TRANSPOSONS

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TRANSPOSONS
GENÉTICA II
Histórico:
· experimentos iniciais sobre mutação: Morgan (com Drosophila) - segregação dos cromossomos, descrição de mutantes, distância de ligação, etc
· ideal de experimentos com a mosca: ciclo de vida curto e de fácil manutenção
· ~ 1920: início de estudo de outros organismos modelo, como o milho (Zea mays)
· vantagens do uso do milho: fácil cultivo, planta monóica, com flores facilmente diferenciáveis, já que as flores masculinas são distais, há uma facilidade na manipulação dos cruzamentos e possui cromossomos grandes
· Barbara McClintock ⇒ base genética da coloração dos grãos
· uma das variedades estudadas foi o milho cálico: variegação na cor da aleurona (camada externa do endosperma das sementes)
 
· ao cruzar uma planta com grãos roxos (CC- ou seja, dois alelos dominantes) com uma de grãos “brancos” (c- um alelo recessivo), originava-se uma planta com espiga variegada (mesmo que havia 2 alelos dominantes para a cor roxa)
· em seus estudos anteriores, ela verificou que os genes para a expressão da antocianina (pigmento roxo) estava no cms 9, o qual possuía uma espécie de nó (uma constrição secundária) na parte distal do braço p 
· nas plantas sem pigmentação dos grãos, havia uma quebra frequente do braço do cromossomo 9 
· com a quebra, seria perdido o alelo dominante; as células filha dessa célula inicial que sofreu uma quebra, também teriam o fenótipo recessivo
· Outros genes marcadores do cms 9:
· Wx (wax): produção de cera
· Sh: configura um fenótipo rugoso nos grãos
· C: coloração
· Ds: não é um gene marcador, mas sim uma região do cromossomo em que frequentemente há a quebra ⇒ fator de dissociação
· qnd havia a quebra, todos os genes eram perdidos em bloco, configurando o fenótipo variegado no grão (uma região sem cor, sem cera 
· em alguns casos, havia a perda de cor, porém não havia quebra do cromossomo
· nesses casos, o fator de dissociação tinha se movimentado para dentro do gene C, inativando-o 
· fator Ds não atuaria sozinho, ficando em conjunto com um fator ativador (Ac), que realizaria a transposição do Ds para outras regiões
· Haveria, então, 4 estados para os genes de coloração:
1. wild type:com coloração
2. gene com Ds inserido dentro de sua região: ausência de coloração (gene inativado)
3. gene com Ds inserido dentro dele, porém com a presença do fator Ac em alguma região relativamente próxima: fenótipo variegado, já que o fator Ds poderia ser translocado para outra região, revertendo o fenótipo descolorido
4. gene com Ac inserido dentro de sua região: fenótipo variegado
· Agora entramos realmente na matéria atual, saindo do histórico
· Transposons: sequências discretas que são capazes de se transportarem para outros locais no genoma
· Diferentes tipos, divididos em classes:
· Classe 1: presentes apenas em eucariotos. São os retrotransposons.
· Mecanismo: transposon é transcrito em RNA, o qual é retrotranscrito (ou seja, RNA → DNA) em um DNA complementar e inserido em outro local do genoma. 
· transposon não sai do local, mas há sua amplificação e inserção do mesmo em outros locais 
· Classe 2: presentes em eucariotos e procariotos; são mais simples e com mecanismos menos complexos. 
· Mecanismo: Elemento transponível é excisado de uma região e inserido em outra parte do genoma. 
· transposon não é amplificado; basicamente sofre uma clivagem e é reinserido em outro local
 
