RESUMO: ESPECTROFOTOMETRIA UV - VIS

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Gabriela Rodrigues 
ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO 
 
INTERAÇÃO LUZ-MATÉRIA 
 Será que uma espécie química absorve 
luz em qualquer comprimento de onda? 
 Para que seja possível identificar e 
quantificar as espécies é preciso que essas 
interajam de formas diferentes das outras nas 
suas interações com a luz, por exemplo. Se todas 
interagirem da mesma forma não há como fazer 
essa identificação. Sendo assim, as espécies não 
absorvem luz da mesma forma e em qualquer 
comprimento de onda. 
 O que faz com que alguns raios interajam 
e outros passem através das coisas? 
 O que um átomo/molécula precisa ter para 
que seja possível que haja essa interação? É isso 
que justifica o porquê que algumas espécies 
absorvem um determinado comprimento de onda 
e outras espécies, outros comprimentos de onda. 
 E quando se fala em absorver comprimentos 
de onda diferentes, se quer dizer também, 
absorção de diferentes energias, porque cada 
comprimento de onda possui um determinado 
valor de energia. 
 Para que uma espécie possa absorver 
radiação do espectro eletromagnético, dois são os 
requerimentos necessários: 
 
1. A radiação incidente deve ser de 
frequência equivalente aquela rotacional 
ou vibracional, eletrônica ou nuclear. 
 
 Uma espécie absorve energia e essa energia 
só é absorvida se essa espécie precisar 
exatamente dessa energia para realizar alguma 
transição (vibracional, rotacional, eletrônica ou 
nuclear). 
 
2. A molécula deve ter um dipolo 
permanente ou um dipolo induzido, ou 
seja, deve haver algum trabalho que a 
energia absorvida possa fazer. 
 Espécie química que tenha na sua estrutura 
diferentes polaridades, sendo necessário haver 
um trabalho para contrabalancear essa 
polaridade. Ou até mesmo um trabalho de 
transição eletrônica. 
PRÍNCIPIO DO MÉTODO 
 Os métodos espectroscópicos se baseiam na 
absorção e/ou emissão de radiação 
eletromagnética por muitas moléculas, quando os 
seus elétrons se movimentam entre os níveis 
energéticos. 
 A espectrofotometria se baseia na absorção 
da radiação nos comprimentos de onda, 
promovendo a movimentação dos elétrons entre 
os níveis energéticos, numa região entre o 
ultravioleta e o infravermelho. 
ABSORÇÃO ATÔMICA x ABSORÇÃO MOLECULAR 
 O princípio é basicamente o mesmo. Tem-se 
então a absorção de energia que promove a 
transição de elétrons para níveis de energia 
superiores. 
 Quando se fala de transição atômica, essas 
são mais sutis, isso porque leva-se em 
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consideração poucos elétrons e considera-se uma 
espécie única, sendo então essas transições muito 
bem definidas (picos finos). 
 Na transição molecular diversos orbitais 
estão envolvidos, isso porque se tem várias 
espécies ligadas, ocorrendo assim a sobreposição 
de orbitais, logo, muito são os níveis energéticos 
envolvidos e também muitos elétrons, havendo 
então diversas transições. Esse comportamento, 
no espectro é visto em termos de banda (picos 
mais alargados). 
 
 A forma de análise é basicamente a mesma, 
no entanto, na transição molecular se trabalha em 
termos do ponto máximo de absorção. 
LUZ 
 Ao trabalhar com essa técnica, lidaremos, 
principalmente com a luz branca (soma de todas 
as componentes). 
 Na absorção molecular, então é necessário 
passar essa luz por um prisma ou uma rede de 
difração, justamente para fazer a separação da luz 
branca nas suas diferentes componentes 
(diferentes comprimentos de onda). 
 
 No visível, isso é visto nas diferentes cores 
que se tem. 
 No entanto, hoje em dia, não se usa mais 
tanto o prisma para fazer essa separação. Opta-se 
então por uma rede de difração, sendo o mesmo 
principio. 
LUZ VÍSIVEL – MATÉRIA 
 Como funciona a interação da luz do visível, 
especificamente, com a matéria? 
 Quando se olha para uma solução e a mesma 
possui cor, isso significa que aquelas a mesma 
absorvem luz numa determinada região do 
espectro eletromagnético, de modo que a luz que 
passa tem grande proporção da região da cor 
característica e isso porque a solução absorve a 
cor complementar. 
 A cor da matéria está relacionada com sua 
absortividade ou refletividade. O olho humano 
enxerga a cor complementar àquela que é 
absorvida. 
 
ESPECTROFOTOMETRO 
 O que se precisa em um espectrofotômetro? 
 É preciso de uma fonte de luz, um 
monocromador que centraliza a radiação 
incidente que passará então por um prisma ou 
uma rede de difração, onde a luz será separada 
nos seus diversos componentes. 
 Tem-se também uma fenda com um 
determinado tamanho, a depender do 
equipamento, que seleciona um determinado 
comprimento de onda que passará pela cubeta. 
 Na cubeta é onde está a amostra, a radiação 
interage com a amostra e parte dessa radiação 
passa e aparece no detector. No detector, a 
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informação é lida por um software que fornecerá 
o espectro de absorção. 
 
 Como mencionado, é na cubeta que ocorre a 
interação da radiação com a amostra. O que 
acontece é: 
 
 Existe o que se chama de caminho óptico 
que é a região onde a luz interage com a amostra. 
O caminho óptico influencia na luz que atravessa a 
amostra, isso porque ao mudar (aumentar ou 
diminuir) o mesmo, muda-se também a região de 
interação luz-amostra, influenciando na 
quantidade de interações. 
 Com base na absorção é possível então 
determinar qual é a concentração da amostra de 
interesse. 
  Feixes 
 Em espectrofotometria, dois são os tipo de 
feixes que se pode ter: feixe simples e feixe duplo. 
 
 Nas soluções que são analisadas não se tem 
apenas um composto e sim a mistura de alguns, 
podendo ainda ter a presença do solvente que 
pode interagir com a luz. É comum então utilizar a 
solução tida como “BRANCO” que nada mais é que 
tudo menos o analito. Ou seja, é uma solução, onde 
se tem todas as espécies presentes na solução 
problema, menos aquela que se quer analisar. 
 Dessa forma, é possível descontar a radiação 
que é absorvida por essas espécies, a partir do 
desconto da leitura do branco, na leitura da 
amostra problema. 
 Voltando ao caso dos feixes. 
 No feixe simples, primeira faz-se a leitura do 
branco e o equipamento guarda essa informação. 
E em seguida, faz-se a leitura das amostras e o 
próprio equipamento já desconta o valor do 
branco. 
 Já no feixe duplo, faz-se essas duas leituras 
ao mesmo tempo, tanto a leitura do branco quanto 
da amostra problema. Usa-se então um espelho 
para dividir a radiação em duas partes iguais, uma 
passa pelo branco e a outra pela amostra, a 
radiação que passa já vem descontada o valor do 
branco. 
 Equipamentos e acessórios 
 É um equipamento bastante simples. 
 
 Tem-se duas lâmpadas, onde uma delas 
emite luz ultravioleta (não é no visível) e a outra é 
uma lâmpada que emite luz visível. 
 
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 Cubetas 
 Para inserir a amostra no aparelho utiliza-se 
as cubetas que podem ser de vidro, quartzo ou 
plástico, variando a usabilidade de acordo com o 
comprimento de onda necessário na análise. 
 
 
 Ao manusear essa cubetas, as mesmas 
devem ser seguradas pelos lados foscos e seu 
preenchimento deve ser feito até a altura 
necessária para a leitura no aparelho. Quando 
inseridas no aparelho, o lado transparente é 
voltado para a direção do feixe. 
 A cubeta faz parte do caminha óptico, logo, 
ela não deve alterar a intensidade da luz que passa 
por ela. 
 
