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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS BIOMEDICINA – 5º PERIODO Relatório: Extração DNA Vegetal 1 Ana Clara Gonçalves Pereira Ana Luiza de Oliveira Andressa Carvalho Silva Fevereiro 2025 POÇOS DE CALDAS PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA – PUC MINAS CAMPUS POÇOS DE CALDAS GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR 2025 Aluno(a): Ana Clara Gonçalves Pereira. Grupo: Ana Clara Gonçalves Pereira, Ana Luiza de Oliveira e Andressa Carvalho Silva. Prática 4: Extração de DNA Vegetal 1. Introdução: Este presente relatório disserta os resultados obtidos do experimento realizado em aula prática Biologia Molecular e Biotecnologia, realizado no dia 26 de fevereiro de 2025. O experimento, auxiliado pelo Prof. Lázaro Medeiros, visou a extração de DNA de vegetais e frutas. Para o estudo descrito, foi feita a utilização do morango. Dessa forma, esta prática teve em vista o conhecimento do procedimento utilizado para a extração do DNA e sua adequada realização, tendo como base as propriedades e estrutura do DNA. Portanto, este relatório visa, de forma geral, a realização da técnica de extração do DNA, observando as reações presentes e suas características. De forma geral, o DNA é um ácido nucleico, sendo uma molécula essencial que armazena as informações genéticas da maioria dos seres vivos. Ele é composto por nucleotídeos e geralmente tem a forma de uma dupla-hélice. Nos organismos eucarióticos, está presente no núcleo, nas mitocôndrias e nos cloroplastos. Já nos procariontes, fica em uma região chamada nucleoide, que não possui membrana ao seu redor. (SANTOS) Figura 1- Molécula de DNA e sua estrutura Fonte: Santos (Brasil Escola) 2. Objetivo geral: Realizar a extração de DNA vegetal. 3. Objetivo específico: Realizar os procedimentos de extração do DNA a partir de amostras de banana, morango e cebola. 4. Fundamento: O isolamento de DNA de plantas e de material vegetal proveniente de cultura de tecidos é uma etapa importante na análise da estrutura e organização do genoma de plantas. Essas análises necessitam, frequentemente, usar enzimas de restrição, que cortam o DNA em fragmentos, para ser que é utilizado em Southern blot ou em construção de bibliotecas genômicas. Preparações de DNA vegetal também são, comumente, utilizadas como substratos em reações de PCR para estudos filogenéticos ou no desenvolvimento de marcadores moleculares como os microsatélites e os gerados por RAPD. Independentemente do tipo de estudo molecular, as preparações de DNA devem produzir amostras puras suficientes para não inibir os tratamentos enzimáticos ou causar interferências nos padrões de migração em gel de eletroforese. 5. Materiais e Métodos Utilizou-se os seguintes materiais: • Morangos; • Saco plástico (ZIP LOC); • Bastão de vidro; • Solução de extração (detergente, NaCl e água); • Água destilada; • Tubo de ensaio e suporte; • Tubo eppendorf; • Micropipeta e ponteira; • Centrífuga; • Congelador para a amostra de DNA; Os procedimentos realizados foram: Preparo da solução de extração: • Separou-se 25 ml de detergente; • Separou-se 7,5 gramas de NaCl (sal de cozinha) = 2 colheres de chá; • Separou-se 450 ml de água (H2O), de preferência mineral; • Foram misturados todos os materiais até a dissolução total do sal. Extração do DNA: • Colocou-se a banana e o morango em um saco plástico (ZIP LOC) e a cebola picada em um almofariz; • Esmagou-se as bananas e os morangos com o punho (ZIP LOC) e a cebola no almofariz por, no mínimo, 2 minutos; • Misturou-se tudo, apertando com as mãos (ZIP LOC) e com o pistilo por 1 minuto; • A solução foi filtrada com gaze ou papel filtro; • Passou-se parte do filtrado para um tubo de ensaio; • Derramou-se vagarosamente o álcool gelado até a metade do tubo de ensaio; • Verificou-se a formação de três camadas no tubo de ensaio; • Mergulhou-se o bastão de vidro na camada intermediária formada no tubo de ensaio e retirar; • Foi feita a análise do material formado. 