Diagnostico Laboratorial da Coagulopatias

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25º Curso de Pós Graduação em Hematologia
Prof Fábio de Moura Camara
Diagnóstico Laboratorial das 
Diáteses Hemorrágicas
CONTROLE DE QUALIDADE 
EM HEMOSTASIA
CONTROLE DE QUALIDADE
• Coleta
• Processamento 
• Estoque
• Controle dos reagentes e equipamentos
• Implantação dos valores normais 
CQ - COLETA
• Jejum de 4 horas
• Medicamentos
• Coleta sem intercorrência
• Garrote
• Agulhas
• Tubos
• Anticoagulante - Citrato de sódio 3.8%
 - EDTA
CQ - COLETA
• Anticoagulante - Citrato de sódio 3.8%/3.2%
 Proporção 1V : 9V sangue
Hematocritos 55% reajuste Anticoag
C = 1.85 x 10-3 (100-Hto) x V
C = volume do anticoagulante
V = volume de sangue
CQ - COLETA
Cateter de longa permanência
Contaminação com heparina - TT e TTPA
Retirada da heparina - heparinase ou coluna de ecteola celulose
CQ - PROCESSAMENTO
• Centrifugação
- Plasma Rico em Plaquetas (200g - 6 min)
- Plasma Pobre em Plaquetas (1800 g - 15 min)
• Tempo entre a coleta e o teste 4 horas - Coag/Fibr
 2 horas - Plaq
• Aspecto da amostra
*Lipemia, hemólise, ictérico
CQ - ESTOQUE
• Congelamento rápido
- Nitrogênio líquido
- Gelo seco + alcool
- -200C ou -800C
• Descongelamento rápido
- 370C
CQ - REAGENTES E EQUIPAMENTOS
• Coagulômetros 
• Agregometros
• Microscópios
• Banho-maria
• Pipetas
• Reagentes
• Vidraria
CQ - CONTROLES E NORMAIS
• Controles comerciais
• Controles internos (Pool de plasmas normais)
Pool de plasmas normais = 20 doadores N
• Valor Normal = 30 doadores N sem drogas
 (15 homens e 15 mulheres)
 
Média  2 SD
TESTES DE HEMOSTASIA
MÉTODOS EM COAGULAÇÃO 
A maioria dos testes são comparativos
• Funcionais - Coagulação
 - Cromogênicos
• Quantitativos - Imunológicos 
 - Imunodifusão radial
 - Eletroimunodifusão
 - ELISA
MÉTODO FUNCIONAL
• Coagulômetros automatizados
 - Aumentam a precisão
 - Reduzem a influência do operador
Métodos
- Turbidimétrico
- Nefelométrico (luz emitida)
- Mecânico (barras magnéticas)
Lipemia, icterícia
HEMOSTASIA PRIMÁRIA
• Contagem de plaquetas (manual/equipamento)
• Tempo de sangramento (TS)
 - Duke (lóbulo da orelha)
 - Ivy (3 incisões)
 - Ivy modificado (1 incisão)
• Agregação plaquetária
COAGULOGRAMA
Tempo de Sangramento
Contagem de Plaquetas
Tempo de Protrombina
Tempo Parcial de Tromboplastina ativado
Dosagem de Fibrinogênio
Duke
Ivy (Simplate)
Local da incisão 40 mmHg Incisão
1ª bolha Cronometrar Fim do teste
Ivy (Lanceta)
Desvantagem
Invasivo
Pouco reprodutivo
Dependente de operador
Baixa sensibilidade à disfunção leve
Pouca correlação com tendência ao sangramento
TEMPO DE SANGRAMENTO
Método de Duke
(1 - 3 min)
Método de Ivy
(Lanceta: até 5 min;
Simplate: até 9 min)
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Encurtado: Não há significado clínico
Prolongado: Def. quantitativa ou qualitativa de plaquetas
 Def. congênita dos Fatores I e V
 Estados Fibrinolíticos
 Estados urêmicos
 Uso excessivo de certos medicamentos como AAS
 
Tempo de Protrombina
 X VIIa VII
 
 Xa V
 
 II IIa
 Fibrinogênio Fibrina
Tromboplastina
RESULTADOS
Tempo em segundos
Razão (Plaquetária : Transmissão de luz
 Impedância
 Lumigregometria
Citometria de Fluxo: Glicoproteínas plaquetárias (IIb-IIIa, Ib)
 Atividade Pró-coagulante
 VASP (fosfoproteína estimulada por vasodilatador)
Marcadores de ativação plaquetária no plasma: 2TG
 PF4
 
PLAQUETOPATIAS
• NÚMERO DE PLAQUETAS (N/D)
• TEMPO DE SANGRAMENTO ( A /N )
• AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA (Ausente/hipoagregante)
TS - PROLONGADO
• Plaquetas abaixo de 100.000/mm3
• Trombastenia de Glanzmann
• Síndrome de Bernard Soulier
• Doença de estoque
• Doença de von Willebrand
• Uremias
• Ingestão de drogas(AAS)
PFA100
Boa Sensibilidade para DvW e baixa sensibilidade plaquetopatias
AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Avalia a função plaquetária na presença de diferentes agonistas
• Métodos
Óptico (PRP)
Impedância (PRP e Sangue total)
AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Agentes agonistas utilizados
ADP (3.75 uM e 0.75 uM)
ADRENALINA (50 uM e 5 uM)
ÁCIDO ARAQUIDÔNICO (15 mM e 0.25 mM)
COLÁGENO (1.5 ; 0.9; 0.6; 0.3 ug/ml)
RISTOCETINA 
PLASMA BOVINO (15 ul)
AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA/SISTEMA 
ÓPTICO
0
 10
 20
 30
 40
 50
 60
 70
 80
 90
 100 
FONTE LUZ
FOTOCÉLULA
AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Defeito de primeira onda de agregação
(ADP, ADRENALINA, AA, COLÁGENO)
Fibrinogênio (afibrinogenemia, disfibrinogenemia, 
hipofibrinogenemia)
Receptores específicos
Receptores IIb-IIIa (trombastenia de glanzmann)
Hipergamaglobulinemia
Drogas (Ticlopidina; Penicilina e derivados) 
INTERFERENTES
ANTIMICROBIANOS;
• Penicilinas
• Cefalosporinas
• Nitrofurantoína
• Anfotericina
• Hidrocloroquina
AGENTES CARDIOVASCULARES
•  Bloqueadores
• Vasodilatadores
• Diuréticos
• Bloqueadores de canal de Cálcio
ALIMENTOS E TEMPEROS
• Café
• Gengibre
• Alho
• Álcool
• Vitaminas C e E
• Pó de guaraná
• Cravo-da-índia
Repouso
Pseudopodes
1ª Onda:
Receptor específico
GP IIb-IIIa
Transdução do sinal
2ª Onda:
Metabolismo AA
Liberação do conteúdo do 
grânulos
Agregação Normal
DvW ou Bernard Soulier ?
Trombastenia de Glanzmann
Aspirina Like
AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
Defeito na segunda onda de agregação
Reação de Liberação
 -Hereditárias (cicloxigenase; tromboxano 
sintetase)
 - Adquiridas (AAS, antinflamatórios não esteroidais, 
uremia, mieloproliferação)
Doenças de estoque
 - Grânulos alfa, denso, lisossomal
 
PLAQUETOPATIAS
DOENÇA ADP ADR AA COL RISTO PB 
T. de Glanzmann A A A A N N 
S. Bernard Soulier N N N D D/A D/A
D.von Willebrand N N N N D N
Doença de Estoque H H N H N N
Drogas (AAS) H H A H N N
Def. Ciclox./Tromb. H H H H N N
DEFICIÊNCIAS PLASMÁTICAS
 HEMOFILIAS
 A B
HEMOFILIAS
• Hemofilia A relacionada com FVIII:C( 1/5000 masc )
• Hemofilia B relacionada com FIX (1/3 a 1/5 Hemof A)
• Classificação
 - Severa ( 5%)
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS HEMOFILIAS
• Coagulograma
• Determinação do Fator VIII:C/IX
• Atividade do cofator de ristocetina
• Pesquisa de inibidor
• Quantificação de inibidor
DETERMINAÇÃO DOS FATORES VIII:C e 
IX
Métodos
Um estágio(plasma deficiente em FVIII:C/IX)
Colorimétrico (Substrato cromogênico)
FATOR VIII:C / IX MÉTODO DE UM ESTÁGIO
• TTPA + Plasma deficiente em fator VIII:C/IX
• Tempo de coagulação inversamente proporcional à 
atividade coagulante do fator
PROCEDIMENTO
Curva referência com pool de plasmas normais
1/5 ; 1/10 ; 1/20 ; 1/40 ; até 1/640
100%; 50% ; 25% ; 12.5% até 0.78%
Plasma teste diluído 1/5 e 1/10 
FATOR VIII:C / IX 
MÉTODO DE UM ESTÁGIO
0.78 1 2 3 25 50 100 
ATIVIDADE (%)
SEG
VN : 50 - 150%
Interferentes : Coleta; Estoque; Anticoagulante Lúpico
PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
Pesquisa Qualitativa 
TTPA Prolongado
TTPA (paciente e pool normal) após 2 horas a 370C
Resultado: 
 Corrigiu Falta de fator 
 Não corrigiu Presença de inibidor 
PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
Quantificação de inibidor em Unidades Bethesda
Princípio
Uma unidade Bethesda inibe 50% da atividade de uma unidade de fator 
VIII:C ou IX
Quantificação : Mistura do plasma do paciente e pool N por 2 horas e 
posteriormente é realizada a determinação da atividade residual do fator 
VIII:C ou IX
PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
Procedimento (UB)
Diluição do plasma do paciente 1:2; 1:4; 1:8.....em tampão
Pool N diluído = 1V + 1V tampão
Plasma do paciente 1V + 1V Pool N
Plasma do paciente 1:2 (1V) + 1V Pool N
Plasma do paciente 1:4 (1V) + 1V Pool N
Plasma do paciente 1:8 (1V) + 1V Pool N
 
