Extração Líquido-Líquido

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Extração líquido-líquido (LLE)
Solventes imiscíveis: água + solvente orgânico
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Geralmente o objetivo é transferir o soluto orgânico do meio aquoso para o meio 
orgânico: compostos polares ou hidrofílicos permanecem na fase aquosa e compostos 
menos polares ou hidrofóbicos são transferidos para fase orgânica
Método clássico de preparo de amostras
Extração, clean-up (?) e pré-concentração (?) em uma 
mesma etapa; além de simples, baixo custo e grande 
variedade de solventes orgânicos
Grande quantidade de resíduo gerado, baixos fatores de 
pré-concentração
Método baseado em equilíbrio de partição no qual 
extração exaustiva é atingida por sucessivas extrações
Extração líquido-líquido (LLE)
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Miscibilidade , densidade e 
polaridade dos solventes usados na 
extração líquido-líquido
Densidade do solvente orgânico 
Éter etílico = 0,71 g mL-1
Água = 0,998 g mL-1
Clorofórmio = 1,49 g mL-1
Mesmo sendo considerados 
imiscíveis, parte do solvente dissolve 
em água e parte da água fica solúvel 
no solvente, e ambas as soluções 
tornam-se mutuamente saturadas 
com o outro solvente.
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Extração líquido-líquido (LLE)
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Soluto é transferido de uma fase para outra de acordo com seu coeficiente de 
partição (Kow ou Kd)
Equilíbrio entre duas fases: distribuição dos analitos entre as fases
Kd = [X]org
[X]aq
X aq X org
Ex. 1 L de uma solução 0,1 ppb de um analito (250 g mol-1) é extraída com 150 
mL de um solvente orgânico. Assumir Kd = 5. 
i) Calcular a quantidade de mols do analito na amostra original
ii) Calcular a quantidade de matéria do analito que permanece na fase aquosa 
após a extração
iii) Calcular a quantidade de matéria do analito na fase orgânica no equilíbrio
iv) Calcular a % de analito extraída para a fase orgânica
Extração líquido-líquido (LLE)
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Equações anteriores podem ser 
rearranjadas para gerar a equação 
geral, na qual VO = volume original e 
VE = volume do solvente extrator 
V = razão das fases = VE/VO
Para sucessivas extrações 
com volumes iguais do 
solvente extrator (n = etapas)
Extração líquido-líquido (LLE)
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Extração subsequente leva à menor % de extração em relação à anterior, mas % 
cumulativa aumenta
Valores maiores de Kd levam a maiores % de extração
Eficiência da extração independe da concentração da amostra
Extração líquido-líquido (LLE)
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Estratégias para aumentar a eficiência da 
extração:
i) substituir o solvente orgânico; 
ii) salting out pode ser usado para 
diminuir a concentração do composto 
na fase aquosa, pela adição de um 
sal neutro e inerte (cloreto de sódio 
ou sulfato de sódio) à fase aquosa; 
ajuda a quebrar a emulsão formada 
iii) adicionar um reagente de par iônico, 
desde que seja garantido que o 
composto a ser extraído esteja 
ionizado; 
iv) suprimir a ionização de compostos 
iônicos ou ionizáveis tornando-o mais 
solúvel na fase de solvente orgânico
Extração líquido-líquido (LLE)
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Alguns problemas de ordem prática são possíveis de ocorrer: 
(i) formação de emulsão, principalmente em amostras gordurosas, levam 
à menor recuperação do analito. Adicionar sal, centrifugar, 
aquecer/resfriar
(ii) analitos fortemente adsorvidos a materiais particulados levam a menor 
recuperação: lavar as partículas com solvente orgânico e adicionar o 
volume desse solvente ao solvente usado na extração
(iii) analitos ligados a compostos com alto peso molecular (por exemplo, 
interação fármaco-proteína); 
(iv) solubilidade entre as duas fases
Extração líquido-líquido (LLE)
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Ajuste do pH do meio aquoso: fracionar solutos em classes em função do 
comportamento ácido-base
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Em análise de traços, muitas vezes se faz necessária a
concentração do analito após extração com solvente,
com o intuito de aumentar a concentração do analito no
extrato.
Se o analito não for volátil, evaporação do solvente
usando fluxo de gás inerte sob a superfície ou
borbulhando no líquido (evitar perda dos analitos mais
voláteis ou perda de analito por gotículas arrastadas).
CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA
Outra possibilidade é usar sistema de rotaevaporação à
vácuo. Entretanto, é difícil transferir quantitativamente
todo o extrato do balão do rotaevaporador para um outro
frasco (perdas podem levar à erros para menos) e também
é difícil medir exatamente volumes pequenos (vial de 1 mL
não são vidrarias volumétricas)
Uso de padrão interno pode contornar erros de volume. 
De que forma? 
Sistema contínuo de extração
liquido-líquido
Solvente orgânico circula continuamente
através da fase aquosa
Aplicável a compostos de baixo Kow 
(< 5)
Equipamento diferente para solventes 
menos densos que a água
Extração líquido-líquido é exaustiva
Evaporação do solvente: 
PRÉ-CONCENTRAÇÃO
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Soxhlet
Metodo clássico de extração líquido-sólido para compostos
orgânicos com ponto de ebulição maior que o solvente
Amostra é envolvida com papel e situada sob um disco poroso,
que permite a passagem do solvente;
Apenas o solvente puro é volatilizado e reinicia o ciclo
Cerca de 300 mL de solvente para cada 1 g de amostra
Substituição por técnicas mais rápidas e limpas
Compostos insolúveis não são extraídos
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TEMPO: entre 6 e 48 de refluxo para extração completa
Escolha do solvente: recuperação pode ser inforior a 100%
Solvente escolhido corretamente: técnica exaustiva
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Extração de compostos orgânicos presentes em material atmosférico
particulado
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Clevenger ou hidrodestilação
Método para extração de óleos essenciais: compostos voláteis
hidrofóbicos presentes nas plantas podem ser arrastados por vapor de
água e recolhidos.
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Extração de compostos orgânicos voláteis (COVs) por headpace
Headspace é o nome dado ao espaço confinado sobre uma amostra (sólida ou
líquida) em um frasco fechado.
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A extração através do headspace é
adequada para compostos majoritários
no headspace (alta volatilidade ou
concentração). Compatível com
cromatografia à gás.
Modo mais simples consiste em
extração do headspace estático com
seringa para gases (volumes 10-500 μL)
e posterior injeção do vapor
diretamente no injetor do GC.
Método de extração muito simples quando comparado aos demais métodos de
preparo de amostra:
Extração de compostos orgânicos voláteis (COVs) por headpace
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Frascos para heasdspace devem ser
fechados hermeticamente, sendo as
tampas de rosca ou por compressão
(crimp), com orifício para deixar o septo
exposto;
Septos auto-seláveis geralmente em
borracha ou silicone. Devem ser trocados
periódicamente ou quando observada
alguma perfuração
Silicone (PDMS) pode absorver compostos das amostras e causar contaminação
cruzada ou efeito memória: película de Teflon® (PTFE) impede a contaminação (USAR
DO LADO CORRETO)
Extração de compostos orgânicos voláteis (COVs) por headpace
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Seringas para gases (gas tight) evitam
perdas da amostra após a
amostragem
Para análises quantitativas, deve-se controlar
a temperatura e o tempo de extração para
minimizar variações;
Deve-se manter a seringa em equilíbrio
térmico com o sistema para evitar a
condensação dos analitos no corpo da
seringa (fria);
Técnica de extração não exaustiva: extração
em equilíbrio: difusão dos analitos da
amostra para o headspace (muito
dependente da matriz)
Agitação
diminui
tempo de
extração
Headpace Estático
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Nesse modo as duas fases (amostra e headspace) permancem
estáticas e a amostragem é feita quando o sistema entra em
equilíbrio. Concentração dos compostos na fase gasosa é
porporcional à concentração na amostra.