6. Resultados e discussão Após a realização do experimento, o resultado obtido, de forma visível, foi apresentado abaixo: Figuras 2 e 3- Extração do DNA Fonte: Arquivos pessoais Através da imagem, é possível visualizar a formação de três fases: a fase alcoólica/aquosa, a fase intermediária (onde o DNA está contido) e a fase orgânica (composta pelo material, com restos de organelas, proteínas, lipídios e estruturas sedimentadas). Na primeira imagem (figura 2), estas fases estão mais claras. Porém, na segunda imagem (figura 3), o DNA se encontra na superfície. Isso se deve ao fato da baixa densidade do DNA que, com o tempo é ressuspendido, passando a ficar na superfície. Além disso, a “nuvem branca” formada não contém apenas DNA, mas também açúcares, pectina (fibra) e proteínas desnaturadas, que acabam passando também. (GONÇALVES, 2021) Os protocolos para extração de DNA envolvem três etapas básicas: lise das membranas, limpeza de contaminantes (proteínas e macromoléculas), a precipitação do DNA, além da reidratação do DNA. Posteriormente esse DNA extraído pode ser processado para que ocorra sua replicação, mutação e o reparo do DNA. (RODRIGUES et al., p. 3) Ademais, é possível inferir que a utilização do álcool gelado é essencial. A presença do NaCl (sal), que se dissocia em Na+ e Cl-, propicia um ambiente favorável para a extração do DNA, visto que estes íons interagem com fosfatos e histonas das moléculas de DNA, neutralizando-as e estabilizando-as. Assim, o DNA fica menos solúvel em contato água. Quando as moléculas são insolúveis em água, elas se agrupam, ficando visíveis. O sal, junto com o álcool, auxilia na separação do DNA, que aparecerá na interface entre o álcool e a mistura aquosa (fase orgânica). (DOGO, 2017) O álcool desidrata o DNA, de forma que este não mais fica dissolvido no meio aquoso e precipita. Além disso, o DNA tende a não ser solúvel em álcool e, deste modo, suas moléculas se agrupam. Como o DNA tem menor densidade que os outros constituintes celulares, ele surge na superfície do extrato. Quanto mais gelado o álcool, menos solúvel será o DNA. (EXTRAÇÃO..., p. 2) Nesta prática, não é possível a visualização da estrutura em dupla hélice da molécula de DNA. Portanto, ao final do processo, foi possível a obtenção e extração do DNA, que foi, posteriormente, congelado a –20 °C. 7. Conclusão A prática foi realizada com sucesso e o DNA vegetal foi extraído de maneira adequada. Esta técnica envolve muitos cuidados e procedimento adequado, devido ao fato de o DNA estar presente no núcleo das células. Assim, devem ser cumpridos todos os passos, realizando a prática laboratorial seguindo as medidas de biossegurança e cuidados para preservação, obtenção e não degradação da amostra para uso posterior. A extração de DNA é comumente seguida por sua amplificação por meio da técnica de PCR, uma das mais utilizadas por cientistas para investigar alterações em nível celular, muito abaixo da quantidade geralmente necessária para estudos sobre parasitas. A PCR teve um papel crucial no avanço da sistemática e epidemiologia parasitária, no estudo da imunologia e das interações entre parasita e hospedeiro, no desenvolvimento de vacinas de DNA recombinante e, mais recentemente, na análise de genomas completos. 8. Referências 1. SANTOS, Vanessa Sardinha dos. DNA: resumo, função, estrutura, composição, DNA x RNA - Brasil Escola. Disponível em: https://brasilescola.uol.com.br/biologia/dna.htm. Acesso em: 1 mar. 2025. 2. GONÇALVES, Tiago Maretti. Extraindo o DNA de vegetais: uma proposta de aula prática para facilitar a aprendizagem de Genética no Ensino Médio. 27 abr. 2021. Disponível em: https://educacaopublica.cecierj.edu.br/artigos/21/15/extraindo-o-dna-de-vegetais-uma-proposta-de-aula-pratica-para-facilitar-a-aprendizagem-de- genetica-no-ensino-medio. Acesso em: 1 mar. 2025. 3. RODRIGUES, Helyandro Manoel et al. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO DE DNA: revisão de literatura. UNIFAN, p. 1-6. Disponível em: https://www.unifan.edu.br/unifan/aparecida/wp- content/uploads/sites/2/2023/03/TECNICAS-DE-EXTRACAO-DE-DNA- revisao-de-literatura.pdf. Acesso em: 1 mar. 2025. 4. DOGO, Camila Ranzatto. Extração de DNA de morangos :: LabCiência. 6 nov. 2017. Disponível em: https://laboratorio- experimental.webnode.page/news/extracao-de-dna-de-morangos/. Acesso em: 1 mar. 2025. 5. EXTRAÇÃO de DNA- Orientação para o professor. USP, p. 1-2. Disponível em: https://www.ieb.usp.br/wp-content/uploads/sites/512/2019/08/extração- professor.pdf. Acesso em: 1 fev. 2025. https://www.ieb.usp.br/wp-content/uploads/sites/512/2019/08/extra%C3%A7%C3%A3o-professor.pdf https://www.ieb.usp.br/wp-content/uploads/sites/512/2019/08/extra%C3%A7%C3%A3o-professor.pdf PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS