Livro Biotecnologia_Industrial_Vol_2_Willibald (1)

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Coordenadores: 
WILLIBALDO SCHMIDELL 
URGEL DE ALMEIDA LIMA 
EUGÊNIO AQUARONE 
WALTER BORZANI 
BIOTECNOLOGIA 
INDUSTRIAL 
VOLUME 11 
ENGENHARIA 
BIOQUÍMICA 
~ 
EDITORA EDGARD BLÜCHER LTDA. 
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111 
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Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o título amplo de BIOTEC-
NOLOGIA INDUSTRIAL, é o resultado do trabalho de um grupo de profissionais 
com vistas à atualização da coleção BIOTECNOLOGIA, cuja publicação foi iniciada 
em 1975 e terminada em 1983. 
A experiência acumulada e as muitas mudanças ocorridas nestes últimos vinte 
anos, ao lado da indiscutível e crescente importância das aplicações da BIOTEC-
NOLOGIA em diversos setores de produção de bens e serviços, justificam plena-
mente - assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Coleção - esta 
primeira atualização, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos 
de graduação. 
Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentação, é tomar conhecimento do que, 
hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA 
INDUSTRIAL. 
A demarcação nítida do campo de atuação de qualquer ramo do conhecimento 
é sempre tarefa muito difícil, para não dizer impossível. 
Tanto isto é verdade que, com certa freqüência, tratados relativos a um dado 
setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma série de temas sem 
tentar esboçar, preliminarmente, um quadro que, em largos traços, indique os 
objetivos e as ap!jcações do que vai ser estudado. 
· Tal maneira de agir, principalmente em cursos de graduação, não nos parece 
aconselhável. Julgamos importante, no início dos .. estudos, a apresentação de um 
panorama que dê, aos alunos, tima idéia, ainda que não bem definida, daqueles 
objetivos e aplicações. 
Não nos parece que seja imprescindível transcrever, aqui, todas as propostas 
de "definição" do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas serão 
suficientes para que seja possível alcançar nosso objetivo. 
Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu 
trabalho intitulado "Patentes para a Biotecnologia", apresentou, em dezembro de · 
1993, em reunião realizada na Academia Brasileira de Ciências: 
"Entende-se por Biotecnologia o conjunto de conhecimentos, técnicas e métodos, 
de base científica ou prática, que permite a utilização de seres vivos como parte 
integrante e ativa do processo de produção industrial de bens e serviços". 
VI 
O Office o f Technology Assessment, por sua vez, "definiu" Biotecnologia como 
sendo: 
"O conjunto de processos industriais que englobam processos biológicos". 
Por outro lado, a Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée, concei-
tuou Biotecnologia como: 
"Aplicação da Bioquímica, da Biologia, da Microbiologia e da Engenharia Química 
aos processos e produtos industriais (incluindo os produtos relativos à saúde, energia 
e agricultura) e ao meio ambiente". 
Finalmente, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 
(CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, "definiu" Biotecnologia hos 
seguintes termos: 
"A utilização de sistemas celulares para obtenção de produtos ou desenvolvimento 
de processos industriais". 
. As poucas tentativas de definição aqui transcritas mostram, nitidamente, que 
a Biotecnologia tem por base vários ramos do conhecimento que poderiam ser 
classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioquímica, Fisiologia, 
Genética, Microbiologia, Virologia, Botânica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros 
que poderiam ser agrupados sob a denominação genérica de ENGENHARIAS (prin-
cipalmente a Engenharia Química). 
Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, o 
que torna absolutamente imprescindível a efetiva colaboração de profissionais 
atuantes em diferentes setores do conhecimento . 
. Destaque-se, porém, que essa atividade multidisciplinar não deve ser enten-
dida como resultante de uma simples justaposição de profissionais, cada um deles 
com sua formação especializada e preocupado apenas com sua área específica. 
Importa que seja, de fato, um trabalho de vários profissionais efetivamente 
integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente não 
aprofundado, dos princípios e das técnicas dos campos de atuação dos demais. 
Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um 
grupo que estuda a otimização de um dado processo, é desejável que tenha alguns 
conhecimentos, mesmo que superficiais, a respeito das estratégias empregadas para 
a modelagem matemática. Vice-versa, o especialista ein modelagem deve efetuar 
um esforço adicional para compreender as características do sistema microbiano 
em estudo, a fim de incorporá-las ao modelo. Somente desta formà a atividade 
multidisciplinar efetivamente existirá e poderá ser mais eficiente. 
VIl 
Se é verdade, por um lado, que a Biotecnologia só passou a ser considerada 
altamente prioritária há relativamente pouco tempo, também é verdade, por outro, 
que processos biotecnológicos vêm sendo utilizados na produção de vários bens, 
principalmente alimentos, desde a mais remota antigüidade. Basta, neste particu-
lar, fazer referência ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na 
Babilônia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.), à produção de pão, utilizando 
· fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e à produção de vinhos na Grécia (2.000 a.C.). 
A Biotecnologia encontra muitas aplicações importantes nas seguintes áreas 
de atividade: 
• Agricultura 
• Pecuária 
• Saúde 
• Preservação do meio ambiente 
• Indústria 
Suas aplicações na indústria constitutem o objetivo primordial da Biotec-
nologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer 
Jonas, é uma boa representação gráfica da "localização" da Biotecnologia Indus-
trial e de sua interação com outros ramos do conhecimento. 
Figura I - Representação esquemática da interação da Biotecnologia Industrial com outros ramos do conhe-
cimento. 
VIII 
Convém, finalmente, ,ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho, 
as áreas de aplicação da Biotecnologia, anteriormente apontadas, não são "gavetas" 
estanques. Há entre elas, freqüentemente, fortes interações. Apenas para citar um 
exemplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na área da Saúde. 
Na etapa final de produção dessa vacina em larga escala surgirão, muito provavel-
mente, problemas de cunho tecnológico e de engenharia que poderão tomar impres-
cindível a efetiva participação da Biotecnologia Industrial na busca das soluções 
mais adequadas. 
A presente Coleção consta de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMEN-
TOS - reúnem-se, como o próprio nome claramente indica, temas fundamentais 
indispensáveis ao estudo de processos biotecnológicos. O segundo- ENGENHA-
RIA BIOQUÍMICA- focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos 
naqueles processos, ao lado de assuntos correlatos de âmbito mais geral, mas im-
portantes na produção em larga escala. Os dois últimos volumes - PROCESSOS 
FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUÇÃO DE 
ALIMENTOS - foram dedicados à descrição e discussão de processos biotecno-
lógicos de importância industrial. 
Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se 
destina, primordialmente, a cursos de graduação. A bibliografia indicada no final 
de cada capítulo poderá servir como ponto de partida pára os que pretenderem um 
exame mais aprofundado de um ou outro tópico. 
Os Coordenadores, o Editor e, seguramente, também os Autores, agradecem 
todas as sugestões relativas à estrutura da Coleção ou de qualquer de suas partes, 
bem como a identificação de falhas ou incorreções, infelizmente sempre possíveis, 
que lhes sejam encaminhadas pelo leitor. 
Literatura Recomendada 
1) Anciães, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial. 
CNPq, Brasília, 1985. 
2) Haelm, H.Bioquímica de las fermentaciones. Aguilar S.A. de Ediciones, Madri, 
1956. 
3) Jonas, R. GBF -Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990. 
4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentadó à Academia 
Brasileira de Ciências em 6.12.1993. 
IX 
ACID 
Cuando la colección "Biotecnologia", editada por los profesores Eugênio 
Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, apareció en 1975, causó un 
hondo impacto entre los biotecnólogos latinoamericanos. Se trató de la primera 
obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra región y representá una 
contribución especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina. 
"Biotecnologia" constó originalmente de tres volúmenes: Tecnologia das 
Fermentações, Tópicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioquímica, a los cuales 
se sumó en 1981 Corrosão Microbiológica y luego Alimentos e Bebidas produzidos por 
Fermentação en 1983. Ahora, pasados ya más de veinte afios, losmismos editores, 
com la participación del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad 
de apreciar y disfrutar la nueva colección "Biotecnologia Industrial" como una 
sucesora natural de "Biotecnologia". El contenido de la nueva obra há sido 
totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances 
experimentados por el conocimiento en esta área en las últimas décadas,.induyendo 
las modernas técnicas de la ingeniería genética y el uso de microorganismos recom-
binantes en bioprocesos. · 
La nueva colección está dividida en cuatro volúmenes que abarcan los mas 
variados tópicos relacionados com la biotecnología industrial: Fundamentos, Ingeniería 
Bioquímica, Procesos Fermentativos y Enzimáticos y Biotecnología en la Produccción de 
Alimentos. En total son 7 4 capítulos escritos por distinguidos especialistas brasileros, 
conteniendo información actualizada acerca tanto de los aspectos básicos como de 
los aplicados de la utilización de células microbianas y no microbianas para 
finalidades productivas. 
El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del 
conocimiento en microbiología, genética, bioquímica y enzimología, finalizando 
com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnología, abriendo así 
el camino a los próximos volúmenes. En el Volumen 2, Ingeniería Bioquímica, se 
exponen los principales aspectos relacionados com la cuantificación de los procesos 
microbianos y enzimáticos y el disefio y operación de los equipos de proceso 
requeridos en una instalación industrial. El Volumen 3~ Procesos Fermentativos y 
Enzimáticos, presenta y discute la aplicación de los microorganismos a la producción 
de una amplia gama de metabolitos y enzimas de interés práctico, el uso de enzimas 
como biocatalizadores industriales y la aplicación de los procesos microbianos a 
diversos sectores industriales y a la descontaminación de efluentes líquidos y 
resíduos sólidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnología en la Producción de Alimentos, 
w.......__ _ _ , ____ _ . _ _ 
X 
detalla la aplicación de la biotecnología a una amplia variedad de industrias de ese 
importante sector. 
Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores 
y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial está destinada a constituirse en 
una obra insustituíble para la ensefi.anza universitaria de pre y post-grado, así como 
también en una valiosa fuente de consulta para el biotecnólogo en la industria. 
L ________ _ 
Fernando Acevedo 
Profesor 
Escuela de Ingeniería Bioquímica 
Universidad Católica de Valparaíso 
Valparaíso, Chile 
-------,--------- -------------------
Adalberto Pessoa Junior 
Professor Doutor 
au 
Universidade de São Paulo 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas 
Departamento de Tecnologia 
Bioquímica-Farmacêutica 
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 
05508-900, São Paulo, SP, Brasil 
Aberto Colli Badino Jr. 
Professor Adjunto I 
Universidade Federal de São Carlos 
Departamento de Engenharia Química 
Caixa Postal, 676 
13565-905, São Carlos, SP, Brasil 
Antonio Bonomi 
.Pesquisador Coordenador 
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do 
Estado de São Paulo S.A. 
Divisão Química , 
Agrupamento de Biotecnologia 
Caixa Postal, 0141 
01064-970, São Paulo, SP, Brasil 
Beatriz Vahan Kilikian 
Professora Associada 
Universidade de São Paulo 
Escola Politécnica 
Departamento de Engenharia Química 
Caixa Postal, 61548 
05424-970, São Paulo, SP, Brasil 
Deise Maria Fontana Capalbo 
Pesquisadora 
Empresa Brasileira de Pesquisa 
Agropecuária 
EMBRAPA/CNPMA 
Rodovia SP 340, km 127,5 
Caixa Postal, 69 
13820-000, Jaguariúna, SP, Brasil 
---,.. - ... ---- . - ------~---- ----- -------------------, .. - -. -- --· -· ----·· --
a 1 
Haroldo Hiss 
Pesquisador Científico 
Insituto Butantã 
Av. Vital Brasil, 1500 
05503-900, São Paulo, SP, Brasil 
Iracema de Oliveira Moraes 
Professora TÚular 
Universidade de Guarulhos 
Centro de CiênCias Exatas e 
Tecnológicas 
Praça Teresa Cristina, 1 
07033-070, Guarulhos, SP, Brasil 
·João Carlos Monteiro de Carvalho 
Professor Doutor 
XI 
Universidade de São Paulo 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas 
Departamento de Tecnologia 
Bioquímica-Farmacêutica 
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 
05508-900, São Paulo, SP, Brasil 
José Geraldo da Cruz Pradella 
Pesquisador 
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do 
Estado de São Paulo S.A. 
Divisão Química 
Agrupamento de Biotecnologia 
Caixa Postal, 0141 
01064-970, São Paulo, SP, Brasil 
Josef Emst Thiemann 
Pesquisador Sênior 
Biobrás S.A. 
Avenida C, 1413- Distrito Industrial 
Caixa Postal, 377 
39404-004, Montes Claros, MG, Brasil. 
r. . 
XII 
Luiz Carlos Urenha 
Pesquisador 
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do 
Estado de São Paulo S.A. 
Divisão Química 
Agrupàmento de Biotecnologia 
Caixa Postal, 0141 
01064-970, São Paulo, SP, Brasil 
Manuel Filgueira Barrai 
Pesquisador 
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do 
Estado de São Paulo S.A. 
Divisão Química 
Agrupamento de Biotecnologia 
Caixa Postal, 0141 
01064-970, São Paulo, SP, Brasil 
Maria Cândida Reginato Facciotti 
Professora Titular_ 
Universidade de São Paulo 
Escola Politécnica 
Departamento de Engenharia Química 
Caixa Postal, 61548 
05424-970, São Paulo, SP, Brasil 
Maria Filomena de Andrade Rodrigues 
Pesquisadora 
Instituto de Pesquisas Tecnológicas do 
Estado de São Paulo S.A. · 
Divisão Química 
Agrupamento de Biotecnologia 
Caixa Postal, 0141 
01064-970, São Paulo, SP, Brasil 
Michele Vitolo 
Professor Titular 
Universidade de São Paulo 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas 
Departamento de Tecnologia 
Bioquímica-Farmacêutica 
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 
05508-900, São Paulo, SP, Brasil 
Pedro Sérgio Pereiralima 
Pesquisador 
. Instituto de Pesquisas Tecnológicas do 
Estado de São Paulo S.A. 
Divisão de Mecânica e Eletricidade 
Agrupamento de Sistemas de Controle 
Caixa Postal, 0141 
01064-970, São Paulo, SP, Brasil 
Rafael Almudi Villen 
Professor Associado 
Centro Universitário do Instituto Mauá 
de Tecnologia 
Escola de Engenharia Mauá 
Departamento de Engenharia Química 
e de Alimentos 
Praça Mauá, 1 
09580-900, São Caetano do Sul, SP, 
Brasil 
Sunao Sato 
Professor Titular 
Universidade de São Paulo 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas 
Departamento de Tecnologia 
Bioquímica-Farmacêutica 
Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 
05508-900, São Paulo, SP, Brasil 
Urgel de Almeida Lima 
Professor Pleno 
Centro Universitário do Instituto Mauá · 
de Tecnologia 
Escola de Engenharia Mauá 
Departamento de Engenharia Química 
e de Alimentos 
Praça Mauá, 1 
09580-900, São Caetano do Sul, SP, 
Brasil . 
Vanildo Luiz Del Bianchi 
Professor Doutor 
Universidade Estadual Paulista 
Intituto de Biociê~cias, Letras e 
Ciências Exatas 
Rua Cristovão Colombo, 2265 
15054-000, São José do Rio Preto, SP, 
Brasil 
Walter Borzani 
Professor Pleno 
-.,...__. ___ . 
Centro Universitário do Instituto Mauá 
de Tecnologia 
Escola de EngenhariaMauá 
Departamento de Engenharia Química 
e de Alimentos 
Praça Mauá, 1 
09580-900, São Caetano do Sul, SP, 
Brasil 
Willibaldo Schmidell 
Professor Titular 
Universidade de São Paulo 
Escola Politécnica 
XIII 
Departamento de Engenharia Química 
Caixa Postal, 61548 
05424-970, São Paulo, SP, Brasil 
( 
XV 
caN 
1 ENGENHARIA BIOQUÍMICA: UMA APLICAÇÃO SUl GENERIS 
DA ENGENHARIA QUÍMICA .................... ................................................................ 1 
Literatura recomendada .................. ....... .. : .. .... .. ... ..... .. ................... ................. 3 
2 MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO 
INDUSTRIAL ..................................................................................................................... 5 
2.1 Introdução ...... ....... ...................... ............ ..... ....... .. ... ... ... .......... .... .. ............. .... ....... 5 
2.2 Fontes de microrganismos de interesse .. ........ ...... ... ................... ..................... .. 7 
2.3 Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura 
para aplicação industrial ............. ......... ................... ......... .. ... ........ .. .... ..... ... : ..... 10 
2.4 Considerações finais ........ ............................................ ... ..... .. .............. .. ............. 18 
Referências bibliográficas ·· ··· ·····:··········· ··· ·· ···· ····· ······ ·· ... ···································· 18 
ESTERILIZAÇÃO DO EQUIPAMENTO ............................................................... 19 
3.1 Introdução ............................................................................................................ l9 
3.2 Terminologia e modo de atuação ...................... ... ................... .. ....................... 20 
3.3 Esterilização por agentes físicos .............................. ......................................... 25 
3.4 Esterilização e desinfecção por agentes químicos ............... ... ........... .. ........ .. 33 
Referências bibliográficas ....... ........................................... ... : ...... ...................... 38 
ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE FERMENTAÇÃO POR 
AQUECIMENTO COM VAPOR . ............... :: ... ......................................................... 39 
4.1 Introdução ............................................................................................................ 39 
4.2 Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido ........... 40 
4.3 Cinética da destruição térmica de microrganismos ....... .. ................... ........... 45 
4.4 Destruição de nutrientes do meio corno conseqüência da esterilização .... 51 
4.5 Considerações geràis a respeito do cálculo do tempo de esterilização ...... 53 
4.6 Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo ..................... 56 
4.7 Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo ........................... 60 
Literatura recomendada ....... .. ... .... .. ....... .. ................... .. .. ..... ..................... ..... .. . 62 
ESTÉRILIZAÇÃO DE AR.········ · ·· ···· · · · · · · ········· · ·· · ·· · · ·· ·· · · · ·· · ·· ·· ·· : ····· ···· · ··········· ·~!: .. ......... 63 
5.1 Introdução .. .................. ........... : ... ................. .... .... .. ..... ......................................... 63 
5.2 Aerossóis microbianos .................................. ... ... ... ......... .. ............... .... .. ....... .. ... . 64 
5.3 Arnostradores ...................................................................................................... 65 
5.4 Métodos para a esterilização de ar ... ... .. .. ......................... ... ........................ ... .. 75 
5.5 Considerações finais .................. .... ........... .. .. : ..................... : .. ................. ... .... ..... 90 
Referência.s biliográficas ........... ... .................... .. .............. ... ............... .. ..... ......... 90 
XVI · 
6 CINÉTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ............. ........................... ..... 93 
6.1 Introdução ... .. ............. ..... .. ..... · .................. ; ........................................................... 93 
6.2 Parâmetros de transformação ·· ···· ··· ·· ··········· ······ ······ ······ ·· ····'········· ················· ·· 95. 
6.3 Cálculo das velocidades .... ..... ... .... .. .. ......... .. ........................... ................ ........ 101 
6.4 A curva de crescimento microbiano ........................... ... ............. .................... 103 
6.5 Classificação dos processos fermentativos ... ................ ............. ............ ....... 107 
6.6 Influência da concentração do substrato sobre a velocidade 
específica de crescimento ....................... .. ... .. .. ... .. .. ............. ...... ............ .......... 110 
Apêndice ...... .. ... .......... ..... .. ............ ... ...................... .. ........ .. ... ..... ............. ........ .. 114 
Referências bibliográficas ........ .......... .. .. .. ... .......................... .. .. .... .... ............. .. 121 
7 MODELAGEM MATEMÁTICA E SIMULAÇÃO DE PROCESSOS 
FERMENTATIVOS . .. ............ .... ............... ............. ....... ............................................. ... 123 
7.1 Introdução ........ ..... ...... ........ .. ....... .. .. .. ... .. ................. .......................................... 123 
7.2 Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos ...... .. 124 
7.3 Ajuste de parâmetros do modelo formulado .. .... .......................... ............... 148 
7.4 Avaliação do modelo matemático ...... .. .... ....... .. .................................... ........ . 164 
7.5 Simulação de processos fermentativos ...... ..... ................. .............................. 172 
Referências bibliográficas ..... .................... .................. , ........... .. .... .. .. .. .......... .. . 175 
8 BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS . ... .. ... ......................... 179 
8.1 Introdução .......... ................. .. ........ ......... ... .......... ...................... ... .. ................... . 179 
8.2 Classificação dos biorreatores ·· ······ ···· ··· ··············:······ ······ ······ ·· ····· ····· ············· 180 
8.3 Formas de condução de um processo fermentativo ............................. ....... 185 
8.4 Exemplos de comparação de desempenho de biorreatores ....................... 189 
Referências bibliográficas ... .. ... ...... .... .................... ................................ ....... ... 190 
· 9 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA . ... .. ... ........ . : ............... .... ... ...... .. .. ... ........ ......... 193 
9.1 Introdução ..... .. ......... ...... ..... ....... .......... .. .. ........... .. ... .... ... ... .. .......... ... ... ... .... ....... 193 
9.2 · Inóculo .................. ..... .. ..... ... .. ... .............. ... ...... ... .... ........................... ..... .. ....... ... 194 
9.3 Mosto .. .......... .................................... .. ... ....... .. .. ... ...... ... ... ......... .. ............. .. ......... 196 
9.4 Classificação ................... ............... ..... .. .......... ..... ..... ....... ..... .. .... ....................... 199 
9.5 Número de domas .... ... ........................... ...... ... .. ............. .. .... .......................... .. 200 
Referências bibliográficas .. .. .... . : ....... .................. :· ············· ······························ 204 
10 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA ALIMENTADA . .......... ..... ............... ....... . 205 
10.1 Introdução ·:······························ ··· ·· ·················· ····· ··· ····· ·: ... ........ ....... .... ............ .. 205 
10.2 Aplicações .. .......... ...... ......... .......... ......... ... .......... .. ...... ... ... ... ...... .... ............ ...... .. 207 
10.3 Classificação.. ................ .. ................. : .................. .. ..... ..... ... ....... ................... ..... 210 
10.4 Modelos matemáticos ......... ..... ...... .. ... ... .......... .. ..... ............ ............... ............... 212 
Referências bibliográficas ............. ... .. ................ ... ... .............. ... .................. ..... 216 
11 FERMENTAÇÃO SEMICONTÍNUA . .. .. ... ... .. ... .......... .................. .. .... ... .... ............ 219 
11.1 Definição ........ ... .... ...... .. ....... .. ..... ......... .... .... ..... : .... ..... .............. ... ..... ... .............. 219 
11.2 Produtividade do processo semicontínuo .................... .... .. .... ... .... .. ............. 220 
11.3 Comentários finais ... .. ..... ..... .... .. ... ........ ... ............ .. ......... .. ... ............................. 222 
Referências bibliográficas ...... .. ........... ... .. ...... ... ........ .... ................................... 222 
12 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA . ...... ...... .. ................... .............................................. 223 
12.1 Conceitos básicos ... ... .. ........... .. ..... .. ..... ... ....... ... ... .... ........... ... ....... .................... 223 
12.2 Vantagens e desvantagens do processo contínuo em relação 
ao descontínuo ........ .. .... .... .... ......... ..................... ..... .... ........................... .. ...... .. 224 
i 
L ____ _ _ 
XVII 
12.3 Formas de operação no sistema contínuo .. .. ..... .. .. .. ................ ... ....... ; ...... ..... 225 
12.4 Formação de produtos no sistema contínuo .... ... .. .......... ... .......................... . 242 
Referências bibliográficas ...................................... .. ... ............. ... . : ........ ........... 245 
13 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO .... ........... ............. ....... .. ............... ...... 247 
13.1 Introdução ...................... .... ........... .... ...... .... ..... .. .. ...................... ... .................. ... 247 
13.2 História do processo da FSS ......... .. ......... .. ... ..... .... ......... .. ... ........... .......... .. ..... 248 
13.3 Microrganisrhos comumente utilizados ... ......... .. ........... ... , ... ........ ..... ........... 250 
13.4 Substratos: características e composição ............................ ................. ........ .. 250 
13.5 Reatores para fermentação semi-sólida ................................ .. .. .. ................... 254 
13.6 Controles do processo ..................... .. ... ...... .. .. ... ......................... ..... ... .............. 259 
13.7 Vantagens e desvantagens ............................................................................ ... 264 
13.8 Exemplos de casos ·····:············································ ··· ························· ··· ··· ··· ·· ·· · 266 
Referências bibliográficas .. ..................... .. .... .. .................................. .. ......... .... 270 
@ AGITAÇÃO E AERAÇÃO EM BIORREATORES . ........................................ : .. 277 
14.1 A importância da transferência de oxigênio .... .................... ..................... ; ... 277 
14.2 Sistemas para a transferência de oxigênio .......................... ................. ......... 279 
14.3 Concentração de oxigênio dissolvido em solucões saturadas ................... 281 
14.4 Transferência de oxigênio e respiração microbiana .............. .... .... ... ... ......... 284 
14.5 Transferência de oxigênio em sistemas agitados e areados ........................ 308 
14.6 Considerações finais .. .......... ... ........ .... ... ... ................................................ ...... .. 329 
~) R:ferências bibliográficas ................................................................................ 329 
L!..?/ VARIAÇAO DE ESCALA . ................... , ............................ ........................ .... ..... .. ..... 333 
15.1 Introdução .. ... ..... , .. .. ... .... .... .. ... ..... .. : ........................ ..... ................. ....... ......... .... .. 333 
15.2 Critérios para a ampliação de escala ..................................... .. ... .......... ... ...... 336 
15.3 Comparações entre critérios para a ampliação de escala ......... ; .. .. ............. 348 
15.4 Redução de escala .. .............................................. ; ........... .' ................ ~ ............... 351 
15.5 Considerações finais ........................ ....................... ... ................ .. ............. .. . : .... 352 
Referências bibliográficas ................................................... ~ .. . ~ ........................ 353 
16 REATORES COM CÉLULAS IMOBILIZADAS . .. ....................................... : .... 355 
16.1 Introdução ...... , .... .......................... .. .......... ....... .. ............ .. .................................. 355 
16.2 Métodos de imobilização ................................................................................. 356 
16.3 Tipos de biorreatores empregados .............................. , .................................. 360 
16.4 Aspectos relativos ao transporte de massa .............. ...... ..................... .... .. .... 363 
16.5 Processos que utilizam células imobilizadas .... ................ .. .................. .. ...... 366 . 
16.6 Conclusões .............................. .. .. .. .............. ... .. ...... ....................... ..................... 370 
Referências bibliográficas ............................................ ........ : ........................... 371 
17 REATORES COM ENZIMAS IMOBILIZADAS ......... ................................... .. . 373 
17.1 Introdução .. , ............ .. .. .. ..................... ; ......... ..... ............................ ; ..... .. .... ......... 373 
17.2 Reatores enzimáticos .......................... .... ...... ............... .. : .. ................................. 374 
17.3 Exemplos de processos enzimáticos ........................ , ..................................... 388 
Referências bibliográficas .... ... .................................... ; .. : ................................. 395 
18 AUTOMAÇÃO E CONTROLE DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ... 397 
18.1 Introdução .......................................... ... ... ................................ .. .... .... ................ 397 
18.2 Principais instrumentos para monitoração ein linha de processos 
fermentativos ... .. ......... ........ .......... ...... ........................................... .... ... ............. 398 
... . . -- -------- -~- ------- - --- -.·-·---------.........,-------~ -- ---~---~-- -~- ..•. ------ ---- --- -·- '.. . 
I 
I · 
XVIII 
18.3 Controle aplicado a processos fermentativos ..... .. ........... ........ ... .......... .... .... 411 
Referências bibliográficas ........ ............. ................ ................. .. .. .................... .. 423 
19 OPERAÇÃO DE INSTALAÇÕES INDUSTRIAIS DE 
FERMENTAÇÃO . ........................................ : .............................................................. .425 
19.1 Princípios gerais para operação ............. ... .................. ........................... .... ..... 425 
19.2 Condições gerais para a execução de um processo fermentativo .... ......... 426 
19.3 Operação de uma indústria ............. ... .. ..... ....... .. ................................ ... ..... .. ... 429 
19.4 Operação de um processo férmentativo asséptico ..... ........ ...... ................ ... 434 
19.5 Exemplo de operação de indústria de fermentação .. .. ........ .. ..................... .435 
Bibliografia ............ .................. ................................... ............. .. ............. .. ......... 439 
20 CONSTRUÇÃO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAÇÃO . .................. 441 
20.1 Introdução ... .. ..... ...... ... ....................... ........ .... ...................... ............. .. ........... .... 441 
20.2 Características básicas de reatores para cultivo de bactérias ou 
células animais ...... .............. ... ....... ............... ................... ... .. ... .... ......... ............. 442 
20.3 Construção do fermentador ................ ...... ..... ..................... ..... .............. .. .. ... .. 448 
20.4 Cultivo de células animais ......................... ...... ........ ................ ............... ........ 468 
20.5 Obtenção e manutenção das condições de esterilidade e 
biossegurança .................................... .... .......... ............................ ... .... ... .. ....... .. ... 470 
20.6 Válvulas e purgadores de vapor .. .. .. .......... ...... ................................ .... .. .... .... 480 
20.7 Outros tipos de reatores .... .. .......... ....... ........... .............................. ............ .... ... 485 
Bibliografia .... .. ... .... .... ....... ... ... .. ..................... .. .................... .................... ... .. ... . 489 
21 PURIFICAÇÃO DE PRODUTO~ BIOTECNOLÓGICOS . ........................... .493 
21.1 Introdução ....... .. ... ..... ............. : ..... .... : ....... .... ..... .......... ...... ... ........... ... .. ... : ........... 493 
21.2 Classificação ...... ... .......... .... .................. : ... ............... ...................... .... ..... ..... ....... 494 
21.3 Rompimento de células microbianas ......... ......... ..... ...... .......... .. ..... ............... 501 
21.4 Precipitação ....... ... ........................ ........................... ........ .... ......... ................... .. 504 
21.5 Ultrafiltração ........ ......... .. ...................................... ..................... ....................... 507 
21.6 Extração em sistemas de duas fases aquosas ......................................... .. .... 507 
21.7 Cromatografia ............ ..... ........... ........ .. .................. ... .... .............. .. .. .............. .... 510 
21 .8 Tratamentos finais ......... .. ... .. ................. ......................................... ............... ... 514 
21.9 Rotinas analíticas ................. .............. .. ... ... ........... .. ... ......... .. ... .. ............. .. ........ 515 
21.10 O processo integrado de purificação .......... .. .... ... ...... ..... ........ .... ... ... ...... ....... 518 
Referências bibliográficas ........ .......................................... ...... .... .. ..... ~. ~ .. ........ 520 
22 ASPECTOS ECONÔMICOS . ...................................................................... ............ 523 
22.1 Introdução ............... .. ..... ........................ .... ........................................... ............. 523 
22.2 Considerações sobre as diferentes variáveis e suas relações · 
existentes em todo o estudo econômico ................. ... .. ...... : ............ ............... 523 
22.3 Análise de viabilidade econômica ........ .. ...................... ......... : ........ ... ............ 528 
22.4 Aspectos econômicos de processos fermentativos ... ............ .. .... ................. 530 
22.5 Métodos de avaliação de investimento ........................... ; ........ ... .................. 535 
Bibliografia ..... ... ..... ........ ... ......... .... .... ... ............ ............ ....................... ....... ...... 541 
L__.__· ·--·------~----------
------------------=-========~~~~=-=-=-=· ==~~============== 
Walter Borzani 
Durante a Segunda Grande Guerra (1939-1945), os então "Aliados" concen-
traram esforços consideráveis na consecução de um objetivo muito específico: 
transferir para escala industrial o processo de laboratório, então conhecido, de 
produção de penicilina por fermentação . 
Ao lado de profissionais já de longa ~ata envolvidos no estudo de ativida-
des microbianas, passaram então a atuar engenheiros químicos, com vistas à solu-
ção de questõesbastante complexás inerentes à desejada ampliação de escala. 
Foi nesse período que nasceu o ramo da Engenharia Química que, mais tar-
de, por suas peculiaridades, receberia o nome de Engenharia Bioquímica. 
Neste praticamente meio século de existência, esse novo ramo da Engenha-
ria Química progrediu rapidamente, conduzindo a muitos resultados de indiscutí-
vel importância-prática. 
O objetivo da Engenharia Bioquímica é a aplicação dos conhecimentos da 
Engenharia Química na solução de problemas que se apresentam na implantação 
de processos biotecnológicos em larga escala, e em sua otimização. 
Segundo AIBA, HUMPHREY e MILLIS: "Biochemical engineering is concer-
ned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the 
links between biology and chemical engineering. The authors believe, moreover, 
that the heart of biochemical engineering lies in the scale-up and management of 
cellular processes". 
BAILEY e ÜLLIS, por sua vez, dizem: "Processing of biological materiais and 
processing using biological agents such as cells, enzymes or antibodies are the 
central domain of biochemical engineering. Success in biochemical engineering re-
quires integrated knowledge of governing biological properties and principies 
and of chemical engineering methodology and strategy. ( .. . ) Reaching this objecti-
ve clearly requires years of careful study and practice" . 
Convém citar que o primeiro livro dedicado à Engenharia Bioquímica foi 
publicado em 1958, por STEEL. 
2 Engenharia bioquímica: uma aplicação sui generis da engenharia química 
Os problemas que se apresentam no âmbito da Engenharia Bioquímica são, 
com alguma freqüência, de difícil solução, dadas as peculiaridades e a complexi-
dade dos sistemas em que se desenvolvem os processos biotecnológicos. 
O estudo de vários desses problemas constitui o principal objetivo deste vo-
lume, mas parece-nos aconselhável, neste primeiro capítulo, comentar alguns de-
les, com a única finalidade de dar, aos alunos, uma idéia das questões que serão 
examinadas. 
Comecemos tecendo alguns comentários a respeito dos balanços materiais 
em processos fermentativos. A célula microbiana responsável pela transformação 
que nos interessa em um dado processo realiza, além dessa transformação, um 
grande número de outras reações com o objetivo, para ela absolutamente primor-
dial, de manter-se viva e multiplicar-se. Isso pode dificultar o estabelecimento de 
balanços materiais, além de afetar o rendimento do processo considerado. O co-
nhecimento das prováveis vias metabólicas que se desenvolvem nas células é, nes-
te particular, de grande auxílio, fornecendo muitas vezes informações que 
indicam a maneira mais adequada de conduzir o processo que nos interessa. 
O fato inevitável, apontado hápouco, de a célula ter a única "preocupação" 
de manter-se viva e multiplicar-se, também pode acarretar sérios problemas no es-
tudo da cinética da transformação que se tem em vista, uma vez que a velocidade 
de formação do produto que nos interessa pode ser profundamente afetada pelas 
velocidades de outras reações integrantes do metabolismo do microrganismo. Isso 
pode dificultar o estabelecimento de modelos matemáticos, cuja importância na 
otimização e no controle de processos já foi constatada muitas vezes. 
A manutenção de um razoável grau de "homogeneidade" no reator, para que 
todos os agentes da transformação se encontrem, pelo menos aproximadamente, 
nas mesmas condições (temperatura, pH, concentrações de substâncias do meio), é 
outro problema a ser considerado, principalmente em reatores industriais. 
Consideremos, agora, a operação de esterilização de grandes volumes de 
meio, operação esta muito freqüente em indústrias de fermentação. Como proce-
der: eliminar os microrganismos por filtração do meio ou destruí-los por aqueci-
mento? Se a esterilização por aquecimento tiver sido escolhida, que processo será 
utilizado: o descontínuo ou o contínuo? Que temperatura de esterilização será 
adotada e qual o correspondente tempo dotratamento térmico? Quais serão as di-
mensões dos equipamentos e os controles necessários em cada caso? 
O meio, uma vez esterilizado, será encaminhado ao fermentador onde será 
transformado pela ação das células microbianas. Aqui nos depararemos com mui-
tas alternativas. Serão utilizados microrganismos em suspensão no meio ou célu-
las imobilizadas em suportes inertes? Que processo de fermentação será utilizado: 
o descontínuo, o semicontínuo ou o contínuo? Com ou sem recirculação do mi-
crorganismo? Se for escolhido o processo descontínuo, será o descontínuo simples 
ou o descontínuo alimentado? Se o processo adotado for o semicontínuo, que fra-
ção de meio fermentado será periodicamente retirada do reator e substituída por 
igual volume de meio novo? No caso de se ter optado pelo processo contínuo, 
adotar-se-á um único reator de mistura, vários reatores de mistura ligados em sé-
rie, ou um reator pistonado? Quais serão as dimensões e o form~to do reator? 
Como controlar as condições de fermentação? Como adicionar alguns nutrientes: 
Engenharia bioquímica: uma aplicação sui generis da engenharia química 3 
todos de uma só vez no preparo do meio, ou de maneira programada durante o 
andamento do processo? 
No caso de se tratar de um processo enzimático contínuo com enzimas imo-
bilizadas, lançar-se-á mão de um reator de leito fixo, ou de leito fluidizado? 
Outro tópico a ser lembrado, é o da ampliação da escala de trabalho ("sca-
le-up"): se bons resultado~ foram obtidos, em certas condições, em um reator de 
pequena capacidade, como operar um reator industrial para que os mesmos resul-
tados sejam alcançados? 
Finalmente, para não alongarmos demasiadamente estes comentários, nunca 
será demais ressaltar a importância de que se reveste a escolha dos processos que 
serão utilizados, tanto na separação dos produtos e subprodutos, como no trata-
mento, ou no aproveitamento dos resíduos. 
A solução adequada de muitas das questões com que se defronta a Engenha-
ria Bioquímica passa, necessariamente, pelo estabelecimento de modelos matemá-
ticos, como se constatará ao longo deste Volume. Parece-nos oportuno, por esse 
motivo, ressaltar a utilidade desses modelos, valendo-nos de um artigo publicado 
por FREDRICKSON e colaboradores em 1970: 
"1. Models serve to correlate data and so provide a concise way of 
thinking about a system or process. 
2. Models allow one- within limits- to predict quantitatively the per-
formance of a system or process.-Thus~ they can reduce the amount of 
experimentallábor necessary to design and/ or optimize a process. 
3. Models help to sharpen thinking about a system or process and can 
be used to guide one's reasoning in the design of experiments, to isola-
te important parameters and elucidate the nature of the system ór pro-
cess. That is to say,' the combinations of mathematical modelling and 
experilllen_~~l research often suggests new experiments that need to be 
done." 
Literatura recomendada 
(1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. 
University of Tokyo Press, Tóquio, 1973. 
(2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais. 
McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986. 
(3) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbiologie Industrielle et Génie Biochi-
mique. Masson et Cie., Éditeurs, Paris, 1970. 
5 
Willibaldo Schmidell 
2.1 - Introdução 
O objetivo central do presente capítulo reside na descrição das característi-
cas gerais que microrganismos e meios de cultura devem apresentar, a fim de ser 
possível utilizá-los em uma operação industrial de grande porte, ou seja, executa-
da em biorreatores com volumes de dezenas de milhares de litros. 
Apesar de se procurar mencionar, ao longo do texto, alguns exemplos, não 
há a preocupação em de$crever características particularmente importantes para 
um determinado processo fermentativo, pois isto tornaria o tema extremamente 
longo, além de apresentar uma importância questionável, tendo em vista o escopo 
geral do presente capítulo. 
Retomando as idéias já abordadas no Capítulo 9 (Vol. 1), na Figura 2.1 en-
contra-se um esquema geral de um processo fermentativo, na qual buscou-seres-
saltar alguns pontos essenciais, que permitem um início de discussão dentro do 
objetivo acima traçado. 
Conforme se pode observar na Figura 2.1, o sucesso de um dado processo 
fermentativo depende muito de uma correta definição de quatro pontos básicos: o 
miCrorganismo, o meio de cultura, a forma de condução do processo fermentativo 
e as etapas de rec\lperação do produto. 
Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem 
enormemente, sendo necessário buscar defini-los de forma conjunta, levando em 
consideração aspectos biológicos e econômicos, o que torna bastante complexa 
esta adequada definição. Para tornar clara essa idéia, pode-se mencionar que sem-
pre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas deve-se lembrar que o 
microrganismo deve encontrar neste ineio condições adequadas para realizar a 
conversão pretendida. · 
.......___ __ - --·--·- ---·· ·--·~--·--- -·.----··--~·-- - -·· - --·---- ' ·· -- .. · 
. ·_, 
6 Microrganismos e meios de cu~ura para utilização industrial 
Em termos de formas de condução do processo fermentativo, seria difícil 
imaginar a produção presente de etanol no Brasil (algo como 15 bilhões de litros 
por ano), caso não se operasse os biorreatores em sistema descontínuo alimentado, 
ou mesmo contínuo, porém com o reciclo das células. Da mesma forma, o grande 
avanço alcançado pela digestão anaeróbia no tratamento biológico de águas resi-
.duárias, deveu-se muitíssimo ao surgimento dos reatores contínuos operados com 
fluxo ascendente e reciclo interno de células. 
Prei>ãrB71ô' :·- .' 
lnóculo:;eta.pa 
lndustriai · ·:. 
~iierri:linad9r~~ l ·-·"." ,.. --.. .... . 
Matérias-primas 
! 
Figura 2.1 - Esquema geral de um processo fermentativo 
As operações finais para a recuperação do produto (operações de 
"downstream"), são igualmente da mais alta importância. Sabe-se ' que a melhor 
forma presentemente para a recuperação do etanol, após uma fermentação alcoóli-
ca, é a operação de destilação, mas ela incide significativamente no custo do pro-
duto final, em virtude da energia necessária para a sua execução. No entanto, a 
importância de uma adequada definiçao das operações de recuperação do produ-
to, fica mais clara quando se aborda a produção de produtos de alto valor agrega-
do, como a produção de· antibióticos, enzimas, ou outras proteínas (insulina, 
hormônios de crescimento, vacinas etcJ Pá'ra esses casos, as operações de recupe-
ração do produto podem ser responsáveis por 50 a 70% do custo do produto final, 
indicando, claramente, a sua importância em termos de uma adequada definição. 
Os aspectos relacionados com a forma de condução de biorreatores, assim 
como as operações de recuperação de produtos, serão abordados em vários capí-
tulos do presente volume . 
Fontes de microrganismos de interesse 7 
Cabe, portanto, conforme salientado anteriormente, abordar alguma refle-
xão sobre microrganismos e meios de cultura que podem ser eventualmente em-
pregados em uma operação industrial. 
2.2 - Fontes de microrganismos de interesse 
Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos ba-
sicamente das seguintes formas: 
isolamento apartir de recursos naturais 
compra em coleções de culturas 
obtenção de mutantes naturais 
obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais 
obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de 
engenharia genética. 
O isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como 
solo, água, plantas etc., sempre foi uma atividade de grande importância para a 
obtenção de novas linhagens de interesse industrial. 
Trata-se de uma atividade que envolve muito trabalho experimental, signifi-
cando um custo relativamente elevado, porém pode conduzir ao isolamento de li-
nhagens melhor produtoras de um dado produto, mas, mais importantedo que 
isto, pode conduzir à descoberta de novos produtos, o que confere a esta possibili-
dade uma relevância inquestionável. 
Cumpre lembrar que as grandes eni.presas produtoras de antibióticos, ou en-
zimas, mantêm programas de isolamento de linhagens de recursos naturais, justa-
mente com o objetivo de incrementar a produção de certos produtos, ou com o 
objetivo de encontrar linhagens produtoras de novos antibióticos por exemplo. 
É dar() ql.!e o isolamento de linhagens deve ter início com certas premissas, 
definindo-se o que se pretende obter, pois o simples isolamento poderá levar à 
disponibilidade de um número inimaginável de culturas, o que dificulta a conver-
gência para o processo ou o produto que se pretende produzir. 
A compra em coleções de culturas é presentemente bastante viável, tendo 
em vista a existência de muitas coleções de culturas em vários países. Nesse 
sentido, STANBURY et al. 1 listam nada menos do que 11 coleções de culturas em 
vários países, podendo-se ainda acrescentar a Agricultura! Research Service 
Culture Collection (EUA), também conhecido como NRRL Culture Collection 
(http:/ /nrrl.ncaur.usda.gov) e a Coleção de Culturas Tropical {Campinas - SP; 
http:/ /www.cct.org.br). O contato com essas coleções é atualmente muito facilita-
do, podendo-se utilizar os recursos da Internet para tal tarefa. 
É de se esperar que o microrganismo utilizado para a produção de um dado 
antibiótico não estará disponível em uma coleção de culturas, sendo, com muita 
freqüência, oriundo de programas de melhoramento genético. 
Como se sabe, quando uma dada célula prolifera, há sempre uma pequena 
possibilidade de surgimento de mutantes naturais, os quais podem ser isolados e 
ensaiados objetivando a verificação de sua potencialidade de produção. Conforme 
8 Microrganismos e meios de cultura para utilização ·industrial 
se verá adiante, essas alterações naturais não são, de forma alguma, interessantes 
do ponto de vista de um processo fermentativo, mas eventualmente podem gerar 
novas linhagens que apresentem interesse prático. 
No entanto, aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse práti-
co, poderá significar o dispêndio de muito tempo, razão pela qual prefere-se, há já 
várias décadas, lançar mão de métodos que forcem o aparecimento de células inu-
tadas, como é o caso de submeter suspensões de células ou esporos a radiações ul-
travioleta ou a substâncias químicas mutagênicas, como a nitrosoguanidina. Ao se 
permitir essa exposição ou contato, ocorre uma drástica destruição da maioria das 
células, recuperando-se, a seguir, aquelas que sobreviveram, verificando-se se 
mutaram na direção desejada. 
Essa técnica para a obtenção de mutantes é obviamente aleatória, tratan-
do-se de recuperar as células sobreviventes em meios ou condições específicas, de 
forma a dirigir este isolamento para as células que se pretende. Tais programas de 
mutação/seleção costumam ser bastante dispendiosos, mas levaram a várias con-
dições de sucesso descritas na literatura. 
Um caso bem relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicillium 
chrysogenum para a produção de penicilina. De fato, na década de 40 obtinha-se 
teor de penicilina no caldo fermentado da ordem de· 100 unidades/ cm3, passan-
do-se a obter, já por volta de 1976, teores da ordem de 51.000 unidades/cm3• Já 
acréscimos da ordem de 4 vezes foram obtidos entre 1970 e 1985 em uma determi-
nada empresa,1 o que indica que este progresso costuma-~er muito estimulante, es-
pecialmente quando se parte de linhagens naturais. Incrementos semelhantes 
foram obtidos na empresa Squibb Indústria Química S.A., no período de 1975 a 
1992, conforme relatado por SCHMIDELL; FERNANDES.2 
Tais progressos realmente significativos costumam ser atribuídos apenas a 
esses programas de mutação/seleção, mas é conveniente lembrar o necessário tra-
balho de adaptação do meio de cultivo, da forma de conduzir o processo.fermen-
tativo e as alterações nas etapas de recuperação do produto, a fim de propiciar o 
real surgimento das vantagens, em nível de produção industrial, da nova linha-
gem selecionada. 2 
Finalmente, nas últimas décadas, as técnicas de engenharia genética (vide 
Vol. 1, Cap. 4), também designadas por técnicas ou tecnologia de DNA recombi-
nante, sem dúvida trouxeram um imenso avanço nas possibilidades de se obter cé-
lulas mais produtivas, ou células produtoras de substâncias que normalmente não 
produzem. Como se sabe, ao lado dessas possibilidades, igualmente trouxeram 
várias reflexões e inquietudes, cujo teor não será abordado no presente capítulo. 
A introdução de fragmentos de DNA de certas células em outras, via vetores 
como os plasmídeos, permite a obtenção de células alteradas geneticamente, po-
rém de forma muito mais dirigida do que as metodologias convencionais anterior-
mente mencionadas, sendo possível de ser executada não apenas com microrga-
nismos, mas iguàlmente com células animais e vegetais. 
Para se ter uma idéia da potencialidade dessas técnicas, imaginemos que se 
conheça a seqüência metaból~ca que leva ao acúmulo de um dado produto de inte-
resse, por exemplo o produto P na seqüência genérica: 
Fontes de microrganismos de interesse 9 
A~B~C~D~ ... ~P 
Um estudo mais aprofundado dessa seqüência, através da determinação das 
concentrações dos compostos intermediários (B, C, D etc.), pode levar à determi~ 
nação da reação limitante da seqüência (aquela que determina a velocidade do flu-
xo metabólico em estudo, por exemplo a reação C 4 D) e, portanto, da enzima 
responsável pela reação específica (enzima c). As etapas seguintes são a identifica-
ção do gene que codifica 'para a síntese dessa enzima, introduzir este gene em 
plasmídeos e voltá-los à célula produtora. Com esse procedimento, aumenta-se o 
número de cópias do gene responsável pela síntese da enzima, o que permite au-
mentar a velocidade da reação limitante, pela presença de uma maior concentra-
ção da enzima responsável (no caso, a enzima c). 
Essa estratégia foi empregada, por exemplo, no incremento da produção de 
cefalosporina C por CephaZosporiuni acremonium. 1 
Ainda, uma etapa intermediária poderia ser imaginada. Uma vez identifica-
da a enzima responsável pela catálise da reação limitante, esta enzima poderia ser 
manipulada, através do conhecimento de sua estrutura e alteração de determina-
dos aminoácidos, por técnicas de engenharia de proteínas, objetivando obter uma 
nova proteína com atividade aumentada. O gene correspondente a essa nova enzi-
ma seria, então, introduzido na célula produtora, conforme acima descrito. 
A potencialidade dessas técnicas é realmente enorme, pois, uma vez solucio-
nado o problema de uma dada reação limitante, outra reação da seqüência meta-
bólica passará a ser limitante, o que permite imaginar a realização de igual estraté-
gia para esta nova reação. Claro está que tais procedimentos não são de simples 
execução, pois inclusive exigem um amplo conhecimento do material biológico 
utilizado, mas apresentam um enorme interesse prático. 
Conforme mencionado, as técnicas de DNA recombinante também podem 
ser aplicadas para tornar células produtoras de substâncias que naturalmente não 
são por elas produzidas, ,em virtude da ausência de codificação genética para tan-
to. Nesse caso, genes de certas células são transferidos, via vetores adequados, a 
outras células, como é o caso de introduzir a codificação para a síntese de glicoa-
milase de Aspergillus em células de Saccharomyces cerevisiae, o que passa a permitir 
a realização da fermenta~ão alcoólica de matérias~primas amiláceas, pela levedura 
alterada geneticamente.3' 
Com esse objetivo, a tecnologia do DNA recombinante tem sido empregada 
para a obtenção de proteínas heterólogas de alto valor agregado, em particular 
para uso em saúde humana, como é o caso da produção de hormônio de cresci-
mento humano, insulina, interferons, Fator VIII (tratamento da hemofilia) etc. 
Como microrganismos receptores da codificação genétieaempregam-se bactérias 
(Escherichia coZi, Bacillus subtiZis), leveduras (Saccharomyces cerevisiae) ou fungos fi-
lamentosos (Aspergillus niger). Igualmente são empregadas células animais (exem.:. 
pio: BHK - "Baby Hamster Kidney"), particularmente para a produção de proteí-
nas mais complexas e de maior valor agregado, o que explica o crescente interesse 
das grandes empresas do setor no cultivo de células animais. 
Presentemente, é inclusive possível imaginar o emprego de um pequeno nú-
mero de microrganismos, bem conhecidos em termos de necessidades nutricionais 
e características de crescimento, como é o caso de Escherichia coZi ou Saccharomyces 
cerevisiae, para a síntese de uma grande variedade de proteínas, no lugar de se ter 
como problema o cultivo de uma linhagem para cada composto a ser produzido. 
I O Microrganismos e meios de cultura para utilizaçã~ industrial 
···-
Claramente isso pode contribuir pa~a uma certa simplificação dos processos pro-
dutivos, desde que se consiga obter os mutantes adequados. 
2.3 - Características desejáveis de microrganismos e meios 
de cultura para aplicação industrial 
Conforme já anunciado, no presente item pretende-se apresentar algumas 
características gerais que microrganismos e meios devem apresentar, a fim de que 
seja possível o estabelecimento de processo produtivo em larga escala. Buscar-se-á 
enunciar as características desejáveis de microrganismos e, em seguida, aquelas 
relacionadas aos meios de cultivo, lembrando, no entanto, que o desempenho de 
um dado microrganismo depende muito da composição do meio de cultura em 
que é colocado. 
Como se pretende expor características gerais, quando da análise de um 
dado processo fermentativo, é possível que algumas destas características não se 
apliquem, enquanto outras,não abordadas no presente texto, poderão ser de gran-
de importância. No entanto, espera-se estabelecer certas reflexões que permitam 
essa análise crítica. 
2.3. I - Características desejáveis de microrganismos 
Para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem 
as seguintes características gerais: · · 
• apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; 
• permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concen-
tração do produto no caldo fermentado; 
• não produzir substâncias incompatíveis com o produto; 
• apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; 
• não ser patogênico; 
• não exigir condições de processo muito complexas; 
• não exigir meios de cultura dispendiosos; 
• permitir a rápida liberação do produto para o meio. 
As duas primeiras características serão discutidas conjuntamente, pois, ape-
sar de serem distintas, concorrem para o mesmo objetivo geral de extrema impor-
tância. 
[)e fato, uma célula deve permitir elevada conversão do substrato em produto, 
pois, com muita freqüência, as matérias-primas incidem pesadamente no custo do 
produto final, podendo-se mencionar uma incidência de 38 a 73% do custo total de 
produção como sendo devido às matérias-primas, em particular a fonte orgânica 
de carbono.1 
Por outro lado, é sempre desejável que o microrganismo permita um elevado 
acúmulo do produto no meio, sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste 
acúmulo, pois isto concorre para uma redução nos custos de recuperação, os quais 
também podem ser muito acentuados. 
Tome-se como exemplo o caso da fermentação alcoólica, aqui representada 
simplificadamente pela equação química final (glicose em anaerobiose sendo con-
vertida em etanol e gás carbônico): 
------------------------~---
Características desejáveis de microrganismos e meios de cuaura para aplicação industrial I I 
..... 
C 6H 12Ü 6 ~ 2C 2H 50H+ 2C02 
Como se pode observar, o fator estequiométrico é igual a 0,511, ou seja, cada 
grama de glicose convertida gera 0,511g de etanol, sendo que o Saccharomyces cere-
visiae, normalmente empregado nesta fermentação, com freqüência permite obter 
um rendimento da ordem de 90% deste valor estequiométrico, o que torna este mi-
crorganismo o mais importante para Tealizar esta conversão, lembrando que vários 
outros também podem acumular etanol, a partir da glicose, porém não com este 
rendimento tão elevado. 
Obviamente, não se consegue manter um processo de fermentação alcoólica 
obtendo-se 100% de rendimento, pois as células têm de proliferar, o que significa a 
síntese de muitos outros compostos intermediários, sendo o acúmulo de etanol a 
via metabólica que permite a geração de energia na forma de ATP (glicólise). Cla-
ro está que esse é um ponto fundamental, pois a matéria-prima incide em algo 
como 60% do custo do etanol e, desta forma, baixos rendimentos tornariam inviá-
vel a produção deste produto de baixo valor agregado. 
f 
Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 a 10% (em volume) em etanol 
no vinho fermentado, já ocorre uma clara inibição da levedura, o que faz com que 
a velocidade da conversão do açúcar em etanol fique prejudicada, razão pela qual 
procura-se não ultrapassar estes valores, pelo menos na produção de álcool com-
bustível (não se está aqui comentando o caso de bebidas alcoólicas). 
Isso significa a necessidade de destilar um líquido que contém apenas 10% 
de etanol, o que - além do dispêndio de energia - ainda irá gerar 90% de resíduo 
na forma de vinhaça, que necessita encontrar um destino adequado. 
{ 
O ideal seria encontrar leveduras mais resistentes ao etanol, porém sem que 
ocorra queda n. a velocidade da fermentação alcoólica (sem queda na produtivida-
de), o que não é tarefa simples. 
De qualquer forma, fica claro que a conversão da matéria-prima em produto 
já é muito elevada, o que não permite visualizar grandes incrementos, lembrando, 
novamente, a necessidade de manter a viabilidade celular para que a fermentação 
não seja interrompida. 
Uma situação bem diversa é a que ocorre com os processos aeróbios, por 
exemplo,na produção de enzimas ou antibióticos. Nesse caso, a conversão do açú-
car pode ser representada esquematicamente da seguinte forma: 
Açúcar + 0 2 ~ células + C02 + H20 + Intermediários + Produto 
Nesse caso, por se operar em aerobiose, a quantidade de células geradas cos-
tuma ser muito intensa, em relação ao açúcar consumido, ao lado de uma quanti-
dade relativamente pequena do produto alvo (antibiótico ou enzima). Se, por um 
lado, o custo da matéria-prima incide menos 'pesadàmente no custo do produto fi-
nal, as operações de recuperação do produto são necessariamente mais onerosas 
(chega-se a valores da ordem de 70%), mas o produto alvo é de mais alto valor 
agregado. 
Assim, ao se encontrar linhagens que cresçam relativamente menos, ou que 
acumulem menos compostos intermediários, é possível visualizar grandes incre-
mentos na síntese do produto, conforme mencionado anteriormente para o caso 
da produção de penicilina. 
12 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial 
· Mesmo permitindo o acúmulo do produto no meio, a célula produtora deve, 
ainda, contar com a característica de não produzir substâncias que sejam incompatíveis 
com o produto, pois isto pode levar a uma situação de desinteresse pelo processo 
produtivo. · 
Esse é o caso, por exemplo, de se estar interessado na produção de uma dada 
enzima, ou proteína, mas se utilizar uma linhagem que também seja uma boa pro-
dutora de proteases extracelulares. Assim, ao se produzir a enzima, separar as cé-
lulas e armazenar o produto, pode-se ter uma redução sensível da atividade 
enzimática em virtude da ação das proteases. 
Um exemplo adicional, mais específico, é sobre a produção de glicoamilase 
por Aspergillus. Como se sabe, a glicoamilase é a enzima que hidrolisa o amido ge-
rando glicose, sendo pois de muito interesse em várias aplicações, destacando-se o 
preparo de xaropes de glicose para a indústria de alimentos. Ocorre que alguns 
microrganismos produtores de glicoamilase também sintetizam a transglicosida-
se, enzima esta que, quando na presença de glicose, voltaa polimerizá-la, gerando 
moléculas que não são mais hidrolisadas pela glicoamilase. 
Na realidade, a presente característica desejável em uma célula pode ser 
bem mais generalizada. Um microrganismo ideal, quanto ao aspecto agora abor-
dado, deve produzir o mínimo de outras substâncias, ao mesmo tempo em que 
sintetiza o composto pretendido. Isso leva a uma maior disponibilidade de nutri-
entes para a síntese do produto (voltando-se à discussão anterior), mas também 
permite vislumbrar uma maior facilidade na recuperação deste produto. ' 
Uma outra característica, da mais alta importância, refere-se à estabilidade fi-
siológica da linhagem a ser empregada industrialmente. Isso significa que não bas-
ta que se tenha uma linhagem hiperprodutora de uma dada substância de 
interesse, mas que se conheça as técnicas mais adequadas para a sua conservação 
e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substância de in-
teresse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferação em nível de 
laboratório, germinadores e biorreator principal (Fig. 2.1). 
Assim sendo; o constante estudo dessas formas de conservação maiS ade-
quadas das linhagens é tarefa das mais importantes, mantendo-se, na indústria, 
aquelas realmente de interesse, assim como o imediato descarte dos lotes que de-
monstrem alguma tendência à atenuação quanto ao acúmulo do produto no meio. 
Para a célula há sempre a tendência em otimizar o crescimento, em detrimento da 
síntese do produto, motivo pelo qual não basta verificar, em termos de metodolo-
gias de conservação, se a célula cresce, mas se ela continua a acumular o produto 
de maneira eficaz. 
Conforme já mencionado anteriormente, quando uma célula prolifera, há 
sempre alguma probabilidade de ocorrerem mutações naturais. Em um processo 
fermentativo típico, normalmente parte-se de uma massa muitopequena de célu-
las nas etapas iniciais de preparo do inóculo (Fig. 2.1), chegando-se a biorreatores 
de dezenas de milhares de litros, contendo concentrações celulares com freqüên-
cia acima de 10 g de matéria seca de células/L, o que significa gerar, em termos de 
massa de matéria seca, algo em torno de toneladas de células. Isso mostra clara-
mente a necessidade de se operar com material genético que seja estável, a fim de 
se contar com células competentes em termos de acúmulo do produto._ 
O emprego de linhagens relativamente instáveis, pode, inclusive, limitar o 
emprego de sistemas de fermentação mais eficientes, como os processos contínuos, 
Características desejáveis de microrganismos e meios de cu~ura para aplicação industrial 13 
pois poderá ocorrer, ao longo do tempo, a seleção de células que privilegiem o 
crescimento em detrimento do acúmulo do produto. 
O fenômeno da atenuação do acúmulo do produto de interesse pode ocorrer 
tanto com linhagens naturais como, em especial, com as linhagens mutadas. Na li-
teratura1 está bem documentada a viabilidade de se produzir lisina pOr mutantes 
auxotróficos, em processo contínuo, apenas quando se empregam mutantes auxo-
tróficos em dois aminoácidps e não em apenas um, a fim de evitar os mecanismos 
de controle da célula e obtér o acúmulo intenso do aminoácido de interesse. Nessa 
condição, é mais difícil o retorno às características da linhagem original, em virtu-
de de uma maior alteração a que a célula foi submetida. 
Células recombinantes, por via da introdução de plasmídeos, igualmente 
podem ser instáveis em virtude da inexistência de replicação do plasmídeo para 
. as células filhas, ou mesmo devido à destruição do plasmídeo na própria célula 
hospedeira, ou ainda à expulsão desse plasmídeo. É necessário lembrar que a in-
trodução de novas codificações genéticas pode, eventualmente, significar um ônus 
adicional para a célula, a qual está interessada em aprimorar o seu crescimento. 
Inclusive, a integração de uma codificação genética contida em um plasmídeo ao 
cromossomo da célula, o que poderia conferir a desejada estabilidade, pode ainda 
não resultar na obtenção de uma hiperprodutora, em virtude da existência de um 
número limitado de cópias do gene de interesse. 
A operação de biorreatores de grande porte, conforme mencionado anterior-
mente, do ponto de vista técnico e econômico, praticamente exige o emprego de 
microrganismos não patogênicos, os quais possam ser manuseados sem riscos ambi-
entais, particularmente nas etapas seguintes em relação ao término do processo 
fermentativo. Mesmo durante a fermentação, caso se manuseasse microrganismos 
patogênicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de 
ser bastante -aumentados, particularmente com os gases efluentes, o que incidiria 
em custos adicionais. 
O cultivo de patogêil.icos é efetuado, por exemplo, para a produção de vaci-
nas, em reatores_çle pequeno porte (da ordem de centenas ou poucos milhares de 
litros), porém confinados em câmaras assépticas, tomando-se precauções necessá-
rias para a rião ·ocorrência de contaminação do meio ambiente. Isso, logicamente, 
significa custo adicional, o qual pode ser justificado no caso de produção de vaci-
nas, mas tornaria inviável a produção de uma enzima ou mesmo um antibiótico. 
A obtenção de células recombinantes de Escherichia coZi, via a introdução de 
plasmídeos, é sempre algo muito atraente, pois esta é uma das bactérias mais co-
nhecidas presentemente, mas encontra resistências em termos de uma utilização em 
instalações de grande porte, justamente por ser uma enterobactéria. Essa é uma das 
razões (não a única), pelas quais hoje se prefere partir de células de leveduras, ou 
fungos filamentosos não patogênicos, ou mesmo de células animais, a fim de se ob-
ter recorribinantes. Apesar disso, ainda existem discussões a respeito da disposição 
final dessas células recombinantes, conforme mencionado anteriormente. 
Um microrganismo também não deve exigir condições de processo muito comple-
xas, por motivos claros de economicidade da produção, sendo que dentro deste tó-
pico muitos aspectos podem ser abordados. 
Como se sabe, sempre existem valores ótimos d0 pH e da temperatura, por 
exemplo, em termos do acúmulo do produto. No entanto, também se sabe que o 
~-----· _._ _______ -----·- -· -·-·- -- · -------- ·-- - --- ··---- ·· ---- - -
14 Microrganismos e meios de cu~ura para utilização industrial 
controle preciso do pH e da temperatura apenas é possível em reatores de banca-
da, sendo que em reatores de grande porte (dezenas de milhares de litros), deverá 
ocorrer uma certa heterogeneidade ao longo da altura do reator, de forma que a 
célula deverá manter o seu desempenho, apesar de uma certa flutuação nos valo-
res destas grandezas tomadas como exemplo. Em outras palavras, o ideal é que o 
microrganismo tenha uma faixa de valores ótimos dessas grandezas e não valores 
pontuais, particularmente no que se refere ao acúmulo do produto. 
Nessa direção, são igualmente muito interessantes os microrganismos que 
conseguem manter um bom desempenho, quando cultivados em baixas concentra-
ções de oxigênio dissolvido. Como ficará claro no capítulo sobre transferência de 
oxigênio, a necessidade de manutenção de altas concentrações de oxigênio dissol-
vido traz problemas bastante sérios no tocante a um maior dispêndio de energia, 
em virtude de uma maior agitação e aeração do meio. Nesse sentido, os microrga-
nismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por exemplo), são sem-
pre mais complicados, pois a ·concentração de oxigênio no meio de cultivo terá de 
ser mais elevada, a fim de que as células mais internas destes aglomerados tenham 
acesso a este oxigênio, quando comparadas às células que crescem isoladamente. 
Já foi abordado anteriormente a inconveniência em operar corh linhagens 
que excretem quantidades exageradas de proteínas para o meio, mas ainda há 
uma questão adicional, pois a geração de espuma freqüentemente se atribui à pre-
sença de proteínas no meio de cultivo, situação ainda mais complexa para os pro-
cessos aeróbios, devidoà necessidade de aerar e agitar.o conteúdo do bioi:-reator. 
Em geral, a geração de espuma pode ocorrer no início de um processo fer-
mentativo aeróbio, quando se empregam meios de cultivo contendo extratos de 
carne ou de levedura, ou água de maceração de milho ("com steep liquor"), e nas 
etapas mais avançadas de um processo em virtude da presença de proteínas. Isso 
causa sérios problemas, como a necessidade de empregar um menor volume útil 
do reator, a fim de ter condições de controlar a espuma, além da freqüente necessi-
dade de empregar antiespumantes que, além de onerarem o produto final, ainda 
podem causar dificuldades nas etapas de recuperação do produto e uma redução 
na transferência de oxigênio, o que exige o aumento da agitação e da aeração, 
agravando a situa.ção. Assim, é .importante a seleção de microrganismos que ex-
cretem poucas proteínas juntamente com o produto desejado. 
As características que um meio de cultivo devem apresentar serão discuti-
das no próximo subitem mas, neste momento, convém mencionar que o microrga-
nismo selecionado para um processo industrial não deve exigir meio de cultura 
extremamente oneroso, por questões claramente de econorrlia do processo produti-
vo. Essa é a razão pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais 
de uma linhagem é estudo de vital importância, objetivando o fornecimento dos 
nutrientes apenas necessários. Em algumas circunstâncias esse desconhecimento 
leva à necessidade da adição de certas substâncias, como extrato de levedura, ex-
trato de carne, peptona etc., as quais costumam ser bastante dispendiosas. 
Particularmente na área de produção de vacinas, costuma-se utilizar meios de 
1 cultura bastante complexos e. onerosos, assim como nos cultivos envolvendo células 
i animais, mas aqui, novamente, os volumes de reação são relativamente pequenos e 
I os produtos gerados podem ser considerados como de alto valor agregado. 
I t F
1
ina
1
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1
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1
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1
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ex race u ares, a to o o interesse em que a in agem se eciona a t ere act e rapt-
L.~--- ------------·--------------· -~-
Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para apl icação industrial I 5 
damente o produto para o meio, de onde ele será recuperado nas etapas seguintes ao 
processo fermentativo . 
Além do aspecto ligado a uma eventual inibição do próprio microrganismo, 
pela retenção de um dado produto do metabolismo, ainda cumpre lembrar que, 
com freqüência, a primeira etapa de recuperação do produto significa a separação 
do microrganismo (por centrifugação ou filtração), trabalhando, a seguir, com o lí-
quido isento de células e estas descartadas. Assim, se algum produto ainda per-
manece associado às células, será perdido. 
Sabe-se que a retenção de certos produtos pelas células depende de uma sé-
rie de fatores, tais como: da linhagem empregada, da composição do meio de cul-
tivo e das condições impostas (pH, temperatura etc.). 
Nessa direção, um exemplo interessante foi o apresentado por AGUERO et 
al} trabalhando no estudo da produção de glicoamilase por Aspergillus niger 
NRRL 337 e Aspergillus awamori NRRL 3112, sendo esta segunda linhagem, sem 
dúvida, melhor produtora que a primeira. Esses autores indicaram que, a pH 4, o 
A . niger reteve cerca de 30% da atividade associada às células, enquanto que o A. 
awamori apenas algo em torno de 10%, indicando que a linhagem melhor produto-
ra tende a ser mais eficiente na excreção. do produto de interesse. Já a pH 6, as cé-
lulas de A. niger retiveram cerca de 70% da atividade enzimática, enquanto que 
nas células de A. awamori esta retenção foi da ordem de 40%, em relação à ativida-
de total (soma da atividade enzimática extracelular, encontrada no caldo, e a ativi-
dade intracelular, ou seja, a atividade encOntrada nas células - atividades 
enzimáticas expressas por unidade de volume de amostra), mostrando de forma 
clara a influência do pH na eficiência da capacidade de excreção das células. Ain-
da, indicaram que as atividades totais obtidas com cada uma . das linhagens atin-
giram valores muito próximos, tanto a pH 4 como 6, indicando. que o pH interferiu 
na excreção, mas não na sjntese propriamente dita. 
Esses resultados indicam a necessidade de se verificar, com a devida aten-
ção, a retenção do produto de interesse pelas células, quando se procura efetuar 
trabalhos de seleção de linhagens, ou se esteja estudando diferentes condições de 
cultivo, mesmo que o interesse resida na recuperação de produtos extracelulares. 
Caso contrário, corre-se o risco de descartar linhagens, ou condições de cultivo, 
que poderiam ser potencialmente interessantes. 
2.3.2 - Características desejáveis de meios de cultivo 
Conforme já comentado no início do item 2.3, é sempre muito difícil mencio-
nar as características de microrganismos, sem associá-los a um determinado meio 
de cultivo. Dessa forma, as características acima indicadas, na verdade em muitos 
casos, dependem do meio utilizado, de maneira que se poderia repetir, no presen-
te item, características como permitir o acúmulo de produto no meio, não permitir 
a síntese de substâncias incompatíveis com o produto etc. Claramente isso não te-
ria um maior interesse, além de tornar-se monótono, preferindo-se descrever algu-
mas características mais específicas, mas que agora, obviamente, dependerão do 
microrganismo a ser utilizado. Igualmente, não será apresentada uma discussão 
item a item, mas será efetuada uma abordagem mais geral. 
16 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial 
Algumas características gerais, que devem ser consideradas, são: 
• ser o mais barato possível; 
• atender às necessidades nutricionais do microrganismo; ' 
• auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tampo-
nado, o que evita variações drásticas de pH, ou evitar uma excessiva for-
mação de espuma; 
• não provocar problemas na recuperação do produto; 
• os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de 
estarem disponíveis todo o tempo; 
• ter composição razoavelmente fixa; 
• não causar dificuldades no tratamento final do efluente. 
Todas essas são características importantes, destacando-se o custo do meio 
de cultura, que deve ser o menor possível, desde que atenda às necessidades do 
microrganismo selecionado. 
Justamente essa combinação de atender às necessidades nutricionais do mi-
crorganismo, a fim de que o produto possa ser sintetizado, e ser minimamente 
oneroso, é que, com freqüência, acaba por causar certas complicações, que mere-
cem ser mais detidamente discutidas. 
Como se sabe, os microrganismos utilizam como fonte de carbono, e fre-
{ 
qüentemente de energia, diversos açúcares, tais como: .. glicose, sacarose, frutose, 
ou ainda polissacarídeos, como o amido e a celulose. Como fonte de nitrogênio 
são freqüentemente utilizados sais, como o (NH4hS04 (o qual costuma provocar 
reduções significativas do pH e, em alguns casos, fenômenos de inibição pelo sul-
fato), o (NH4) 2HP04, ou aminoácidos, ou a uréia (a qual permite reduz,ir os proble-
mas de controle do pH). Como fonte de fósforo utilizam-se os fosfatos solúveis, 
como o monoamônio fosfato (MAP), ou o diamônio fosfato (DAP), os quais pas-
sam a ser fontes de nitrogênio e fósforo simultaneamente. Ainda, necessita-se adi-
cionar outros elementos, como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co etc., em 
concentrações freqüentemente muito reduzidas, na forma de seus sais solúveis. 
Meios de cultura constituídos apenas por essas substâncias costumam ser 
chamados de meios definidos, ou meios sintéticos, cuja composição química é 
sempre muito bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer instante. Por essa 
razão, para as células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, es-
pera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de, em geral, 
não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do produto final. 
Essesmeios, mesmo sendo mais onerosos, podem ser preferidos, caso realmente 
permitam uma maior economia nas etapas de recuperação do produto. 
No entanto, para uma grande variedade de linhagens, há a necessidade da 
adição de certos "fatores de crescimento", ou seja, alguns aminoácidos específicos 
ou vitaminas (como biotina, tiamina, riboflavina etc.). Claro está que, quando se 
conhecem essas necessidades específicas, o que nem sempre é o caso, é possível 
adicionar essas substâncias puras, a fim de manter o meio em sua forma mais defi-
nida, mas o custo destes meios pode tornar-se inviável, particularmente para ins-
, talações de grande porte, a menos que isto signifique um enorme ganho 
Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial 17 
econômico na recuperação do produto, ou preserve alguma característica funda-
mental deste produto, necessariamente de alto valor agregado. 
Alternativamente, para suprir as necessidades de linhagens mais exigentes 
e, em geral, com características nutricionais mal conhecidas, pode-se adicionar 
certos materiais complexos como: extrato de levedura (autolisado de leveduras), 
extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc. Esses 
materiais (individualmente ou adicionados .conjuntamente) permitem introduzir 
no meio de cultura os fatores faltantes em um meio definido, mas, além de onero-
sas, são complexas e de composição variável ao longo do tempo de armazenagem 
e na dependência do fabricante e do lote empregado. Assim, pode-se imaginar a 
ocorrência de oscilações no processo fermentativo, além de possíveis dificuldades 
nas operações de recuperação do produto final, dependendo das características 
deste produto e das operações de recuperação. 
É freqüente observar-se, n~s trabalhos básicos de isolamento ou seleção de 
linhagens, o emprego de meios contendo quantidades muito grandes desses extra-
tos ou hidrolisados (vários gramas por litro, ou mesmo dezenas de gramas por li-
tro). Dessa forma, no desenvolvimento do processo produtivo, uma das tarefas 
iniciais é verificar a possibilidade da obtenção de iguais desempenhos, porém em 
meios isentos desses materiais, ou com a adição de quantidades mínimas, tendo 
em vista o custo envolvido. 
Na direção dos meios mais complexos e, igualmente, menos onerosos, razão 
pela qual são empregados na maioria dos processos fermentativos em grande es-
cala, cumpre mencionar o uso de matérias-primas naturais, tais como caldo de ca-
na-de-açúcar, melaços, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), 
água de maceração de milho ("com steep liquor") etc. · 
Essas matérias-primas são de composição química desconhecida, poden-
do-se conhecer os teores dos açúcares disponíveis, nitrogênio, fósforo, mas não se 
conhecem os teores dos sais minerais, pois certamente há sempre um número mui-
to grande de constituintes. Meios de cultura contendo esses materiais naturais 
com freqüência são completados com alguns sais (particularmente contendo nitro-
gênio e fósforo). 
Claro está qu~ a composição química estará na dependência de uma série de 
fatores, tais como solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante 
a colheita e estocagem etc. Esses fatos indicam já a expectativa de que possam 
ocorrer oscilações no processo fermentativo que emprega essas matérias-primas, 
além de obrigarem as empresas produtoras de antibiótico$, ou enzimas a mante-
rem instalações piloto para o ajuste da composição do meio a cada novo lote de 
matéria-prima que a empresa recebe (particularmente aquelas que usam a água de 
maceração de milho), a fim de evitar maiores surpresas nos biorreatores de grande 
porte. 
