2-aula-antibiograma

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Determinação de 
sensibilidade bacteriana 
aos antimicrobianos
Prof. Adj. Ary Fernandes Junior
Departamento de Microbiologia e Imunologia
Instituto de Biociências – UNESP
Tel. 14 3880.0412/0413
ary@ibb.unesp.br
O diagnóstico laboratorial das doenças 
infecciosas começa com a indicação clínica 
adequada do exame microbiológico, o que 
requer conhecimento da epidemiologia e da 
fisiopatologia do processo infeccioso.
Diagnóstico microbiológico
requer o conhecimento e a colaboração
de vários profissionais
A coleta e o transporte da amostra são 
etapas críticas na execução do exame 
microbiológico.
A suspeita clínica do processo 
infeccioso determinará o tipo de amostra 
clínica que deve ser enviada ao 
laboratório para confirmar, estabelecer ou 
complementar o diagnóstico clínico
Representação esquemática do fluxograma da 
amostra clínica enviada para o exame microbiológico
Identificação laboratorial de patógenos clínicos
(Fase analítica)
Antibiograma
Auxiliar o clínico com a escolha do 
antimicrobiano a prescrever para o 
paciente
pois verifica se a bactéria pesquisada é 
sensível ou resistente aos antimicrobianos 
testados.
Antibiograma 
(Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI), 
Princípio da Diluição Princípio da Difusão
1.Métodos baseados na diluição da 
droga
Diluição em caldo  Concentração 
Inibitória Mínima (CIM) e Concentração 
Bactericida Mínima (CBM)
Diluição em meio de cultura sólido 
diluição em agar CIM
Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio)
Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos 
agentes antimicrobianos e envolve a preparação de 
diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por 
exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/mL) em um meio de cultura líquido, 
o qual permitirá o crescimento bacteriano.
Determinação da CIM pelo método da diluição em 
caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.
Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)
Apresentação de uma 
placa utilizada no 
teste de microdiluição, 
após sua inoculação e 
incubação.
1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 µg/mL
Controles
positivos
2.Métodos baseados na difusão da 
droga
Princípio do método de Kirby - Bauer
Parâmetros a serem padronizados: meio 
de cultura, discos, inoculação do germe 
no meio, incubação das placas, leitura e 
interpretação
a.Controle de qualidade
http://3.bp.blogspot.com/-dDd_cDJPy6o/Tzl1Yu-OKiI/AAAAAAAAAnU/yecVEMC7mjA/s1600/discos_antibiograma.jpg
Meio de Cultura (Mueller-Hinton  Meio Padrão)
Permite crescimento satisfatório da maioria dos 
germes não fastidiosos; 
Não interfere com a atividade da droga 
(Ex.: peptonas – sulfas; Mg++ - gentamicina; Ca++, 
Fe++, Mg++ - tetraciclinas)
São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico) 
com camada do meio de 6 mm de espessura
Método de Kirby-Bauer
Inóculo (Padronizado)
Preparo: Transferir para um tubo com BHI 
(Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria 
em estudo; incubar a 37oC; obter densidade 
equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5 
(1,5 x 108 UFC/mL)
Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o 
correspondente a turvação mostrada em 
solução contendo 0,5 mL de BaCl2 a 1% em 
99,5 mL de solução de ácido sulfúrico a 1%)
0,5 1,0 2,0 3,0
Tubos da escala de McFarland 
posicionados em frente do cartão de 
Wickerham.
Comparação da escala 0,5 de McFarland com 
suspensão bacteriana 
(E. coli ATCC 25922)
Semeadura: Swab estéril; retirar excesso 
de caldo e semear na superfície do meio 
uniformemente; secar em temperatura 
ambiente por 3 a 5 minutos.
Importante: número de colônias 
utilizadas (várias); material contaminado 
com flora normal (não usar colônias 
provenientes de meios de 
enriquecimento); variações na densidade 
do inóculo possibilitam variações também 
no tamanho do halo de inibição
Discos
Aplicação: pressionar levemente contra a 
superfície do meio e pelo menos 2 cm da 
borda da placa e a pelo menos 3 cm um 
do outro (evitar halos de inibição em 
fusão); usar apenas um disco de cada 
grupo de drogas (concentração única)
Características: papel de filtro adequado; 
concentração de droga suficiente; prazo 
de validade; controle de eficiência
Incubação das Placas
Em temperatura (37oC) e atmosfera 
adequada para o crescimento da 
bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10% 
de CO2)
Atmosfera influi na atividade das drogas: 
tetraciclina, meticilina e novobiocina –
CO2; estreptomicina e canamicina -
anaerobiose
Leitura das Placas
Após 18-24 horas de incubação; usar 
compasso ou régua para determinar o 
diâmetro do halo de inibição; colônias 
dentro do halo sugerem mutantes 
resistentes ou contaminantes.
Halo de 
leitura em 
mm
Interpretação
resistente, moderadamente resistente ou 
sensível, de acordo com o halo de 
inibição; 
há correlação inversa entre concentração 
inibitória mínima e diâmetro do halo de 
inibição.
Kirby e Bauer – Método dos discos
Halo de inibição (mm)
Resistente Intermediário Sensível
C
IM
 (
µ
g
/m
L
)
Etest® ( teste da elipse = Episilometer test)
Apresentação do Etest® para avaliação da CIM após 
incubação
Área de 
Crescimento 
bacteriano
Fita graduada 
de material 
impermeável
“Elipse de 
inibição”
Concentração 
Inibitória Mínima 
(CIM)
--lactamaseslactamases do Grupo 1 (do Grupo 1 (AmpCAmpC))