TEMA 4 - Microscopia de Luz

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Microscopia de luz
Você vai conhecer as características da microscopia de luz e os componentes de um microscópio, bem
como suas funções e as diversas modalidades de observação existentes. É fundamental que o profissional
de saúde conheça a correta utilização desse equipamento e as possibilidades de aplicação da microscopia
em diagnósticos e pesquisas em saúde.
Profa. Gabriela Cardoso Caldas
1. Itens iniciais
Objetivos
Descrever os conceitos gerais da microscopia de luz e os seus componentes ópticos.
Identificar os diversos tipos de observação em microscopia de luz.
Introdução
A palavra microscópio vem da junção das palavras gregas mikrós, que significa pequeno, e skoppéoo, que
significa observar. A maioria dos conhecimentos atuais sobre a microbiologia e a biologia celular é resultado
do desenvolvimento de técnicas de microscopia, que utiliza a luz (visível ou não) para gerar uma imagem.
Vamos conhecer os princípios e os conceitos gerais da microscopia de luz, bem como os principais
componentes do microscópio convencional. Além disso, vamos descobrir se há diferença entre aumento e
resolução e aprender como garantir a correta iluminação em nossa imagem e como manusear adequadamente
um microscópio.
Por fim, vamos conhecer um pouco sobre os principais tipos de microscopia de luz, os princípios de seu
funcionamento e as suas principais aplicações. Vamos lá!
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Microscópio de Zacharias Janssen
Microscópio de luz
1. Microscopia de luz: princípios e conceitos gerais
Histórico dos microscópios
Confira, neste vídeo, os primeiros microscópios e os cientistas relevantes para o avanço dos estudos com
microscopia. 
Conteúdo interativo
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Com a invenção do microscópio, um mundo novo e fascinante foi descoberto, cheio de possibilidades e
aplicações. Desde a utilização dos equipamentos mais simples até as modernas técnicas de reconstrução de
tecidos em 3D, a microscopia fascina e desperta a curiosidade.
A partir do século XVII, a invenção do
microscópio revolucionou a biologia celular,
trazendo novos conhecimentos e novas
interpretações sobre o mundo que nos rodeia.
Porém, o nome do inventor e a data exata da
criação do primeiro microscópio ainda é motivo
de dúvida.
Alguns historiadores sugerem que o primeiro
microscópio surgiu no final do século XVI, com
o trabalho do fabricante de óculos Zacharias
Janssen. Ao unir duas lentes em um mesmo
eixo, ele conseguiu visualizar estruturas
pequenas e simples.
Contudo, outras teorias apontam que, em 1623, Galileu observava minúsculas partículas com um telescópio
rudimentar.
 