´ É preciso ter alguns cuidados com as 
cubetas: 
 - Limpeza adequada; 
 - Utilização de papes macios que não soltem 
fios; 
 - Posicionamento igual do instrumento; 
 - O nível da amostra deve ser suficiente para 
todo o raio de luz; 
 - Uso de cubetas idênticas para análise do 
branco e da amostra; 
 - Evitar e verificar a presença de rachaduras. 
 Computador 
 No computador faz-se a varredura e 
determina-se os valores iniciais e finais do 
comprimentode onda que se deseja. 
 O aparelho então mede a absorbância em 
cada comprimento de onda dentro da faixa 
escolhida, gerando um gráfico, conhecido como 
espectro de absorção. 
 É possível preparar diferentes 
concentrações de um mesmo material que se 
deseja analisar e medir a absorbância de cada uma 
dessas soluções. 
 Dessa maneira, é possível identificar a 
absorbância no comprimento de onda máximo de 
absorção de cada uma dessas soluções, podendo 
ainda plotar uma curva de calibração que forneça 
qual a absorbância para cada uma das 
concentrações. 
 Isso possibilita descobrir, por exemplo, a 
concentração de uma solução desconhecida a 
partir da sua absorbância. 
 
 
PRINCÍPIOS DA ABSORÇÃO DE LUZ 
  1º Princípio 
Qual a relação da concentração com a interação da luz? 
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 A absorção da luz é maior nas soluções com 
maiores concentrações. Então quanto mais 
concentrada for a solução menos luz irá atravessa-la. 
 Por que isso acontece? 
 Quanto mais concentrada a solução, maior é a 
quantidade da espécie do analito de interesse, então 
maior será a absorção. Assim, quanto mais 
concentração maior será a absorbância daquela 
solução. 
  2º Princípio 
 
 Quanto maior for o caminho óptico maior é 
absorção da luz, ou seja, quanto maior for a distância 
percorrida pelo feixe luminoso através da amostra 
maior é a absorção (mais quantidade de espécie do 
analito para absorver luz). 
 Existe um modelo matemático que descreva 
esse comportamento? 
  Lei de Lambert Beer 
 A absorbância de uma espécie em um 
determinado comprimento de onda é igual ao valor 
de absortividade molar (A) (quanto uma consegue 
absorver num determinado comprimento de onda) 
multiplicado pelo produto da concentração da 
amostra (c) e a distância percorrida pelo feixe (l). 
 
 Quando se analisa o que ocorre na cubeta, o que 
o equipamento analisa de imediato não é a 
absorbância e sim a transmitância (T), ou seja, o que 
passou pela cubeta sem ser absorvido. 
 
 
 
 
 Assim, a transmitância é dada pela radiação 
que passou pela amostra divida pela radiação 
incidente. 
 Em termos de porcentagem: 
 
 
 
 
 Essa transmitância depois é convertida pelo 
em absorbância. E como é feita essa conversão? 
 
 
 
 
 
 E por que não usar a transmitância ao invés 
da absorbância? 
 Quando se aplica a transmitância 
graficamente, o comportamento que se tem é: 
 
 
Absorbância 
( fixo) 
 
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 Trabalhar com a absorbância graficamente é 
mais fácil. Uma vez que se faz uma linearidade, de 
modo que é possível trabalhar em termos de uma 
função de reta (Y = ax + b). 
 
APLICAÇÃO 
 Etapas de um processo espectrofotométrico 
 1ª ETAPA: PREPARAÇÃO 
 - Limpeza do material; 
 - Aferição das vidrarias; 
 - Calibração das balanças; 
 - Preparo de soluções (complexantes, 
tampões, solução estoque ou solução padrão); 
 - Preparo da amostra (abertura e solução). 
 
 2ª ETAPA: QUALITATIVA 
 - Montagem do espectro de absorção. 
 Pela equação de Beer, foi possível verificar 
que a absorbância é tida em termos de um 
comprimento de onda. Como saber qual é o 
comprimento de onda certo? 
 Diversos comprimentos de ondas são 
incididos na amostra, de forma que a mesma tem 
uma interação com eles. No entanto, existe um 
comprimento de onda que a amostra irá absorver 
mais, e é esse que se quer descobrir. 
 Qual é o comprimento de onda que o 
analito absorve mais? 
 Para responder tal questão, é preciso se leia 
uma solução com o analito de interesse e faça a 
leitura em diversos comprimentos de onda. De 
modo se vai se ter diversos valores de absorbância. 
Plota-se o gráfico: 
 
 O analito em questão tem uma absorção 
máxima em torno de 610 nm. Qual deve ser a cor 
dessa amostra? A amostra absorve laranja, a cor 
complementar é azul-esverdeado, desse modo, a 
amostra deve ter essa coloração. 
 Assim, 610 nm é o valor de comprimento de 
onda que vai se usar nas outras etapas. Sendo essa 
uma característica daquele analito. 
 