Inclusive essas matérias-primas naturais podem causar problemas adicionais 
na recuperação e purificação do produto final, assim como problemas nos trata-
mentos das águas residuárias. 
No entanto, ainda continuam a ser as matérias-primas preferidas em grande 
número de casos, pela simples razão de serem as mais baratas. 
18 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial 
2.4 - Considerações finais 
A definição adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do 
meio de cultura para este microrganismo, é etapa fundamental para o sucesso de 
um processo fermentativo. No entanto, é sempre importante lembrar que a defini-
ção de um processo fermentativo mais adequado, assim como as preocupações 
com a recuperação do produto, são etapas da mais alta importância. 
Em alguns casos, o emprego de microrganismos disponíveis em coleções de 
cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraen-
tes. É necessário lembrar, no entanto, que presentemente se dispõe de muitos re-
cursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos 
fermentativos cada vez mais promissores. 
Essas considerações trazem também um importante alerta sobre a constante 
necessidade de desenvolvimento do processo produtivo já instalado, justamente 
por essa grande variedade de desenvolvimentos possíveis. Presentemente é bas-
tante difícil imaginar que uma dada empresa disponha do microrganismo "óti-
mo", ou do meio de cultura "otimizado". É da mais alta importância que essa 
empresa continue a busca por melhores condições, em termos de microrganismo e 
meio; caso contrário, poderá ser ultrapassada por outras com ofertas de produtos 
de menor custo, ou melhor qualidade. 
Referências bibliográficas 
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on Technology. 2.ed. Reino Unido, Elsevier Science Ltd., 1995. 
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SCHENBERG, A.C.G. Genetic improvement of Saccharomyces for et,hanol producti-
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(4) ABUD, A.K.S.; TAVARES, L.B.B.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W.; 
FARIA, J.B.; SCHENBERG, A.C.G. Avaliação do comportamento cinético da leve-
dura Saccharomyces cerevisiae recombinante L36 em biorreator: influência do méto-
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355-60, 1990. 
19 
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------·----··- - --
3.1 - Introdução 
--------·- ~ 
Luiz Carlos Urenha 
José Geraldo da Cruz Pradella 
Maria Filomena de Andrade Rodrigues 
Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de 
seu interior ou superfície. Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eli-
minação parcial da população microbiana dos equipamentos é suficiente para ga-
rantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde 
inibidores de crescimento são produzidos (fermentação alcoólica, produção de vi-
nagre/ ácido acético, ácido láctico ou antibióticos e outros biocidas, etc.) o teor de 
inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vários microrganis-
mos. Na indústria de laticínios, os processos de pasteurização destroem a maior 
parte, mas não todos os microrganismos presentes.1'2 A pasteurização é emprega-
da quando uma assepsia mais rigorosa destruiria propriedades importantes do 
alimento e seus subprodutos. · 
Assim, desenvolveram-se processos de desinfecção que não esterilizam, mas 
garantem a assepsia adequada. Essa situação é comum na indústria de alimentos, 
onde a eliminação de microrganismos patogênicos é levada a efeito por processos 
não esterilizantes. Nesses casos, a população de microrganismos que não é elimi-
nada é mantida sob controle pela imposição de condiçõesque impedem seu de-
senvolvimento, como refrigeração ou aplicação de inibidores de crescimento (sais, 
açúcares em altas concentrações, condimentos, preservantes químicos, biocidas, 
biostáticos, etc.). 
Os processos de produção de bens destinados à saúde humana ou animal e 
os de alimentos enlatados estão entre os mais restritivos com respeito à presença 
de contaminantes. Nesses casos, a simples presença de uma única célula de conta-
minante pode pôr a perder todo um lote do produto. 
Para lidar com essas situações, desenvolveu-se uina série de técnicas para al-
cançar o tipo adequado de assepsia. Esse assunto será abordado no item 3.2. 
20 Esterilização do equipamento 
A esterilização de equipamentos é feita pela aplicação de métodos físicos ou 
químicos. Os métodos físicos mais freqüentes são o calor seco, calor úmido, radia-
ção ultravioleta, radiação com partículas ionizantes (gama) e ultra-som. Os méto-
dos químicos consistem na limpeza do equipamento com líquidos ou gases que 
matam os microrganismos ou danificam irreversivelmente sua capacidade repro-
dutiva (hipoclorito, fenóis, formaldeído, óxido de etileno, ozônio, dióxido de en-
xofre, etc.). 
Reatores bioquímicas e tubulações são, geralmente, esterilizados pela apliw 
cação de calor úmido (vapor saturado). 
Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentação 
(bombas, filtros, centrífugas, misturadores, separadores, colunas cromatográficas, 
homogeneizadores, etc.) são preferencialmente esterilizados por calor úmido. Nos 
casos em que isto não é possível, empregam-se agentes químicos adequados. 
Material de laboratório utilizado durante o processo é esterilizado por calor 
úmido (autoclaves), seco (fornos) e mais raramente por radiação ultravioleta. 
Meios de cultura são esterilizados por calor úmido. Nos casos em que a ina-
tivação térmica de nutrientes do meio é significativa (cultura de células animais, 
vegetais ou de insetos, por exemplo) emprega-se a filtração em membranas ou car-
tuchos esterilizantes para remover fisicamente os microrganismos. 
O ar para o processo fermentativo é esterilizado por filtração em cartuchos 
esterilizantes. 
Embalagens são em geral esterilizadas por radiação gama, calor úmido, ou 
por lavagem com produtos químicos adequados. 
Os métodos de esterilização agem destruindo ou comprometendo estruturas 
microbianas, como paredes celulares, ácidos nucléicos, etc., ou inativando enzi-
mas, proteínas, etc. 
O número de microrganismos que sobrevive em qualquer estágio de uma es-
terilização depende diretamente do número inicialmente presente. Portanto, onde 
for necessário aplicar esterilização, a limpeza e uma baixa carga inicial de micror-
ganismos interferem fortemente na severidade do processo a ser aplicado.3 
3.2 - Terminologia e modo de atuação 
3 .2.1 - Esterilização 
Esterilização é o processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as 
formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrga-
nismos incluindo bactérias, fungos - tanto em suas formas vegetativas como es-
poruladas - e vírus. O termo esterilização possui um significado absoluto e não 
relativo, ou seja, uma substância ou material não pode ser parcialmente estéril. 
Um material estéril é totalmente isento de qualquer organismo ativo. Essa condi-
ção deve se manter indefinidamente.3A'5'6 
Terminologia e modo de atuação 2 I 
3.2.2 - Desinfecção 
Desinfecção é um processo menos rigoroso de eliminação de microrganis-
mos, envolvendo usualmente o uso de um agente químico, denominado desinfe-
tante ou germicida, geralmente líquido e à temperatura ambiente ou moderada. A 
desinfecção não implica necessariamente na eliminação de todos os microrganis-
mos, sendo direcionada aos mais prejudiciais, principalmente em sua forma vege-
tativa, que é menos resistente que a forma esporulada. 
Antisséptico é um desinfetante, aplicável em seres animados (humanos e 
animais) para eliminar microrganismos patogênicos.3 
A Tabela 3.1 apresenta uma relação dos principais termos técnicos relaciona-
dos a processos de desinfecção, com seus significados. 
3.2.3 - Modo de ação dos agentes esterilizantes 
Agentes esterilizantes podem ser classificados como agentes físicos oU quí-
micos. Esses agentes podem induzir, por diferentes mecanismos, a formação de 
substâncias químicas letais no interior das células e/ ou alterações em moléculas 
essenciais para a manutenção e sobrevivência celular, levando à morte do micror-
ganismo. 
A morte celular pode ser causada por uma ou mais lesões. Na célula viva 
normal existem inúmeros alvos possíveis de lesão celular, tais como: (a) enzimas, 
responsáveis pelos processos metabólicos; (b) membrana citoplasmática, que man-
tém a integridade do conteúdo celular, controlando o transporte de substâncias 
entre a célula e seu meio externo, além de ser também o local de algumas reações 
enzimáticas; (c) parede celular, que proporciona rigidez e resistência mecâiüca aos 
microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos. Uma lesão em qual-
quer um desses níveis pode desencadear alterações que levam à morte celular. 
Alternativamente, um dano irreversível a um gene, responsável pela codificação 
de alguma éniima essencial, também pode levar à morte celular. 
A seguir descreveremos como agem os principais agentes esterilizantesY'6 
Calor úmido 
A temperatura elevada, associada ao alto grau de umidade, representa um 
dos métodos mais efetivos para a destruição dos microrganismos. O calor úmido 
mata os microrganismos, principalmente pela desnaturação irreversível de suas 
proteínas, destruindo portanto elementos essenciais para a sobrevivência e multi-
plicação celular, como enzimas ·e membranas celulares. 
A resistência das proteínas ao calor é uma função da hidratação da célula. 
Quanto maior a quantidade de água, mais facilmente esta entrará nos domínios 
internos das moléculas de proteína, causando mudanças conformacionais irrever-
síveis. 
Além das proteínas, os carboidratos também sofrem alterações sob o trata-
mento de calor, sendo muitas vezes caramelizados e gerando produtos tóxicos. 
Essa degradação exerce, portanto, um papel importante na esterilização. 
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22 Esterilização do equipamento 
Tabela 3.1 - Principais termos técnicos utilizados em processos de assepsia e seus significados 
TERMO SIGNIFICADO 
Remoção de todas as formas de vida 
Esterilização 
de um objeto ou material. 
Remoção ou destruição dos organis-
Desinfecção mos vivos capazes de causar danos 
ou infecções. 
Agente químico capaz de promover 
Desinfectante ou germicida 
desinfecção. 
Agente químico aplicável em pessoas 
Antisséptico ou animais, com capacidade de elimi-
nar microrganismos patogênicos. 
Remoção de microrganismos patogê-
Assepsia 
nicos ou indesejados. 
Tratamento térmico (geralmente 62°C 
por 30 min, seguido de resfriamento 
brusco) para redução drástica no nú-
Pasteurização mero de microrganismos - presentes 
em alimentos, normalmente leite, 
seus derivados, e bebidas enlatadas 
ou engarrafadas. 
Processo de esterilização capaz de 
eliminar esporos altamente resisten-
tes ao calor. Consiste em manter, o 
material a 100°C por vários minutos, 
resfriá-lo a temperatura ambiente e 
Tindalização . incubá-lo por cerca de 24 h. O proce-
dimento é repetido várias vezes. Du-
rante a incubação, os esporos passam 
à forma vegetativa, onde são suscep-
tíveis à destruição durante o aqueci-
mento seguinte. 
Biocidas 
Agentes capazes de causar a morte 
de microrganismos. 
Agentes capazes de impedir a repro-
Biostáticos dução de microrganismos, sem neces-
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:! Na esterilização por vapor sob pressão (por exemplo, nas autoclaves), esta 
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1 tem duas funções principais: uma delas está relacionada com a transferência de 
, calor, que é favorecida pela condensação ocorrida no material, levando a um rápi-
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Terminologia e modo de atuação 23 
menta do nível de hidratação no interior das células, favorecendo portanto a 
coagulação das proteínas. 
Calor seco 
·O calor seco destrói os microrganismos através da oxidação de seus consti-
tuintes químicos . A esterilização por calor seco é muito mais lenta e menos eficaz 
que por calor úmido. Ao contrário do calor úmido, nesse tipo de esterilização o ca-
lor é transferido muito lentamente e o nível de hidratação das células tende a di-
minuir, conferindo urna certa proteção às proteínas. 
Apesar de a esterilização pelo calor seco ser principalmente um processo de 
oxidação, não se pode afirmar que a ação do calor seco seja restrita a isto, pois 
nem sempre o que ocorre é uma esterilização apenas por calor seco. Dependendo 
do conteúdo de água na célula, pode oçorrer também a coagulaÇão de proteínas. 
Irradiação por luz ultravioleta (UV) 
A radiação UV é absorvida por muitas substâncias celulares, mas de modo 
mais significativo pelos ácidos nucléicos, onde geralmente ocorrem as lesões. O seu 
efeito letal é proporcional à dose de radiação aplicada. A região do espectro de UV 
com ação esterilizante é de 220 a 300 nrn, muitas vezes chamada de região "abiótica". 
Existe urna relação entre os comprimentos de onda germicidas e aqueles ab-
sorvidos por ácidos nucléicos ou seus constituintes. Compostos corno as purinas e 
pirirnidinas, absorvem UV a aproximadamente 260 nm, bem próximo da radiação 
mais efetiva que é 253,7 nrn. Os aminoácidos aromáticos, corno o triptofano, feni-
lalanina e tirosina, absorvem UV a 280 nrn. ·. 
Dentre os componentes dos ácidos nucléicos, os fosfatos de açúcares não ab-
sorvem significativamente UV acima de 220 nrn. As pirirnidinas são muito mais 
sensíveis ao UV do que as purinas, por isto os efeitos letais e de rnutagênese nos sis-
temas biológicos são atribuídos a transformações fotoquímicas das bases de pirirni-
dina. A ação esterilizanté do UV ocorre primeiramente pela produção de ligações 
cruzadas entre pirirnidinas adjacentes na mesma fita de DNA (ácido desoxirribonu-
cléico), formando dírneros. Essa reação ocorre principalmente entre resíduos de ti-
mina, formando dírneros de tirnina, levando à ·perda da integridade do DNA 
bacteriano (Fig. 3.1). Essas ligações podem causar erro de leitura do código genéti-
co, resultando em mutações que prejudicam funções vitais do organismo e conse-
qüentemente causando a morte celular. Existem mecanismos de reparo, pelos quais 
a integridade do DNA pode ser recuperada, dependendo do nível de lesão. · 
uv 
Timinas Dímero de .timinas 
Figura 3.1 - Formação do dímero de timina 
24 Esterilização do equipamento 
Dímeros mistos de citosina-timina e citosina-citosina também foram identifi-
cados em DNA de organismos irradiados. Apesar de serem menos freqüentes, 
também podem apresentar efeitos letais. 
ORNA também pode sofrer ação do UV, que gera dímeros de hidratos e 
uracila, que podem causar inativação do RNA. 
I 
Vários fatores podem influenciar na sensibilidade microbiana a UV. Desta-
cam-se o pH, o estado fisiológico das células (a maior atividade é na fase logarít-
mica de crescimento) e a constituição genética. 
Radiação ionizante 
As radiações ionizantes eletromagnéticas são principalmente alfa (a), beta 
(p), gama (y), raios X, raios catódicos, além de prótons, nêutrons e elétrons de alta 
energia. Esse tipo de radiação pode causar uma grande variedade de efeitos físicos 
e bioquímicas em microrganismos. O principal alvo que leva à perda de viabilida-
de é a molécula de DNA. 
Na radiação ionizante, um átomo emite elétrons de alta energia, que ioni-
zam sua molécula. O elétron é ejetado e absorvido por outro átomo, criando uma 
cadeia de ionizações na substância irradiada. Essa atividade excita grupos quími-
cos no DNA, causando a produção de radicais químicos altamente reativos, os 
quais podem alterar grupos químicos e até quebrar as· fitas de DNA, causando 
mutações. 
A morte celular resulta da formação de uma cadeia de ionização numa por-
ção significativa do DNA. Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos 
a radiações ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelula-
res são mais sensíveis à radiação ionizante do que organismos unicelulares, 
Óxido de etileno 
Óxido de etileno (EtO) é um éter cíclico que mata as células, agindo como 
agente alquilante. A sua ação consiste na substituição de um átomo de hidrogênio 
(através de umareação de alquilação) de grupos funcionais de proteínas, ácidos 
nucléicos e outras moléculas (carboxila livre, amino oti sulfidrila) pela molécula 
de EtO aberta (CH2CH20-) como exemplificado na Figura 3.2. Essa reação resulta 
no bloqueio dos grupos ativos das moléculas. No caso das proteínas, ocorre a des-
naturação. 
Óxido de etileno Enzima inativada 
Figura 3.2 - ReàÇão de alquilação entre o óxido de etileno e uma enzima 
Esterilização por agentes tlsicos 25 
Glutaraldeído 
O glutaraldeído age na superfície das células, onde ocorrem interações glu-
taraldeído-proteínas, gerando diversos produtos. Essa interação aumenta com a 
elevação do pH, mas os produtos formados são estáveis à hidrólise ácida. 
O glutaraldeído reage principalmente com os grupos amina livres das pro-
teínas da camada de peptoglicana das bactérias, o que interfere no transporte de 
aminoácidos de baixo peso molecular. Em vários microrganismos ocorre a aglu-
tinação celular, devido à formação de ligações intercelulares. 
3.3- Esterilização por agentes físicos 
Os principais agentes físicos esterilizantes são: calor seco, calor úmido, radia-
ção ultravioleta, radiação gama e sonicação. Cada um deles encontra aplicação em 
diferentes partes de um processo de assepsia. 
3.3.1 -Esterilização por calor úmido 
O agente de uso mais freqüente é o calor úmido, fornecido por vapor de água 
saturado. A facilidade de obtenção, de manuseio, sua eficácia e custo relativamente 
baixo explicam o uso freqüente. O vapor é obtido em caldeiras e distribuído por 
dutos de aço galvanizado ou aço inoxidável, isolados termicamente. Pelas altas 
temperaturas e pressões nas caldeiras, o vapor é considerado estéril. No entanto, 
em alguns casos mais críticos, utiliza-se filtração em cartuchos esterilizantes ime-
diatamente antes da entrada do vapor no processo. 
Tubulações e reatores (fermentadores), vazios ou carregados com meio de 
cultura, são usualmente esterilizados por calor úmido. 
Esterilização de reatores vazios 
A esterili:zação de reatores vazios consiste em injetar vapor diretamente em 
seu interior e promover inicialmente a expulsão de todo o ar presente. Após a ex-
pulsão do ar, o reator é fechado e injeta-se vapor até que a temperatura e pressão 
internas sejam adequadas, comumente 121 oc e 1 atm. A partir desse momento, e 
por todo o tempo de esterilização, novas injeções só são necessárias para manter 
constantes a pressão e temperatura. Terminada a esterilização, a entrada de vapor 
é fechada e ar esterilizado deve ser injetado, para evitar que o resfriamento e a 
conseqüente condensação do vapor presente no interior do reator gere vácuo, o 
que poderia provocar danos ao equipamento ou promover a entrada de ar externo 
contaminado, por eventuais pequenas fissuras em soldas, vazamentos em válvu-
las, etc. Após o resfriamento e estabilização da pressão interna, o meio de cultura 
esterilizado externamente, por esterilização contínua ou não, pode ser carregado e 
a utilização do tanque ser iniciada. 
Esterilização de reatores com meio de cultura 
A esterilização de reatores como meio de cultura (esterilização descontínua)é feita em três etapas. Durante todo o processo de esterilização, uma agitação mí-
nima deve ser fornecida ao meio de cultura. 
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· 26 Esterilização do equipamento 
Inicialmente, circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a tempera-
tura do meio de cultura seja maior que 96 a 97°C. Durante essa etapa, a cabeça do 
tanque deve receber vapor fluente para expulsão do ar de seu interior. Ao mesmo 
tempo, as válvulas, filtros e tubulações de entrada e saída do reator também são 
esterilizadas por vapor fluente. 
·Na etapa seguinte, injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até que 
este atinja 100°C. A partir desse momento, o reator é completamente fechado e a 
injeção de vapor continua até que a temperatura e pressão internas sejam adequa-
das (por exemplo 121 °C e 1 atm). 
Atingido esse patamar, a injeção direta de vapor pode ser cortada e o contro-
le de temperatura e pressão mantidos através da serpentina ou camisa pelo tempo 
necessário. 
O resfriamento é feito pela circulação de água fria na serpentina ou camisa. 
Quando a temperatura atingir a marca dos 100°C, deve-se injetar ar esterilizado 
no tanque para evitar formação de vácuo pela condensação do vapor presente. 
A injeção direta de vapor provoca um aumento no volume de meio de cultu-
ra de cerca de 10 a 15%, em função da condensação. Por essa razão, o meio de cul-
tura deve ser preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluição pelo 
condensado. 
O tempo de esterilização é função das condições do próprio reator e do pro-
cesso. Se um reator é usado sempre com o mesmo micrOrganismo, e se ele estiver 
em bom estado (perfeitamente limpo, sem fissuras, sem vazamentos em válvulas 
ou conexões de sensores), 20 a 40 minutos a 121 oc e 1 atm devem ser suficientes 
para sua esterilização. Se for um reator multipropósito, utilizado com bactérias ou 
fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por 
assepsia química antes da esterilização por vapor. Nesse caso, a manutenção a 
121 oc e 1 atm deve se estender por um tempo que pode ser maior que 60 minutos, 
desde que não prejudique o meio de cultura. 
Uma etapa crítica é a de aquecimento do· meio de cultura desde a temperatu-
ra ambiente até atingir 96 a 97°C, quando o processo é feito por serpentinas ou ca-
misa. Nesse caso, uma relação adequada entre a área de serpentina ou camisa e o 
volume de meio de cultura favorece o rápido aquecimento. As Figuras 3.3 e 3.4 
apresentam curvas de aquecimento de meio de cultura em reatores de volume útil 
200 1 e 2.000 1 respectivamente. O tanque de 200 1 apresenta 6,5 m 2 de área de troca 
térmica por m3 de meio de cultura. O tanque de 2.000 1 apresenta 1,8 m2 de área de 
troca térmica por m 3 de meio de cultura. 
Reatores com esterilização programável 
Equipamentos mais sofisticados, completamente automatizados, trazem in-
corporada a função de esterilização em seu software de controle. Nesse caso, para 
proceder à operação de esterilização, basta um comando do operador num painel 
ou em um rnicrocomputador de controle. Em geral, pode-se escolher. o tempo e a 
temperatura de esterilização. Esses equipamentos são disponíveis em qualquer ca-
pacidade, desde os de bancada até os industriais. 
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120 
100 
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B 60 
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C1l a. 
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C1l 
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CURVA DE AQUECIMENTO 
fermentado r de 200 L 
10 15 20 
Tempo (min) 
Esterilização por agentes fisicos ., 2 7 
25 30 
Figura 3.3 - Formato do tanque de 200L úteis ( 6,5 m 2 serpentina/m3 de meio de cultura), e curva de aquecimento. 
Caso a auto-esterilização seja feita por injeção de vapor diretamente no meio 
de cultura, deve-se considerar a diluição de 10 a 15% provocada pela condensação 
do vapor. 
A injeção direta de vapor pode, em alguns casos, provocar a formação de es-
puma em grande quantidade no reator. Se o problema for crítico, a esterilização 
deve ser levada a cabo apenas através da camisa ou serpentina.2 
Esterilização em autoclaves 
A esterilização por calor úmido de reatores de pequeno porte (até cerca de 
30 L) e de vidrarias e outros materiais, inclusive meio de cultura, é em geral feita 
em autoclaves. A Figura 3.5 apresenta simplificadamente um reator sendo esterili-
zado em uma autoclave . 
28 Esterilização do equipamento 
140 
120 
Ê 100 
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60 a. 
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~ 40 
20 
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o 
o 
o 
o 
CURVA DE AQUECIMENTO 
fermentado r de 2.000 L 
60 90 120 
Tempo (min) 
150 180 
Figura 3.4 - Formato do tanque de 2.000 L úteis (I ,8 m2 serpentina/m3 de meio de cultura), e curva de aquecimento 
Existem autoclaves das mais diversas dimensões, e em geral são verticais 
ou horizontais. Nas verticais (como na figura), a porta de acesso localiza-se na 
parte superior. As horizontais podem ter uma ou duas portas de acesso. O 
aquecimento para geração de vapor pode ser elétrico (mais comum) ou a gás. O 
vapor pode também ser gerado externamente numa caldeira e em seguida inje-
tado na autoclave. Algumas autoclaves de grande porte podem ter sistemas in-
ternos para circulação do vapor e operarem continuamente, em vez da 
operação tradicional por ciclos. 
A operação é simples. Se o vapor é gerado internamente, a primeira providên-
cia é completar o nível de água até a marca indicada pelo fabricante. Em seguida, o 
material ou equipamento a ser esterilizado é colocado na autoclave e a porta é fe-
chada. O vapor gerado ocupa todo o espaço interno e deve fluir para o exterior, por 
uma válvula de descarga, expulsando assim todo o ar contido na autoclave e nos 
materiais e equipamentos presentes. Após a expulsão do ar (10 a 20 minutos, em 
geral) a válvula de descarga é fechada e a pressão e temperatura internas devem 
Esterilização por agentes ffsicos 29 
subir até a temperatura e pressão de esterilização (geralmente, 121 °C e 1 atm). 
Atingida a condição de esterilização, o sistema de aquecimento ou a entrada de 
vapor devem ser controlados para manter estáveis a pressão e temperatura. A eta-
pa de resfriamento inicia-se com o desligamento do aquecimento ou fechamento 
da entrada de vapor. A autoclave só deve ser aberta após a temperatura chegar 
próxima da ambiente, já que uma despressurização brusca pode provocar danos 
aos sensores colocados nq interior dos reatores, como sondas de pH e de oxigênio 
dissolvido. 
Válvula de 
segurança 
Auto clave 
Fermentador 
Figura 3.5 - Esterilização de reator em autoclave 
MANÔMETRO 
Erlenmeyers com meio de cultura, pipetas graduadas, tubos de ensaio, etc., em 
geral são esteriliZados por 15 a 30 minutos. Reatores necessitam uma esterilização por 
mais tempo (40 minutos a 1 hora), já que não são agitados durante a esterilização e o 
seu centro demora para atingir a temperatura adequada. A Figura 3.6 apresenta a 
curva de aquecimento em autoclave de um reator com volume útil de 10 litros. O sen-
sor de temperatura foi colocado próximo ao centro geométrico do reator. Pode-se no-
tar que cerca de uma hora após o termômetro da autoclave indicar a temperatura de 
121 °C, o centro do reator ainda não havia atingido esta temperatura. 