Através do balanço de massa, a quantidade de
matéria do analito originalmente na amostra
fica distribuída entre as duas fases
A concentração do analito na fase gasosa é dependente
da concetração original, da constante de partição entre
as fases e da razão dos volumes das fases (β)
Headspace dinâmico ou purge & trap
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Analitos são continuamente extraídos por um gás de purga (purge) e concentrados em
um material adsorvente ou armadilha (trap).Quantidade dos analitos presentes no adsorvente é muito maior que aquela presente
na seringa gas tight (HS estático) = sinal muito maior permite a determinação de
compostos minoritários no HS
BETXs em azeites
HS dinâmico
HS estático
Headspace dinâmico
a) Frit (vidro poroso) permite a passagem de gás de forma
homogênea e maior eficiência de extração: ideal para líquidos
límpidos
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b) Sistema com agulha para suspensões
b) agulha sob a amostra para evitar espuma
Headspace dinâmico
TRAP E MATERIAIS ADSORVENTES
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- Tubo de aço ou vidro com aproximadamente 2,7 mm de diâmetro interno (1/8″ OD) e
comprimento usual de 24 cm;
- preenchidos sequencialmente com múltiplas camadas de adsorventes: o adsorvente
de menor capacidade retensiva na primeira camada, enquanto os mais fortes ficam ao
final (componentes menos voláteis permanecem retidos na primeira camada, enquanto
os mais voláteis que a ultrapassam são retidos nas camadas posteriores)
- dessorção térmica no sentido do fluxo do gás contrário (backflush): compostos menos
voláteis nunca entram em contato com os materiais muito retensivos, onde poderiam
ficar irreversivelmente adsorvidos
Headspace dinâmico
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Principais materiais adsorventes e suas características
- TENAX ®: polímero macroporoso (óxido do 2,6-difenil-p-fenileno), área superficial 50
m2/g. Excelente retenção para compostos pouco polares.
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Amostragem in situ
Folhas intactas
Folhas amassadas
Folhas trituradas
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Extração em fase sólida (SPE)
Técnica na qual os analitos são extraídos exaustivamente de uma solução e
transferidos para um material sorvente sólido, sendo posteriormente eluidos do
sorvente através de um solvente adequado.
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Princípio de retenção da 
cromatografia líquida
Kd = [X]sorvente
[X]líquido
Etapa de concentração: considera-se Kd infinito
(retenção máxima)
Etapa de eluição: considera-se Kd zero
(nada retido no sorvente)
i) Extração/concentração do analito:
- passa-se um grande volume de amostra e analitos são retidos
- analitos são eluídos em reduzido volume de solvente selecionado
- Fator de concentração (razão entre volume da amostra e volume do extrato)
entre 50 e 5000
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ii) Isolamento do analito:
- Tem como objetivo isolar o analito, sem que necessariamente ocorra a
concentração do mesmo
Propósitos da 
SPE
(i) Extração/concentração do analito
(ii) Isolamento do analito
(iv) Estocagem da amostra
(iii) Isolamento da matriz (clean up)
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iv) Estocagem da amostra
- Amostra é tratada por SPE no local da coleta a fim de reter os compostos de
interesse
- Cartucho armazenado em baixas temperaturas e transportado até o local da
análise (evita transportar grandes volumes / evita perda e degradação do
analito)
iii) Isolamento da matriz (clean up):
- O objetivo é reter a matriz e deixar o analito ser eluído diretamente
- Limpeza da amostra, não há concentração
Formatos de SPE
Cartuchos (syringe):
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- seringas de 1-6 mL
- 50 a 500 mg de material sorvente, partículas de 40-60 μm e área superficial ~ 1
cm2;
- filtros PE/PTFE de 20 μm
Formatos de SPE
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- Vazão da amostra e do solvente de eluição devem ser controlados:
reprodutibilidade; evitar secar o cartucho para evitar caminhos preferenciais;
- pressão do líquido sobre o cartucho: seringa ou vácuo;
- sistema Manifold: preparo simultâneo de diversos cartuchos (cuidar
contaminação das partes
- amostrador para grandes volumes
Formatos de SPE
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Discos
- 500 mg de material sorvente e área superficial ~ 12 cm2 (espessura menor)
- amostra deve ser filtrada previamente; macromoléculas pode obstruir as
micropartículas com sorvente;
- sistema de filtação de solvente para HPLC pode ser usado para extração;
- adequado para grandes volumes de amostra (1 - 4 L)
Fases sólidas (sorventes) para SPE
Mecanismos de 
sorção
Adsorção: superficial
Absorção (partição): intrafacial
Exclusão por tamanho
Troca iônica
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- Analitos são sorvidos em uma fase sólida; sorção deve ser reversível;
- Sucesso nas extrações por SPE;
1) Elevada e reprodutível quantidade do analito retida no sorvente
2) Analito removido facilmente e completamente do sorvente
Material sorvente:
- Poroso e com elevada área superficial;
- estabilidade química frente aos solventes e matriz da amostra;
- livre de impurezas que possam ser lixiviadas
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A maioria das fases sólidas para SPE são as fases estacionárias para HPLC, dividida em 3
grupos:
- Sílica quimicamente ligada;
- materiais de carbono;
- materiais poliméricos porosos;
Fases sólidas (sorventes) para SPE
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Fases sólidas: Sílica quimicamente ligada
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Maior parte das fases sólidas disponível comercialmente é baseada em partículas de sílica
ligadas covalentemente através de silanóis da superfície a grupos como C18, C8, C2,
cicloexil, fenil, cianopropil, aminopropil (NH2), além de grupos trocadores de
cátions/ânions
Grupos silanóis superficiais (individuais,
vicinais, geminados) são substituídos
por grupos:
APOLARES (C18, C8, C2, cicloexil, fenil)
são adequados para extração de
compostos apolares ou pouco polares;
POLARES (cianopropil, aminopropil
(NH2)) são adequados para compostos
polares
TROCADORES IÔNICOS: trocadores
baseados em ácido carboxílico ou ácido
sulfônico
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Apolar – fase reversa
Grupos silanóis residuais interferem
muito na fase reversa: adsorção de
água através de ligações de hidrogênio
ou adsorção irreversível de analitos
polares
Interação entre fase estacionária e soluto ocorre através de forças de van der Waals, no
caso de octadecil, octil, etil, fenil, cicloexil.