Foi em 1665 que Robert Hooke construiu o equipamento que mais se assemelha aos microscópios de luz
utilizados hoje. Em seu livro, Micrographia (1665), ele apresentou a descrição de suas observações feitas a
partir de um microscópio que se baseava na ampliação da imagem, o que ocorria por meio da combinação de
uma lente ocular com outra objetiva. Nesse livro, há ainda o relato da observação de cortes de cortiça e a
primeira citação do termo células.
Paralelamente, o holandês Anton van Leeuwenhoek também construiu um microscópio e fez observações a
partir da análise de uma cortiça e de microrganismos coletados na água da chuva. Ele é reconhecido por
muitos por suas melhorias ao microscópio.
Ao longo dos séculos, a microscopia se aperfeiçoou, e hoje,
ela nos permite observar os maiores detalhes da estrutura
celular das diferentes formas de vida.
Apesar de os microscópios atuais serem muito mais
complexos do que os do século XVI, eles seguem o mesmo
princípio de associarem lentes para gerar uma imagem
ampliada.
Os diversos tipos de microscopia possuem muitas aplicações. Talvez nenhuma outra invenção tenha
revolucionado tanto a ciência como o microscópio, que permitiu a quebra de paradigmas científicos e
impulsionou o campo da biologia celular.
Atividade 1
O microscópio é, sem dúvidas, um dos equipamentos mais importantes das ciências da natureza. Com relação
à sua história, é verdade que:
A
Zacharias Janssen é o reconhecido inventor do primeiro microscópio de luz.
B
foi no livro Micrographia que Robert Hooke apresentou o termo vírus.
C
os microscópios atuais seguem os mesmos princípios dos primeiros microscópios.
D
os primeiros materiais observados no microscópio foram a grama e o pelo de animais.
E
Zacharias Janssen uniu três lentes em um mesmo eixo para conseguir visualizar estruturas pequenas e
simples.
A alternativa C está correta.
A microscopia se aperfeiçoou muito ao longo dos anos, e hoje temos microscópios de alta tecnologia.
Porém, apesar da maior complexidade, o princípio permanece o mesmo dos rudimentares do século XVI: a
associação de lentes para gerar imagens ampliadas da amostra observada.
Princípios da microscopia de luz
Veja, neste vídeo, as características da luz, a explicação dos fenômenos difração e refração e sua importância
para a formação da imagem final. 
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Também conhecida como microscopia fotônica, ela possui fótons (partícula de energia na forma de radiação
eletromagnética), ou seja, partícula de energia na forma de radiação eletromagnética. Em outras palavras:
trata-se de partículas de luz. Para entendermos o funcionamento dos microscópios, precisamos conhecer as
propriedades e as características da luz.
Atenção
A luz pode ser descrita como uma onda ou um fluxo de fótons, dependendo do fenômeno que
desejamos descrever. Dentro da microscopia de luz, um conceito importante é o espectro da luz, ou seja,
os comprimentos de onda. Ele não se limita ao domínio visível, pois abarca desde ondas de rádio à
radiação gama. A luz que enxergamos está dentro de uma faixa pequena desse espectro, a região
visível, que varia do vermelho ao violeta. 
Quando observamos a luz branca, por exemplo, vemos, na verdade, a soma de todos os comprimentos de
onda que fazem parte da região visível do espectro. A microscopia de luz se interessa justamente por essa
região. Porém, em alguns microscópios, a fonte de luz é dada por lâmpadas de mercúrio, as quais emitem luz
que ultrapassa o espectro visível.
Espectro eletromagnético, demonstrando que apenas uma pequena faixa de onda é
visível aos nossos olhos
Além das características da luz, também precisamos conhecer dois fenômenos físicos de interferência na luz,
que são importantes na formação da imagem final: a refração e a difração. Estudando esses dois fenômenos
vamos entender, por exemplo, a capacidade de resolução de uma lente e a utilização dos meios de imersão.
Fenômenos da luz
Você sabe o que é difração e refração?
Em materiais transparentes, como o vidro ou a água, as ondas luminosas (ou raios) são absorvidas e
reemitidas por moléculas do material até o atravessar inteiramente. Por isso, pode-se enxergar através deles.
Entretanto, essa passagem ocasiona pequeno atraso na propagação e, consequentemente, a velocidade da
onda no material é menor que no ar, resultando em leve desvio ao mudar de meio.
Como isso funciona na prática?
Exemplo
Um lápis dentro de um copo com água parece estar torto ou distorcido. O que ocorre, na realidade, é o
desvio da luz ao mudar de um meio para outro (do ar para a água), pois os índices de refração deles são
diferentes. Na microscopia, conhecer o fenômeno da refração ― mudança na velocidade de uma onda
ao atravessar dois meios com índices de refração diferentes ― é importante para entender por que
utilizamos meios de imersão para lentes objetivas e qual é o impacto deles na geração e na qualidade da
imagem. 
Já a difração é o fenômeno que está diretamente relacionado ao processo de formação da imagem e à
capacidade de resolução de uma lente.
As ondas de luz, emitidas a partir de uma fonte luminosa, tendem a seguir uma trajetória em linha reta. No
entanto, conforme vemos na imagem a seguir, a existência de uma parede com fendas faz com que a luz se
espalhe formando cones de iluminação que, na realidade, representam a luz difratada. Logo, difraçãoé a
capacidade de as ondas desviarem ou contornarem os obstáculos que encontram durante sua propagação,
bem como se espalharem ou alargarem quando atravessam fendas ou orifícios.
Esquema representando o fenômeno de difração da luz
A difração parece um fenômeno complicado e longe da prática da microscopia, não é? Mas vamos trazer para
a nossa realidade para entendê-lo melhor.
Podemos comparar a “parede com fendas” a uma lâmina com algum corte de tecido biológico, em que
diferentes estruturas celulares terão maior ou menor capacidade de interferir na penetração da luz. Em geral,
a fonte de luz dos microscópios fica na base do aparelho, e o feixe de luz atravessa a amostra e permite a
formação de sua imagem. A resolução de uma lente é dada por sua capacidade de captar os raios que foram
difratados.
Atividade 2
Para melhor aproveitamento dos microscópios de luz, é fundamental o conhecimento de certas propriedades
e características dos fótons. Com base em seus conhecimentos, analise as afirmativas a seguir e assinale a
correta.
A
O índice de difração mede a razão entre a velocidade da luz no vácuo e aquela em determinado meio.
B
A luz que enxergamos ocupa grande parte do espectro da luz.
C
Nos microscópios de luz, a luz emitida pela fonte é essencialmente do espectro visível.
D
A refração é um conceito diretamente relacionado à capacidade de resolução de uma lente.
E
Ao serem emitidas por uma fonte, as ondas de luz tendem a seguir trajetória em linha reta.
A alternativa E está correta.
Em um ambiente sem obstáculos, quando as ondas de luz são emitidas, elas tendem a seguir um caminho
retilíneo. Porém, quando encontra um obstáculo, como um corte histológico com estruturas celulares
diferentes, onda de luz se espalha, formando cones de iluminação. 
Conhecendo o microscópio de luz
Acompanhe, neste vídeo prático, os diferentes componentes de um microscópio e tente responder quais são
e para que servem. Veja também as lentes objetivas e o significado das informações técnicas gravadas em
seu exterior a partir de exemplos.
Conteúdo interativo
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Vamos conhecer o microscópio de luz, com ênfase no microscópio de campo claro. Um microscópio pode ser
dividido em dois principais sistemas: o mecânico e o óptico. Conhecer o nome de cada parte e a sua
respectiva função é importante para manusear de maneira adequada esse equipamento tão essencial para as
ciências biomédicas.
O sistema mecânico é composto por diferentes partes, que têm funções específicas e distintas:
1. Pé ou base: confere suporte e apoio para sustentar o microscópio sobre uma superfície.
2. Coluna: sustenta as demais peças e articulações do microscópio, além de ajudar no transporte do aparelho.
3. Platina: é o local em que o material para observação é visto.
4. Charriot: possibilita a movimentação da lâmina (esquerda e direita) conforme o operador desejar, auxiliando
na mudança do campo visual.
5. Pinças: ficam presas na platina e servem para fixar a lâmina com o material de estudo.
6. Revólver: fica localizado logo abaixo do canhão e sustenta as objetivas. É possível rodá-lo no próprio eixo
para trocar a objetiva.
7. Parafusos micrométrico e macrométricos: permitem mover a platina na vertical para focar a imagem. O
micrométrico movimenta a platina delicadamente e é usado para o ajuste fino do foco. Já o macrométrico
possibilita o ajuste inicial do foco, com movimentos mais grosseiros.
Veremos agora quais elementos compõem a parte óptica de um microscópio. Essa talvez seja a parte mais
interessante do aparelho, pois é nela que os mistérios envolvidos na formação e no aumento da imagem são
descobertos.
8. Condensador: concentra os raios luminosos na amostra.
9. Diafragma do condensador: regula a quantidade de luz que entra no condensador, possibilitando o ajuste
do contraste. Existe ainda o diafragma de campo, próximo à fonte de luz, para controlar a intensidade
luminosa.
10. Fonte luminosa: é uma lâmpada de halogênio que fornece a luz do sistema.
11. Lentes objetivas: estão localizadas no revólver. Inicialmente, têm a função de ampliar a imagem com
resolução.
12. Lentes oculares: ampliam com resolução a imagem gerada pela objetiva.
O ajuste dioptria se refere ao ajuste da ocular para promover acomodação para as diferenças de visão do
observador.
Observe na imagem a seguir todos os componentes básicos que foram indicados em um microscópio de luz
convencional!
Apresentação dos componentes básicos de um microscópio de luz convencional
Como é possível observar uma garrafa de cultura de célula, já que algumas não cabem no espaço entre a
platina e a objetiva por serem muito altas? Nesses casos, utilizamos os chamados microscópios invertidos,
nos quais a fonte de iluminação fica acima da platina e, as objetivas, abaixo dela.
Microscópio invertido
Objetivas
As lentes objetivas são talvez o componente mais importante de um microscópio e, geralmente, no revólver,
há quatro objetivas. Elas são fundamentais, pois atuam no ganho em resolução, no contraste e no tamanho do
campo analisado.
Outros elementos do sistema óptico são importantes para corrigir ou modificar o padrão da luz, mas sua
função primordial é ampliar e fazer a manutenção da imagem gerada pelas objetivas.
Revólver contendo as quatro objetivas do microscópio de luz convencional
Ao contrário do que se imagina, uma lente é composta por um complexo sistema óptico que, por meio da
convergência e da divergência dos raios luminosos, consegue ampliar a imagem. Uma objetiva contém em sua
parte externa diferentes códigos e números que indicam todas as suas características e especificações. É
importante que você aprenda a identificar essas informações, pois elas darão dicas de como você deve
utilizar o microscópio e observar sua amostra.
Tudo pronto? Então, vamos lá!
Imagem 9: À esquerda, uma lente objetiva com as informações técnicas gravadas
em seu exterior. À direita, o seu interior, demostrando um conjunto de lentes e a
complexidade do sistema óptico.
No momento da análise do material no microscópio, a escolha das objetivas abrange diversas variáveis, como
o tipo de amostra, a abertura numérica e o tipo de microscopia utilizada.
Talvez você não saiba o significado de algumas dessas informações, e por isso vamos identificá-las. O 
fabricante é o nome da empresa responsável pela produção da lente objetiva. No caso do nosso exemplo, a
empresa é a Zeiss.
Já a denominação compreende a classe e o tipo de correção da lente. É interessante saber que dois tipos de
aberrações ocorrem nas objetivas: esférica e cromática. Alguns recursos são utilizados para corrigir essas
aberrações e melhorar a qualidade da imagem gerada. De modo geral, os fabricantes adotam uma
nomenclatura única, facilitando o entendimento do operador do microscópio.
Esférica, Cromática
EsféricaOcorre quando os raios luminosos focam em uma distância diferente da lente. Isso depende da
distância entre o centro e o ponto de incidência do raio na lente.CromáticaSurge do fato de que os raios
luminosos de diferentes comprimentos de onda não estão focados no mesmo ponto do eixo óptico.
Vejamos a seguir as principais especificações encontradas no campo da denominação. Para isso, observe a
tabela a seguir com mais informações.
DENOMINAÇÃO ESPECIFICAÇÃO
Achromat Utilizada para correção esférica e cromática para duas cores.
Apochromat Utilizada para correção esférica e cromática para quatro cores.
Fluar, FL ou 
Fluor 
Utilizada, principalmente, em microscopia de fluorescência e possui
correção cromática de três ou quatro cores.
Plan Utilizada somente para correção esférica. Achroplan são as
recomendadas para luz transmitida e Epiplan são para luz refletida.
Principais denominações e especificações
Gabriela Cardoso Caldas
Encontramos também em denominação as informações da classe da objetiva, que se refere ao tipo de
aplicação da lente. As principais aplicações são:
LC – long working distance
Microscópios invertidos, que requerem certa
distânciado objeto de análise.
EC – enhanced contrast
Microscópios de fluorescência.
LCI – live cell imaging
Visualização de organismos vivos.
‘C’ – C-Aprochromat
Microscópios confocais.
Ao observarmos a imagem 9, vemos que a objetiva é uma EC, própria para microscópios de fluorescência.
Epiplan indica que é utilizada para luz refletida, e Apochromat significa que essa objetiva corrige tanto
aberrações esféricas como cromáticas para quatro cores.
A palavra magnificação pode assustar à primeira vista, mas significa apenas a quantidade de vezes que a
objetiva consegue ampliar a imagem da amostra de estudo. No nosso exemplo (imagem 9), a objetiva amplia
50 vezes (50x) a imagem. A abertura numérica (AN) determina a eficiência de resolução da objetiva, ou seja,
sua capacidade de captar os raios luminosos, já considerando a difração sofrida, e fornece detalhes da
amostra. No caso da objetiva do exemplo dado (imagem 9), a abertura numérica é de 0,95.
Atenção
Você não precisará calcular a AN, pois o valor está escrito na lente. Entretanto, é necessário entender 0 f
fundamentos do cálculo. A AN é dada pela fórmula: Na fórmula, é o índice de refração do meio entre a
objetiva e a amostra, é a metade do ângulo máximo de abertura da objetiva e sen é seno de . 
Quanto maior o valor de AN, maior também serão o poder de resolução e a necessidade de uso de um meio de
imersão, pois menor será o espaço entre a lente e a lamínula (distância de trabalho).
Como saber se a abertura numérica é alta?
 
A escolha da abertura numérica para melhorar a resolução da objetiva está muito ligada à sua magnificação.
Em uma objetiva de 40x, por exemplo, uma AN de 0,75 é baixa, e o intervalo entre 1,2 e 1,4 é considerado
ótimo. Por outro lado, AN de 0,25 em uma objetiva de 10x é baixa, e é recomendada uma 0,45. Não existe, por
exemplo, uma objetiva de 10x com uma AN de 1,2. Desse modo, por uma questão física e trigonométrica, o
intervalo de AN ideal para suas análises terá que ser analisado juntamente com a magnificação dada pela sua
objetiva.
Observe os dois procedimentos a seguir.
Método de contraste
Algumas situações específicas exigirão conhecimentos adicionais, como é o caso da visualização de
organismos vivos e tecidos não corados. Você precisa prestar atenção, pois esse tipo de amostra necessita
da aplicação de um método de contraste para melhor definir as estruturas da amostra. 
A microscopia de contraste de fase transforma diferenças de fase em diferenças de intensidade
luminosa.
As lentes empregadas na microscopia de contraste são indicadas com “Ph” e contêm um anel de fase em sua
estrutura óptica. Se a indicação for “DIC” ou “Pol” significa que essa objetiva é adequada para a microscopia
de contraste de interferência e a de polarização, respectivamente.
Meio de imersāo
As diferenças de meio interferem na velocidade da luz e, consequentemente, na qualidade e na percepção da
imagem. A luz sofre refração ao passar do vidro da lâmina e da lamínula para o ar e, em seguida, para a
objetiva. Por exemplo, o índice de refração do ar é de, aproximadamente, 1, já o do vidro utilizado em lâminas,
1,5. Existem diversos meios de imersão utilizados na microscopia, e seu uso busca corrigir as diferenças de
índice de refração entre os diferentes meios que a luz ultrapassa no momento da leitura de uma lâmina.
Demonstração da refração sofrida pela luz ao passar por diferentes meios no
microscópio
As objetivas que necessitam de algum tipo de meio de imersão apresentam a indicação por meio de uma faixa
de cores que representa um meio específico. Vejamos os principais.
 