A esterilização em autoclave não altera significativamente o volume dos lí-
quidos presentes nos frascos ou reatores. 
3.3 .2 - Alguns detalhes de projeto de reatores esterilizáveis por 
calor úmido 
A Figura 3.7 apresenta alguns pontos a serem considerados quando se proje-
ta um reator a ser esterilizado por calor úmido {vapor saturado). 
A entrada de ar para o reator (1) deve conter um filtro esterilizante adequado 
(2) . Toda a linha, incluindo o filtro, deve ser esterilizada por vapor saturado (V). 
1/ 
I. ,, 30 Esterilização do equipamento 
O reator deve ser dotado de uma válvula de segurança e uma quebra-vácuo 
(3), para evitar pressurização ou despressurização (vácuo) excessivas que possam 
danificar o equipamento duranteo processo de esterilização ou de fermentação. 
Curva de aquecimento em autoclave 
120 
Ê 100 
~ 
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~ 80 <1> c. 
E 
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20 
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o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 
Tempo (min) 
Figura 3.6 - Curva de aquecimento em autoclave vertical de um reator com volume útil de I O lrt:ros. O ponto a indi-
ca o momento em que o termômetro da autoclave marcou 121 °C. O ponto b indica o momento em que a tempera-
tura da autoclave passou a ser controlada em 121 oc. 
v 
12 
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11 
10 
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o 
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4 
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o 
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8 
7 
'-+----------9 
Figura 3.7 - Alguns detalhes a serem considerados no projeto de reatores esterilizáveis por calor úmido. 
Esterilização por agentes ffsicos 3.1 
A linha de exaustão de gases também deve conter um filtro esterilizante 
adequado (4), que evite tanto a contaminação do reator por microrganismos do 
ambiente como a contaminação do ambiente por microrganismos e aerossóis origi-
nados no reator. 
O sistema de agitação do líquido deve preferencialmente ser colocado na 
parte superior do reator. Dessa maneira, o selo que permitirá a vedação do orifício 
por onde penetra o eixo ~5) deverá ser projetado para reter apenas gases. Quando 
for mais conveniente a colocação do eixo pelo fundo do reator, o sistema de se-
lagem deverá ser capaz de reter líquidos. Em geral, selos para gases são mais 
eficientes e de manutenção mais simples. 
As linhas de inoculação (6), amostragem (7), e esgotamento (9) devem tam-
bém ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado. A de amostragem deve 
ser esterilizada após cada retirada de amostra. 
Um procedimento comum para esterilização descontínua do reator é o se-
guinte: (a) o reator recebe o meio de cultura e aplica-se uma agitação baixa; (b) 
aquece-se o meio através da serpentina ou camisa (8, 10) até cerca de 96 a 97°C; (c) 
simultaneamente ao item b, injeta-se vapor pelas linhas de entrada superior de ar 
(11) e de inoculação (6), deixando o vapor fluir pela linha de exaustão (4) e se pos-
sível pela válvula de segurança (3); (d) inicia-se a aplicação de vapor vivo ao tan-
que pela linha de entrada inferior de ar (12) e, se necessário, pelas linhas de esgo-
tamento do tanque (9) e de amostragem (7); (e) quando o meio de cultura atingir 
100°C, as válvulas de exaustão, de segurança, de entrada superior de ar (12) e de 
inoculação (6) são fechadas; (f) quando a temperatura e pressão internas atingirem 
as indicadas para esterilização (em geral, 121 °C e 1 atm), as válvulas de entrada 
inferior (12), de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7) devem ser fecha-
das; (g) manter a pressão e temperatura de esterilização pelo tempo necessário 
através da aplicação de çalor pela serpentina ou camisa; (h) atingido o tempo ne-
cessário, iniciar o resfriamento pela aplicação de água fria através da serpentina 
ou camisa; (i) quando a temperatura do meio de cultura atingir 100°C, iniciar a 
pressurização do tanque com ar estéril (1, 11), o suficiente para evitar formação de 
vácuo no reator; (j) quando a temperatura atingir 'cerca de 85°C, abrir a válvula de 
exaustão de gases (4); (k) continuar o resfriamento do tanque até a temperatura 
desejada. 
A manutenção periódica do reator deve incluir a limpeza e eventual substi-
tuição de todas as válvulas que tenham contato direto com o reator ou com as li-
nhas esterilizadas (ar, inóculo, amostragem, exaustão, descarga, etc.). Outros pon-
tos sensíveis são o sistema de selagem do eixo do agitador e as soldas e conexões 
do reator. Pequenos vazamentos em válvulas, selos, conexões e soldas podem ser 
detectados, fechando-se todas as saídas do reator e pressurizando-o com ar até 
cerca de 1 atm. Fecha-se o ar e verifica-se se a pressão é mantidapor períodos lon-
gos (24 h). Caso haja perda de pressão, deve-se buscar e corrigir os vazamentos. 
Vazamentos na serpentina ou camisa podem ser detectados, secando-se to-
talmente o reator e circulando-se água sob pressão no sistema de aquecimen-
to/resfriamento por um período longo (24 h). Se houver vazamento, aparecerá 
água no interior do reator. · 
32 E~erilitação do equipamento 
3 .3 .3 - Esterilização por calor seco 
A esterilização por calor seco é empregada para vidrarias, ;metais e sólidos 
resistentes ao calor. É levada a efeito em fornos ou estufas que atingem temperatu-
ras superiores a 150°C. 
Na ausência de umidade, a transferência de calor é mais lenta e os microrga-
nismos apresentam maior resistência à inativação. Dessa forma, os tempos de ex-
posição ao calor devem ser muito maiores (cerca de 3 a 4 horas), para garantir a 
eficiência da operação de assepsia. 2 
3.3.4- Esterilização por radiação ultravioleta 
Radiação ultravioleta é utilizada para esterilizar materiais sólidos, como vi-
drarias, utensílios metálicos, embalagens, etc. 
Os raios ultravioleta agem diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a es-
trutura dessas moléculas e provocando danos ao processo de manutenção e divi-
são celular. Em função do tempo de exposição, esses danos normalmente levam os 
microrganismos à morte. 
Ultravioleta jamais deve ser usado na presença de pessoas ou animais. 
A fonte de ultravioleta é normalmente uma lâmpada emissora dessa radia-
ção. A emissão diminui com o tempo, exigindo um controle sobre o tempo de vida 
útil dessas lâmpadas. 
A esterilização é feita simplesmente expondo os materiais à radiação em am-
biente fechado, pelo tempo adequado (várias horas). Como a capacidade de pene-
tração da radiação ultravioleta é muito baixa, apenas a superfície do material 
exposto e o ar ao redor são esterilizados. 
3.3.5- Esterilização por radiação gama 
Ràdiação gama, em geral produzida por cobalto 60 ou césio 137, tem poder 
de penetração extremamente alto. O bombardeio de microrganismos por gama 
gera grande quantidade de alterações nas moléculas de DNA, danificando-as, em 
geral irreversivelmente. Adicionalmente, inúmeras moléculas internas aos micror-
ganismossão ionizadas (a água, por exemplo), dando origem a espécies tóxicas al-
tamente reativas, como os peróxidos e vários radicais livres.4 Essas moléculas . 
desestruturam o equilíbrio bioquímico dos microrganismos, mesmo esporulados. 
Os materiais expostos à radiação gama não guardam resquícios radiativos, 
daí ser um método seguro de esterilização. 
O bombardeio com radiação gama deve ser feito em câmaras especiais, em 
geral muito grandes. Uma vez posta em operação, não é mais possível impedir a 
emissão da radiação, de forma que essas câmaras operam continuamente. 
A esterilização é feita colocando-se o material a ser esterilizado em um con-
têiner, que por sua vez é colocado em uma esteira que circula pelo interior da câ-
mara de irradiação. O material pode entrar e sair da câmara várias vezes, até 
atingir o nível de irradiação adequado. 
- ------ --··----- ----------··· ···---- --·------------ -- ------------·· -· -- · --------- ----------------------- ------ --- ---- --- -
Esterilização e desinfecção por agentes qufmicos 3 3 
Dada a complexidade do método, apenas materiais como vidrarias, metais, e 
materiais sólidos como pós, solo, alimentos, sementes, embalagens, etc. são sub-
metidos a esse processo de esterilização. 
A unidade de medida da irradiação no SI é o gray. Materiais pouco conta-
minados são submetidos a doses de 10 a 30 quilograys. Materiais mais 
contaminados requerem doses maiores, como 50 a 75 quilograys. O microrganis-
mo mais resistente à radiação chama-se Deinococcus radiodurans e exige cerca de 60 
. quilograys para ser inativado. Esporos de Clostridium botulinum demandam 5 a 22 
quilograys para serem inativados. O gray substituiu a unidade rad, muito utiliza-
da. Na conversão, 1 gray corresponde a 100 rad. 
3.4- Esterilização e desinfecção por agentes químicos 
3.4.1 -Germicidas químicos 
A utilização do calor úmido é, de longe, a técnica mais utilizada para pro-
porcionar a esterilização e a desinfecção de equipamentos dentro de uma indús-
tria de fermentação.Os agentes químicos de esterilização e desinfecção são utilizados quando 
equipamentos de operações unitárias ou componentes de uma instalação industrial 
não admitem esterilização pelo vapor de água saturado. Isso pode ocorrer em vir-
tude da incompatibilidade dos materiais de construção desses componentes com 
temperaturas elevadas (por exemplo, filtros; bombas, centrífugas, secadores, vál-
vulas, linhas de transferências de fluidos e equipamentos de medição, etc.). 
Nesses casos, para atingir o grau de sanitização necessário a um dado pro-
cesso, faz-se uso de agentes sanitizantes líquidos denominados germicidas quími-
cos. Diferentemente da esterilização pelo calor, essas substâncias agem à 
temperatura ambiente, necessitando entretanto tempos maiores de contato para 
produzir o efeit() _desejado. Além disso, sua capacidade sanitizante está fortemente 
relacionada a fatores ligados às propriedades físicas do material a ser tratado (ma-
terial plástico ou metálico, superfície lisa ou rugosa, porosidade do material, au-
sência ou presença de locais de difícil acesso) e às características químicas do 
ambiente (pH, presença de matéria orgânica contaminante, formação de filmes e 
depósitos no material, dureza da água utilizada na diluição do · princípio ativo, 
presença de resíduos de sabão). Todos esses fatores podem afetar negativamente o 
processo de esterilização ou desinfecção, e somente a prática pode dar ensejo a um 
procedimento padronizado que conduza a um nível de sanitização adequado a 
um determinado processo industrial. 
Em razão dos grandes problemas advindos das infecções em ambientes hos-
pitalares, especialmente pelo fato do surgimento de linhagens bacterianas patogê-
nicas resistentes, responsáveis por doenças como a tuberculose, meningite e 
pneumonia e de vírus como o da hepatite B e o HIV, promotor da SIDA/ AIDS 
(Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), um grande trabalho de pesquisa e de 
regulamentação vem sendo dedicado ao uso de germicidas químicos no controle 
dessas infecções. Como conseqüência, o uso desses compostos tem se transforma-
do em um método bastante conveniente e efetivo de esterilização e desinfecção e 
iio..._ ___ -- --- - -····· ·---·-·---- --·· --··· ·- ·-·-·····-- ·- --- --- - · --··-·- ... 
34 Esterilização do equipamento 
um grande número de formulações comerciais surgiram no mercado. Até o início 
dos anos 90, havia nos Estados Unidos, registrados na EP A (Environmental Pro-
tection Agency), uma das agências americanas responsáveis pelo registro e legisla-
ção sobre o uso desses produtos, cerca de 14.000 formulações comerciais com ação 
germicida. 
Baseado na experiência prática, é possível estabelecer-se uma ordem de re-
sistência dos microrganismos à exposição aos germicidas químicos (Tabela 3.2). · 
Tabela 3.2 - Ordem descendente de resistência a germicidas químicos e nível de atividade requerido 
para esterilização (adaptado de Favero; Bond 7). 
TIPO DE MICRORGANISMO 
BACTÉRIA ESPORULANTE 
Bacillus subtilis 
Clostridium sporogenes 
MICOBACTÉRIA 
Mycobacterium tuberculosis 
var. bovis 
VÍRUS PEQUENOS OU NÃO LIPÍDICOS 
poliovírus 
rhinovírus 
FUNGOS 
Trichophyton spp. 
Cryptococcus spp. 
Candida spp. 
I 
BACTÉRIA VEGETATIVA 
Pseudomonas aeruginosa 
Staphylococcus aureus 
Salmonella choleraesuis 
VÍRUS MÉDIOS OU LIPÍDICOS 
·vírus da Herpes simplex 
Citomegalovír~s . 
NÍVEL DE ATIVIDADE 
REQUERIDO 
Alto 
Alto a intermediário 
Alto a intermediário 
Intermediário a baixO 
Baixo 
Baixo 
Esterilização e desinfecção por agentes químicos 3 5 
Essa tabela mostra que as bactérias formadoras de esporos, exemplificadas 
aqui por Bacillus subtilis e Clostridium sporogehes, são as mais resistentes aos germi-
cidas, enquanto que, em ordem descendente de resistência, os vírus de tamanho 
médio ou que possuem componentes lipídicos em sua composição tendem geral-
mente a possuir a mais baixa resistência aos germicidas. 
Esporos bacterianos necessitam alto nível de atividade germicida para se-
rem destruídos. Essa condíção pode ser conseguida com a utilização de soluções 
aquosas de glutaraldeído, peróxido de hidrogênio de 6 a 30% e produtos que con-
têm mistura a baixas concentrações de ácido peroxiacético e peróxido de hidrogê-
nio (0,1% e 1,0%, respectivamente). 
O dióxido de cloro (Cl02) pode ser usado a concentrações variadas. Porém, 
por ser .fortemente oxidante, seu uso é limitado, devido ao efeito altamente corro-
sivo em superfícies de metal ou de plástico. O uso de formaldeído em soluções 
aquosas de 6 a 8% é efetivo, embora haja controvérsias devido ao seu possível efei-
to carcinogênico. 
Germicidas de nível intermediário não necessariamente causam a destruição 
de esporos bacterianos, mas devem possuir a característica de inativar Mycobacte-
rium tuberculosis var. bovis, assim como fungos, vírus lipídicos ou não lipídicos e 
bactérias vegetativas. 
Exemplos desses germicidas são soluções hidroalcoólicas 70 a 90% de etanol 
ou isopropanol, compostos clorados com cerca de 500 a 5.000 ppm de cloro livre, 
solução aquosa de peróxido de hidrogênio 3a 6%, algumas preparações fenólicas 
e os iodophors (preparações que conseguem carrear 12 à concentração de 40 a 50 
ppm de iodo livre). 
Os germicidas químicos de nível baixo são capazes de destruir formas vege-
tativas de bactérias, a maioria dos fungos (mas não todos), assim como vírus que 
contêm lipídios em sua composição. · 
Esses germicidas não conseguem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bo-
vis nem tampouco bactérias esporuladas. Exemplos desses desinfetantes são as 
formulações de compostos quaternários de amônioà concentração de 0,1 a 0,2%. 
Como foi dito, a prática de desinfecção/esterilização industrial utilizan-
do-se germicidas químicos depende de uma série de fatores ambientais, que de-
vem ser levados em conta quando do estabelecimento do protocolo de sanitização 
de um determinado equipamento. De uma maneira geral, um ciclo de desinfecção 
I esterilização químicà de um equipamento contém as seguintes etapas: 
a) desmontagem do equipamento (se for o caso); 
b) limpeza dos componentes, procedendo-se à remoção de todo tipo de resí-
duos de meio de cultura, biomassa e produtos, fazendo uso de detergentes, se ne-
cessário; 
c) lavagem dos componentes com água com baixo teor de dureza para remo-
ção dos detergentes utilizados; 
d) montagem do equipamento e introdução da solução aquosa do germici-
da, propiciando o tempo de exposição preestabelecido para a ação germicida re-
querida; · 
e) drenagem da solução germicida do sistema; 
ij 
I 
36 Esterilização do equipamento 
f) remoção dos resíduos do germicida através de circulação cuidadosa de 
água ou outro fluido estéril. 
A Tabela 3.3 descreve algumas utilizações típiCas de germicidas químicos. 
Existem disponíveis no comércio várias preparações com características semelhan-
tes às descritas nessa tabela. No Brasil, a regulamentação e recomendação do uso · 
de um germicida particular é realizada por organismos como o INCQS (Instituto 
Nacional de Controle de Qualidade em Saúde). A Tabela 3.3, pretende, dessa ma-
neira, ser meramente didática. 
Tabela 3.3 - Utilização típica de germicidas químicos 
(N.A.=nível de atividade, sol.aq.=solução aquosa) 
GERMICÍDA ATIVIDADE E UTILIZAÇÃO 
QUÍMICO CARACTERÍSTICAS TÍPICA 
Compostos quaternários de 
Bactérias vegetativas, gram-
amônio sol. aq. até 0,2% negativas, podem ser resis- Limpeza geral e manutenção 
tentes, N.A. baixo 
Compostos fenólicos, sol. 
Pode ser ativo até contra ví-
Desinfecção de áreas de la-
rus não lipídicos, N.A. baixo 
aq. até 5% 
a intermediário boratório e produção 
Sol. aq. etanol ou isopropa-
Bactérias vegetativas, fun-
Desinfecção de materiais 
nol a 70% gos e amplo espectro de ví- por imersão na solução 
rus, N.A. intermediário 
Amplo espectro, pode inati-
var bactérias esporuladas, li- Desinfecção de equipamen-
Sol. aq: 0,5% cloro livre mitação de uso pela ativida- tos, áreas de laboratório e 
de corrosiva, N.A. produçãointermediário 
Amplo espectro, pode inati-
var bactérias esporuladas, 
Desinfecção de equipamen-
Sol. aq. Formaldeído 4 a 8% potencial carcinogênico, 
irritante, N.A. intermediário 
tos 
a alto 
Amplo espectro, ação contra 
Esterilização de equipamen-
Sol. aq. Formaldeído 8% e micobactérias e bactérias es-
etanol ou isopropanol a 70% poruladas, potencial carci-
tos, dependendo do tempo 
nogênico, irritante, N.A. alto 
de exposição 
Sol. aq. glutaraldeído 2% e Amplo espectro, ação contra Esterilização de equipamen-
surfactante micobactérias e bactérias es- tos, dependendo do tempo 
poruladas, iritante, N .A. alto de exposição 
Formulações contendo peró- Amplo espectro, ação contra Esterilização de equipamen-
xido de hidrogênio 6 a 10% micobactérias e bactérias es- tos, dependendo do tempo 
poruladas, N.A. alto de exposição 
Esterilização e desinfecção por agentes químicos 3 7 
Assim, recomenda-se fortemente utilizar as formulações comerciais disponí-
veis no mercado, segundo a orientação do fabricante, de acordo com seu registro 
nos órgãos governamentais competentes. 
Desde que as operações preliminares de limpeza das partes a serem desinfeta-
das ou esterilizadas tenham sido feitas cuidadosamente, o tempo de exposição para 
se atingir um determinado nível de destruição microbiana em um dado equipamento 
vai depender fundamentalmente do germicida escolhido e das características da po-
pulação microbiana remanescente, ou seja, tipo e número de microrganismos presen-
tes. Embora a temperatura seja um fator relevante nos processos de destruição 
microbiana, não estamos levando isto em conta, pois supõe-se que o procedimento de 
desinfecção I esterilização seja realizado à temperatura ambiente. 
O tempo necessário para se atingir um determinado nível de sanitização, 
dessa forma, varia bastante. Uma simples desinfecção, com a qual se pretenda des-
truir a população ativa de bactérias vegetativas, a maioria dos fungos e os vírus li-
pídicos, rode ser conseguida utilizando-se etanol 70% em água em cerca de 10 
minutos. Uma população de esporos de bactérias aeróbias bastante elevada (108 
esporos) pode ser destruída em 60 minutos com exposição a uma solução de peró-
xido de hidrogênio a 10%.8 Por outro lado, uma solução de formaldeído 8% e iso-
propanol 70% pode levar até cerca de 18 h para a eliminação de uma alta 
população de esporos bacterianos. 7 
A escolha de um germicida químico particular vai se basear, dessa maneira, 
no nível de desinfecção requerido pelo processo e em aspectos econômicos. 
3 .4. 2 - Agentes gasosos 
Agentes gasosos não é o método de escolha em indústrias de fermentação, 
sendo rara, para não dizer inexistente, sua utilização para esterilização e desinfec-
ção de equipamentos. A assepsia de salas e laboratórios, porém, comumente é rea-
lizada com vapores de formaldeído. 
Os agentes de esterilização gasosos mais importantes são os seguintes: óxido 
c!e etileno, óxido de propileno, formaldeído e betapropiolactona. 
O primeiro é utilizado principalmente na esterilização dos mais diversos 
itens hospitalares, artigos plásticos de laboratório e outros materiais. O processo 
se dá em câmaras especiais Sf!melhantes a autoclaves de esterilização por vapor. A 
câmara é carregada com os itens a serem esterilizados, onde a seguir é insuflada 
uma mistura gasosa do agente ativo e um gás inerte como co2 ou freon (fluoroclo-
rocarbono). Após um determinado tempo de exposição, a mistura gasosa é drena-
da da autoclave e esta é cuidadosamente limpa pela passagem de ar, para 
eliminação total de resíduos do óxido de etileno.9 
O óxido de propileno é utilizado na esterilização de alimentos.10 
Vapores de formaldeído e betapropiolactona são utilizados principalmente 
para desinfecção de câmaras, salas e ambientes onde assepsia é desejável. 
A resistência de bactérias vegetativas e esporuladas, vírus e fungos aos mé-
todos de esterilização por gases é bastante variável, e depende do agente utiliza-
do, sua concentração, umidade relativa do ambiente e temperatura do processo. 
Por exemplo, uma população de 106 esporos de Bacillus subtilis v ar. niger pode ser 
......_ ____ - . ...... - ··-··-·-·-- - ------ -- - --- -.-·.- ..... --~ -' ... _ .... _ 
38 Esterilização do equipamento 
inativada -a 50% de umidade, 47,5°C e 500 ppm de óxido de etileno, em cerca de 50 
minutos. Outros microrganismos possuem resistências menores ao óxido de etileno. 
Detalhes a respeito da utilização de gases como agentes desinfetantes e este-
'1' d d 1' b 10 11 n tzantes po em ser encontra os em tteratura so re o assunto. ' 
Referências bibliográficas 
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Company, Nova York. 1986.965 p. 
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1968. 173 p. 
(4) BLOCK, S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd 
edition, Filadélfia. 1991. 1162 p. · 
(5) REDDISH, G.F. Antiseptics, Disinfectants, Fungicides, and Chemical and Physical 
Sterilization. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadélfia. 1957. 953 p. 
(6) QUESNEL, L.B. Sterilization and Sterility. In: Bullock, J.; Kristiansen, B. Basic Bio-
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(7) FAVERO, M.S.; BOND, W.W. Chemical Disinfection of Medicai and Surgical Materi-
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Filadélfia. 1991. Chapter 35, pp.617-641 
(8) WARDLE, M.D.; RENNINGER, G.M. Biocidal effect of hydrogen peroxide in space-
craft bacterial isolates. Appl. Microbiol.,30, 710-711, 1975. 
(9) PARISI, A.P.; YOUNG, W.E. Sterilization with Ethylene Oxide and other Gases, In: 
Block,S.S. Disinfection, Sterilization, and Preservation. Lea and Febiger, 2nd edition, Filadél-
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(10) ALGUIRE, D.E. Effective sterilization with 100% ethylene oxide. Bul. Par. Drug 
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(11) CHAIGNEAU, M. Stérilisation et Désinfection par les Gaz. Maisonneuve Editeur, 
Saint-Ruffine. 1977. 329 p. 
--.. 
39 
-........----......_____· .SftiUBZ.A~ÃO-DE=IIIEIOS-=~: 
A ·-.:=----~-~DE=-F-ERNIENTA"Ç-ÃlJ=P-O·R-=---~-=, 
--J .. -G~u~~IMENH=c-GM::VAP-OR~ 
--------------------------------------------------------- -----------
Walter Borzani 
4.1 - Introdução 
Em muitos processos fermentativos, a presença de microrganismos estra-
nhos (e, às vezes, de vírus) denominados, genericamente, "contaminantes", pode 
levar a prejuízos consideráveis. . 
No caso da produção de penicilina, por exemplo, os contaminantes podem 
produzir penicilinase, enzima que decompõe a penicilina, resultando meios fer-
mentados com baixa ou mesmo nula concentração do antibiótico. 
Outro exemplo que merece citação é o da fermentação acetona-butanólica. A 
bactéria responsável por ésse processo pode ser rapidamente destruída por vírus 
bacteriófagos, paralisando completamente a fermentação. 
Outras vezes os contaminantes afetam negativamente o processo, principal-
mente pelo fato de consumirem nutrientes do meio, competindo assim com os mi-
crorganismos responsáveis pela fermentação desejada. É o que acontece, por 
exemplo, na produção de enzimas, vitaminas, antibióticos, etanol, etc. 
Há, porém, casos em que a presença de contaminantes pouco ou nada inter-
fere no processo. Assim, por exemplo, na fermentação lática de hortaliças, no tra-
tamento biológico de resíduos, na produção de vinagres, na lixiviação bacteriana · 
de minérios, a boa marcha do processo é assegurada pelas próprias condições de 
trabalho, sendo dispensável eliminar eventuais contaminantes. 
