Protocolo Manuseio do Microscópio Óptico

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AULA PRÁTICA 
	
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	Disciplina:
Microscopia e Biologia Celular e Molecular
	Data Emissão:
Abril/2022
	Turma:
Fisioterapia/Medicina
	Período:
1º 
	Versão nº
02
	Prof. Dra. Melissa Negro-Dellacqua
	Autores: Franciely Vanessa Costa, Geovana D. Savi Bortolotto, Tiago Bortolotto, Bruna Daniel Rabelo e Melissa Negro Dellacqua
	ASSUNTO: Microscopia e Focalização
1. OBJETIVO
· Conhecer os tipos de microscópio e aprender a focalizar um microscópio óptico de luz.
	
2. INSTRUÇÕES PARA AULA
· Obrigatório o uso dos materiais de segurança descritos abaixo.
3. SEGURANÇA
· Jaleco;
· Vestimenta comprida (saia ou calça);
· Sapatos fechados. 
HISTÓRICO DO MICROSCÓPIO
	Os povos antigos sabiam que os espelhos curvos e esferas de vidro cheias de água aumentavam o tamanho das imagens. Nas primeiras décadas do século XVII se iniciaram experiências com lentes a fim de obter o maior aumento possível. Em 1609, Galileo Galilei tomou conhecimento dos telescópios e começou a construí-los. Esses instrumentos eram vistos principalmente como elementos de observação da terra e do mar. Galileo, no entanto, decidiu usá-los em direção ao céu. Os impressionantes resultados provocaram uma revolução no mundo do conhecimento da época. 
	Os primeiros microscópios eram simples e bastante limitados em relação à ampliação. Os primeiros que se têm notícia foram construídos na primeira metade do século XVII, com o objetivo de estudar insetos.
Existiam dois tipos de microscópios: o simples e o composto. O simples nada mais era que uma lente montada e o composto estava formado por uma combinação de lentes. Atribui-se a invenção do microscópio composto a Zacharias Janssen na Holanda. Os detalhes do primeiro microscópio não são claros, mas a figura abaixo dá uma ideia do que foi essa invenção.
Figura 1 - Primeiro microscópio atribuído a Janssen
Fonte: https://theamazingbiology.weebly.com/citologia.html
	
Logo depois da invenção de Janssen, em poucos anos surgiram novos desenhadores de microscópios na Europa. Alguns acontecimentos relevantes são apontados a seguir:
· O naturalista holandês Jan Swammerdam observou insetos e também descobriu que o sangue não era apenas um líquido vermelho, mas que possuía corpúsculos que lhe davam essa cor.
· O botânico inglês Nehemiah Grew estudou os órgãos de reprodução das plantas e descobriu os grãos de pólen.
· O anatomista holandês Reigner de Graaf realizou estudos em animais descobrindo certos elementos do ovário que desde então se conhecem como folículos de Graaf.
· Marcello Malpighi foi considerado por suas observações como o fundador da anatomia microscópica e da histologia e descobridor do sistema capilar sanguíneo.
	Os microscópios que se observam na figura 2 são do tempo dos trabalhos de Malpighi.
Figura 2 - Modelos de microscópios italianos do séc. XVII
 
