TIPOS DE SEMEADURA E URINOCULTURA

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TIPOS DE SEMEADURA E URINOCULTURA
Os meios de cultura podem ser seletivos ou diferenciais. Os primeiros, como o próprio nome diz, selecionam determinadas espécies pela inibição do crescimento de outras, pela ação de substâncias presentes em sua composição, como antibióticos, corantes, bile ou sais biliares. Um exemplo de meio de cultivo enriquecido e muito seletivo é o Thayer-Martin, no qual crescem apenas as bactérias do gênero Neisseria, por conter vancomicina (inibidor de bactérias Gram-positivas), colistina (inibidor de bactérias Gram-negativas) e nistatina (inibidor fúngico).
Os meios diferenciais são produzidos para isolamento de microrganismos com base em suas características bioquímicas ou fisiológicas, diferenciando-os das demais espécies presentes na amostra. Essa funcionalidade é obtida por meio da adição de um carboidrato e de um indicador de pH ao meio de cultura, possibilitando identificar, pela mudança de cor, devido à acidificação, as colônias que produzem ácidos a partir do carboidrato adicionado.
Também existem meios de cultura seletivos e diferenciais, como o ágar MacConkey, que contém sais biliares e cristal violeta (inibidores de bactérias Gram- positivas e algumas Gram-negativas fastidiosas), e lactose e vermelho neutro (para diferenciação de bactérias lactose-dependentes): bactérias lactose-positivas se apresentam em tons avermelhados, e bactérias lactose-negativas se apresentam transparentes (Figura 1). Outro exemplo é o meio CLED (cisteína, lactato, eletrólito deficiente), muito utilizado em urinocultura, contendo azul de bromotimol: a cor original do meio é verde, tornando-se amarela na presença de bactérias lactose-positivas (Figura 2).
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Figura 1 – Ágar MacConkey. Fonte: Shutterstock.
Figura 2 – Ágar CLED. Fonte: Shutterstock.
O ágar Salmonella-Shigella (SS) é um meio seletivo para esses dois gêneros de bactérias enteropatogênicas, por conter altas concentrações de sais biliares e citrato de sódio, sendo diferencial para outras bactérias Gram-negativas intestinais, por conter lactose e vermelho neutro. Além disso, o meio proporciona diferenciação também entre salmonelas (colônias com centro negro, Figura 3) e Shigella sp. (colônias rosadas). O ágar
sangue de carneiro, por sua vez, proporciona o isolamento de bactérias produtoras de substâncias hemolíticas (hemolisinas), formando um anel claro ao redor da colônia pela lise das hemácias presentes no meio.
Figura 3 – Ágar Salmonella-Shigella (SS). Fonte: Shutterstock.
Para o isolamento dos microrganismos em cultura pura, uma das técnicas mais utilizadas é a do esgotamento, baseada no princípio de que uma célula microbiana isolada origina um agrupamento visível macroscopicamente (colônia) em meio de cultura propício para seu crescimento.
O procedimento consiste na semeadura da suspensão de microrganismos com uma alça de inoculação, de maneira estriada, não sobreposta, e das bordas para o centro da placa, em três regiões diferentes (Figura 4). Dessa forma, a quantidade de amostra na alça vai diminuindo a cada estriação e, ao final da última, as células microbianas estarão separadas umas das outras na superfície do meio – podendo mais facilmente ser identificadas e passadas para um novo meio de cultura, obtendo-se uma cultura pura. Para obtenção de resultados com qualidade, deve-se: a) realizar o maior número de estriações possível; b) não perfurar ou rasgar o ágar, cuja consistência é delicada,
lembrando a da gelatina; c) não voltar com a alça sobre as estrias, de maneira a sobrepô-
las; e d) iniciar a semeadura com uma pequena quantidade de amostra na alça de inoculação.
Figura 4 – Técnica de semeadura por esgotamento. Fonte: UNIRIO (s. d.).
Na urinocultura, o esgotamento é realizado com uma alça calibrada de 10µL ou, mais comumente, 1µL, e o estriamento é realizado por toda a extensão da placa, precedido por uma estria central de cima a baixo (Figuras 5 e 6). Quando a técnica é realizada com alça de 1µL, cada colônia representa 1.000 unidades formadoras de colônia (UFC) por mililitro, ou 103UFC/mL. Contagens superiores a 100.000UFC/mL determinam um resultado positivo; contagens inferiores a esse número, um resultado negativo. No entanto, mesmo resultados negativos podem ser importantes se associados ao sedimento urinário, ao quadro clínico do paciente, a exames anteriores e à relevância do microrganismo isolado (Figura 7).