2 horas 370C
Após a incubação, diluir todas as misturas 1/5 
para determinação do fator VIII:C/IX
Cálculo da atividade do fator residual:
 Atividade do fator (paciente) x 100
 Atividade do fator do Pool N diluído
PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
Procedimento (UB)
PESQUISA DE INIBIDORES ESPECÍFICOS
CÁLCULOS UB
A atividade residual do fator é convertida em UB 
utilizando-se a tabela de conversão
Considera-se a diluição do plasma do paciente que 
apresenta valor residual igual ou acima de 25%
A UB é calculada multiplicando-se a diluição do plasma do 
paciente utilizada para a determinação do fator residual
INIBIDOR VIII:C/IX
Misturas VIII:C/IX residual
1/2 Pac + Pool N 12%
1/4 Pac + Pool N 20%
1/8 Pac + Pool N 25%
Na tabela 25% de VIII:C/IX res = 2 UB
1/8 foi a diluição 8 x 2UB = 16 UB
Um Hemofílico apresentou sua dosagem inicial de Fator VIII de 2,3%. Ao realizar a Pesquisa de Inibidor o 
resultado foi POSITIVO. A dosagem encontra-se abaixo:
Pool + Tampão: 45 %de FVIII
Paciente+Pool: 10%
Paciente/2 + Pool: 10%
Paciente/4 + Pool: 15%
Paciente/8 + Pool: 35%
Tabela:
UBe FVIIIr%
1. 50
2 25
4 12,5
DOENÇA DE VON 
WILLEBRAND
Doença de von Willebrand
•Doença hemorrágica hereditária mais comum 
(0,8 – 2%)
•Padrão de transmissão autossômico
•Redução ou alteração funcional do FVW
Funções do fator von Willebrand
•Adesão plaquetária
•Ligação ao FVIII:C 
DOENÇA DE VON WILLEBRAND/CLASSIFICAÇÃO
• Deficiência quantitativa
• Deficiência qualitativa
• Deficiência quantitativa
 - Tipo I: def. parcial do fator vW
 - Tipo III ; def. completa do fator vW
DOENÇA DE VON 
WILLEBRAND/CLASSIFICAÇÃO
• Deficiência qualitativa
 - 2A: redução da função dependente de plaquetas, associada à 
ausência dos multímeros de alto peso molecular
 - 2B: maior afinidade pela GPIb
 - 2M: redução da função dependente de plaquetas não devido a 
ausência de APM
 - 2N: menor afinidade pelo fVIII:C 
DOENÇA DE VON WILLEBRAND
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
 DIAGNÓSTICO 
SUBTIPO
TS
TTPA
FVIII:C
FVW:Ag
FVW:RCo
padrão multimérico
FVW:VIIIB
FVW intra-plaquetário
RIPA
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA DE 
VON WILLEBRAND
Determinação de fator von Willebrand:Ag
Métodos Imunológicos
 - Imunoeletrodifusão (número de moléculas)
 - ELISA (número de sítios antigênicos)
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA 
DE VON WILLEBRAND
Determinação de fator von Willebrand:Ag
IMUNOELETRODIFUSÃO (agarose 1%)
 
(+)
(-)100 50 25 12.5 1 2 3 4 5 6 7 8
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA DE 
VON WILLEBRAND
DETERMINAÇÃO DO FVW:Ag POR (ELISA)
 Anticorpo capturante anti-von Willebrand
 Anticorpo anti-von Willebrand ligado à Peroxidase
 Substrato específico (OPD)
 A intensidade da cor é diretamente proporcional à 
concentração do antígeno
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇA DE 
VON WILLEBRAND
Padrão Multimérico do Fator von WillebrandEletroforese em gel de agarose
Transferência em papel de nitrocelulose
Reação com Ac anti-von Willebrand
Reação com Ac secundário - Peroxidase
Revelação com Luminol
DEFICIÊNCIA DO FATOR XIII
Prova de solubilidade da uréia 5M 
Princípio
Polímero de fibrina é estabilizado por ação do XIIIa formando 
ligações covalentes. Na ausência de XIIIa formam-se ligações fracas 
que na presença de uréia , as ligações de desfazem
Sensibilidade: 2 - 3%
Manifestação hemorrágica :