Entre os dois casos extremos, isto é, aqueles processos em que a presença de 
contaminantes compromete seriamente o resultado, e aqueles em que os contami-
nantes praticamente não interferem no bom andamento da fermentação, há um 
grande número de situações intermediárias.Em resumo, o grau de eliminação de contaminantes com o objetivo de obter 
bons resultados depende de cada caso. Informações pormenorizadas a respeito 
desse assunto serão fornecidas, quando necessário, no Volume 3 desta Coleção, ao 
se estudar vários processos fermentativos industriais. 
í 
... .J 
40 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
Não podemos deixar de lembrar que, às vezes, a operação de eliminação to-
tal de contaminantes pode inviabilizar economicamente o processo, como é o caso 
da fermentação para produção de etanol a partir de caldo de cana-de~açúcar. 
No presente capítulo examinaremos apenas os processos de destruição de 
contaminantes por aquecimento com vapor, também chamados "esterilização por 
calor úmido". 
4.2 - Descrição sumária dos processos de esterilização 
por calor úmido 
Consideraremos aqui apenas os dois processos mais importantes de esterili-
zação de meios em escala industrial, utilizando-se vapor como fluido de aqueci-
mento: o processo descontínuo (também chamado processo de batelada) e o 
processo contínuo. 
No processo descontínuo, o meio é quase sempre colocado no fermenta-
dor e, a seguir, aquecido com vapor. Nessas condições, esterilizam-se simulta-
neamente o meio e o fermentador. O aquecimento do sistema pode ser 
efetuado, quer borbulhando-se diretamente vapor no meio (é o chamado aque-
cimento com "vapor direto"), quer passando-se vapor por uma serpentina mer-
gulhada no meio ou por uma camisa que envol_ve o fermentador (é o 
aquecimento com "vapor indireto") . Em qualquer dos casos, o meio é agitado 
mecanicamente, a fim de assegurar, tanto quanto possível, a mesma temperatu-
ra em todos os pontos do sistema. 
O aquecimento com vapor direto acarreta, obviamente, diluição do meio (da 
ordem de 10 a 15%), como conseqüência da condensação do vapor injetado. 
Na esterilização descontínua distinguem-se nitidamente três fases (ver Figs. 
4.1, 4.9 e 4.10): 
a) aquecimento, que eleva a temperatura inicial do meio (sempre próxi-
ma da temperatura de preparo do meio) até à temperatura de esterili-
zação (geralmente da ordem de l20°C); 
b) esterilização, na qual a temperatura é mantida aproximadamente 
constante durante um intervalo de tempo adequado, chamado tempo 
de esterilização; 
c) resfriamento, quando, com auxílio de água fria passando pela serpen-
tina ou pela camisa, a temperatura é reduzida até se atingir a tempera-
tura de fermentação. 
A rigor, a destruição térmica dos microrganismos não se dá apenas na fase 
chamada "esterilização". No aquecimento, e também durante o resfriamento, en-
quanto a temperatura for superior à denominada "temperatura mínima letal" (da 
ordem de 80 a 100°C), também há destruição de microrganismos (ver Fig. 4.1) . 
Voltaremos a examinar esse assunto mais adümte. 
Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido 4 I 
1 .. 
e 
-----------~--· 
II 
I 
Ti 
Algumas horas 
Tempo 
Figura 4.1 - Representação esquemática da variação de temperatura do meio durante sua esterilização por proces-
so descontínuo. 1: Aquecimento. 11: Esterilização. 111: Resfriamento. Te: temperatura de esterilização. Ti: temperatura 
· inicial. T t: temperatura final do meio esterilizado = temperatura de fermentação. T m: temperatura mínima letal. e: 
tempo de esterilização. 
Se, por um lado, a esterilização descontínua apresenta a vantagem de esteri-
lizar simultaneamente o meio e o fermentador, reduzindo assim os perigos de con-
taminação nas operações de transferência do meio para a dorna, ela apresenta, por 
outro lado, algumas sérias desvantagens, a saber: 
a) manutenção do meio em temperaturas relativamente altas (acima de 
100°C), por períodos bastantes longos (da ordem de algumas horas), favorecendo 
o desenvolvimento de reações químicas no meio com possíveis alterações indese-
jáveis em sua composição (decomposição de nutrientes, por exemplo); 
b) elevados consumos de vapor (no aquecimento) e de água (no resfriamen-
to), conseqüentes da eficiência relativamente baixa do sistema de troca de calor; 
c) problemas de corrosão ocasionados pelo contato prolongado do fermenta-
dor com o meio aquecido; 
d) tempo "não produtivo" relativamente elevado, uma vez que o fermenta-
dor é utilizado apenas como um tanque de esterilização durante o processo de 
destruição dos contaminantes. 
Passemos agora ao exame da esterilização por processo contínuo, represen-
tado esquematicamente na Figura 4.2.: o meio recentemente preparado é enviado, 
pela bomba B, ao trocador de calor TCl (de tubos, ou de placas), onde atua como 
fluido de resfriamento do meio já esterilizado e ainda quente; desse trocador de 
calor, o meio, agora preaquecido, mistura-se com vapor enviado ao injetor I onde 
a temperatura sobe quase instantaneamente, até alcançar a temperatura de esteri-
lização; a essa temperatura, praticamente constante, o meio percorre o tubo de re-
4 2 Esterilização de meios de fennentação por aquecimento com vapor 
tenção ou de espera TE (quase sempre termicamente isolado), dimensionado de 
modo a que o tempo de residência do meio no tubo seja igual ao tempo de esterili-
zação; o meio já esterilizado, mas ainda a uma temperatura muito alta, passa pela 
válvula de redução de pressão V e vai, em seguida, ao trocador de calor TCl já ci-
tado; deste último, o meio esterilizado é encaminhado a um segundo trocador de 
calor (TC2), onde sua temperatUra é reduzida até alcançar o valor desejado; o flui-
do de resfriamento no trocador TC2 é água fria. Tratando-se, pelo que foi descrito, 
de aquecimento com vapor direto, haverá diluição do meio, da ordem de 10 a 15%. 
O mosto esterilizado, e já na temperatura de fermentação, é então enviado 
ao fermentador. 
Vapor 
p 
TE 
--------------------------------- -------, 
I 
I 
,--------------------------------------· 
I 
I ---------------------------------------. 
I 
TC1 TC2 
Fermenta dor 
---- ·----- ------- +--------~-- --------------- +---------' 
'-------+---- -------------
Meio 
Agua 
B 
Figura 4.2 - Representação esquemática de um esterilizador contínuo. B:.bomba. TC I e TC2: trocadores de calor. 
1: injetor de vaj)or. T: termômetro. P: manômetro. TE: tubo de retenção ou de espera. V: válvula de redução de pres-
são. 
A Figura 4.3 mostra, esquematicamente, a variação da temperatura do meio 
durante a esterilização contínua. Nesse caso, a destruição de microrganismos · du-
rante o aquecimento e durante o resfriamento pode ser desprezada. 
---------- - ------ ·-·- --------·--·----- ---··------ -·~---~. ------~· ·- -.....,.--- -- -------
Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido 43 
e 
Alguns minutos 
Tempo 
Figura 4.3 - Representação esquemática da variação de temperatura do meio durante sua esterilização por proces-
So contínuo. Ti: temperatura inicial. Tt : temperatura final do meio esterilizado= temperatura de fermentação. Te: 
temperatura de esterilização. Tm: temperatura mínima letal. 8 : tempo de esterilização. 
Na esterilização contínua, o aquecimento do meio até à temperatura de este-
rilização também pode ser efetuado com vapor indireto, substituindo-se o injetor 
de vapor I (Figura 4.2) por um trocador de calor. Neste caso, não haverá diluição 
do meio. 
A Figura 4.4 representa, de maneira esquemática, um tubo de espera. 
Um tubo de espera çomo o representado na Figura 4.4, desde que adequada-
mente projetado (o número de ramos em U deve ser sempre maior que o necessá- · 
rio, para assegurar a esterilização do meio), permite, por um lado, a execução de 
eventuais reparos sem interromper o processo e, por outro, alterar, dentro de cer-
tos limites, o tempo de permanência do meio na temperatura de esterilização sem 
variar a vazão. 
Seguem alguns valores numéricos relativos às condições de operação dos es-
terilizadores contínuos: 
a) vapor de aquecimento: vapor saturado com pressão de 6,8 a 8,5 atm; 
b) bomba de recalque do mosto n~o esterilizado: podem ser utilizadas bom-
bas centrífugas, rotativasou de pistão; 
c) diâmetro do tubo de espera: 4 a 12 polegadas (10 a 30 em, aproximada-
mente); 
d) tempo de enchimento do fermentador: não superior a 8 h; 
e) velocidade do meio no tubo de espera: 3 a 60 cm/s, sendo mais utilizado o 
intervalo de 6 a 12 em/ s; 
f) número de Reynolds no tubo de espera: 36.000 a 80.000; 
g) temperatura de esterilização: 130 a 165°C. 
44 · Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
____ _. c 
..,. ____ _ 
..,. ____ _ 
Figura 4.4 - Representação esquemática de um tubo de espera. A: meio à temperatura de esterilização. B: tubos 
verticais. C: tubos em U dispostos em planos horizontais. D: meio esterilizado. As setas indicam o percurso do meio 
no tubo de espera com os registros I , 2 e 3 fechados. · 
Para se colocar em funcionamento um aparelho de esterilização contínua, pro-
cede-se do seguinte modo: em primeiro lugar injeta-se em todo o sistema, incluiTI.do o 
fermentador, vapor a 1 atm (aproximadamente 121 oq durante 2 horas; a seguir, inje-
ta-se ar esterilizado no fermentador de modo a nele se ter uma sobrepressão de 0,3 
atm; regulam-se então as c<;>ndições de trabalho utilizando-se água em vez do mosto; 
quando as condições estiverem ajustadas, começa-se a bombear o meio a ser esterili-
zado; uma vez eliminada toda a água existente no aparelho, abre-se o registro para o 
fermentador, que é então carregado com meio esterilizado. 
O processo contínuo de esterilização apresenta, em relação ao descontínuo, 
algumàs vantagens, a saber: 
a) por se trabalhar a temperaturas mais elevadas, e também por serem muito 
rápidas as operações de aquecimento e resfriamento do mosto, o tempo de perma-
nência do meio em alta temperatura é relativamente pequeno (da ordem de 5 a 15 
min), o que acarreta menor destruição de nutrientes (como veremos mais adiante); 
como conseqüência deste fato, a prática tem mostrado, em vários casos, que a fer-
mentação de um meio esterilizado por processo contínuo apresenta rendimento 
substancialmente maior do que o obtido na fermentação do meio esterilizado por 
processo descontínuo (5 a 6 vezes maior na produção de riboflavina, e cerca de 10 
vezes maior na produção de vitamina B12, por exemplo); 
b) pelo fato de ser de dimensões relativamente pequenas, o tubo de espera 
pode ser construído com ligas especiais, evitando a contaminação metálica (mui-
tas vezes prejudicial à fermentação) do mosto que poderia resultar do ataque da 
parede do tubo pelo meio; 
------~---------------------. ---------. ____ .. _______ , __ ________ . -· --
Cinética da destruição ténnica de microrganismos 45 
c) quando o meio apresenta densidade ou viscosidade relativamente alta, 
como no caso de mostos de cereais, o processo contínuo dispensa os motores de 
potência elevada que seriam necessários para o acionamento dos agitadores no 
processo descontínuo de esterilização; 
d) economia de vapor, e de água de resfriamento, em relação ao processo 
descontínuo, desde que os trocadores de calor e o isolamento térmico da tubula-
ção sejam adequadamente dimensionados; 
e) os esterilizadores dmtínuos podem ser também utilizados nos processos 
de cozimento e sacarificação de matérias.:.primas amiláceas. 
Importa, contudo, não esquecer que as viabilidades técnica e econômica do 
processo contínuo dependem das dimensões e do regime de trabalho dos fermen-
tadores da instalação industrial. 
4.3 - Cinética da destruição térmica de microrganismos 
A velocidade de destruição pelo "calor úmido" de microrganismos presen-
tes em um dado meio depende de vários fatores, a saber: 
a) do microrganismo (gênero, espécie, linhagem; idade da cultura, existência 
ou não de esporos); 
b) do meio (composição, pH, presença de sólidos em suspensão); 
c) da temperatura. 
Imaginemos um experimento em que um determinado microrganismo, em 
suspensão em um dado meio, é mantido a uma temperatura constante e superior à 
temperatura mínima letal. Se durante o ensaío determinarmos o número de mi-
crorganismos vivos existentes no sistema, como a temperatura é superior à míni-
ma letal esse número de microrganismos vivos será uma função descrescente do 
tempo. A experiência mostra que, com boa aproximação, os resultados podem ser 
representados como indica ,a Figura 4.5, 
z 
E 
Figura 4.5 - Representação esquemática da variação do número de microrganismos vivos (N) após um tempo t de 
manutenção do meio a uma temperatura letal constante T · N 0 =número de microrganismos vivos no instante t = O. 
· -· · •· _________ _j 
i 
46 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
Isso nos mostra que, do ponto de vista cinético, a destruição do microrganis-
mo se comporta como se fosse uma reaÇão de primeira ordem, isto é: 
dN 
-=-k ·N 
dt 
(4.1) 
sendo N o número de microrganismos vivos existentes no meio após um tempo t 
de aquecimento do sistema a uma dada temperatura constante. A constante k é de-
nominada constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo. 
O valor de k depende dos fatores citados no início deste item. Para um dado 
microrganismo em um dado meio, k dependerá apenas da temperatura. 
Sendo N 0 o número de microrganismos vivos no instante t =O, a eq. (4.1) nos 
dá: 
lnN=lnN0 -k ·t (4.2) 
equação esta que nos permite, a partir de valores experimentais resultantes de me-
didas de N para diferentes valores de t, calcular a constante k do microrganismo 
em estudo, no meio considerado, na temperatura ensaiada. 
A título de exemplo, consideremos os valores da Tabela 4.1, obtidos de expe-
rimentos realizados com esporos de Bacillus stearothermophilus, suspensos em solu-
ção tampão de pH = 7,0, à temperatura de 105°C. · · 
Tabela 4.1 - Destruição térmica de esporos de Bocillus steoro thermophilus a I osoc. 
t (minutos) N ~ 
~ 25 8,5. 104 . 
50 3,5. 104 I~ ~ ~; 
100 6,0 ·_103 .. ~ 
> 
200 2,0. 102 
~ 
~t 
250 40 ~ 
~'- .. ~ - ·.- - • lÕi: ~- -~-..'-~· _;- - ... "?}:':"'..~!é~J~ . 
A partir dos valores da Tabela 4.1, por regressão linear obtemos (ver Fig. 
4.6), no intervalo de tempo 25 mina 250 min: · 
ln N = 12,1626- 0,0341 · t 
(r= -0,9998) 
sendo r o coeficiente de correlação. Nesse caso, o valor de k é 0,0341 min-1 • 
Se o experimento tivesse sido realizado não a 105°C, .mas a 121 oc, valores de 
k próximos de 3 min -1 poderiam ser obtidos, dependendo da variedade do Bacillus 
j~-----------
Cinética da destruição térmica de microrganismos 4 7 
stearothermophilus utilizada (ver Fig. 4.8). A influência da temperatura no valor de 
k será considerada mais adiante. 
z 
E 
12 
8 
4 
o 
o 100 
t (min) 
Figura 4.6- Representação gráfica dos resultados da Tabela 4.1 . 
200 300 
Mostra a experiência que os esporos são bastante mais resistentes à destrui-
ção térmica do que as células vegetativas. 
Além disso, observa-se que não há, nesse caso, obediência, à eq. 4.2 no inter-
valo de tempo inicial de exposição dà suspensão de esporos à temperatura consi-
derada, como indica a Figura 4.7. Não cabe, neste livro, o exame desse problema. 
Considerando-se, porém, que a destruição térmica de esporos é, na prática, sem-
pre realizada em ·temperaturas elevadas (pelo menos l20°C), e considerando-se 
que, nessas temperaturas, o desvio da curva experimental em relação à eq. 4.2. é 
·geralmente pequeno, pode-se, para fins de cálculos de interesse industriÇtl, consi-
derar aplicável a expressão 4.2. 
No estudo da destruição térmica de microrganismos, costuma-se definir um 
outro parâmetro: o tempo de redução decimal, indicado por D. É o tempo necessá-
rio para reduzir o número de microrganismos a 1/10 do valor inicial (em outras 
palavras, para destruir 90% dos microrganismos vivos existentes). Se na equação 
4.2 fizermos N = 0,1 · N 0 , teremos, de acordo com a definição de tempo de redução 
decimal, t = D. Logo: 
e, portanto: 
ln(0,1·N0 )=lnN0 -k·D 
D= 2,303 
k 
(4.3) 
48 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
z 
E 
Figura 4.7- Representação esquemática de curvas de destruiçãotérmica de esporos a diferentes temperaturas 
(Tl , Tz e T3) • 
No caso do exemplo indicado na Tabela 4.1, teremos: 
D=67,5min 
isto é, à temperatura de 105°C, 90% dos microrganismos presentes no meio consi-
derado serão destruídos em 67,5 min. 
A eq. 4.3 mostra, ainda, que os fatores que afetam o valor de k afetam tam-
bémD. ' 
Uma vez fixados o microrganismo e o meio, vejamos de que maneira a tem-
peratura afeta o valor de k. D11as equações foram propostas com o objetivo de cor-
relacionar k e a temperatura, a saber: 
a) Equação de Arrhenius 
k=A·exp(-a I RT) (4.4) 
onde A é uma constante empírica, R é a constante universal dos gases perfeitos, T 
é a temperatura absoluta e a é a denominada energia aparente de ativação de des-
truição térmica do microrganismo (ou simplesmente energia de ativação de des-
truição do microrganismo). 
b) Equação de Bigelow 
k =A' ·exp (!) · T') (4.5) 
onde A'e!) são constantes empíricas e T' é a temperatura medida em °C ou em °F. 
---- --·------------------------· ----------- -
.__ ___ _ 
Cinética da destruição térmica de microrganismos 49 
As eqs. 4.4 e 4.5 conduzem, respectivamente, a: 
a 1 
lnk=lnA--·-
R T 
lnk=lnA'+P·T' 
(4.6) 
(4.7) 
Conhecendo-se os valores de k para diferentes temperaturas, as eqs. (4.6) e 
(4.7) permitem calcular, por regressão linear, os valores das constantes nelas indi-
cadas. Em particular, a equação 4.6 nos dará o valor da energia de ativação a. 
A Figura 4.8 mostra a influência da temperatura no valor da constante de 
velocidade de destruição térmica de esporos de Bacillus stearothermophilus. Obser-
ve-se a obediência à eq. 4.4. Neste exemplo, os valores experimentais representa-
dos na Figura 4.8 conduzem a um valor de a igual a 68,7 kcal/mol. Para muitos 
microrganismos encontram-se valores de a entre 65 e 85 kcal/mol. 
3 
• 
~ 
";"c 0,5 
I 
.>tt. 
• 
0,1 
0,05 
255 260 265 
1 05/T (K-1) . 
Figura 4.8 - Influência da temperatura (T) na constante de velocidade de destruição térmica (k) de esporos de Bacil-
lus stearothermophilus. 
Se aplicarmos as equações de Arrhenius e de Bigelow a um mesmo micror-
ganismo, no mesmo meio e à mesma temperatura, teremos: 
Logo: 
. A·exp(-a I RT) =A'·exp(P· T') 
, 1 A a 1 
T =-·ln---·-
p A' P·R T 
(4.8) 
~ . 
i 
L. ·-·-· 
50 Esterilização de meios de fermentàção por aquecimento com vapor 
Lembrando que A, A', a,~ e R são constantes, a eq. 4.8 nos diz que T' varia 
linearmente com 1IT, o que é um absurdo, uma vez que T' (expressa em oq é 
igual a T-273. Acontece, porém, que a equação 4.8 permite, com boa aproximação, 
calcular T' em função de T, desde que não se considerem intervalos de temperatu-
ra muito amplos. Assim, por exemplo, no intervalo de 100 a 160°C, a seguinte 
·equação pode ser obtida por regressão linear: 
T' = 532,9 -1,620(105 I T) 
(r = -0,9992) 
(4.9) 
onde T' é a temperatura em °C, T é a temperatura absoluta e r é o coeficiente de 
correlação. 
Se considerarmos apenas o intervalo de 120 a 160°C, que do ponto de vista 
de aplicações práticas é o mais importante, teremos: 
T' = 552,4 -1,701 (105 I T) 
(r =- 0,9995) 
(4.10) 
A Tabela 4.2 mostra, para vários valores de T, ·os valores de T' calculados 
por T-273 e pelas eqs. (4.9) e (4.10). · 
Tabela 4.2 - Aplicação das equações 4.9 e 4.1 O. 
T' (OC) 
T (K) 
T-273 Eq. 4.9 Eq. 4.10 
.~ 
373 100 98,6 - ::_ ·~ -:: 
383 110 109,9 - ·.'C I 
t 
393 120 120,7 119,6 tf • . 
"' 403 130 130,9 130,3 ·~ 
.f 
413 140 140,6 140,5 ·:. 
423 150 149,9 150,3 ~'* L\t.l 
433 160 158,8 159,6 r~~ 
.. -e · -,_:;.· ·_{"- :,.,. · .... <;<.."'.:F...:·,., .,.....,,;::. -•. .:: ... .;::4> . . ' ~tJ::· ~· ·:;:;,1i~~ JJ-'1.: :r J1 
Explica-se, portanto, levando-se em conta os erros experimentais que afetam 
os valores de k (principalmente os inerentes às medidas dos números de células 
vivas), a possibilidade de cqrrelacionar k com a temperatura, tanto pela eq. 4.4 
quanto pela 4.5. · 
... . . -----~--- · ··------------- --- ------------------ -----------· ·-· - - ------------- -------- ----- - - . --------------- --.----- ------------------------:--;----,-------------------·····- ··- ----
i:..: 
Destruição de nutrientes do meio como conseqüência da esterilização 5 I 
4.4 - Destruição de nutrientes do meio como conseqüência 
da esterilização 
O aquecimento de um meio com o objetivo de destruir microrganismos nele 
existentes acarreta, simultaneamente, alterações em sua composição. Reações in-
desejáveis (como por exemplo, decomposição de vitaminas e reações entre glicose 
e aminoácidos), cujas vélocidades aumentam com a temperatura, podem prejudi-
car a posterior atividade dos microrganismos da fermentação, conduzindo a ren-
dimentos ou produtividades menores do que os esperados. 
A temperatura escolhida para a esterilização do meio desempenha, nesse 
particular, papel relevante. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a 
temperatura escolhida para se conseguir a destruição de uma dada quantidade de 
microrganismos do meio, menor será a destruição de nutrientes existentes nesse 
meio e, conseqüentemente, melhores serão os resultados obtidos na fermentação 
posterior. Isso é uma conseqüência do fato de ser a energia de ativação da destrui-
ção térmica dos microrganismos (65 a 85 kcal/mol) maior que a da destruição tér-
mica de nutrientes. A Tabela 4.3 mostra valores da energia de ativação de 
destruição térmica de alguns nutrientes. 
Tabela 4.3 - Energia de ativação de destruição térmica de alguns nutrientes. 
Energia de ativação 
,. 
Substância 
(kcal/mol) 1.:: .. 
Vitamina C 23,1 
~. 
{"t: 
Ácido fólico 16,8 
ir 
~~ Vitamina 812 23,1 ·"!' 
... Vitamina A 14,6 .. 
~~i 
Vitamina B1 26,0 
.. ~~ :..cJ;,~ . ~ -- - - • • • r •• ~~ -. -f,.,., .. _;,; ·- · •..;;·.,., .. .. '"""···-.;..,........,.. ...... _,.. . ' 
Por sua importância prática, tanto na esterilização de meios de fermentação 
como na esterilização de alimentos, essa afirmativa deve ser demonstrada. 
Consideremos um dado volume de meio contendo N0 microrganismos vi-
vos, número esse que deve ser reduzido a N 1 < N 0• Seja 50 a concentração de um 
nutriente termolábil no meio, antes do tratamento térmico. Suponhamos que esse 
tratamento térmico seja realizado a duas temperaturas constantes TI e T2, com T2 > 
TI. Sejam: 
ti = tempo para reduzir.o número de microrganismos vivos de N o a N 1, quan-
do a temperatura é TI; . 
t2 = tempo para reduzir o número de microrganismos vivos de No a Nfl quan-
do a temperatura é Tú 
ki = constante de velocidade de destruição dos microrganismos à temperatu-
ra TI; 
52 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
k2 = constante de velocidade de destruição dos microrganismos à temperatu-
ra Tz; 
a = energia de ativação de destruição dos microrganismos; 
51 = concentração final do nutriente após o tratamento do meio à temperatu-
ra T1; 
ra T2; 
52 = concentração final do nutriente após o tratamento do meio à temperatu-
k1' =constante de velocidade de destruição do nutriente à temperatura T1; 
kz' = constante de velocidade de destruição do nutriente à temperatura T2; 
a' =energia de ativação de destruição do nutriente. 