 3ª ETAPA: 
 - Montagem da curva de calibração e 
obtenção da equação da reta. 
 A curva de calibração é necessária para saber 
se o equipamento de fato responde de acordo com 
a lei de Lambert Beer, uma vez que essa lei tem um 
comportamento linear, o equipamento também 
precisa ter. 
 Para isso é necessário o preparo de soluções 
padrões do analito de interesse, conhecendo assim, 
a concentração dessas soluções. Faz-se então, uma 
solução branco (tudo menos o analito). Faz-se 
soluções de baixa concentração, aumentando-a 
gradativamente. 
 
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 Sabendo o valor de absorção máximo do 
analito (610 nm). Agora pega-se as as amostras 
(em ordem crescente de concentração) e faz-se a 
leitura no equipamento em 610 nm, para saber o 
quanto esse analito absorve nesse valor. Fazendo 
as outras leituras, é possível plotar o gráfico (como 
o da figura). 
 Se o equipamento estiver “ok”, tem-se um 
comportamento linear, uma vez que quanto maior 
a concentração, maior a absorbância. Sendo 
possível então obter a equação da reta. 
Y = ax + b 
 
 
 A equação representada na equação da reta, 
nada mais é que a equação de Beer, uma vez que l 
(caminho) é considerado 1. 
 
 4ª ETAPA: ANÁLISE 
 - Análise da amostra. 
 Pega-se a amostra e faz-se a aleitura, tem-se 
um valor de absorbância. 
 O valor obtido é inserido na equação da reta 
obtida a partir do gráfico da curva de calibração, 
como sendo Y. Encontra-se X, acha-se a 
concentração da amostra de interesse. 
 Se houve diluição, é necessário ajustar os 
cálculos. 
EM RESUMO: 
 
 Fatores que afetam a linearidade de Beer 
1. Concentrações muito altas do analito em 
função das diversas interações 
eletrostáticas entre eles. 
2. Dispersão da luz em função da presença de 
sólidos na amostra. 
 
 
 
3. Fluorescência (tempo curto na absorção de 
luz e emissão de fótons) e fosforescência na 
amostra. 
4. Equilíbrios químicos pouco estabilizados. 
 
OBS: É importante observar se há cromóforos (partes 
da molécula responsáveis pela absorção) na amostra 
problema. 
 
 
 Análise da Cloroquina 
 O intuito aqui é saber se a concentração da 
amostra problema condiz com o padrão desejado. 
Para isso, basta fazer o espectro do padrão e da 
Absorbância 
 Absortividade 
molar () 
Concentração 
 
“Grau de erro” 
 