 
COR TIPO DE SUBSTÂNCIA
Preto Óleo de imersão (oil)
Laranja Glicerina
Branco Água
Vermelho Óleo, flicerol ou água
Faixa de cores da objetiva e tipos de substância utilizada como meio de imersão
Gabriela Cardoso Caldas
A indicação de cor na objetiva é muito importante, pois o uso incorreto do meio de imersão pode resultar em
perda significativa de qualidade na imagem ou até mesmo danificar a lente.
O código de cor encontrado em algumas objetivas indica o meio de imersão que deve ser utilizado, como as
cores preta, laranja, branca e vermelha. Outras cores podem ser encontradas, mas elas estão relacionadas ao
tamanho da ampliação. Isso é muito útil quando você tem um revólver contendo várias objetivas e deve
selecionar rapidamente uma ampliação específica. Como no exemplo dado (imagem 10), o código de cor azul
presente na objetiva indica que a ampliação é de 60x.
Comprimento ou extensāo do tubo
Informação gravada na parte externa da objetiva, indicando que ela foi fabricada para ser utilizada a
uma distância fixa (160 mm, correspondente à distância da base da objetiva até as oculares) ou
corrigida para óptica infinita (sinalizada por ∞). Os microscópios mais modernos geralmente utilizam
objetivas de óptica infinita.
Espessura máxima de lamínula
Algumas objetivas exigem o uso de lamínulas de espessuras específicas
para ganhar o máximo de qualidade de imagem possível (Imagem 11). O
sinal negativo ( - ) indica que não há interferência de acordo com a
espessura, podendo ser utilizadas lamínulas diversas. Por outro lado, o
número zero (0) aponta que a lamínula não deve ser utilizada, isto é, a
preparação deve ser feita sem lamínula!
Nesse caso, o cuidado deve ser redobrado para que a objetiva não
encoste na amostra. Na maioria dos casos, a espessura das lamínulas
padrão varia de 0,15 a 0,19 mm. No nosso exemplo (Imagem 9), a objetiva
apresenta número zero!
Atividade 3
Um microscópio de campo claro convencional pode ser dividido em dois sistemas: o mecânico e o óptico. No
sistema óptico, qual é o nome do componente que tem a função de concentrar os raios luminosos na amostra?
A
Coluna
B
Canhão
C
Diafragma do condensador
D
Condensador
E
Objetivas
A alternativa D está correta.
O condensador do microscópio é um dos componentes mais importantes para ajustarmos antes da análise
das amostras, pois sua função é justamente concentrar os raios luminosos, fornecendo a condição
luminosa ideal.
Aumento, resolução e iluminação de Köhler
Acompanhe, neste vídeo, o passo a passo da iluminação de Köohler, abordando a diferença entre aumento e
resolução.
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Você sabia que os microscópios não apenas nos auxiliam ampliando as estruturas observadas, mas também
aumentam a resolução da nossa visão? Por isso, aumento e resolução são coisas diferentes! Vamos entender
melhor!
O olho humano tem um poder de resolução de aproximadamente 0,2 micrômetros, que equivalem à milésima
parte de 1 milímetro. Isso significa dizer que, se olharmos dois pontos separados por uma distância menor que
0,2 micrômetros, vamos enxergar apenas um único ponto em vez de dois. Portanto, para que consigamos
visualizar estruturas separadas umas das outras, é necessário o auxílio de instrumentos ópticos que
aumentem o poder de resolução.
Então, resolução é a capacidade de distinguir dois pontos próximos. Observe na imagem a seguir.
O aumento da resolução permite a distinção de dois pontos com maior clareza
Poder de resolução não é a mesma coisa que poder de aumento. Se você ampliar uma foto várias vezes, as
estruturas separadas por menos de 0,2 micrômetros continuarão aparecendo como um ponto só, como se
fossem um único borrão. Nesse caso, haverá o aumento do poder de ampliação, mas não de resolução. O
surgimento dos microscópios permitiu ao ser humano aumentar tanto o poder de ampliação como o de
resolução das imagens.
Comentário
No microscópio, o aumento obtido é resultado da multiplicação entre o aumento da objetiva e o da
ocular. Por exemplo, se o aumento de uma objetiva for de 100x e o de uma ocular for de 10x, a ampliação
total será de 1000x. 
Iluminação de Köhler
Foi desenvolvida no final do século XIX pelo professor alemão August Köhler e até hoje é usada quase
exclusivamente como o método de iluminação em microscópios. Ela funciona por meio do ajuste dos
componentes do sistema óptico, para que cada umcontribua garantindo a intensidade e a constância da
iluminação na amostra. O professor Köhler sabia que, na microscopia, assim como o uso de boas lentes é
necessário, o controle da iluminação também é essencial.
A iluminação de Köhler é muito importante e fácil de fazer. Observe a seguir.
Imagem A
É preciso ligar o microscópio. Em seguida, coloque uma lâmina qualquer na
platina e focalize. Feche o diafragma de campo. Você deve enxergar um
círculo ou um hexágono.
Imagem B
Mexa cuidadosamente nos parafusos do condensador para centralizar a
imagem no campo.
Imagem C
Ajustando o foco do condensador, deixe as bordas do círculo ou do hexágono
bem nítidas.
Imagem D
Abra o diafragma de campo até que a luz ocupe o seu campo visual, mas sem
ultrapassar muito.
Imagem E
Retire com muito cuidado uma das oculares para a correta observação do
diafragma do condensador, que deve estar aberto em cerca de 80% do
campo.
Atividade 4
João, um estudante de graduação, está cursando a disciplina de análises clínicas e é questionado pelo
professor sobre a diferença entre aumento e resolução. Sobre o assunto, marque a alternativa correta.
A
Aumento se refere à capacidade de visualizar estruturas pequenas, enquanto resolução se relaciona à
ampliação da imagem.
B
Resolução está ligada à capacidade de distinção de dois pontos próximos, enquanto o aumento diz respeito à
multiplicação entre a objetiva e a ocular do microscópio.
C
Resolução permite a distinção de dois pontos com maior clareza, enquanto aumento resulta na visualização de
estruturas separadas.
D
Aumento é a capacidade de ampliar a imagem, enquanto resolução é a habilidade de enxergar objetos
pequenos.
E
Aumento e resolução são termos intercambiáveis. Ambos se referem à capacidade de visualização de
detalhes microscópicos.
A alternativa B está correta.
Enquanto a resolução está relacionada à capacidade de distinguir dois pontos próximos, o aumento é a
capacidade de ampliação da imagem vista no microscópio, obtida pela multiplicação entre a objetiva e a
ocular do aparelho. Contudo, a imagem pode estar ampliada 100 vezes e ainda parecer embaçada, e é aí
que temos a necessidade da resolução. Ela se refere à precisão da imagem focalizada, podendo estar mais
ou menos nítida.
Como utilizar um microscópio?
Confira, neste vídeo, como manusear um microscópio de maneira adequada para explorar todos os recursos
do equipamento. Veja também as recomendações básicas e as boas práticas para a manutenção, o que pode
ou não ser feito, como operar e limpar seus componentes, o passo a passo de como observar uma lâmina ao
microscópio e como limpar com solução de álcool e éter.
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Como você deve saber, o microscópio é um equipamento muito utilizado em diversos laboratórios, auxiliando
tanto em pesquisa como em diagnóstico e na educação. Apesar disso, ele é um equipamento sensível e caro.
Você foi apresentado aos principais componentes do microscópio e aprendeu suas respectivas funções. Esse
conhecimento é importante para que você manuseie esse aparelho da maneira adequada, pois apenas
dominando os procedimentos básicos de operação você poderá alcançar todos os recursos do equipamento,
além de mantê-lo funcionando por mais tempo.
Nunca se deve manusear um microscópio com as mãos sujas ou molhadas nem forçar nenhuma de
suas partes, pois todas devem funcionar suavemente. A lente da objetiva, seja de maior ou de menor
aumento, nunca deve encostar na lâmina ou lamínula. Você não pode focalizar a imagem levantando
a platina com o macrométrico e olhando na ocular ao mesmo tempo.
As lentes devem ser limpas com uma solução de álcool éter (proporção 9:1) e um papel absorvente bem
macio. Não toque nelas diretamente com as mãos. Enquanto não estiver observando sua amostra, evite deixar
a fonte de luz ligada.
Com essas recomendações básicas, vamos aprender como observar corretamente uma amostra no
microscópio.
Passo 1
Ligue o microscópio na tomada. Atenção à voltagem indicada no aparelho!
Passo 2
Ajuste a intensidade da luz.
Passo 3
Use a objetiva de menor aumento para focalizar e, em seguida, faça a iluminação de Köhler.
Passo 4
Mude a objetiva para o aumento seguinte, se for do seu interesse. Ajuste o foco com o micrométrico.
Passo 5
Terminou a observação? Diminua a luz, desligue-a e retire o cabo da tomada.
Passo 6
Desça a platina ao máximo, retire a lâmina e volte o revólver para objetiva de menor aumento.
Passo 7
Cubra o aparelho com uma capa plástica ou de pano para melhor conservá-lo.
Quando utilizar as objetivas, elas necessitam de um meio de imersão. Nesses casos, alguns cuidados
adicionais devem ser adotados. Com auxílio de um papel bem macio, delicadamente, seque o óleo de imersão
da objetiva. Tenha muito cuidado, pois você pode acabar arranhando a lente. Em seguida, utilize a solução de
álcool éter para retirar os resquícios do óleo.
Atividade 5
Imagine que um aluno, ao mexer de forma inadequada nos componentes do microscópio de luz convencional
para analisar uma lâmina histológica, quebrou a lâmina e trincou a objetiva de 100x. Esse episódio poderia ser
evitado se:
A
ele tivesse limpado a lâmina com solução de álcool e éter antes da análise.
B
o estudante tivesse ajustado cuidadosamente o micrométrico, sem olhar na ocular, e só depois focar.
C
o aluno tivesse encostado a objetiva na lamínula com o auxílio do macrométrico.
D
o alunado tivesse utilizado óleo de imersão durante o ajuste da amostra.
E
ele tivesse ajustado a luz a partir dos procedimentos da iluminação de Köhler.
A alternativa B está correta.
Provavelmente, o dano à lâmina e à objetiva foram causados devido à má utilização do macrométrico para
focar a imagem. Como a objetiva de 100x normalmente é a que requer mais cuidado no ajuste com o
micrométrico, a utilização do ajuste grosseiro (macrométrico) sem cuidado pode ter causado os danos. É
importante relembrar que, independentemente da objetiva, o ajuste com o macrométrico é feito sem olhar
na objetiva ao mesmo tempo. Uma vez que esse ajuste é feito, o foco fino é alcançado com o micrométrico.
Verificando o aprendizado
Questão 1
Aprendemos que as lentes objetivas são talvez o componente mais importante de um microscópio. Para que
utilizamos o meio de imersão na prática da microscopia?
A
Melhorar a iluminação da amostra, permitindo o aumento da magnificação.
B
Diminuir a diferença de velocidade da luz ao passar de um meio para o outro, suavizando o efeito da refração
dos raios luminosos.
C
Evitar que a lamínula encoste na lente, o que pode danificá-la.
D
Aumentar a abertura numérica, possibilitando o encurtamento da distância de trabalho.
E
Reduzir o índice de difração, ao amenizar o atrito com a lamínula.
A alternativa B está correta.
Os meios de imersão são utilizados para diminuir a diferença de velocidade da luz entre dois meios,
aproximando os seus índices de refração (IR). Dependendo do IR de alguns meios, a luz pode passar mais
rápida ou lentamente, desviando os raios de luz. Essa diferença diminui a qualidade da imagem.
Questão 2
Vimos que o microscópio é divido didaticamente em dois principais sistemas: o mecânico e o óptico. Assinale
a alternativa que apresenta apenas elementos do sistema óptico de um microscópio.
A
Coluna, lentes objetivas, charriot e diafragma do condensador.
B
Diafragma de campo, condensador, lentes objetivas e parafuso micrométrico.
C
Condensador, diafragma do condensador, lâmpada e lentes oculares.
D
Lentes oculares, lentes objetivas, diafragma do condensador e revólver.
E
Lentes objetivas, canhão, lentes oculares e revólver.
A alternativa C está correta.
Um microscópio é dividido esquematicamente em dois principais sistemas: mecânico e óptico. O
condensador, o diafragma do condensador, a lâmpada e as lentes oculares, assim como as lentes objetivas,
são elementos exclusivos do sistema óptico.
2. Diferentes modalidades de observação em microscopia de luz
Microscopia de campo claro
Explore,neste vídeo, as características gerais da microscopia de campo claro e o processamento de amostras
para ela. O vídeo também vai abordar a clivagem, explicar o processamento, mostrar o bloco de parafina,
explicar a microtomia, mostrar a lâmina branca sem contraste e as lâminas pós coloração.
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Veremos agora a microscopia de campo claro. Na verdade, ela é o tipo mais comum de microscopia e é o mais
utilizado pela maioria dos estudantes e pesquisadores do mundo. Você sabe como ela funciona?
Na microscopia de campo claro, temos uma fonte luminosa de onde parte a luz. Ela é concentrada pelo
condensador, que aumenta a intensidade luminosa e a torna uniforme na amostra. Saindo do condensador, a
luz interage com a nosso espécime e é coletada pela objetiva, que forma uma imagem ampliada. A imagem é
novamente ampliada pelas lentes oculares e, finalmente, chega aos nossos olhos.
Confira esse processo na imagem a seguir.
Mecanismo simplificado de funcionamento do microscópio de campo claro
A partir da utilização das lentes objetivas e oculares que aumentam a imagem com resolução, observamos
estruturas mais detalhadas que não conseguiríamos enxergar a olho nu. O fundo da imagem que vemos é
branco, daí o nome campo claro.
Tecidos biológicos corados com diferentes corantes
Você consegue notar que as imagens anteriores possuem cor? Como isso foi possível?
Para observarmos alguma amostra nesse tipo de microscopia, é necessário que ela possua cor própria... ou
que adicionemos algum corante a ela. Por quê?
As amostras que costumam ser submetidas à visualização por microscopia de campo claro são muito finas ou
delgadas para permitirem interação com a luz. Assim, o contraste que elas oferecem é muito baixo. A adição
de corantes oferece maior contraste entre as estruturas, possibilitando sua correta observação.
Corte de fígado sem corante (à esquerda) e corado com hematoxilina e eosina (à
direita)
A microscopia de campo claro é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas e de pesquisa,
contribuindo enormemente para os estudos de parasitologia, microbiologia, histologia e biologia celular, de
modo geral.
Dependendo da estrutura a ser analisada, existe uma coloração específica? A lista é bem grande, mas vamos
ver duas delas.
Hematoxilina e eosina
É a combinação dos corantes mais utilizados na
histologia. Basicamente, os ácidos nucleicos
presentes no núcleo são corados pela
hematoxilina, ficando roxo azulados. Já a eosina
cora de rosa proteínas do citoplasma, fibras e
organelas, como as mitocôndrias. Hepatócitos,
células do fígado, são corados por hematoxilina
e eosina. Note o núcleo arroxeado, enquanto o
citoplasma é visto em rosa.
Coloração de Giemsa
É a partir dessa coloração que podemos
observar células sanguíneas, como plaquetas e
eritrócitos. Ela pode ser utilizada para a
visualização de protozoários, como o
Plasmodium sp. e o Trypanosoma cruzi. Na
imagem, vemos Trypanosoma cruzi em meio a
eritrócitos humanos, corados por Giemsa.
Atividade 1
A microscopia de campo claro é a modalidade mais comum da microscopia de luz e a mais utilizada nos
estudos de biologia celular e histologia. Com base nos princípios da técnica, analise as afirmativas a seguir e
assinale a correta:
A
A fonte de luz se localiza acima da amostra, para garantir melhor distribuição da luminosidade.
B
A luz é concentrada pelas lentes objetivas e ampliada pelas lentes oculares.
C
O condensador garante a imagem ampliada, que será novamente aumentada pelas lentes oculares.
D
Para calcular o aumento da imagem, é necessário multiplicar o aumento da objetiva pelo da ocular.
E
Para ser possível enxergar qualquer amostra no microscópio de campo claro, a utilização de corantes é
necessária.
A alternativa D está correta.
Quando sai do condensador, a luz interage com a amostra e é coletada pelas lentes objetivas, que formam
uma imagem ampliada (10x, 20x, 40x, por exemplo). Essa imagem é novamente ampliada pelas lentes
oculares, normalmente em 10x, e finalmente chega aos nossos olhos. Se o aumento da objetiva escolhida
for 20x e o da ocular for de 10x, o aumento final é 200x.
Microscopia de polarização
Assista, neste vídeo, às características gerais de um microscópio de polarização, o polarizador e o analisador,
além da birrefringência dos cristais e outros materiais. 
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Você já observou o que acontece quando um raio de luz passa através de certas substâncias, como um
cristal? Ele é dividido, gerando outros. A microscopia de polarização permite que essas substâncias com
capacidade de desviar a direção da luz, chamadas de birrefringentes, possam ser analisadas.
Por que isso acontece? Porque esses materiais birrefringentes possuem dois índices diferentes de refração
para direções de propagação da luz distintas. As substâncias birrefringentes podem estar naturalmente
presentes nos tecidos biológicos ou ser adicionadas às amostras por meio de métodos tintoriais.
Saiba mais
Além de em lindos cristais, podemos encontrar a birrefringência em materiais do nosso dia a dia? O
papel celofane, alguns itens plásticos, a fita adesiva e até fios de cabelo podem ser úteis para observar
essa característica óptica! 
O microscópio de polarização funciona de modo semelhante ao de campo claro comum, possuindo somente
duas diferenças principais: nesse tipo de aparelho, a luz é polarizada através de um prisma chamado de
polarizador, localizado entre a fonte de luz e o espécime. A função do polarizador é selecionar apenas um
plano da luz incidente. Assim, o que passa pela nossa amostra é uma luz polarizada. A luz do sol, por exemplo,
é não polarizada, possuindo várias direções.
Esquema do fenômeno de polarização da luz
A luz polarizada incide em nossa amostra com características birrefringentes e é dividida em dois feixes, que
são desviados. Dentro do tubo do microscópio, entre a lente objetiva e a ocular, encontramos um segundo
prisma, que é chamado de analisador. A função dele é bloquear a passagem da luz incidente que não foi
desviada e selecionar apenas a luz desviada pela amostra birrefringente.
Mecanismo simplificado do funcionamento do microscópio de polarização
Para a realização da microscopia de polarização, é necessário que o polarizador e o analisador estejam
alinhados, formando um ângulo reto que resulta em um fundo escuro.
Caso eles não estejam alinhados, permitindo a passagem seletiva dos raios desviados, não conseguimos ver
absolutamente nada.
Exemplo
Vamos imaginar que estamos em um laboratório e queremos analisar uma fatia de borracha e uma
amostra biológica com características birrefringentes. Para isso, será utilizada a microscopia de luz
polarizada. Quando a amostra é a fatia de borracha, não vamos conseguir observar nada. Isso ocorre
porque a borracha não é refringente, assim os raios de luz não foram divididos pelo objeto, mesmo
quando colocamos a amostra na platina do microscópio, com os prismas alinhados formando o fundo
escuro. O mesmo ocorre quando as amostras não são refringentes. 
Ao analisarmos uma amostra biológica, que seja cristalina ou birrefringente, como fibras musculares, gotículas
de gordura ou espermatozoides, teremos uma imagem sensacional! A partir do ajuste dos prismas e sob o
efeito da luz polarizada, os componentes birrefringentes da amostra desviarão a luz e a imagem final terá um
brilho incrível, em que conseguiremos ver com detalhes os realces, em detrimento dos que não são
birrefringentes.
Músculos da (Piolho d`água)
Desenvolvida em 1828 pelo físico W. Nicol, a microscopia de luz polarizada é utilizada na análise de
macromoléculas, como DNA, fibras de colágeno, amido e celulose. Ela também é usada no estudo de células
que possuem organização de macromoléculas cristalinas, como a célula muscular esquelética e os
espermatozoides, e na análise de tecidos biológicos, como o dente, o tecido ósseo e o cartilaginoso.
Ela não é usada somente nabiologia, pois também é utilizada na mineralogia, sendo aplicada à análise de
componentes cristalinos dos minerais, e em outras áreas.
 Células de batata, com amido de milho, que é birrefringente, sob luz polarizada
A birrefringência de algumas amostras pode ser intensificada por meio do uso de corantes, como é o caso das
fibras de colágeno, que podem ser mais evidenciadas se coradas por Picrosírius. Outro exemplo é o Azul de
toluidina, que evidencia a cromatina e a matriz extracelular.
Atividade 2
A microscopia de polarização funciona de forma semelhante à microscopia de campo claro. Porém, há
algumas diferenças particulares. Sobre esse assunto, analise as afirmativas a seguir e assinale a correta.
A
Na microscopia de polarização, há um polarizador, localizado entre a fonte de luz e a amostra.
B
Na microscopia de polarização, há um polarizador, localizado entre o diafragma do condensador e a objetiva.
C
A função do polarizador é selecionar dois planos de luz incidentes, que passarão simultaneamente pela
amostra.
D
Entre a fonte de luz e a amostra, localiza-se o analisador, que permite a passagem da luz incidente.
E
O analisador seleciona apenas a luz que não foi desviada pela amostra birrefringente.
A alternativa A está correta.
Duas características diferem a microscopia de polarização da microscopia de campo claro – a presença de
um polarizador e de um analisador. O polarizador tem a função de selecionar apenas um plano da luz
incidente e se localiza entre a fonte e a amostra a ser analisada. Já o analisador, encontrado entre a
objetiva e a ocular, bloqueia a passagem da luz incidente que não foi desviada e seleciona apenas a luz
desviada pela amostra birrefringente.
Microscopia de contraste de fase
Confira, neste vídeo, as características gerais da microscopia de contraste de fase, que também contará a
história do físico holandês Zernike, que inventou o microscópio de contraste de fase e recebeu o prêmio Nobel
de física por isso. 
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Para visualizarmos amostras biológicas no microscópio de campo claro, precisamos fixá-las e corá-las. Esses
procedimentos são realizados, na maioria das vezes, por substâncias químicas tóxicas que acabam matando
as células. Por isso, na microscopia de campo claro comum, só conseguimos ver a estrutura da nossa amostra
no instante em que ela for fixada ou corada.
Comentário
Durante muito tempo, a maioria dos detalhes de células vivas não pôde ser observada pelo microscópio
de campo claro comum, porque as estruturas celulares são transparentes e não apresentam contraste
suficiente para serem visualizadas. 
Para resolver esse problema, o físico holandês Zernike inventou o microscópio de contraste de fase e, por
conta da sua importância, recebeu o prêmio Nobel de física em 1953.
A microscopia de contraste de fase permite que possamos visualizar, com detalhes, amostras vivas,
não fixadas nem coradas. 
Para entendermos o mecanismo de funcionamento do microscópio de contraste de fase, precisamos conhecer
seus principais componentes. Assim como o microscópio de campo claro comum, o de contraste de fase
também possui fonte iluminadora, condensador e lentes objetivas e oculares. A grande diferença é que, no
microscópio de contraste de fase, existe um anel de fase no condensador e na lente objetiva, que serve para
receber a luz difratada. Parece complexo, não é? Mas você vai ver que é mais simples do que você imagina!
Acompanhe o que foi descrito na imagem a seguir.
Componentes do microscópio de contraste de fase
A microscopia de contraste de fase se baseia no fato de que a luz difratada (desviada) possui um atraso em
relação à luz não difratada. Então, quando passam pela nossa amostra, os raios difratados apresentam uma
diferença de velocidade (cerca de ¼) em relação aos raios não difratados.
Imagine que você tem uma amostra biológica viva, bem delgada, e liga o microscópio de campo claro comum
para emitir luz nela. Você vai ver uma imagem com um contraste muito baixo, pois boa parte da luz vai difratar,
sem atingir a amostra.
Como o problema de velocidade pode ser resolvido?
 