Outro descobrimento importante da época foi o do científico inglês Robert Hooke. Em 1663, dedicou-se à observação da estrutura da cortiça para tentar descobrir o que fazia dela um material tão leve e flutuante. Então teve a ideia de cortá-la em fatias finas o bastante para que pudessem ser observadas ao microscópio. Através das lentes de aumento constatou que a cortiça era formada por um grande número de cavidades preenchidas com ar. Mais tarde, denominou essas estruturas de células. Em 1665, escreveu Micrographia, que contém a descrição detalhada de cinquenta e sete observações realizadas com o microscópio que o próprio autor fabricou, e três observações telescópicas. A obra foi recebida com entusiasmo por uma parte da comunidade científica europeia. 
Figura 3 - Microscópio de Hooke
Fonte: http://curiosidadesdamicroscopiaifam.blogspot.com/2016/06/microscopios-antigos.html
Anton van Leeuwenhoek foi o primeiro estudioso a descobrir o que chamamos hoje de microorganismos, com seu microscópio bem primitivo, conforme mostra a Figura 4.
Figura 4 - Microscópio de Leeuwenhoek
Fonte: http://pt.nextews.com/9cfd28b9/
	Com o passar dos anos, o poder de resolução dos microscópios ópticos foi aumentando com a melhora da qualidade das lentes. Em 1930, surgiu o microscópio eletrônico cuja vantagem é o alto poder de resolução em relação à microscopia óptica. Mais adiante, retorna-se a explicação da microscopia eletrônica.
	A microscopia representou um papel muito importante na comunidade científica, pois representou grandes descobertas em estudos relacionados às áreas da biologia celular, histologia, anatomia, microbiologia e outras áreas das ciências biológicas.
TIPOS DE MICROSCÓPIOS
Microscópio de contraste de fase
O microscópio de contraste de fase foi desenvolvido para aumentar as diferenças entre as células e o meio ao redor, permitindo dessa forma que as células vivas sejam vistas sem que precisem ser coradas. Nos microscópios de campo luminoso é necessário empregar preparações que coram e matam as células.
 
Figura 5 - Esporos de Aspergillus sp. em contraste de fase
 
	O microscópio de contraste de fase tem como vantagem o fato de que as ondas de luz passam através de objetos transparentes, tais como as células, aparecendo em diferentes fases, dependendo das propriedades dos materiais através dos quais elas passam. Esse efeito é ampliado por um anel especial nas lentes da objetiva do microscópio de contraste de fase, o que leva à formação de imagem escura em forma de luz de fundo.
Microscópio de campo escuro
O microscópio de campo escuro é um microscópio óptico no qual o sistema de iluminação foi modificado para atingir somente os lados da amostra. Isto é obtido através de um condensador especial que bloqueia os raios da luz direta e a luz refletida para o exterior através de um espelho posicionado ao lado do condensador em ângulo oblíquo. Cria-se assim um “campo escuro” que contrasta com a borda sombreada das amostras. A microscopia de campo escuro foi muito útil na observação de certos organismos, como o Treponema pallidum, agente causador da sífilis.
Microscópio de Fluorescência
A fluorescência ocorre quando algumas substâncias são irradiadas por luz de certo comprimento de onda e emitem luz com um comprimento de onda mais longo. Alguns organismos fluorescem naturalmente devido à presença de substâncias fluorescentes naturais presentes no interior das células, tais como a clorofila. Aqueles que não fluorescem naturalmente podem ser corados com um grupo de corantes fluorescentes, chamados fluorocromos.
Microscópio Eletrônico
O microscópio eletrônico é um microscópio com potencial de aumento muito superior ao óptico. A diferença básica entre o microscópio óptico e o eletrônico é que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons. Há três tipos de microscópios eletrônicos: de transmissão, varredura e tunelamento.
Microscópio Óptico ou de Luz
É um dos mais utilizados microscópios em várias áreas como hematologia, citologia, parasitologia e microbiologia. O microscópio óptico é composto por partes mecânicas e ópticas. A parte mecânica serve de suporte e a parte óptica é constituída por um sistema de três lentes: o condensador, as objetivas e as oculares. O condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um feixe luminoso sobre o espécime. A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma imagem aumentada do objeto em relação à ocular, que novamente amplia a imagem e a projeta na retina.
A parte mecânica é constituída por:
· Base – suporta o microscópio, assegurando sua estabilidade.
· Braço ou coluna – peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio.
· Tubo ou canhão – cilindro que suporta o sistema de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com as objetivas.
· Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador. Apresenta geralmente 2 pinças destinadas a imobilizaras preparações.
· Parafuso macrométrico – engrenagem cuja rotação é responsável por movimentos verticais da platina, rápidos e de grande amplitude. Permite afastar ou aproximar a platina das objetivas rapidamente. É indispensável para fazer o foco.
· Parafuso micrométrico – afasta ou aproxima a platina das objetivas ao imprimir-lhe movimentos de amplitude muito reduzida, completando o foco. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio.
· Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliações. Por rotação é possível trocar rapidamente de objetivas.
· Charriot – movimenta a lâmina de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina como um todo.
A parte óptica é constituída por:
· Sistema de oculares e sistema de objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A ampliação total dada pelo microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular. A ocular capta a imagem ampliada pela objetiva, ampliando-a, através de seu sistema de lentes e permite sua observação pelo olho humano. As oculares mais usadas são as de ampliação 10X. As objetivas ampliam a imagem do objeto a ser observado, através do sistema de lentes que a compõem.
· Fonte luminosa – existem vários tipos de fontes luminosas, sendo que a mais utilizada é a lâmpada (iluminação artificial).
· Diafragma – regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio. 
· Condensador – distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz que atravessa o diafragma. 
A figura 6 mostra esquematicamente as partes acima descritas.
 