Estabilidade química frente à soluções aquosas em 1 < pH < 8, sendo que for a dessa
faixa a ligação Si – C é atacada.
Acima de pH 4 grupos silanóis encontram-se dissociados apreciavelmente: a
interferência causada por grupos silanóis não substituídos
Fases sólidas: Sílica quimicamente ligada
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CAPEAMENTO DAS PARTÍCULAS DE SÍLICA: grupos silanóis residuais não substituídos
devido impedimento estérico ou reagente trifuncional são removidos por reação de
silanização com TMS ( reação com trimetilclorosilano)
Fases ligadas quimicamente podem ser obtidas pela ligação dos grupos silanóis com
organosilanóis R-Si-X (R = grupo funcional; X = cloro ou metóxi), no qual o grupo X
interage com a superfície da sílica
Monofuncional
Fase monomérica
Transferência de 
massa mais rápida
Trifuncional
Fase polimérica
Transferência de massa 
mais lenta
Fases sólidas: Sílica quimicamente ligada
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Polar – fase normal
Fases sólidas: Sílica quimicamente ligada
Grupos amino e ciano interagem com
analitos polares através del ligações de
hidrogênio ou dipolo-dipolo
Materiais como sílica, alumina (Al2O3), florisil (sulfato de magnésio) atuam como
ADSORVENTES para espécies polares (NÃO É FASE LIGADA, É ADSORÇÃO) através de
interações hidrofílicas como dipolo-dipolo ou dipolo-dipolo induzido. Adsorção de água
leva a baixa reprodutibilidade e menor interação com soluto.
Sílica
Cianopropil
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Trocador Iônico
Fases sólidas: Sílica quimicamente ligada
Grupos ácido carboxílico (pKa ~ 4,8) e
ácido sulfônicatiônicos fraco co (pKa <
1) são trocadores e forte,
respectivamente. Grupo aminopropil
(pKa ~10) e aminas quaternárias (pKa >
14) são trocadores anionicos fraco e
forte, respectivamente.
- interagem com analitos polares
através de interações eletrostáticas;
- ajuste do pH de extrema importância
para manter os grupos funcionais do
sovente e do analito ionizados;
- cinética do processo de troca iônica é
mais lento que mecanismos de
interação entre compostos
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Sorventes Mistos
Fases sólidas: Sílica quimicamente ligada
Múltiplos mecanismos de sorção em
um mesmo material: o que era um
problema (fase normal + silanol livre)
Partículas recobertas com diferentes
tipos de sorventes são misturadas
homogeneamente no cartucho ou então
dispostas em camadas individuais
Ex: grupo C8 e sulfonato permite extrair um composto orgânico apolar (C8) que
apresente umequilíbrio ácido-base e possa ser protonado (sulfonato)
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Fases sólidas: polímeros de impressão molecular (MIP)
Sorventes muito seletivos (ou até específicos)
para um analito ou classe de analito;
Mais barato e mais simples de produzir que os
imunosorventes;
PREPARO DO MIP = TEMPLATE + MONÔMERO +
AGENTE CROSS-LINKING
Formação de estrutura rígida na presença do analito, que é removido por
solvente: seletividade devido a cavidades com dimensões específicas e
características químicas específicas para o template (ligações de
hidrogênio ou interações hidrofílicas/hidrofóbicas.