Figura 5 – Esgotamento em urinocultura. Fonte: Diagnósticos do Brasil (s. d.).
Figura 6 – Esgotamento em urinocultura. Fonte: Ost (2014).
	Contagem (UFC/mL)
	Leucócitos*
	Sintomas
	Isolados
	Interpretação
	Sem crescimento
	Sim/Não
	Sim/Não
	0
	Negativo
	< 100.000
	Não
	Sim/Não
	≥ 2
	ID
	< 100.000
	Sim
	Não
	≥ 1
	ID
	< 100.000
	Sim
	Sim
	1**
	ID + TSA
	≥ 100.000
	Não
	Não
	≥ 1
	ID
	≥ 100.000
	Não
	Sim
	1**
	ID + TSA
	≥ 100.000
	Sim
	Sim/Não
	1**
	ID + TSA
	*Valores considerados ≥ 10 leucócitos por campo.
**Crescimentos superiores a 1 microrganismo devem ser analisados juntamente com o médico para melhor conduta.
Tabela 1 – Condutas para urinocultura. Fonte: Nicésio (2014).
Na urinocultura, comumente se utiliza o espalhamento, uma etapa subsequente ao método das diluições em placas ou seriadas, que serve tanto para o isolamento quanto para a contagem. Para as diluições, caso a amostra seja sólida, em pó ou muito viscosa, é realizada uma homogeneização prévia, seguida de sucessivas diluições em tubos, geralmente em salina ou soluções tamponadas, e na razão de 1 para 10, obtendo- se diluições de 1/10, 1/100, 1/1.000, e assim por diante (Figura 7). Posteriormente, é realizado o plaqueamento (distribuição de uma alíquota de 1mL da diluição) em meio de cultura, originando, após incubação, as unidades formadoras de colônia (UFC) que serão contadas.
Quando o plaqueamento é realizado utilizando-se o método do espalhamento, também conhecido por spread plate, uma alíquota de 0,1mL é espalhada de maneira uniforme sobre o ágar com uma alça de Drigalsky (Figura 8). Após incubação, a contagem deve ser preferencialmente realizada na placa cuja diluição tenha proporcionado o crescimento de 10 a 100 colônias. Assim, a contagem é multiplicada pela diluição correspondente, seguida da correção do volume do inóculo e da obtenção do resultado em número de células/mL da suspensão original. Apesar das dificuldades na contagem de células viáveis, a técnica é amplamente utilizada porque fornece as melhores informações a respeito do número destas, sendo rotineiramente empregada em microbiologia médica, ambiental e de alimentos.
Figura 7 – Contagem por meio de diluições seriadas. Fonte: Madigan et al. (2004).
Figura 8 – Semeadura por espalhamento. Fonte: Madigan et al. (2004).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
COELHO, R. R. R. Técnicas de isolamento e contagem de microrganismos. In: VERMELHO, A. B. et al. Práticas de microbiologia. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2019. Cap. 5, p. 89-103.
DIAGNÓSTICOS DO BRASIL. Técnicas de semeadura. Diagnósticos do Brasil, [s. d.]. Disponível em: https://www.diagnosticosdobrasil.com.br/material-tecnico/semeadura- micro-cartaz. Acesso em: 25 jan. 2021.
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de Brock. 10. ed. São Paulo: Prentice Hall, 2004. Cap. 6, p. 127-154.
NICÉSIO, Raphael Gonçalves. Interpretação da urocultura. Biomedicina Brasil, 2014. Disponível em: https://biomedicinabrasil.com.br/microbiologia/interpretacao-da- urocultura/. Acesso em: 25 jan. 2021.
OST, Adriane. Bactérias microscópicas: fazemos os desenhos com as bactérias e elas fazem a pintura. Pintura Microscópica, 2014. Disponível em: http://pintura- microscopica.blogspot.com/2014/03/bacterias-microscopicas-fizemos-os.html. Acesso em: 25 jan. 2021.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO – UNIRIO. Técnicas de
semeadura. UNIRIO, [s. d.]. Disponível em: http://www.unirio.br/ib/dmp/nutricao- integral/aulas-praticas/Tecnicas%20de%20Semeadura%20-%202019.2.pdf.Acesso em: 25 jan. 2021.