Roteiro aula prática enterobactérias

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ROTEIRO DE AULA PRÁTICA
BACTERIOLOGIA CLÍNICA
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE ENTEROBACTÉRIAS
Aluna: Anna Julia Lopes Mendes 2018089702
1. INTRODUÇÃO
As enterobactérias são bacilos Gram negativos da família Enterobacteriaceae. A sua
patogenicidade ocorre de forma estrita ou oportunista e geralmente estão relacionados
à microbiota intestinal. As infecções podem ocorrer por contato entre pessoas
infectadas ou através da contaminação de alimentos e água (principalmente de origem
fecal). O trato respiratório e as vias urinárias são os locais mais comuns de serem
acometidos por infecções por esse grupo. É importante que para o diagnóstico os teste
utilizados sejam aqueles cujo resultado apresente probabilidade próxima a 80% de
identificação bacteriana. Sendo assim, é de extrema importância o controle de
qualidade do laboratório para assegurar a confiabilidade dos resultados que forem
obtidos por eles.
2. DESCRIÇÃO DOS PROCEDIMENTOS
Para caracterizar bioquimicamente a espécie selecionada e diferenciar os membros da
família Enterobacteriaceae, serão executados os seguintes procedimentos:
2.1 COLORAÇÃO DE GRAM
O preparo individual da lâmina se inicia pela identificação. O esfregaço deve ser fino
e homogêneo para boa visualização. Pingar 2 gotas de salina 0,9% na lâmina e
transferir a amostra com o auxílio da alça calibrada. Secar a lâmina próxima ao bico
de Bunsen, garantindo esterilidade durante a confecção. Coloração pelo método de
Gram: cobrir o esfregaço com cristal violeta durante 1 minuto. A adição de solução de
bicarbonato de sódio após a aplicação do corante é opcional neste passo. Lavar a
lâmina com água corrente para retirada do excesso de corante. Cobrir o esfregaço com
lugol durante 1 minuto e lavar novamente a lâmina com água. Descorar rapidamente o
esfregaço com éter-acetona e lavar com água corrente em seguida. Cobrir o esfregaço
com a safranina durante 1 minuto e lavar a lâmina com água. Retirar o excesso de
água da superfície com uma folha de papel e secar ao calor. Por fim, a lâmina pode ser
examinada ao microscópio óptico. Antes de utilizar a objetiva de 100x, deve ser
aplicado o óleo de imersão sobre o foco a analisar na lâmina.
2.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO – ÁGAR EMB E MACCONKEY
Semear nas placas de ágar EMB e MacConkey usando a técnica de estria por
esgotamento para obter colônias isoladas. O ágar EMB – eosina azul de metileno - é
um meio seletivo que inibe o crescimento de bactérias Gram positivas; possuem
lactose como única fonte de carbono - bactérias fermentadoras de lactose apresentam
coloração metálica. Já o ágar MacConkey é um meio indicativo de fermentação de
lactose que gera alteração do pH, e as colônias lactose positivas apresentam coloração
amarelada (quando este está abaixo de 6,8).
2.3 CITRATO - PROVAS BIOQUÍMICAS
Com a alça bacteriológica, realizar a estria da região inclinada do ágar. Este deve ser o
primeiro teste a ser realizado, para evitar resultados falso positivos pelo carreamento
de fontes de carboidrato provenientes de outros meios. Se a bactéria for capaz de
metabolizar o citrato, há produção de amônia e alteração de pH e da coloração do
meio - de verde para azul.
2.4 MALONATO - PROVAS BIOQUÍMICAS
Colônias coletadas com o uso da alça bacteriológica e dissolvidas no caldo. Em caso
de positividade, a coloração do meio altera para azul.
2.5 LISINA - PROVAS BIOQUÍMICAS
No meio ágar lisina-ferro, inserir a agulha bacteriológica até o fundo do tubo e estriar
a superfície da região inclinada ao retornar. Alterações na base avaliam a capacidade
da bactéria em descarboxilar a lisina. No ápice, avaliam a desaminação desta. Os
positivos apresentaram coloração roxa e vermelha, respectivamente. Se houver
produção de H2S, haverá formação de precipitado negro por reação com o tiossulfato.
Porém, esse não é o meio mais indicado para confirmação de produção de H2S.
2.6 SIM – PRODUÇÃO DE H 2 S, INDOL E MOTILIDADE - PROVAS
BIOQUÍMICAS
No meio ágar SIM, utilizando a agulha bacteriológica: perfurar o ágar semi-sólido
(0,5% ágar) até 2/3 de profundidade. A síntese de H2S é evidenciada pela formação
de precipitado negro. A produção de indol, sintetizado a partir da degradação do
triptofano, é avaliada com o gotejamento do reagente de Kovacs: se positivo, o meio
fica avermelhado. A motilidade é avaliada pela “picada” - se a bactéria é imóvel, seu
crescimento é restrito à região da picada; caso contrário, todo o meio turva.
2.7 TSI – TRIPLE SUGAR IRON - PROVAS BIOQUÍMICAS
No meio ágar TSI, inserir a agulha bacteriológica até o fundo do tubo e estriar a
superfície da região inclinada ao retornar. O meio contém citrato férrico, pequena
quantidade de glicose; sacarose e lactose estão em concentração cerca de 10x maior.
A produção citrato férrico é evidenciada pela formação de precipitado negro. A
fermentação restrita de glicose gera fundo amarelo e região inclinada avermelhada;
fermentação de glicose + sacarose e/ou lactose deixam o meio todo amarelo. A
formação de gás é evidenciada por bolhas no fundo do tubo, podendo haver
deslocamento do meio.
2.8 UREASE – ÁGAR UREIA - PROVAS BIOQUÍMICAS
No meio ágar uréia, utilizando a agulha bacteriológica, perfurar o ágar sólido até 2/3
de profundidade. Bactérias que apresentam a enzima urease degradam a ureia presente
no meio. São geradas duas moléculas de amônia que basidificam o meio, virando o
indicador para a coloração rosa. Em caso de alteração discreta da coloração,
recomenda-se segunda incubação por mais 24 horas nas mesmas condições.
2.9 MEIO DE RUGAI - PROVAS BIOQUÍMICAS
No meio de RUGAI, inserir a agulha bacteriológica até o fundo do tubo e estriar a
superfície da região inclinada ao retornar. O meio possibilita a realização de diversas
provas bioquímicas em um único tubo: indol, fenilalanina desaminase, ureia,
síntese de gás, fermentação de glicose, descarboxilação da lisina, produção de H2S e
motilidade.
3. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Após a leitura do gram, correlacionar com os crescimentos das culturas e os
resultados das provas bioquímicas, a probabilidade bioquímica deve ser calculada
usando as tabelas em anexo.
4. COMO REPORTAR OS RESULTADOS
Especificar o tipo de amostra, descrever os achados no gram, características das
colônias que cresceram (ou não) nos meios semeados e reportar os cálculos e
probabilidade bioquímica da espécie em questão.
Amostra:
Resultado gram:
Crescimento em ágar EMB:
Crescimento em ágar macconkey:
Probabilidade bioquímica:
5. REFERÊNCIAS
Enterobactérias - Capítulo 3, Módulo 6: Detecção e identificação de bactérias de
importância médica. Anvisa – Agência de Vigilância Sanitária.