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3-Aminopropyltriethoxysilane
Methacrylic acid
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Seletividade do MIP-SPE: a)
amostra pura; b) SPE
convencional; c) MIP-SPE
para medicamento
alfuzosina
Sorventes para MIP-SPE são estáveis em solventes orgânicos e em água;
Ótima seletividade e LDs devido ao uso de grandes volumes de amostra;
Devido à forte interação analito – MIP, o template (molécula do analito) pode não ser
completamente removido durante o preparo do MIP, mas ser lixiviado
subsequentemente durante análise: PROBLEMA DE CONTAMINAÇÃO EM ANÁLISE DE
TRAÇOS
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Procedimento e otimização da SPE
Seleção do sorventes e de solventes de eluição são determinantes em SPE: seletividade e
afinidade baseada nas propriedades dos analito, da fase sólida e da polaridade do
solvente
A matriz da amostra é solúvel em meio aquoso ou orgânico?
Se em água, o analito encontra-se neutro ou ionizado?
Se ionizado, a ionização independe do pH (forte) ou depende do pH (fraco)?
Se analito está não ionizado (neutro) ou se a ionização pode ser controlada (ver
pKa) , ele é polar, moderadamente polar ou apolar?
Se amostra é insolúvel em água, ela é solúvel em solventes orgânicos apolares
(hexano/tolueno) ou em solventes orgânicos polares (metanol/actonitrila)?
O analito neutro é apolar, moderadamente polar ou polar (ver Kow)?
Conhecer essas informações é importante para seleção; ver guia de fabricantes;
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analito
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Força eluentes
Força de eluição para fases polares
Força de eluição para fases apolares
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RECUPERAÇÃO em SPE
A recuperação em SPE depende da eficiência das etapas de concentração e eluição:
recuperação = eficiência de sorção x eficiência de dessorção
Entretanto, etapas de condicionamento ou lavagem mal executadas podel influienciar na
recuperação
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Efeito do volume de dessorção na eficiência de eluição
Para os ésteres de ftalato apresentados, o maior volume de eluição leva a um aumento
na recuperação;
Extração de alquilftalatos
em 1g de C8; 25 ppb, 50 mL
de amostra;
Eluição com HEXANO
Efeito é mais pronunciado em analitos mais polares (porque a interação entre hexano e
DNOP ou BEHP é maior que com DMP e DEP)
Nenhum dos analitos atinge 100% de recuperação: ver eficiência de sorção.
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Como verificar a eficiência total?
Fator de concentração: Volume amostra / volume final do extrato = 50 X
Extração de alquilftalatos em 1g de C8; 50 mL de amostra 25 ppb em água;
Eluição com 10 mL de HEXANO, evaporação do solvente e ressuspensão em 1 mL
Solução padrão em hexano para injetar no GC deve ser 50X mais concentrada que a
amostra aquosa: concentração para comparação 1250 ppb = 1,25 ppm;
Comparar a área dos picos em uma solução padrão de concentração _____ ppb
em hexano com a área dos picos no extrato (em hexano).
Para verificar as etapas de sorção e de eluição individualmente, deve-se proceder
conforme descrito anteriormente (aumentar massa de sorvente / cartuchos em
sequência x aumentar volume de solvente de eluição / trocar solvente)
SPE pode ser não exaustiva??? NÃO!!!
Entretanto, através do uso do padrão interno, perdas nas etapas de sorção e
dessorção para analito e padrão interno podem ser compensadas e parecer que
extração é exaustiva.
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Como verificar a eficiência total?
Colocar 4 passos:
1) Curva analítica em solvente orgânico
2) Padrão aquoso que passou pela SPE
3) Amostra aquosa passou pela SPE
4) Amostra aquosa + spike pela SPE
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- Menor consumo de solventes orgânicos;
- facilidade de automação;
- altos fatores de concentração
- Diversos sorventes disponíveis comercialmente;
- pode ser usado para concentração de metais
- Sorventes específicos: MIP, imunosorventes
- Elevado tempo de preparo;
- custo cartuchos / manifold / automação;
- cartuchos descartáveis;
- baixa reprodutibilidade entre lotes de cartuchos
- entupimento e caminhos preferenciais
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Extração em Fase Sólida