Figura 6 - Elementos de um microscópio óptico
2.5.1 Poder de Resolução do microscópio óptico
	O poder de resolução é a capacidade de o instrumento fornecer imagens diferentes de pontos muitos próximos. O poder de resolução de um microscópio é estimado pelo seu limite de resolução, ou seja, a menor distância entre dois pontos para que eles apareçam individualizados. O limite de resolução responde à seguinte equação:
LR = 0,61. λ
 AN
 
O limite de resolução depende do comprimento de onda λ e da abertura numérica (AN) da objetiva. Por sua vez, a AN depende do índice de refração do meio (n) e do seno do ângulo de abertura (α), segundo a fórmula:
AN = n. seno α
 
	O limite de resolução é inversamente proporcional ao poder de resolução do instrumento utilizado, de maneira que, quanto maior for este, menor será o limite de resolução conseguido.
PRÁTICA 1 - EXERCÍCIO DE VISUALIZAÇÃO NO MICROSCÓPIO – LETRAS
1. OBJETIVO
Aprender a utilizar o microscópio.
2. INTRODUÇÃO
O microscópio óptico, também conhecido como microscópio de luz, compõe-se de uma parte mecânica, que serve de suporte, e uma parte óptica, constituída por três sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular. A finalidade do condensador é projetar um cone de luz sobre as células que estão sendo examinadas no microscópio. Após atravessar as células, esse feixe luminoso, em formato de cone, penetra na objetiva, a qual projeta uma imagem aumentada, no plano focal da ocular, que, novamente, a amplia. A ampliação total oferecida por um microscópio é igual ao aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.
3. MATERIAL
· Um pedaço da folha de um jornal ou as letras escritas em quadrados de papel com 1 cm2
· Tesoura
· Lâmina 
· Lamínula
· Microscópio
· Água
· Conta-gotas
· Pinça
4. PROCEDIMENTO
· Recortar a palavra do jornal ou revista;
· Colocar 1 gota de água sobre a lâmina;
· Colocar a palavra recortada sobre a lâmina;
· Cobrir a preparação com uma lamínula;
· Retirar as bolhas de ar pressionando levemente a lamínula com a pinça;
· Colocar a lâmina sobre a platina do microscópio e prender com as presilhas;
· Com o botão macrométrico, subir a platina até conseguir a focalização. Começar a focar com a objetiva de menor aumento;
· Gire o botão micrométrico para a focalização mais fina;
· Observar o material. As letras observadas no microscópio mostram-se invertidas e rebatidas;
· Para observar em lentes de aumentos maiores, girar o revolver no sentido horário sem mexer no macrométrico, somente no micrométrico. A objetiva de 100X só pode ser usada com óleo de imersão.
Figura 11 - Observação de letras ao microscópio
Ao terminar de usar o microscópio, reduzir a intensidade da luz, desligar a luz no botão de liga/desliga, baixar a platina, retirar a lâmina do microscópio, posicionar a objetiva de menor aumento, retirar o plug da tomada e cobrir o microscópio com capa protetora. Quando for utilizado o óleo de imersão, solicitar a limpeza da objetiva ao técnico responsável. Jamais utilizar óleo nas objetivas de menores aumentos.