Atrasando ou acelerando os raios que não foram difratados! E é justamente aí que entram os anéis de fase,
tanto do condensador como da objetiva: eles basicamente aceleram ou retardam esses raios, gerando
diferenças de intensidade luminosa e aumentando a interação entre eles, resultando na melhoria considerável
no contraste da imagem. Para alcançar esse objetivo, primeiro, devemos regular o microscópio, selecionando
os anéis de fase (no condensador e na objetiva).
Para que a fase seja ajustada, retiramos cuidadosamente uma das oculares e alinhamos um anel de fase com
o outro, a área sombreada de um com a do outro. Na imagem final, as partes mais escuras correspondem a
áreas mais densas da amostra, e as partes mais claras estão atreladas às áreas menos densas. 
A microscopia de contraste de fase possibilita a observação de células e tecidos vivos não corados, além de
processos celulares, sendo muito utilizada em pesquisa e análise de microrganismos, secções de tecidos
finos, fibras e partículas subcelulares (como o núcleo). Por conta da sua alta aplicabilidade, pode ser
facilmente incluída nas áreas de hematologia, virologia, bacteriologia e parasitologia.
Relembrando
A microscopia de contraste de fase é uma das modalidades possíveis dentro da microscopia de luz. No
microscópio de contraste de fase, existe um anel de fase no condensador e outro na objetiva. O princípio
da microscopia de contraste de fase reside no fato que a luz difratada possui atraso em relação à luz
não difratada. Para resolver esse problema, usam-se anéis de fase, um localizado no condensador e
outro na objetiva, que aceleram ou retardam os raios que não foram difratados. 
Atividade 3
A microscopia de contraste de fase é uma das modalidades possíveis dentro da microscopia de luz. Sobre
esse assunto, analise as afirmativas e assinale a correta.
A
Ao contrário da microscopia de campo claro, a de contraste de fase necessita que as amostras estejam
fixadas e coradas.
B
No microscópio de contraste de fase, existe um anel de fase na fonte iluminadora, que serve para receber a
luz refratada.
C
No microscópio de contraste de fase, existe um anel de fase no condensador e outro na objetiva.
D
A luz difratada possui aceleração maior em relação à luz não difratada, que é cerca de ¼ a mais.
E
Na imagem final, as áreas mais escuras correspondem às áreas menos densas da amostra.
A alternativa C está correta.
O princípio da microscopia de contraste de fase reside no fato de que a luz difratada possui um atraso em
relação à luz não difratada. Para resolver esse problema, usam-se anéis de fase, um localizado no
condensador e outro na objetiva, que aceleram ou retardam os raios que não foram difratados.
Microscopia de contraste diferencial de interferência (DIC)
Acompanhe, neste vídeo, o microscópio de contraste diferencial de interferência (DIC), no qual se pode
observar amostras não coradas, vivas, com um alto contraste e um diferencial: a percepção de profundidade. 
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Foi desenvolvida pelo físico Georges Nomarsky, em 1952, um ano antes do cientista que inventou a
microscopia de contraste de fase ganhar o Prêmio Nobel.
Utilizando o microscópio de DIC, podemos observar amostras não coradas, vivas, com um alto contraste e um
diferencial: uma sensação de profundidade! Se tivermos amostras mais grossas, que não conseguiríamos
visualizar no microscópio de contraste de fase, podemos utilizar a microscopia de DIC.
No que é baseada a microscopia DIC?
 