A eq. 4.2 nos permite calcular t1 e t2: 
Logo: 
Mas, pela eq. 4.4, temos: 
1 N0 t2 =- ·ln-
kz Nf 
k2 =A·exp(-a I R·T2 ) 
(4.11) 
(4.12) 
(4.13) 
Substituindo-se, na eq. 4.11, os valores de k1 e k2 dados pelas eq. 4.12 e 4.13, 
teremos: 
(4.14) 
Vejamos, agora, o que aconteceu com a concentração do nutriente. Admitin-
.do, apenas para simplificar a demonstração, que a destruição térmica do nutrien-
te seja de primeira ordem, teremos: 
----------------- -------··-·-- ---------
Considerações gerais a respeito do cálculo do tempo de esterilização 53 
Pela equação de Arrhenius: 
Logo, a eq. 4.15 nos dá: 
!.1_ =ln (5 0 I 51) ·exp(~. T2- T1,J 
t2 (5 0 I 52) R T1 · T2 
As expressões 4.14 e 4.16 permitem, então, escrever: " 
(a T2 - T1 J ln (50 I 51) (a' T2 - T1 J exp -· = ·exp - · . R T1 · T2 (5 0 I 52) R T1 · T2 
tf 
Lembrand? quea >a', teremos: 
N :.~· 
(4.15) 
(4.16) 
Ficando assim demonstrado que a concentração final do nutriente no trata-
mento térmico do meio, à temperatura T2, é maior do que a concentração final do 
nutriente no tratamento térmico do meio à temperatura T1 < T2, isto é, a destrui-
ção do nutriente . é menor quando o meio é termicamente tratado a temperatura 
mais alta. 
4.5 Considerações gerais a respeito do cálculo do tempo 
de esterilização 
Já vimos que a eq. 4.2 nos dá: 
(4.17) 
54 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
expressão esta que nos permite, conhecido o valor de k, calcular o tempo necessá-
rio para reduzir o número de microrganismos vivos de N 0 até N. 
A aplicação dessa equação a cálculos de tempos de esterilização não é tão 
simples como pode parecer à primeira vista. 
O primeiro problema que se apresenta, decorre do fato que os meios de fer-
mentação a esterilizar não possuem uma única espécie de microrganismo a ser 
destruída. Nos meios utilizados na prática encontramos microrganismos vivos 
pertencentes a diferentes gêneros e espécies, alguns esporulados e outros não, que 
devem ser eliminados para assegurar a inexistência de contaminantes na fermen-
tação posterior. Lembrando que o valor de k depende do microrganismo, a aplica-
ção da eq. 4.17 torna-se praticamente impossível. Contorna-se esse problema esco-
lhendo-se um microrganismo de referência conhecido, altamente resistente ao ca-
lor, e admitindo-se que todos os microrganismos existentes no meio a ser esterili-
zado apresentem uma resistência à destruição térmica igual à do microrganismo 
de referência. É bastante freqüente a escolha do Bacillus stearothermophilus esporu-
lado como microrganismo de referência. 
O segundo problema que surge ao tentarmos aplicar a eq. 4.17 a casos reais 
reside no fato de a constante de velocidade k depender, também, do meio e da 
temperatura. Uma vez escolhido o microrganismo de referência, é preciso, portan-
to, conhecer os valores de k desse microrganismo em suspensão no meio a ser este-
rilizado e a diversas temperaturas, o que pode, com freqüência, implicar na reali-
zação de experimentos preliminares de determinação de k. Como primeira aproxi-
mação, quando não se conhecem valores de k, pode-se admitir k:.::::: 1 ~in-1 (a 121 °C) 
e a :.::::: 75 kcal/ mol. 
O terceiro problema a ser considerado é conseqüente do fato de, nos meios a 
esterilizar, as células microbianas a serem destruídas poderem se encontrar na for-
ma de aglomerados, ou ainda protegidas por partículas sólidas em suspensão no 
meio. Isso acarreta um verdadeiro aumento da resistência dos microrganismos à 
destruição térmica, aumento esse de quantificação muito difícil. 
Finalmente, outro problema na aplicação da eq. 4.17 ao cálculo do tempo de 
esterilização decorre da própria definição de esterilização. De fato, lembrando que 
a esterilização é a operação que tem por finalidade destruir todos os microrganis-
mos vivos existentes no meio, o número final de microrganismos vivos deverá ser 
N =O e, neste caso, a eq. 4.17 deixa de ser aplicável. 
Esse último problema pode, porém, ser resolvido a partir da definição de 
probabilidade de falha de uma esterilização. Sendo: 
E, = número total de operações de esterilização realizadas nas mesmas con-
dições; 
E1 = número de operações de esterilização que falharam, isto é, que não con-
duziram a um meio esterilizado. 
Define-se probabilidade de falha (P) dessa esterilização pela relação: 
(4.18) 
Considerações gerais a respeito do cálculo do tempo de esterilização 55 
Multiplicando-se por 100 essa última fração, a probabilidade de falha será 
expressa em porcentagem. 
Suponhamos, para facilitar a exposição, que uma dada esterilização apresen-
te probabilidade de falha igual a 0,03 (ou 3%). Isso significa que, de 100 partidas 
de meio tratadas termicamente nas mesmas condições, serão obtidas, em média, 
97 partidas esterilizadas e 3 partidas não esterilizadas. Se indicarmos por N0 o nú-
mero de microrganismos vivos em cada partida de meio a esterilizar, o número de 
microrganismos nas 100 partidas de meio a esterilizar será 100 N0• Acontece, nesse 
caso, que 3 partidas não se encontravam esterilizadas após o tratamento térmico 
do meio. Se considerarmos que a condição necessária e suficiente para que falhe a 
esterilização de uma partida de meio é que nele exista, após o tratamento térmico, 
um microrganismo vivo, o número final de microrganismos vivos nas 100 partidas 
será, no mínimo, igual a 3 (um .em cada partida em que a esterilização falhou). 
Aplicando-se a eq. 4.17 ao conjunto das 100 partidas, teremos: 
t=.!_·ln 100No =.!_·ln No 
k 3 k 0,03 
De um modo geral, sendo P a probabilidade de falha, podemos escrever: 
1 N0 t=-·ln-
k p 
(4.19) 
Para fixar idéias, consideremos o seguinte exemplo numérico: um dado vo-
lume de meio a esterilizar contém 2,5.101 0 microrganismos vivos; o valor de k é 3,4 
min -1; calcular os tempos .de esterilização para que as probabilidades de falha se-
jam iguais a 0,1 (ou 10%), 0,01 (ou 1 %) e 0,001 (ou 0,1 %). Aplicando-se a equação 
4.19, teremos: 
a) para P = 0,1 (10%) 
t = __!_ ·ln _2;_,5_· _10_1_0 = 7,7 min 
3,4 0,1 
b) para P = 0,01 (1%) 
t =_!_ -ln2,5·1010 84 . ---'----- = f ffi1n 
3,4 0,01 
c) para P = 0,001 (0,1 %) 
t = __!_ ·ln 2,5 ·1010 = 9,1 min 
3,4 0,001 
56 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
4.6 - Cálculo do tempo de esterilização por processo 
descontínuo 
Suponhamos que na esterilização descontínua de um dado volume de meio, 
a curva da Figura 4.9 represente a variação da temperatura do meio com. o tempo. 
I 
I 
I 
I I J/'p ____ _l _______ L_ 
' I I I I N I I I 
I 1 I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
- ---r----~-------r-r-----
1 I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
I I I I 
Tempo 
Figura 4.9- Variação de temperatura do meio com o tempo, durante sua esterilização por processo descontínuo. 
Te: temperatura de esterilização. T m: temperatura mínima letal. T f: temperatura final do meio esterilizado =tempera-
tura de fermentação. T 0 : temperatura inicial do meio a esterilizar. N 1 : número de células vivas no instante t1 . P: proba-
bilidade de falha. 
Para calcularmos o tempo de esterilização (9) precisamos conhecer: 
a) o número inicial de células vivas no meio (N1); 
b) a probabilidade de falha (P); 
c) as curvas de aquecimento e de resfriamento do meio; 
d) a temperatura mínima letal (T m); 
e) a temperatura de esterilização (Te); 
f) a variação de k com a temperatura. 
Na Figura 4.9, N2 e N3 são, respectivamente, os números de microrganismos 
vivos no fim da fase de aquecimento e no início da fase de resfriamento. Como ve-
remos logo mais, N2 e N3 não precisam ser conhecidos. 
Tanto no aquecimento como no resfriamento, o valor de k varia como conse-
qüência da variação da temperatura. Nesses casos, a eq. 4.1 nos dará: 
a) no aquecimento: 
b) no resfriamento: , 
Z6 6 
Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo 57 
N t2 
ln-1 =Jk·dt 
N2 t 
1 
N t, 
ln-3 =Jk·dt 
p t 
3 
(4.20) 
(4.21) 
Essas integrais podem, por exemplo, ser calculadas do seguinte modo: esco-
lhem-se diversos valores de t na fase de aquecimento (ou de resfriamento); para 
cada valor escolhido de t, a curva de aquecimento (ou de resfriamento) nos dá a 
temperatura correspondente; mas para cada valor da temperatura, lembrando que 
a variação de k com a temperatura é conhecida, calcula-se o correspondente valor 
de k; teremos, deste modo, a variação de k com o tempo no aquecimento (ou no 
resfriamento); tendo-se k = f(t), podemos calcular as integrais das eqs. 4.20 e 4.21. 
ver: 
Sendo k. o valor de k na temperatura de esterilização, podemos então escre-
Logo: 
N 12 
ln-1 = Jk: ·dt 
N2 I 
1 
N . 1, 
1n-3 =Jk·dt 
p I 
3 
N 12 I , 
ln pl =ke ·9+ Jk ·dt+ Jk·dt 
11 13 
A eq. 4.22 nos permite calcular e. 
(4.22) 
A título de exemplo numérico, consideremos o cálculo do tempo de esterili-zação de um mosto, sendo dados: 
a) volume do mosto= 100m3 (105 litros); 
b) concentração de microrganismos vivos no mosto= 7,2 ·109 células/litro; 
58 Esterilização de meios de fennentação por aquecimento com vapor 
. c) temperatura de esterilização = l20°C; 
d) temperatura mínima letal = 80°C; 
e) probabilidade de falha= 0,001 (ou 0,1 %); 
f) curvas de aquecimento e de resfriamento= ver Fig. 4.10; 
g) variação de k (em min-1) com a temperatura T' (em 0 C): 
k =6,04 ·10-11 . e0,200·T'(equação de Bigelow) 
T' 
120 / e 
ô 80 
~ 
f:-
40 
o 
T' m 
Resfriamento 
Aquecimento 
40 80 o 40 
t (min) 
Figura 4.1 O - Curvas de aquecimento e de resfriamento do meio (exemplo numérico). 
120 
40 
o 
80 
(4.23) 
A partir das curvas da Figura 4.10 e da equação que relaciona k com a tem-
peratura T', montamos as Tabelas 4.4 e 4.5, que nos permitem representar grafica-
mente a variação de k com o tempo (ver Fig. 4.11) 
Tabela 4.4 - Valores de k durante o aquecimento do meio (exemplo numérico). 
t (min) T' (0 C) k (min-1) 
.• 
~~.~ 
20 75 0,0002 ~ 
!~ 
30 87 0,0022 
~ 40 97 0,016 
50 105 0,080 
. 
60 112 0,32 
70 116 0,72 ~~. 
80 120 1,60 
r--:~ 
·"' ... ~.a..':': .. . 6' ::t· , .~.- .::.. ;..; . 
- -- -·------- -··-- -· - - - - - - --· ····--·-· .. _ __1 
Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo 59 
1,6 
1,2 
~ 
i:: .E 
0,8 
?;! 
0,4 
o 
Tabela 4.5- Valores de k durante o resfriamento do meio (exemplo numérico). 
t (min) T ' (0 C) k (min-1) 
~-----------------r----------------~----------------~1 ; 
o 120 o/.1 1,60 '' 
Ir-------------------~--------------------~-------------------; ' , 
2 114 0,48 :t. ~ 
t-------------------~--------------------~----~--------------11 · , .. 
-;' 
0,18 4 109 
6 105 
1 ~: 
0,080 ~ ~-·· 
ll------------------r------------------+--------------------11 .... : 
8 101 0,036 :i:' 
lr-------.-10--------r-------9-7------~-------0-,0-16-------i~~ 
88 15 
ll------------------~----------------r--------------~11~ 
20 80 0,0005 .. ,""!· 
0,0026 
Aquecimento 
80 
Jk·dt 
24 
20 40 60 80 o 
t (min) 
Resfriamento 
20 
fok ·dt 
4 
t (min) 
8 
1,6 
1,2 
0,8 
0,4 
o 
. 12 
Figura 4.11 -Variação de k durante o aquecimento e o resfriamento do meio (exemplo numérico). 
i..._ __ --- --. 
Teremos então: 
N 1 =10
5 -7,2-109 =7,2 ·1014 
p =0,001 . 
ln (N 1 I P) = 41,12 
~ 
i:: .E 
?;! 
60 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
80 
Jk·dt~19,40 
24 
20 
Jk ·dt ~3,23 
o 
(ver Fig. 4.11; fase de aquecimento) 
(ver Fig. 4.11; fase de resfriamento) 
Substituindo esses valores na equação 4.22, calculamos e: 
41,12 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23 
e = 11,6 min ~ 12 min 
Suponhamos, agora, que tivéssemos: 
a) concentração de microrganismos vivos no mosto= 4,3 · 102 células/litro; 
b) probabilidade de falha= 0,1 (10%). 
Nesse último caso: 
p = 0,1 
ln(N1 I P)=19,88 
A equação 4.22 nos daria, então: 
19,88 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23 
9=-1,7min 
Esse resultado indica que, nesse último exemplo numérico, o aquecimen-
to e o resfriamento são mais que suficientes para conseguirmos a esterilização 
desejada. 
4. 7 - Cálculo do tempo de esterilização por processo 
contínuo 
Lembrando que, no processo contínuo, tanto o aquecimento quanto o resfri-
amento do meio são muito rápidos, as integrais representadas nas eqs. 4.20 e 4.21 
podem ser desprezadas, e o cálculo do tempo de esterilização e se resume na apli-
cação da equação: 
-----------~---- -------- -------- - --~ 
Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo 61 
Nl ln-=k .e p e 
Voltemos ao exemplo numérico citado no item anterior, mas com tempera-
tura de esterilização igual a 130°C. Teremos, pela eq. 4.23: 
ke = 11,8 min -l 
Logo, o valor de e ser'á: 
41)2 =11,8-e :. e =3,5min 
Resta-nos, finalmente, considerar o dimensionamento do tubo de espera. 
Sejam: 
V= volume de meio necessário para encher um fermentador; 
te = tempo de carga do fermimtador; 
p = massa específica do meio à temperatura de esterilização; 
J..l =viscosidade do meio à temperatura de esterilização; 
e = tempo de esterilização = tempo de residência do meio no tubo de espera; 
Re = número de Reynolds no tubo de espera; 
D = diâmetro interno do tubo de espera; 
v = velocidade de meio no tubo de espera; 
L= comprimento do tubo de espera. 
Os valores de V te, p, J..l, e, são conhecidos e, além disso, sabemos que Re e v 
devem estar compreendidos nos intervalos 36.000 a 80.000 e 3 a 60 em/ s, respecti-
vamente. 
Interessa-nos calcular D e L, lembrando que o valor de D deve estar contido, 
aproximadamente, no interv~lo 10 a 30 em. 
Sendo F = V I te a vazão do meio no tubo de espera, podemos escrever: 
rr.·D 2 . z 4 ·F 
F=--·V .. D ·V=--
4 rr. 
Por outro lado: 
Re = D·v ·p :.D· V= JJ.·Re 
J..l p 
As equações 4.24 e 4.25 nos dão: 
D=4 ·F·p _ _!_ 
· rr.·JJ. Re 
(4.24) 
(4.25) 
(4.26) 
Para cada valor de Re, a eq. 4.26 permite calcular D e, então, a eq. 4.24 nos 
dá o correspondente valor de v. Considerando que L ~v· e, calculamos o corres-
pondente valor de L. 
~ ----
I 
l 
1 
! 
1 
l 
6 2 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 
A título de exemplo numérico, imaginemos um caso no qual: 
V= 100m3 = 1,00.108cm3 
te= 4 h= 1,44.104 S 
p = 1,06 g/cm3 
J.l = 0,55 cp = 5,5.10-3p 
e= 3,5 min = 2,1.102s 
A partir dos valores de V e te calculamos a vazão do meio: 
F=V !te =6,94 ·103 cm 3 /s 
Com esses valores numéricos, poderemos calcular D, v e L para cada valor 
de Re (ver Tab. 4.6). 
A escolha do valor de D (e do correspondente L) dependerá, obviamente, 
dos diâmetros de tubos existentes no mercado, dos preços desses tubos, de algu-
ma característica peculiar do meio, e de outros requisitos ou limitações inerentes 
ao projeto global. Por segurança, o projeto poderá prever, no tubo de espera, um 
"tubo em U" (ver Figura 4.4) suplementar. 
Tabela 4.6- Valores do diâmetro (D) e do comprimento (L) do tubo de espéra, e da velocidade (v) do meio no 
tubo de espera para diferentes valores do número de Reynolds (Re ), no exemplo numérico considerado. 
R e D (em) v (cm/s) L (m) 
,:_ 
40000 42,6 4,87 10,2 ~-~~r 
50000 34,1 7,60 16,0 :.~·:· 
-· ~ i'" 
60000 28,4 10,96 23,0 "' ·~-~~ 
70000 24,3 14,97 31,4 -:·-· 
80000 21,3 19,49 
?t-· 
40,9 
~.·_.._ 
:.i~~' 
.• -- ' c': - ' ~~..,_,4.}:-~ . . '· ,. . - . ' - A~. - - . .'·t;:~ ~ 't~ _,... .. ~ . .. ..;. }~." ,..· .... ·' ~;-- L~ 1 ... .._. 
Literatura recomendada 
(1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. Univer-
sity of Tokyo Press, Tóquio, 1973. 
(2) BAILEY, J.E . & OLLIS, D.F. Biochemicai Engineering Fundamentais. McGraw-Hill 
Book Company, Nova York, 1986. 
(3) BLAKEBROUGH, N . Biochemicai and Bioiogicai Engineering Science. Academic 
Press, Nova York, 1967 e 1968. 
(4) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbioiogie Industrielle et Génie Biochimique. Mas-
son et Cie., Éditeurs, Paris, 1970. 
(5) SOLOMONS, G.L Materiais and Methods in Fermentation. Academic Press, Lon-
dres, 1969. 
---------- ------------·------------------- -·-·--- --- · ----- - ---~----..,.------ ----------·--···------·- - .. ------- ----- --~ 
63 
:: 
__________ , ___________ , __ 
Willibaldo Schmidell 
5.1- Introdução 
Como se sabe, os processos químicos industriais podem ser divididos, de 
uma forma simples e global, em processos inorgânicos, orgânicos e biológicos. 
Assim, um processo químico industrial biológico é aquele no qual o processo de 
conversão da matéria-prima em produto repousa basicamente em um fenômeno 
biológico. 
Esse tipo de indústria apresenta uma série de características próprias, 
pois freqüentemente trata-se de fazer crescer um certo microrganismo ou, de 
forma mais geral, uma dada célula, seja microbiana, animal ou vegetal. Esse 
fato exige a pres,ença, desde o projeto da planta até sua operação em regime, de 
uma mentalidade própria e particular em relação à existente na indústria quí-
mica não biológica. 
É também fato conhecido, que até a SegundaGuerra Mundial não s~ dispu-
nha de tecnologias adequadas para a condução de processos fermentativos em 
grande escala e em condições de assepsia, motivo pelo qual não havia a possibili-
dade de se fabricar produtos tais como antibióticos, vitaminas, enzimas, etc. 
Os produtos elaborados por processos fermentativos eram aqueles cuja ge-
ração, no caldo em fermentação, tornassem o meio não adequado para a prolifera-
ção de possíveis contaminantes, determinando, desta forma, uma proteção natural 
ao meio (etanol, acetona, ácidos orgânicos, etc.). 
O grande avanço observado durante a Segunda Guerra Mundial foi exata-
mente o desenvolvimento dessas estratégias que permitiram a condução de pro-
cessos em larga escala em condições de assepsia, em particular a possibilidade 
, de se efetuar a esterilização de grandes volumes de ar, necessário aos processos 
biológicos aeróbios. 
Apenas para se ter uma idéia da importância da: esterilização do ar, imagi-
ne-se a necessidade de fornecer ar esterilizado para um reator de 100m3 a uma va-
:l 
!. 
64 Esterilização de ar 
zão específica de 0,5 min-1 (ou, como freqüentemente mencionado, 0,5 v.v.m., ou 
seja, volume de ar por volume de meio por minuto). Esse problema, que nada tem 
de extraordinário, sendo mesmo bastante freqüente, pode ser resumido à necessi-
dade de se esterilizar 50 m3ar/min. 
Admitindo-se uma contaminação do ar ambiente da ordem de 103 partícu-
las/m3 (vide item seguinte), caso não houvesse a esterilização do ar, introdu-
zir-se-iam no reator 5x104 partículas/min. Lembrando que um processo 
fermentativo pode freqüentemente ocorrer durante 50 ou 100 horas, isto significa-
ria introduzir um total de 3x108 partículas contendo microrganismos, ao longo de 
100 horas de fermentação. 
Esse exemplo torna claro que não se poderá obter sucesso nesse processo, 
caso o acúmulo do produto desejado dependa da ação isolada do microrganismo 
responsável pela síntese deste produto. 
Na verdade, caso se trate de um processo descontínuo de fermentação, os 
instantes mais problemáticos são os instantes iniciais do processo, pois aí se tem 
baixa concentração do microrganismo produtor e alta concentração de substratos, 
o que significa alta potencialidade de contaminação do sistema. Já nos instantes 
mais avançados tem-se uma alta concentração do microrganismo responsável pelo 
processo produtivo e uma baixa concentração de substratos, o que torna o caldo 
em fermentação menos suscetível a contaminações. Isso não significa que se possa 
conduzir o process<;> de forma menos atenta, pois a ocórrência de contaminações 
que produzam substâncias que destruam o produto gerado pode _comprometer o . 
processo, como é o caso de contaminações com células produtoras de proteases 
em um processo de produção de uma dada enzima. 
Claro está que o nível de preocupação com a esterilização do ar depende da 
maior ou menor suscetibilidade do_ processo quanto a cúntaminantes. Caso o meio 
de cultivo, ou as condições impostas ao reator (pH, temperatura), sejam extrema-
mente seletivos, os cuidados podem ser atenuados, mas ainda assim a ocorrência 
de contaminações pode interferir negativamente no que se refere à obtenção de al-
tos rendimentos, o que geralmente não compensa a economia que se tenha feito, e 
que não mais permita uma operação asséptica eficiente. 
No presente capítulo pretende-se descrever certas particularidades sobre os 
aerossóis microbianos, indicar formas para se estimar a concentração de microrga-
nismos suspensos no ar, apresentar as formas mais freqüentes e disponíveis para 
se executar a esterilização do ar, sempre com a principal preocupação no forneci-
mento de ar esterilizado para processos fermentativos aeróbios. 
5.2 - Aerossóis microbianos 
As espécies microbianas suspensas no ar atmosférico, assim como sua con-
centração, podem ser extremamente variáveis, dependendo de uma série de fato-
res. Pode-se encontrar microrganismos de maiores dimensões, como bolores 
(fragmentos de hifas) e leveduras, assim como espécies de menores dimensões 
como bactérias ou seus esporos. Esses microrganismos são provenientes do solo, 
ou de plantas, ou ainda de cursos de água, sendo postos ein suspensão pela 
--------------·--------. - - --·----·------------- --- -~- - ------- _..,...._....,. 
Amestradores 65 
movimentação do ar ambiente, sendo os de menores dimensões freqüentemente asso-
ciados a partículas de poeira. 
A simples menção desses fatos já indica que, dependendo do clima de urna 
dada localidade, ou mesmo de um dia para outro em urna mesma localidade, po- , 
dern-se encontrar diferentes concentrações de microrganismos suspensos no ar, 
assim corno distintas espécies de microrganismos suspensos. De fato, ao se efetuar 
a contagem de microrgàni~rnos no ar em um ambiente livre de radiações solares e 
com umidade relativa elevada, muito provavelmente obtêm-se concentrações ele-
vadas de células vegetativas. Ao contrário, urna determinação feita após longa ex-
posição à luz solar forneceria urna contagem preferencial de espécies mais 
resistentes, corno ·os esporos de bactérias. Analogamente, a concentração de mi-
crorganismos suspensos no ar é drasticamente reduzida após um período de chu-
vas e extremamente elevada após. um período de ventos fortes. 
Essas informações permitem refletir sobre o local de onde se deve proceder 
à captação de ar para processo. Esse local de captação não deve ser entendido 
corno aleatório, pois podemos estar captando ar de locais II).Uito contaminados, 
corno seria o caso de se localizar a entrada de ar do sistema de compressão muito 
próxima do solo, ou ainda voltada para locais particulares e sujeitos a um maior 
nível de contaminação. 
No próximo item se buscará descrever sistemas para a determinação da· con-
centração de microrganismos suspensos no ar, mas já se pode afirmar que, apesar 
das possíveis variações em urna mesma localidade, ao se efetuar estas deterrnina-
.ções por longos períodos (um ano por exemplo), obtêm-se valores médios relativa- · 
mente próximos. Assim, AIBA et al. 1 indicam, para a atmosfera de Tóquio, urna 
concentração média de microrganismos de 12x103 partículas/rn3, enquanto que 
GADEN;HUMPHREY 2 indicam, para Londres, um valor de 3 a 9x103 partículas/rn3• 
PARIS et al.3 chegaram a urna concentração média de 1 a 3x103 partículas/rn3, 
no que se refere à atmosfera da capital de São Paulo, após realizarem amostragens 
durante o período-de um ano e em diversas localidades. ' 
Deve-se salientar que as diferenças observadas entre esses diversos dados 
disponíveis na literatura são devidas às próprias características do fenômeno, con-
forme discutido anteriormente, mas também em virtude do emprego de diferentes 
rnetodologias na quantificação. 
