gastroenterite → preparação de uma 
suspenção de fezes e olhar no ME 
 
Pesquisa de ácido nucleico viral 
Eletroforese em gel de poliacrilamida 
 Utilizada para vírus de genoma segmentado 
o Ex: rotavírus e reovírus 
 Ocorre dentro de uma matriz ou gel 
 O gel é submerso em um tampão que possui 
íons para a corrente passar e também para 
manter o pH mais ou menos constante. 
 O material vai passar através do gel, sendo 
carreado pela corrente elétrica (o material tem 
que ter carga) → vão ser classificada de acordo 
com o tamanho e forma 
 Gel composto de agarose ou poliacrilamida 
Poliacrilamida 
• A poliacrilamida é um polímero de ligação 
cruzada de acrilamida → poros menores, 
podem ser usadas para proteínas, DNA 
• Vertical 
• Difícil de preparar → placas de vidros 
• Potente 
neurotóxico 
• Alta 
capacidade de 
separação e 
alta resolução 
PCR 
 Reação em cadeia pela polimerase → é uma 
técnica de amplificação usada para sintetizar, 
in vitro, sequências específicas de DNA 
 Extração de DNA 
 Extração de RNA e em seguida faz um DNA 
complementar usando uma transcriptase 
reversa (cDNA) 
 Amplificação enzimática 
Termociclador – coloca DNA, nucleotídeos, primer 
específico e enzimas (polimerases) no tubo de ensaio 
 Esquenta para 90° para desnaturar as fitas do 
DNA → separação das fitas 
 O primer se liga à sequência alvo quando a 
temperatura vai pra 50° 
 Eleva para 70° onde a polimerase tem 
atividade ótima para fazer a fita complementar 
→ aumenta mais a temperatura e desnatura 
Em caso de PCR convencional, faz uma eletroforese 
com as amostras 
A PCR em tempo real é um sistema baseado na 
detecção e quantificação de um sinal fluorescente 
→ agente ligante de DNA 
• Durante a síntese das fitas já emite a 
fluorescência 
• Não precisa de eletroforese 
• Determina a carga viral 
• A leitura é feita simultaneamente à 
amplificação 
Sequenciamento 
• Caracterização viral 
• Sequência de nucleotídeos dos vírus 
• Leitura das bases do material genético 
• É possível determinar o vírus que está 
causando a infecção