No princípio de que as possíveis diferenças de composição ou espessura entre regiões de amostra
apresentam índices de refração variados. Por conta disso, a velocidade da luz que atravessa essas regiões é
diferente.
Vamos agora entender como isso é usado para gerar a imagem final.
O microscópio de DIC possui umpolarizador parecido com o da microscopia de polarização, que vai selecionar
a luz em uma direção única. Depois disso, ela é separada em dois feixes por um prisma, chamado de prisma
de Wollaston. O resultado dessa separação é uma região da amostra iluminada por um feixe, e outra região
iluminada pelo outro feixe.
Depois que interagiram com a nossa amostra, é hora de juntarmos novamente esses feixes. Quem faz isso é
um segundo prisma situado próximo à objetiva. Em seguida, um analisador seleciona os feixes que sofreram
mudança de angulação, por conta dos diferentes índices de refração. Juntando tudo, a combinação e a
interação de todos esses feixes, que alcançaram áreas diferentes da nossa amostra, criam uma imagem de
alto contraste.
Esquema simplificado do microscópio de contraste diferencial de interferência
Dependendo da amostra, a imagem gerada nos dá a sensação de textura e profundidade, diferente da
microscopia de contraste de fase. Além disso, vemos regiões de sombra, que são o resultado justamente dos
diferentes índices de refração.
Embora nos dê imagens lindas, a microscopia de DIC evidência apenas os contornos de grandes
organelas celulares, como núcleos e vacúolos. Então é muito importante saber o que precisamos
analisar.
Observe as imagens a seguir. Você consegue perceber as principais diferenças entre elas? Conseguimos ter
uma sensação de textura e profundidade na microscopia de DIC e não vemos o halo de fase (indicado pela
seta), o que é característico da microscopia de contraste de fase.
Hifa de Cladophialophora carrionii vista por microscopia de contraste de fase
Paramécio observado por DIC.
Atividade 4
O desenvolvimento da microscopia de contraste diferencial de interferência (DIC) é contemporâneo ao da
microscopia de contraste de fase. Com base nos seus conhecimentos em relação à microscopia de DIC,
analise as afirmativas e assinale a correta.
A
Se tivermos amostras muito finas para serem analisadas no microscópio de contraste de fase, podemos usar o
DIC, pois nessa modalidade há sensação de profundidade.
B
A microscopia de DIC se baseia no princípio de que as possíveis diferenças de composição da amostra
apresentam índices de difração variados.
C
O prisma de Wollaston condensa os feixes de luz em um único, direcionado para a amostra.
D
O analisador separa os feixes que sofreram mudança de velocidade, por conta dos diferentes índices de
difração.
E
No microscópio de DIC, há um polarizador semelhante ao da microscopia de polarização, e sua função é
selecionar a luz em uma direção única.
A alternativa E está correta.
No microscópio de DIC há um polarizador localizado logo após a fonte de luz, que seleciona a luz em uma
direção única, semelhante ao que ocorre na microscopia de polarização. Após isso, a luz é separada em
dois feixes pelo prisma de Wollaston, que faz com que uma região da amostra seja iluminada por um feixe e
outra região pelo outro feixe. Após a interação com a amostra, os feixes são novamente unidos por um
segundo prisma. Por fim, um analisador seleciona os feixes que sofreram mudança de angulação, por conta
dos diferentes índices de refração.
Microscopia de fluorescência e confocal
O vídeo mostrará as incríveis imagens que podem ser feitas a partir da microscopia de fluorescência e da
confocal, explorando suas diferentes aplicações na área da saúde, inclusive, para o diagnóstico de câncer.
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Você sabia que algumas substâncias apresentam naturalmente característica fluorescente? Isso acontece
porque, quando são excitadas por uma determinada fonte de energia, elas emitem luz.
Vamos tentar entender melhor com o esquema a seguir. Mas antes, precisamos nos lembrar de um conceito
da física.
O comprimento de uma onda é inversamente proporcional à sua energia, ou seja, quanto maior o
comprimento de onda, menor a energia.
O fenômeno da fluorescência acontece quando os elétrons presentes em uma determinada molécula são
excitados por uma fonte de energia, como a luz UV. Uma vez estimulados por essa energia, eles pulam de
camada eletrônica, migrando para uma camada superior mais energética. Isso dura apenas algum tempo, e
esses elétrons retornam para a sua camada original emitindo luz. Essa luz possui um comprimento de onda
maior (e de menor energia) que a fonte de luz inicial, pois há perda energética na forma de calor nesse
processo de mudança de camada eletrônica (Imagem 22).
Representação do diagrama de Jablonski, esquematizando o fenômeno da
fluorescência
O primeiro microscópio de fluorescência foi construído por August Köhler no início do século XX. Porém, foi
somente meio século depois, com o desenvolvimento de anticorpos ligados a moléculas fluorescentes (os
chamados fluorocromos ou fluoróforos), que a microscopia de fluorescência pode ser amplamente aplicada
nos laboratórios.
Atenção
Fluorocromos ou fluoróforos são um grupo de moléculas capazes de absorver energia na forma de luz de
um comprimento de onda específico e emitir luz em um comprimento maior (com menos energia). A luz
de excitação pode ser dada por lâmpadas de mercúrio de 120 watts (recomendada), que precisam ser
trocadas regularmente para que a intensidade do sinal fluorescente não diminua. 
Os fluoróforos acoplados aos anticorpos presentes nesse tipo de microscopia apresentam espectro de
excitação e emissão conhecidos. A luz é utilizada como fonte de excitação e, como ela apresenta
comprimento de onda diferente do que é necessário para excitar a molécula fluorescente, são utilizados filtros
que separam esses comprimentos de onda e limitam apenas a passagem de determinados comprimentos.
Desse modo, vemos somente as regiões em que houve a ligação do anticorpo conjugado a essa molécula
fluorescente.
Agora que entendemos como ocorre a excitação dos fluorocromos e a posterior emissão de luz, vamos
conversar um pouco mais sobre como funciona a microscopia de fluorescência.
O caminho óptico, aquele feito pela luz, é diferente do que vimos nos tipos anteriores de microscópio.
No microscópio de fluorescência, os raios luminosos passam pelo condensador e pela objetiva antes
de chegarem à amostra. Logo, o caminho que a luz faz para chegar à amostra é o mesmo da luz que é
emitida pela amostra.
 
