Relatórios Enzimologia

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Relatórios das Aulas Práticas de Enzimologia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2017 
 
Introdução 
 
A enzimologia é a ciência responsável por estudar as enzimas e todos os 
demais fatores relacionados à sua atividade. As enzimas são moléculas em sua 
maioria de natureza proteica que atuam como catalisadores de reações 
específicas e que atuam em condições de um ambiente favorável. 
O substrato é aquela substância que terá interação específica com o sítio 
catalítico também chamado de sítio ativo, que é o local presente na molécula de 
enzima, que tem conduzir a reação,a ação das enzimas diminuem a energia de 
ativação formando o complexo enzima-substrato e posteriormente liberando o 
produto. 
Logo se tem a cinética enzimática que é o estudo do mecanismo pelo qual as 
enzimas se ligam aos substratos, transformando-os em produtos, onde são 
utilizados dados sobre a velocidade de reação de enzimas através de ensaios 
enzimáticos, mostrando a relação entre a concentração do substrato e a 
velocidade de reação, um dos modelo cinético mais aceitos foram descritas por 
Michaelis e Menten,cujo o objetivo básico é explicar a influência da concentração 
inicial de enzima e de substrato na velocidade inicial de reação enzimática. 
Os aspectos moleculares da interação entre a enzima e o substrato ainda não 
estão completamente esclarecidos, importantes variáveis podem afetar essa 
 
interação da enzima, como temperatura, pH,concentração das 
enzimas,concentração do substrato,concentração dos agentes inibidores e 
imobilização das enzimas. 
Essas variáveis devem ser observadas, pois podem provocar alterações na 
conformação da enzima e consequentemente alterar a interação 
enzima-substrato,e modificar a cinética enzimática, sendo assim temos 4 
experimentos que relaciona diversos fatores que influenciam a cinética 
enzimática e que discorremos sobre eles. 
 
 
 
 
 
1ª Aula Prática - Cinética Enzimática 
 
A atividade enzimática é uma propriedade medida pelo aumento de 
velocidade de conversão de uma reação química que uma enzima produz, o 
objetivo desta prática é demonstrar experimentalmente a cinética das reações 
enzimáticas. Usamos nesta prática a enzima β D-Frutctofuranosidase que converte 
a sacarose em glicose e frutose, também conhecida como Invertase, neste 
experimento foi incubada por 5 minutos em sua temperatura ótima de atuação 
(550C) para soluções diluídas de sacarose (Brenda, 2017). 
Posteriormente a glicose é medido pela Glicose oxidase, onde a quantidade 
de produto obtido é corresponde proporcionalmente à quantidade de substrato 
consumido, podemos assim determinar os parâmetros cinéticos através da curva 
dos duplo-recíprocos.Os dados utilizados por este grupo é apresentado na figura 
abaixo.Com concentração de sacarose de 50g/L. 
 
 *Diluição 1:1 **Diluição 2:1 Tabela 1. Dados do experimento 1. 
Os dados obtidos no espectrofotômetro ,que é medido pela absorção de luz 
na região espectral do produto formado na reação, são convertidos através de uma 
curva-padrão apropriada para o produto detectado, foram feitas os devidos acertos 
decorrente as diluições realizadas nos frascos 3, 4, 5, 6 e 7. As velocidades iniciais 
foram calculadas com base no tempo em que os tubos foram incubados, de 5 
minutos ou 300, foi elaborada a conversão de litros e de segundos para uma melhor 
uso da curva padrão e comparações com a literatura. 
 
 
 *Diluição 1:1 **Diluição 2:1 Tabela 2: Dados linearizados do experimento 1. 
A atividade de uma enzima é geralmente descrita através de Vmax e também 
da constante de Michaelis-Menten (KM), que representa a concentração de substrato 
à qual se detecta uma velocidade de reacção igual a metade de Vmax,porém o 
gráfico de velocidade face a [S] não é linear, assim o gráfico de Lineweaver-Burk ou 
representação de duplo recíproco é a forma mais comum, e simples,de mostrar os 
dados da cinética enzimática. 
 
Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de 
Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da acima, o resultado deste tipo 
de representação é uma linha reta cuja equação é e = mx + c, sendo o ponto de 
interceção entre a reta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de 
intercepção entre a reta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km. 
Para o cálculo de Vmáx e Km, foi necessário linearizar os dados por meio do 
cálculo dos inversos da velocidade da reação, e da quantidade do substrato. Deste 
 
gráfico foram usados todos os pontos. A curva padrão utilizada foi a curva 
Abs=0,1053*(Concentração em g/L ) + 0,0198), vale ressaltar que se experimentou 
todas as curva fornecidas, e a exclusão dos primeiros pontos pois os mesmo 
estavam fornecendo um coeficiente linear negativo indicando um Vmax negativo que 
não se deve ter. 
A primeira curva padrão (Abs=0,4179*(Concentração em g/L) + 0,1946) 
fornecida não foi possível utilizar devido um R2 inferior a 0.95, que deve ser 
descartado por não fornecer uma alta confiabilidade,e a segunda curva 
Abs=0,2394*(Conc em g/L)+0,0736 apresentou um R2 dentro do limite, porém foi 
testando a terceira curva e forneceu um R2 superior sendo assim aceita por garantir 
uma maior confiabilidade . 
 