· Categorizados “vulgarmente” em transposons de cópia e cola, replicativos e retrotransposons
Transposons em Procariotos
Tipos:
1. “Corta e Cola”
a. IS (insertion sequences): são as formas mais simples de transposon bacteriano
· codifica a enzima necessária para a transposição ⇒ transponase, sendo que a ORF está flanqueada por repetições invertidas nos extremos
· podem se inserir tanto no cromossomo como em plasmídeos
· Mecanismo:
· sequência alvo é clivada pela transposase, gerando extremos coesivos → transposon (IS) é inserido → polimerase e ligase fazem a polimerização do DNA e a ligação das regiões
· identificação do transposons: sempre estarão flanqueados por uma repetição direta da sequência alvo (originada pela DNApol) nas extremidades e também pelas repetições invertidas
· sequência alvo não é aleatório, cada transposon apresenta uma especificidade à uma sequência de nucleotídeos
b. Transposons compostos: incluem genes extras (não associados com a transposição em si) entre duas sequências de inserção (geralmente genes de resistência a antibióticos)
· basicamente são 2 IS com um gene extra no meio; podem se movimentar pelo genoma de 2 formas: (I) em bloco, levando os genes extras para outras partes do genoma/plasmídeo; (II) independente, levando apenas o próprio IS
· tamanhos variados
· Quanto à orientação dos IS:
· as duas podem estar na mesma orientação (Ex: Tn9)
· as duas podem estar em orientações opostas *(Ex: Tn5, Tn10)
* um IS codificado em uma das fitas e o outro na fita complementar (as orientações de leitura da RNAP são diferentes)
· Mecanismo:
· transposase funciona como duas subunidades, cada uma delas reconhecendo as repetições invertidas, formam uma alça, o que facilita a clivagem do segmento. Após isso, há o reconhecimento do sítio alvo e a inserção do transposon em loop
2. “Replicativos”: Tn3 like
· realizam a amplificação do transposon ⇒ uma cópia permanece no DNA doador enquanto que outra é inserida no DNA recipiente 
· Transposon Tn3
· repetições invertidas nos extremos, um gene que codifica transposase, um gene que codifica uma resolvase e um gene de resistência a antibiótico 
· Mecanismo: (exemplo de transferência de um plasmídeo para outro)
· transposase reconhece repetições invertidas e as extremidades da sequência alvo → clivagem dos segmentos → uma das fitas invade a outra, formando um cointegrado → síntese DNA → resolvase é transcrita e medeia um processo de recombinação das fitas doadoras e recipientes (já que há homologia na estrutura) e a clivagem, formando dois plasmídeos recombinantes
· Esquema alternativo abaixo: 
Transposons em eucariotos:
· Corta e cola: exemplo do milho 
· Retrotransposon:
· Não LTR: non long terminal repeats
· LTR
· Podem ser categorizados entre autônomos e não autônomos (como fator Ds)
1. Corta e cola
a. Fator Ds/Ac em milho
· elemento ativador (Ac): transposon autônomo, pois carrega toda a informação necessária para sua transposição
· elemento de dissociação (Ds): transposon não autônomo, pois sofreram vários tipos de mutações na transposase, ou seja, não podem realizar a transposição independentemente 
b. Elemento P em Drosophila
· cruzamento de fêmea M com macho P gera prole estéril (disgênica), mas o contrário não ocorria
· Elemento P: 3 íntrons e 4 éxons, sendo que em um deles é transcrito uma transposase, permitindo sua movimentação
· Possui uma regulação tecido específica:
· células somáticas: transcrito possui um íntron, o que gera um stop codon ⇒ transposase expressa erroneamente, sendo inativa
· células germinativas: splicing correto faz com que haja apenas éxons no transcrito ⇒ transposase ativa: a atividade de suas 40 cópias no genoma faz com que haja uma estabilidade cromossômica, levando à esterilidade das moscas 
· Cruzamentos:
· Macho e fêmea P: transposase inativa → não há transposição elemento P
· Macho P e fêmea M: transposase ativa → há a transposição do elemento P → moscas disgênicas estéreis 
· Macho M e fêmea P: expressão de transposase inativa
· Outros mecanismos de regulação:
· piRNA: funcionam como um microRNA, ou seja, reprimem a atividade do elemento P, fazendo com que as moscas não sejam estéreis; caso seja ausente, o elemento P estará com atividade e as moscas serão estéreis
2. Retrotransposon (de classe 1): encontrado em leveduras, plantas e animais
· possuem várias semelhanças com retrovírus 
· Ciclo de vida de um retrovírus:
· Genoma dos retrovírus: RNA (ss ou ds)
· SARS-Cov 2:
· ORF1a: proteases 
· ORF1b: genes do metabolismo (helicase, RNAP)
· Bloco 3: proteína spike (receptor de membrana que se liga à proteína ACE) e outras proteínas complementaresa. LTR
· Principal diferença entre retrotransposons e retrovírus: há LTR, genes gag e pol, porém não há gene env, ou seja, não podem ser empacotados e infectados por outras células
· Ciclo dos retrotransposons:
· Retrotransposon Ty1 ⇒ levedura
· 2 genes apenas: transcrevem uma proteína estrutural e uma transcriptase reversa
· genoma → transcrição e exportação do RNA para citoplasma → tradução → formação de um complexo ribonucléico → formação de uma estrutura similar a um virióide (VLP) → retro transcrição do RNA em cDNA → importação do cDNA para o núcleo → inserido no genoma 
b. Não LTR
· muito comum em humanos (~50% do genoma), porém a maioria não está ativo
· também há transposons LTR (que podem ser autônomos ou não)
· Entre os não LTR:
· LINEs (long interspersed nuclear elements): autônomos
· SINEs (short interspersed nuclear elements): não autônomos
· LINEs
· Ciclo resumido do L1
· Ciclo mais complexo e completo do L1
· 2 ORFs: uma será transcrita em uma transcriptase reversa e a outra em uma helicase
→ encontram sítio alvo (rico em T), clivam as extremidades → uso da cauda poliA (que se pareia com sítio alvo rico em T) para facilitar a inserção do transposon → inserção 
· SINEs
· sequências Alu indicadas em verde 
· Consequências da atividade dos transposons:
· Manutenção ao longo da evolução, já que pode prejudicar tanto o hospedeiro
Obs.: safe heavens, como regiões de heterocromatina 
· Vantagens evolutivas:
· aumentam a taxa de mutação (o que pode ser prejudicial, já que podem ter efeito deletério)
· aumentam a variabilidade genética → maior plasticidade
· Como ocorre o aumento da taxa de mutação? 
· transposons podem funcionar como regiões de homologia entre o DNA, permitindo a recombinação das sequências
· Domesticação de proteínas codificadas por transposons:
· RAG1 e RAG2 atuam como transposases; permitem a recombinação VDJ da cadeia variável dos anticorpos