Sem presença 
de sólidos 
Com presença 
de sólidos 
Um feixe de luz é passado, sendo 
possível observar nanopartículas 
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amostra e analisar os valores de absorbância 
obtidos. 
 Parte experimental 
 Pesou-se 0,1 g da amostra de cloroquina e 
transferiu-se para um balão volumétrico de 100 
mL. Adicionou-se 5 mL de água destilada para 
solubilizar. Em seguida o volume foi completado 
com ácido clorídrico 0,1% (p/v). 
 Fez-se a diluição em ácido clorídrico 0,1% 
(p/v) até alcançar uma concentração equivalente a 
0,001% (p/v). 
Para a dilução: M1V1 = M2V2 
M1 = 0,1% ; M2 = 0,001% ; V2 = 100 mL  V1 = 1 mL 
O volume necessário da solução amostra para produzir a 
solução diluída é de 1 mL 
 A solução padrão foi preparada com a mesma 
concentração, com o mesmo solvente. 
 Para fazer as medições no espectrofotômetro, 
utilizou-se um comprimento de onda igual a 343 
nm (especificado pela Farmacopeia). Utilizando 
para o branco ácido clorídrico 0,1% (p/v). 
 Primeiro faz-se então a leitura do branco, 
obtendo a linha de base do espectro. 
 Em seguida, faz-se a leitura da amostra 
padrão de concentração 0,01 % (p/v). 
 Faz-se a leitura da solução problema com 
mesma concentração do padrão. 
 Com os resultados realiza-se os cálculos 
necessários, de acordo com a lei de Beer, para 
determinação da concentração real, obtendo assim 
o teor da amostra do difosfato de cloroquina. 
OBS: lavar a cubeta 3x e enxugar bem. 
 Analisandoo espectro 
 Observa-se que as leituras estão bastante 
parecidas, estando sobrepostas (o vídeo não 
favoreceu pegar a imagem do gráfico). 
 Em 343 nm tem-se o máximo de absorção do 
difosfato de cloroquina. 
 Para a amostra padrão o valor de 
absorbância foi de 0,36614. E para a solução 
problema foi de 0,36789. Valores bastante 
próximos. 
 Agora para saber se o teor de cloroquina está 
dentro das especificações da Farmacopeia 
Brasileira 6ª Ed, sendo essa de  2 %, faz-se os 
cálculos. 
 Cálculos 
 Para o cálculo, sabendo que pela lei de Beer 
tem-se a seguinte relação: 
  
Esse comportamento é válido tanto para a 
amostra padrão quanto para a amostra problema. 
E sabendo que para um valor de comprimento de 
onda de fixo  é igual para ambas as amostras, l 
também é igual, e ainda as concentrações são 
iguais nesse caso, assim: 
 
 
 
 
 
 
De modo que para encontrar a porcentagem 
do teor de cloroquina, faz-se: 
 
 
 
 
O valor não está dentro dos padrões 
estabelecidos pela farmacopeia. 
 Exemplificação: Permanganato de Potássio 
 Montagem da curva de calibração de KMnO4. 
Essa é bastante utilizada em casos onde, por 
exemplo, se quer determinar a dosagem dessa 
substância em comprimidos. 
 Solução mãe 
 Em uma balança analítica pesa-se 0,01 mol de 
KMnO4 que corresponde a 1,5803 g. Transfere a 
quantidade pesada para um balão volumétrico de 
1L. 
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Gabriela Rodrigues 
 A diluição é feita com água destilada para que 
se tenha uma concentração equivalente a 0,01 
mol/L. 
 Soluções diluídas 
A seguinte diluição foi realizada: 
 
 Análise das amostras 
 Escolhendo-se uma das amostras diluídas 
para fazer a análise, sendo essa a de concentração 
equivalente a 500 mol/L. 
 Inicialmente, quer-se determinar a partir do 
espectro UV-vis dessa amostra, o valor de absorção 
máximo da mesmo (ponto máximo no gráfico). 
 Faz-se as seguintes medições: 
 
 O comprimento de onda do ponto de máxima 
absorção é equivalente a 545 nm. Sendo esse o 
valor escolhido para que se faça a curva de 
calibração. 
 Fazendo então agora a leitura de cada uma 
das soluções diluídas preparadas num 
comprimento de onda de 545 nm. Lembrando que 
primeiro é importante que faça a medição do 
branco da solução, para que se possa descontar o 
valor encontrado para esse nas demais leituras. 
 Os resultados obtidos para as leituras e o 
gráfico obtido a partir daí, foram: 
 
 Com a reta plotada é possível verificar a 
equação da reta obtida, sendo essa igual a: 
 
 Onde Y é a absorbância e X a concentração. 
 
REFERÊNCIAS 
Teoria: 
Resumos e anotações próprias de aula. 
Vídeo aula: CLIQUE 
Vídeo aula: CLIQUE 
Experimental 
Cloroquina: CLIQUE 
Permanganato: CLIQUE 
 
 
https://www.youtube.com/watch?v=wCl5YZY7drE
https://www.youtube.com/watch?v=iuAyML6Gt6w&list=PLpbpvwPbOGByxl4eIupnEfVGIH_Xuw9OG&index=19
https://www.youtube.com/watch?v=qLu4TbpTH3Y
https://www.youtube.com/watch?v=oqLe8FwjCEA