Gráfico 1: Comportamento da enzima no experimento 1 
Os parâmetros cinéticos foram calculados através da equação da reta obtida 
com pelo gráfico dos inverso de Velocidade e concentração de substrato com 
R2=0,962 foram utilizando a fórmula . 
 
 
Obtemos os valores de Vmax=0,39 g/(L*s) e Km=83 g ou 461 mM. De acordo 
com o banco de dados BRENDA Enzymes para este substrato o Km varia de 0.05 – 
5000 mM e número de renovações que corresponde ao Vmax com variação de 5.7 
– 7300000 s-1. 
Os dados obtidos de Km estão dentro dos valores encontrados na literatura, 
entretanto vale ressaltar que esta enzima possui uma ampla faixa de variação para 
sacarose, esta variação se deve a amplas fontes de organismos em que a enzima é 
obtida, visto que ela é obtida principalmente de leveduras de panificação. 
Outra observação que podemos inferir é quanto aos valores de Vmax, que 
deu abaixo da variação da literatura ,o que pode indicar uma inibição tanto da 
concentração do substrato, provavelmente devido à água de baixa concentração, 
quanto do produto no caso a D-frutose, que tem inibição com a enzima que pode ter 
influência na obtenção dos parâmetros cinéticos.Outro adendo que se deve discutir 
é quanto à erros que podem estar vinculado a erros aleatórios, como manuseio do 
material no laboratório, e a erros sistemáticos, originados do próprio 
espectrofotômetro. 
Concluímos a partir dos dados que o aumento da concentração de substrato 
causa um aumento gradual na velocidade (Vo) da reação catalisada. Porém como 
este experimento só considera uma temperatura (55ºC) e uma concentração de 
enzima (3 mL), não é possível concluir qual o efeito da temperatura considerada. E 
que os parâmetros da cinética enzimática pode sofrer outros tipos de interferências 
como inibição, temperatura e concentração do substrato confirmando o conteúdo 
aprendido em aula. 
 
 
 
 
 
2ª Aula prática - Influência da temperatura na cinética enzimática 
 
 
Tabela 3. Dados do experimento 2, segunda aula prática. 
 
Esta prática pode ser dividida em duas partes, a primeira condiz com o estudo 
da cinética enzimática em diferentes concentrações de sacarose em um mesmo 
tempo de incubação (5 minutos) na temperatura selecionada de 65°C e a segunda a 
influência do tempo de incubação para uma mesma concentração de sacarose final 
(20 g/L). 
 
Tabela 4: Absorbância e concentração de sacarose 
 
Primeira parte: 
 
Dado a curva padrão, pode-se calcular o valor da concentração de glicose 
através da equação da reta fornecida: 
y= 0,1053 x + 0,0198 
 R2= 0,99 
 sendo y=A (absorbância) e x= Concentração de glicose ([glicose]). Portanto, 
[glicose] = (A– b) / a 
 
 
 
 
Tabela 5: Absorbância e concentração de glicose 
 
Para se encontrar a velocidade de formação de glicose em 5 minutos, 
utilizou-se a relação: 
 
Obteve-se os seguintes dados: 
 
 
Tabela 6: Velocidades iniciais e dados linerizados 
 
Plotando dados em um gráfico se obtém o seguinte gráfico: 
 
 
Gráfico 2: Gráfico linearizado da relação concentração x velocidade de formação do produto. 
 
A partir da equação da reta gerada, Y = 12,471x + 0,0409 (com R²= 0,9992), 
calculou-se o Km e o Vmáx a partir da comparação com a equação 
Lineweaver-Burk: 
 
 
Onde: 
1/V=Y 
1/S=x 
1/Vmax=0,0406 
Km/Vmax=1,4972 
Sendo assim, Vmax= 24,45 g/L.min e Km=304,914 mol/l 
 
Segunda parte: 
 
 
Tabela 7: Tempo de incubação e absorbância 
 
Dado a mesma curva padrão da primeira parte, calcula-se a glicose: 
Com R2 = 0,99 e sendo y=A (absorbância) e x= Concentração de glicose ([glicose]). Portanto, 
[glicose] = (A – b) / a 
 
 
Tabela 8: dados para o cálculo do tempo de meia vida 
 
 
 
Gráfico 3: Tempo de meia vida da Enzima 
 
Pela equação, sabe-se que a constante de degradação (Kd) é 0,1315. Para encontrar o 
tempo de meia-vida utiliza-se a fórmula (t½) = ln2/kd. Logo, o valor do tempo de meia-vida é 5,271081 
min. Apesar de ser possível calcular o tempo de meia-vida, os dados não são confiáveis devido ao R2 
. Acesso em 28/11/2017. 
BORZANI, W.; SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Biotecnologia 
Industrial. Processos Fermentativos e Enzimáticos São Paulo, Edgard Blücher Ltda, 
vol.1, 2001.