A luz sai de uma lâmpada policromática e passa pelo condensador, que concentra os raios luminosos.
 
Os raios passam por um filtro de excitação, que seleciona e deixa passar apenas o comprimento de
onda ideal (feixe azul) para excitar o fluorocromo utilizado na amostra. A luz é refletida pelo espelho
dicroico, que tem a função de transmitir comprimentos de ondas específicos e refletir outros.
 
O feixe azul atravessa a objetiva, sendo concentrado na região da amostra, que é iluminada nesse
momento.
 
Os anticorpos conjugados a fluorocromos presentes na amostra são excitados pelo feixe e emitem a
luz que possui comprimento de onda distinto do feixe azul (feixe verde), que volta ao espelho dicroico,
e é transmitida ao filtro de emissão.
 
O filtro de emissão seleciona o comprimento de onda específico e a imagem final pode ser visualizada
diretamente na ocular ou por câmeras específicas.
• 
• 
• 
• 
• 
• 
 
Os filtros de emissão e excitação, bem como o espelho dicroico, ficam no interior de um cubo, o
chamado cubo de fluorescência, localizado acima da objetiva.
Observe toda essa sequência na imagem a seguir.
Esquema simplificado do mecanismo de funcionamento do microscópio de
fluorescência
A microscopia de fluorescência também é extremamente útil nas ciências biomédicas e em diagnósticos,
como o do câncer. A partir da utilização de fluoróforos, podemos localizar estruturas e moléculas específicas
no interior das células ou em tecidos, como também realizar estudos de colocalização de estruturas e
moléculas em uma mesma amostra, usando fluoróforos diferentes.
Além disso, moléculas fluorescentes específicas podem ser injetadas, inclusive, em animais vivos e culturas
celulares viáveis, funcionandocomo rastreadores. Esses métodos são úteis para estudar junções
intercelulares, detectar marcadores de crescimento celular e rastrear a via de fibras nervosas, por exemplo.
Atenção
Na microscopia de fluorescência, é necessário que utilizemos um óleo de imersão especial que evita a
autofluorescência. Além disso, lâminas e lamínulas também precisam ser adequadas para essa
microscopia. A escolha do conjunto de filtros é extremamente importante, pois ele deve ser compatível
com o espectro de excitação e emissão do fluorocromo utilizado. 
Microscopia confocal
Durante nosso percurso pelos tipos de microscopia de luz, vimos que, para observar uma amostra biológica, é
necessário que ela esteja bem delgada, permitindo a passagem da luz. Além disso, a amostra, normalmente,
possui espessuras diferentes em variadas áreas, o que resulta em imagens que estão no foco e fora dele.
Amostras muito espessas criam uma imagem borrada justamente por possuírem muitos planos fora de foco. 
• 
Mesmo em uma amostra delgada, a focalização da imagem ocorre em todos os planos ao mesmo
tempo.
Vamos sempre observar todas as nossas estruturas em um único plano, sem conseguirmos juntar todos os
planos de foco para montar uma imagem tridimensional. E não é novidade para ninguém que todos os
organismos são tridimensionais.
A microscopia confocal, que é uma espécie aperfeiçoada de microscopia de fluorescência, permite-nos ver os
detalhes de diversos planos de focalização da amostra, um de cada vez, e juntá-los no final, formando uma
imagem tridimensional.
Cultura de fibroblastos humanos observada por microscopia confocal. O núcleo está
em vermelho, enquanto o verde marca filamentos de actina e o azul, os filamentos
de tubulina
O princípio da confocalidade é a base da microscopia confocal e foi descrito pela primeira vez em 1955. No
microscópio confocal, encontraremos duas barreiras físicas, com uma distância entre si do tamanho de uma
cabeça de alfinete (o chamado pinhole).
Ele se encontra no mesmo plano focal da amostra e impede a passagem de luz das regiões que não estão no
foco. Além disso, o pinhole funciona como um divisor de feixes luminosos, que vão incidir em diferentes planos
da nossa amostra.
Representação esquemática dos anteparos físicos e do pinhole
A maioria dos microscópios confocais utilizam lasers como fontes de iluminação. Entenda como isso ocorre:
Deixando a fonte, o feixe luminoso é dividido pelo pinhole em outros feixes, que caminham até o
espelho dicroico. Lá, eles serão refletidos de diversas maneiras, por conta dos diferentes ângulos que
encontram esse espelho.
 
Sendo refletidos, os feixes incidem em diferentes pontos da amostra marcada com fluoróforos, assim
como na microscopia de fluorescência.
 
Sendo absorvidos pelas moléculas fluorescentes, os feixes luminosos emitem outros raios com outros
comprimentos de onda, que passam pelo espelho dicroico e são captados por detectores especiais,
chamados de fotomultiplicadores.
A função dos fotomultiplicadores é captar os fótons emitidos e gerar sinais elétricos com intensidade
proporcional à quantidade de sinal captado. Perceba que apenas a fluorescência emitida pelo plano em foco
será captada pelo detector, enquanto todos os outros planos que não estão em foco são eliminados pelo
pinhole.
Veja a próxima imagem para entender melhor o mecanismo de funcionamento do microscópio confocal.
Mecanismo simplificado do funcionamento do microscópio confocal
Ao aproximarmos e afastarmos a amostra da objetiva, conseguiremos variar o plano em foco. Com o uso da
computação, as imagens geradas nos diferentes planos focais podem ser reunidas e utilizadas para formar
uma única imagem da nossa amostra, com características tridimensionais.
A vantagem da utilização da microscopia confocal é, sem dúvida, a aquisição de imagens com maior
detalhamento das estruturas e a possibilidade de reconstrução tridimensional das amostras. Além disso, como
os planos fora de foco são eliminados pelo pinhole, podemos analisar amostras mais espessas, como biofilmes
bacterianos e estruturas fúngicas, pois somente o plano em foco será observado. Ou seja, podemos analisar e
estudar espécimes que são variáveis e fixos, sem a necessidade de cortá-los em fatias finas.
• 
• 
• 
Atenção
Por se tratar de uma iluminação a laser, que é uma luz contínua em forma de ponto, não conseguimos
formar uma imagem completa do campo. A imagem final, na verdade, é uma montagem feita pelo
computador a partir da aquisição de todos os pontos focais. Por esse motivo, não conseguimos observar
a imagem diretamente nas oculares do microscópio. 
Atividade 5
Em um laboratório de pesquisa em arboviroses, um aluno de iniciação científica desenvolve seu projeto de
TCC. Seu objetivo era descrever o papel das células do sistema imune no desenvolvimento da Febre do Zika.
Após conversar com seu orientador, ele desenhou um experimento que consistia em marcar linfócitos B com o
marcador CD19 e saber se eles estariam infectados pelo vírus Zika, por meio da detecção da proteína NS3.
Inicialmente, ele ficou em dúvida, pois seria necessário visualizar duas marcações ao mesmo tempo, por meio
da diferença de cor. Ao explicar sua dúvida ao orientador, ele descobriu que um determinado tipo de
microscópio de luz possibilitaria o experimento. Esse microscópio em questão é o:
A
de campo claro.
B
de fluorescência.
C
de polarização.
D
de contraste diferencial de interferência.
E
de campo escuro.
A alternativa B está correta.
Na microscopia de fluorescência, podemos utilizar anticorpos ligados a moléculas fluorescentes
(fluorocromos), com espectro de excitação e emissão conhecidos. Dessa forma, dependendo do
microscópio, podemos até marcar mais de duas estruturas.
Verificando o aprendizado
Questão 1
Você é responsável por um grande centro de microscopia multiusuário e recebe de um aluno de iniciação
científica uma lâmina de fígado de paciente, marcado com diferentes fluoróforos. Ele pede sua ajuda para
observar as estruturas marcadas com grandes detalhes. Pelas condições da amostra apresentada, qual seria
a microscopia que você indicaria para esse usuário?
A
Microscopia de contraste de fase.
B
Microscopia confocal.
C
Microscopia de campo claro.
D
Microscopia de fluorescência.
E
Microscopia de contraste diferencial de interferência.
A alternativa B está correta.
Essa técnica permite a visualização de amostras (viáveis ou não), marcadas com fluoróforos, em diferentes
planos focais, proporcionando uma imagem com alto ganho de resolução.
Questão 2
(INMETRO 2010 -Tecnologista em Metrologia e Qualidade – MODIFICADA) Nos microscópios de fluorescência,
temos alguns componentes essenciais, como os filtros de excitação e emissão e o espelho dicroico. Sobre
esse assunto, assinale a opção correta.
A
Os filtros de emissão são lentes associadas à fonte luminosa do microscópio de fluorescência, que regula a
intensidade de emissão de luz sobre as amostras.
B
Os filtros de excitação são lentes transparentes colocadas após as lentes objetivas de forma a intensificar a
emissão da imagem luminosa para as lentes objetivas, contribuindo, dessa forma, com a ampliação final da
imagem adquirida.
C
A escolha dos filtros a partir dos fluoróforos utilizados nas amostras não interfere na visualização da imagem,
já que todos eles podem ser excitados por qualquer comprimento de onda.
D
A função básica do espelho dicroico na microscopia de fluorescência, situado dentro do chamado cubo de
fluorescência, é refletir os raios luminosos de comprimento de onda para excitação do fluoróforo e transmitir
os raios de comprimento de onda de emissão do mesmo.
E
Os filtros de excitação são elementos que absorvem a luz incidente no microscópio de fluorescência,
reduzindo a intensidade de emissão de luz sobre as amostras.
A alternativa D está correta.
No caminho óptico do microscópio de fluorescência, o raio luminoso de comprimento de onda específico
para excitar o fluoróforo presente na amostra é selecionado pelofiltro de excitação. Uma vez selecionado,
esse raio é refletido pelo espelho dicroico, atravessa a objetiva e alcança a amostra. Os comprimentos de
onda dos raios emitidos pela amostra são transmitidos pelo espelho dicroico e direcionados ao filtro de
emissão. O filtro de emissão selecionará o comprimento de onda específico e a imagem final poderá ser
visualizada diretamente na ocular ou por câmeras específicas.
3. Conclusão
Considerações finais
O que você aprendeu neste conteúdo?
Os princípios e as características da luz, que são a base para o estudo da microscopia, como
comprimentos de onda, difração e refração.
 
Os principais componentes do microscópio, como platina, charriot, canhão e condensador, além de
suas funções e a importância das objetivas na resolução, no contraste e no tamanho do campo
analisado.
 
A diferença entre ampliação e resolução e como isso interfere na análise das amostras.
 
Como é feito o correto ajuste de iluminação para obtermos uma imagem com qualidade, utilizando os
sistemas óptico e mecânico do microscópio, por meio da iluminação de Köhler.
 
As principais modalidades de observação em microscopia de luz, como a de campo claro, a de
polarização e a de fluorescência, bem como suas diferenças e especificidades.
As múltiplas aplicações da microscopia nas ciências biomédicas, como nas análises clínicas, na
pesquisa e no diagnóstico.
Explore +
Para aprofundar os seus conhecimentos no assunto estudado neste tema, recomendamos os seguintes
materiais:
 
No canal Escola CVI, que você pode encontrar na internet, há uma série completa de vídeos sobre os
diferentes tipos de microscopia de luz. Pesquise por Conceitos gerais de microscopia.
 
No canal LabMeM UFSLag, na internet, busque o vídeo Introdução à microscopia, que apresenta a
descrição dos componentes do microscópio e as dicas de manuseio.
 
No canal CePOF & INCT Óptica Básica e Aplicada, na internet, busque o vídeo História da microscopia
óptica e conheça mais sobre a história dos microscópios.
 
A microscopia de fase e DIC apresenta diferenças. Para visualizá-las de forma interativa, bem como
outros conceitos de microscopia de luz, visite o site da Nikon e leia o artigo Microscopy the source for
microscopy education. Se precisar, utilize alguma ferramenta de tradução on-line.
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Para ler um pouco mais sobre as diferentes modalidades de microscopia de luz, visite o site da Kasvi e
leia a reportagem Microscópio – conheça as diversas técnicas de microscopia.
Referências
CORRÊA, J. R. et al., Microscopia confocal básica. Brasília, DF: Universidade de Brasília, 2015.
 
DAVIDSON, M.; ABRAMOWITZ, M. Optical microscopy. Wiley Online Library, 2002.
 
DE SOUZA, W. Microscopia Óptica: fundamentos e aplicações às Ciências Biomédicas. 1 ed. Rio de Janeiro:
Sociedade Brasileira de Microscopia, 2010.
 
MACHADO, M. P.; MANSO, P. P. de A. Microscopia da luz. In: MOLINARO, E. M.; CAPUTO, L.; AMENDOEIRA, M.
R. (Org.) Conceitos e métodos para a formação de profissionais em laboratórios de saúde. Rio de Janeiro:
EPSJV; IOC, 2009.
 
MANNHEIMER, W. Microscopia dos materiais: uma introdução. Rio de Janeiro: E-papers Serviços Editoriais,
2002, 221 p.
 
TEIXEIRA, F. S. Microscopia óptica. Portal da Microscopia – USP. Consultado na internet em: 15 set. 2020.
 
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2017.
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	Microscopia de luz
	1. Itens iniciais
	Objetivos
	Introdução
	1. Microscopia de luz: princípios e conceitos gerais
	Histórico dos microscópios
	Conteúdo interativo
	Atividade 1
	Princípios da microscopia de luz
	Conteúdo interativo
	Atenção
	Exemplo
	Atividade 2
	Conhecendo o microscópio de luz
	Conteúdo interativo
	Objetivas
	LC – long working distance
	EC – enhanced contrast
	LCI – live cell imaging
	‘C’ – C-Aprochromat
	Atenção
	Método de contraste
	Meio de imersāo
	Comprimento ou extensāo do tubo
	Espessura máxima de lamínula
	Atividade 3
	Aumento, resolução e iluminação de Köhler
	Conteúdo interativo
	Comentário
	Iluminação de Köhler
	Imagem A
	Imagem B
	Imagem C
	Imagem D
	Imagem E
	Atividade 4
	Como utilizar um microscópio?
	Conteúdo interativo
	Passo 1
	Passo 2
	Passo 3
	Passo 4
	Passo 5
	Passo 6
	Passo 7
	Atividade 5
	Verificando o aprendizado
	2. Diferentes modalidades de observação em microscopia de luz
	Microscopia de campo claro
	Conteúdo interativo
	Hematoxilina e eosina
	Coloração de Giemsa
	Atividade 1
	Microscopia de polarização
	Conteúdo interativo
	Saiba mais
	Exemplo
	Atividade 2
	Microscopia de contraste de fase
	Conteúdo interativo
	Comentário
	Relembrando
	Atividade 3
	Microscopia de contraste diferencial de interferência (DIC)
	Conteúdo interativo
	Atividade 4
	Microscopia de fluorescência e confocal
	Conteúdo interativo
	Atenção
	Atenção
	Microscopia confocal
	Atenção
	Atividade 5
	Verificando o aprendizado
	3. Conclusão
	Considerações finais
	O que você aprendeu neste conteúdo?
	Explore +
	Referências