Quanto às dimensões dos microrganismos suspensos no ar, pode-se conside-
rar corno representativos valores da ordem de 0,5 a 1,0 !JID, ou seja, dimensões de 
bactérias ou seus esporos. Por outro lado, as partículas de poeira, que freqüente-
mente transportam os microrganismos, apresentam diâmetros freqüentemente su-
periores a 4 J.liD, sendo que os esporos normalmente não estão associados a estas 
partículas de poeira.4 
5.3 - Amestradores 
A determinação da concentração de microrganismos suspensos no ar atmos-
férico é realizada através do uso de dispositivos designados genericamente por 
arnostnidores. Esses instrumentos não são apenas importantes por realizarem essa 
--- - - ------· _____ _,___ .... ~----~,. .. ~--. ---...,...,_----=--~...:.....,_.,,.,... __ _ __________ _____ ·---- - - --
66 Esterilização de ar 
tarefa, como também são empregados para a · verificação da efetiva esterilização 
do ar destinado ao processo, ou na quantificação de eventuais contaminantes e.m 
áreas ditas estéreis (salas de cirurgia). 
Essas são as razões pelas quais reveste-se de importância o conhecimento de 
alguns detalhes sobre.os tipos de amestradores que podem ser empregados, assim 
como sua forma de operação e limitações. 
De uma forma geral,todos os amestradores operam de maneira semelhante, 
pois o princípio básico deles consiste em reter, de alguma forma, os microrganis-
mos suspensos em um determinado volume de ar, dando-se, a seguir, condições 
para que estas células proliferem, de maneira a tornar possível a contagem de co-
lônias, para a quantificação dos contaminantes no volume de ar amostrado. 
Tendo em vista essa descrição geral, pode-se concluir que: 
a) dependendo da forma empregada para reter os microrganismos, não se 
pode assegurar que esta retenção seja total, podendo-se inclusive imaginar que 
haja distintas eficiências de coleta para diferentes amestradores; 
b) ainda na dependência da forma de reter os microrganismos, pode-se tam-
bém imaginar a possibilidade da ocorrência de destruição de certas espécies; 
c) lembrando que células microbianas suspensas no ar podem estar associa-
das a partículas de poeira, podendo ocorrer a existência de mais que uma célula 
por partícula, por mais que se busque desagregar estes conjuntos, é sempre difícil 
afirmar que uma colônia tenha tido, obrigatoriamente, origem em uma única célu-
la. Essa é, inclusive, a razão pela qual os resultados são freqüentemente expressos 
em número de partículas, ou de número de colônias por unidade de volume de ar 
amostrado; 
d) conforme indicado, a etapa final da determinàção consiste em contar co-
lônias que se desenvolveram em um dado meio de cultura e, tendo em vista a 
grande variedade de microrganismos suspensos no ar, torna-se difícil eleger um 
meio no qual se possa afirmar que todas as espécies se desenvolvam em um dado 
intervalo de tempo. · 
Uma primeira conseqüência dos fatos acima apontados/ reside n<J'dificulda-
de em comparar resultados obtidos pelo uso de diferentes amestradores, ou com 
um mesmo amestrador~ porém operado de formas distintas. 
Outra conseqüência clara é a impossibilidade de se obter a concentração, to-
tal ou absoluta, de microrganismos suspensos no ar atmosférico. 
Uma forma de minorar esses problemas, especialmente quando se deseja 
efetuar testes de efetividade de esterilização de um dado sistema, por exemplo de 
um dado filtro, consiste em preparar uma suspensão de um dado microrganismo 
em ar, previamente submetido à esterilização. Esse ar, artificialmente contamina-
do com o microrganismo usado como marcador, é passado através do filtro, deter-
minando-se a concentração (ou o número) de microrganismos no ar antes e após o 
elemento filtrante, desde que também se conheça o volume de ar amostrado, me-
dindo-se a vazão de ar e o tempo do ensaio. Pode-se assim quantificar a eficiência 
de retenção (TJ) do filtro em teste: 
N ~N 
. TJ = l z X 100 
Nl 
. (5.1) 
_, .. ----·-.- -------------- - · .... ..... ... ... ___.il 
Amestradores 6 7 · 
onde: N1 =concentração de microrganismos no ar antes da passagem pelo filtro 
.(partículas ou colônias por unidade de volume) e 
N2 = concentração de microrganismos no ar após a passagem pelo filtro,_ 
(partículas ou colônias por unidade de volume). . 
O fato de se conhecer o microrganismo empregado para esse tipo de deter-
minação, significa que se conhece perfeitamente o aspecto dÇl.s colônias que se 
quer contar (formato, apar&ncia, cor), além de se conhecer o meio de cultura e as 
condições mais adequadas para a sua proliferação. 
Vários microrganismos têm sido empregados para a realização desses testes, 
tais como Serratia marcescens,S Pseudomonas diminuta6'7 e esporos de Bacillus subtilis 
var. niger.4 Obviamente esses microrganismos são de pequenas dimensões, como é 
o caso do Pseudomonas diminuta, que apresenta diâmetros de 0,3 por 0,8 J.Lm. 7 
Pretende-se, a §eguir, apresentar algumas características de alguns amostra-
dores mais freqüentemente empregados. Convém salientar que na literatura há a 
descrição de um número elevado de amostradores, sendo freqüente que um pes-
quisador, ao trabalhar sobre. o tema, acabe por desenvolver o seu próprio sistema, 
ou propondo variações sobre os existentes. Isso resulta na geração de dados que 
são de difícil comparação, a não ser que se empregue sistema idêntico. 
5.3.1 - I!Tlpinger 
O impinger é um dos amostradores mais conhecidos e sobre o qual há inui-
tas referências. Existem, inclusive, inúmeras versões desse amostrador, sendo um 
exemplo típico o indicado na Figura 5.1, extr_aída do trabalho de TYLER; SHIPE,8 
sendo conhecido como "all-glass impinger" (AGI). 
2 
13cm 
Figura 5.1 - "All-glass impinger" (AGI). (I) Entrada do ar; (2) Saída do ar (bomba de vácuo). 8 
- -·-:-- - -~ -- -- ------·· ~-- -·· ·· --· - · ·-·· · · · ------ --· -------- - ---~__;_ _______ ~---.-- -·-;---·---- --- ·----- -- -·------ ---:--
68 Esterilização de ar 
Esse amostrador consta de um recipiente de vidro que contém 10 mL·do lí-
quido coletor, que pode ser água destilada, ou determinadas soluções como a so-
lução gelatina-fosfato, constituída de gelatina (2 g/L) e Na2HPQ4 (4 g/L), à qual se 
adiciona 0,01 mL de óleo de oliva esterilizado, a fim de evitar a formação de espu-
ma. Antes do início da amostragem, todo o conjunto deve ser esterilizado. 
Ao se iniciar a amostragem do ar, liga-se a abertura 2, indicada na Figura 
5.1, a uma bomba de vácuo, de forina a reduzir a pressão no interior do recipiente. 
Dessa forma, o ar entrará no amostrador através da abertura 1, borbulhando no lí-
quido coletor através do tubo de vidro, o qual é capilar em sua parte final para 
gerar bolhas de pequeno diâmetro. Espera-se, portanto, que os microrganismos 
existentes no ar fiquem retidos no líquido. 
Terminada a tomada de amostra, o frasco é agitado, a fim de promover a de-
sagregação dos eventuais aglomerados de células, determinando-se, então, a con-
centração de microrganismos no líquido coletor, através dos métodos usuais de 
diluições e contagem de colônias em placas. 
Conhecendo-se a vazão de ar e o tempo de amostragem, conhece-se o volu-
me de ar amostrado, tendo-se, portanto, todos os dados necessários para o cálculo 
da concentração de microrganismos neste ar. 
Uma das vantagens desse amostrador consiste no fato de Iião ser necessário 
o uso de medidor de vazão de ar, uma vez executada a calibração do aparelho, 
pois o tubo capilar funciona como um "orifício crítico". Essa expressão "orifício 
crítico" significa uma condição de trabalho na qual a relação entre as pressões rei-
nantes nas extremidades do tubo capilar é suficiente para produzir velocidade do 
ar igual à do som. Essa velocidade não é mais ultrapassada, mesmo que a pressão 
do lado do vácuo diminua ou oscile abaixo desse valor crítico. Para o ar, a relação 
de pressões é de 0,53, significando que se a amostragem for efetuada de um ambi-
ente à pressão de 1 atm, a pressão do lado do vácuo deverá ser inferior a 0,53 atm, 
podendo inclusive oscilar entre valores abaixo deste e, mesmo assim,' a vazão per-
manecerá constante.9 Assim, uma vez construído o instrumento, ele deve ser sub-
metido a uma calibração, para se conhecer a vazão de ar que ele pe/mite, com a 
devida precisão. 
No caso do AGI utilizado por TYLER; SHIPE,8 a vazão de ar era de 12,5 L/min 
e a distância da extremidade livre do capilar ao fundo do frasco era de 4 mm. Esse 
impinger apresentou uma eficiência de retenção de esporos de Bacillus subtilis su-
perior a 99%, em comparação com os · dados obtidos com um amostrador de algo-
dão (vide a seguir) considerado como absoluto, apesar de se saber que ocorre 
destruição de células neste tipo de amostrador. 
Em vista desses fatos, os mesmos autores puderam imaginar que haveria re-
tenção de microrganismos no tubo de admissão de ar, assim como poderia ocorrer 
a destruição de células, em virtude da excessiva velocidade com que as partículas 
são lançadas no meio, podendo, inclusive, haver choque contra o fundo do frasco. 
Para demonstrar a ocorrência de retenção no tubo de admissão 'do ar, TYLER 
et al. 10 empregaram aerossol contendo cristal violeta, sendo que após certo tempo 
de amostragem efetuavam uma lavagem no tubo de admissão, determinandoa 
concentração daquele corante através de um colorímetro. Demonstraram que não 
Amostradores 69 
apenas ocorre essa retenção, como também que ela depende do tamanho da partí-
cula, observando que para partículas de 20 Jlm ocorre praticamente retenção total. 
Um dos métodos empregados pelos autores para a determinação da des-
truição de células vegetativas durante a amostragem, consistiu no uso de células 
marcadas radiativamente. Para tanto, usaram uma suspensão de Serratia marces-
cens previamente cultivada em meio glicosado contendo fósforo ou enxofre radio-
ativos. Após a amostragen( determinavam o número de partículas no líquido 
coletor através de um contador Geiger e as células viáveis pela técnica usual de 
contagem de colônias em placas. 
Uma vez constatados esses problemas com o AGI, SHIPE et al. 11 desenvolve-
ram um outro tipo de amestrador, que recebeu a designação de amestrador Shipe, 
indicado na Figura 5.2. 
2 
Figura 5.2 - Amostrador Shipe. (I) Oriffcio crítico (entrada do ar); (2) saída do ar (bomba de vácuo). 11 
Esse outro tipo de instrumento consiste em um erlenmeyer de 125 mL, sendo 
a entradado ar feita através de um "orifício crítico". Ele opera de forma similar ao 
AGI, colocando-se no erlenmeyer 25 mL do líquido coletor e ligando-se a saída de 
ar a uma bomba de vácuo. Devido à entrada do ar em alta velocidade ser efetuada 
na superfície do líquido, isto provoca um movimento circular do líquido coletor, 
sendo importante a localização do orifício de entrada, a fim de evitar uma excessi-
va umidificação das paredes do frasco. 
70 Esterilização de ar 
Como se pode observar, o amostrador Shipe não conta com o tubo de entra-
da, e ainda lança as partículas contra a superfície do líquido coletor que está em 
movimento. Isso evita a mencionada retenção e também reduz :a possibilidade de 
destruição de células vegetativas, sendo que testes comparativos indicaram cerca 
de 23% a mais de células viáveis no amostrador Shipe, em relação ao valor obtido 
no AGI. 
Os detalhes expostos acima servem para ilustrar os cuidados na constru-
ção e operação desses amostradores, para se poder obter resultados satisfató-
rios e reprodutíveis, mesmo no caso de se utilizar aerossóis contendo células 
conhecidas. 
5.3.2 - Amostragem por filtração 
Existem vários amostradores cujo princípio básico da amostragem é a filtra-
ção, sendo, portanto, distintos dos amostradores mencionados. Consistem em fazer 
passar o ar através de um elemento filtrante, o qual deverá reter os microrganismos 
suspensos. Posteriormente, pode-se colocar esse material filtrante em suspensão em 
um volume conhecido de um líquido adequado, procedendo-se a uma agitação vi-
gorosa, a fim de propiciar a passagem dos microrganismos retidos para o líquido. 
Finalmente, efetua-se a determinação da concentração de microrganismos no líqui-
do, pelas técnicas usuais de diluições e contagem em placas. Conhecendo-se o volu-
me de líquido sabe-se o número total de microrganismos retidos e, novamente, 
conhecendo-se a vazão do ar amostrado e o tempo de amostragem, têm-se todos os 
elementos para o cálculo da concentração de células no ar. 
Alternativamente, pode-se após a passagem do ar através do elemento filtran-
te dar condições para que as células proliferem no próprio coletor; efetuando-se en-
tão a contagem de colônias. Esse procedimento, quando possível, evita o trabalho 
adicional de suspender as células em um líquido para posterior contagem. 
Um amostrador típico dessa categoria é o amostrador de algodão, esquema-
tizado na Figura 5.3. Após a sua montagem ele deve ser submetido a esterilização, 
preferencialmente por meio de calor seco (estufa), a fim de evitar o umedecimento 
das fibras e a conseqüente perda de eficiência de retenção de microrganismos. 
A amostragem é realizada conectando-se a extremidade 2 (Fig. 5.3) a uma 
bomba de vácuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazão de ar. Após o 
tempo de amostragem, o chumaço de algodão é retirado do amostrador e asseptica-
mente transferido para um recipiente contendo um volume conhecido de água este-
rilizada. Procede-se, então, a uma vigorosa agitação, objetivando a passagem dos 
microrganismos retidos nas fibras para o líquido, efetuando-se a determinação da 
concentraÇão de microrganismos no líquido por contagem de colônias em placas. 
Esse amostriidor apresenta uma série de inconvenientes, como a dificuldade 
em suspender os microrganismos retidos, além de provocar a destruição de célu-
las vegetativas, conforme apontado por TYLER; SHIPE.8 Alternativamente pode~se 
eiilpregar lã de! vidro, mas de ' qualquer maneira a obtenção de altas eficiências de 
coleta depende de se ter o material fíltrante muito bem compactado, de forma a se 
observar uma perda de carga, no leito filtrante, relativamente elevada e da ordem 
de 0,5 kg* /em. · · 
-~----------__. 
Amestradores 71 
2 
13 em 
Figura 5.3 - Amostrador de algodão. (I) Entrada do ar; (2) Safda do ar (bomba de vácuo). 8 
Uma forma mais conveniente de se efetuar amostragens por filtração con-
siste no emprego do amostrador proposto pela Millipore Ind. e Com. Ltda. Esse 
amostrador consiste em urri suporte em aço inoxidável, o qual abriga membranas 
Millipore de 4Zmm de diâmetro e poros de 0,22 J..lm ou 0,8 J..lm, devendo ser pre-
viamente esterilizado. O sistema dispõe de uma bomba de vácuo, que succiona o 
ar, · obrigando-o a passar através da membrana e tà:mbém através de um orifício 
crítico, . a .Jim de se ter uma vazão constante e conhecida. Terminada a amostra-
gem, a membrana deve ser retirada assepticamente e colocada sobre a superfície 
de um meio de cultura em pequenas placas de Petri. Após tempo adequado de in-
cubação, contam-se as colônias que aparecem sobre a membrana, obtendo-se, as-
sim, a concentração de microrganismos no ar amostrado. PARIS et al} cujos 
resultados foram meru::ionados anteriormente, efetuaram determinações com o 
emprego desse tipo de amostrador. 
Ao que tudo indica, o desenvolvimento de amostradotes que operam por fil-
tração através de membranas, teve seu início com o trabalho de TQRLONI; 
BORZANI,12 empregando um sistema cujo elemento filtrante qmsistia em papel-
filtro Whatman 40 e 42. Esse original sistema, esquematizado na Figura 5.4, era 
constituído de um funil de alumínio, ao qual se adapta uma folha de papel-filtro 
apoiado em uma grade de aço inoxidável. Entre a grade e a folha de papel colo-
ca-se uma camada de algodão hidrófilo. · 
72 . Esterilização de ar 
entrada __ 
do ar 
Figura 5.4 - Amostrador de papel filtro. 12 
Após a esterilização do sistema, ao se efetuar a passagem de ar através da 
folha de papel-filtro, o que poderia ser feito acoplando-se um segundo cone após 
o elemento filtrante e este ligado a um orifício crítico e a uma bomba de vácuo, os 
microrganismos devem ficar retidos sobre esta folha. Terminada a amostrél,gem, o 
sistema pode ser desmontado, adicionando-se a seguir um meio de cultura ao al-
godão hidrófilo, de forma a permitir, após um certo período de incubação, a con-
tagem de colônias surgidas na superfície do papel-filtro. 
A partir dos resultados obtidos pelos mencionados pesquisadores, 12 com o 
amostrador proposto pode-se estimar a concentração de microrganismos no ar at-
mosférico da cidade de São Paulo como estando entre 4 a 6x103 partícttlas/m3, va-
lor este perfeitamente de acordo com os dados anteriormente mencionados. 
5.3.3 - Amestradores de fenda ou orifício 
O princípio básico de funcionamento desses amostradores consiste em se fa- .· 
zer com que o ar amostrado incida, a uma dada velocidade, sobre a superfície de 
um meio de cultura sólido, havendo, em virtude de uma brusca mudança de dire-
ção do ar, o choque das partículas suspensas que não acompanham as linhas de 
corrente, ocasionando a retenção destas partículas nesta superfície. 
·A Figura 5.5 mostra esquematicamente o amostrador de fenda desenvolvido 
por Bourdillon e descrito por TORLONI.9 Como se nota, consta de uma placa de Pe-tri, contendo um meio de cultura sólido preso a um disco horizontal giratório, es-
tando todo este conjunto no interior de uma caixa metálica, provida de uma janela 
que permite fechamentó hermético. O ar entra por um tubo vertical que possui, na 
extremidade inferior, uma fenda através da qual as partículas em suspensão no ar 
Amestradores 73 
são lançadas contra a superfície coletora. Uma vez esterilizado todo o conjunto, a 
saída de ar é conectada a uma bomba de vácuo, intercalando-se um sistema para a 
medida da vazão de ar. 
! 
3 -4 
Figura 5.5 - Amostradorde fenda. (I) Placa de Petri ; (2) Disco giratório; (3) Tubo e fenda (entrada do ar); (4) Saída 
do ar para o medidor de vazão e bomba de vácuo; (5) Caixa metálica. 
Durante o período de amostragem, o disco gira com velocidade angular re-
gulável, em função da contaminação do ar que se está tomando como amostra, po-
dendo-se imaginar valores desde 0,1 rpm até cerca de 2 rpm. 
Após a amostragem, a placa de Petri é retirada do amestrador, fechada em 
condições de assepsia e incubada. Decorrido um intervalo de tempo adequado, 
conta-se -o número de colônias que àparecem sobre ·o meio de cultura. Conhecen-
do-se a velocidade de rotação da placa; a vazão de ar e o número de colônias sobre 
o meio, ou parte de sua superfície, têm-se todos os elementos para quantificar a 
contaminação do ar amostrado. 
Note-se que não há como proceder à desagregação dos aglomerados de célu-
las, o que também ocorre com os sistemas, anteriormente descritos, nos quais se 
efetua a contagem diretamente sobre a superfície coletora. Isso significa que cui-
dados devem ser observados, especialmente quando se trabalha com aerossóis de 
microrganismos definidos, a fim de evitar a presença de aglomerados, que podem 
ser aleatoriamente desfeitos sobre a superfície coletora durante a amostragem, ge-
rando contagens igualmente aleatórias. 
Os autores também indicaram que a eficiência de retenção de aerossóis de-
pende da vazão do ar, assim como da distância da fenda ao meio de cultura. De-' 
terminaram um valor máximo de 95% de retenção, quando empregavam vazões 
superiores a 28 L/mine 2 mm de distância da fenda ao meio. Essa retenção dimi-
- ----------- · 
7 4 Esterilização de ar 
nuía sensivelmente quando se reduzia a vazão do ar, sendo que obtiveram reten-
ções inferiores a: 70%, operando corri urna vazão da ordem de 56 L/rnin e urna 
distância de 6 rnrn entre a fenda e o meio sólido. · 
Para amostragens muito prolongadas pode ocorrer ainda o inconveniente da 
perda de água do meio de cultura sólido, com a conseqüente abertura de fendas 
no meio, o que inutilizaria o ensaio efetuado. 
Apesar dos inconvenientes e cuidados apontados no que se refere a esse tipo 
de arnostrador, ele apresenta certas vantagens sobre os demais. De fato, pode-se 
imaginar a realização de teste de um determinado sistema para a esterilização do 
ar, corno por exemplo o teste de um determinado material filtrante, determinando 
de forma contínua a eficiência de esterilização ao longo do tempo de operação do 
sistema. Pelo emprego de urna suspensão de um dado microrganismo conhecido, 
marca-se no meio de cultura a posição da fenda no instante inicial. Após a incuba-
ção, pode-se proceder à contagem do número de colônias existentes em determina-
dos setores da placa, os quais corresponderão a certos intervalos de tempo 
conhecidos, desde que se conheça a velocidade de rotação da placa. Corno se conhe-
ce a vazão, sabe-se o volume de ar amostrado em cada setor da placa e, portanto, a 
correspondente concentração de microrganismos no ar que passou pelo elemento 
filtrante em teste. Pode-se, assim, determinar a variação da eficiência de retenção 
em função do tempo de amostragem, ou de operação do sistema de esterilização. 
É evidente que outros amestradores também perrni~ern esse tipo de determi-
nação, porém executada de forma intermitente, pois a cada amostragem há a ne-
cessidade de substituição do sistema de coleta do arnostrador, para a realização da 
contagem de partículas. No caso do arnostrador em questão, isso:não é necessário, 
bastando providenciar a substituição da placa, após um giro completo, por outra 
esterilizada. 
Na verdade, esses testes de sistemas de esterilização de ar, destinados a pro-
cessos ferrnentativos, são de grande importância, tendo em vista a ne~ssidade de 
alta confiabilidade. 
Um sistema desse tipo foi empregado por AIBA et al.,5' 13'14 para a realização 
de testes em filtros de materiais fibrosos e filtros de placas porosas, empregando 
porém um orifício no lugar de urna fenda. Na Figura 5.6 encontra-se esquematiza-
do o sistema empregado pelos mencionados pesquisadores, observando-se que o 
ar passa por medidores de vazão e, após a nebulização de urna suspensão do mi-
crorganismo utilizado corno marcador (no caso Serratia marcescens), ele vai para os 
amestradores. Quando a válvula A estiver aberta, a B deve estar fechada, efetuan-
do-se, nestas condições, a determinação da concentração de microrganismos no ar 
a ser filtrado. Feito isso fecha-se o registro A e abre-se oB, perrnitindo~se que o ar 
atravesse o filtro. 
Encontram-se naliteratura vários outros esquemas imaginados para a reali-
zação de testes de efetividade de sistemas para a esterilização do arY·15 Deve-se, 
no entanto, acrescentar que testes em linha deveriam ser executados, efetuando-se 
amostragens periódicas, ou até mesmo contínuas, de ar esterilizado ao longo do 
Métodos para a esterilização de ar 7 5 
tempo em que o processo fermentativo esteja ocorrendo, a fim de verificar a efi-
ciência da esterilização do ar, tendo em vista os altos custos envolvidos na perda 
de partidas em virtude de contaminações. Isso normalmente não é realizado, as-
sim como outras medidas nessa direção, o que torna sempre muito difícil a desco-
berta das causas de contaminações em processos. 
Câmara 
de vidro 
esterilizada 
Derivação 
para ensaio 
em branco 
Placa de Petri 
Termômetro de 
bulbo sec'o 
Rotâmetro 
e úmido t 
Compre~ ----.....L.-_....:;;. _ __. 
de ar 
t 
Rotâmetro 
Figura 5.6 - Sistema de teste de materiais filtrantes , empregando u~ amestrador de fenda.5 
5.4 - Métodos para a esterilização de ar 
A esterilização de ar pode ser realizada por diversos processos. No entanto, 
a filtração é, sem dúvida, a solução mais conveniente, motivo pelo qual se dará a 
ela maior ênfase . . 
5.4.1 - Esterilização por aquecimento 
Sabe-se que a resistência à destruição de microrganismos, quando submeti-
dos ao calor seco, é bem superior quando comparada à resistência ao calor úmido. 
Por esse motivo, a esterilização do ar pelo calor seco exige temperaturas relativa-
mente elevadas, assim como tempos de permanência nestas temperaturas também 
elevados. Ainda, o transporte de microrganismos por partículas sólidas de poeira, 
em virtude da possibilidade de alguma proteção térmica, acaba contribuindo para 
a necessidade de condições de esterilização mais drásticas. 
7 6 Esterilização de ar 
Quando se raciocina em termos de aplicação industrial, constituída de reato-
res de grande porte, há a necessidade de vazões de ar bastante elevadas (observe o 
que foi descrito na Introdução). Isso dificulta imaginar o aquecimento de todo 
esse ar para atingir essas elevadas temperaturas, assim como é impossível projetar 
tubos de retenção ou de espera suficientemente longos, a fim de se contar com os 
tempos de residência prolongados a essas temperaturas. 
Devido a esses problemas, a esterilização de ar por calor seco encontra ape-
nas aplicação para pequenas instalações, como é ó caso da esterilização do ar para 
equipamentos de laboratório ou escala piloto. Acrescente-se, ainda, que com o 
surgimento de sistemas de esterilização muito confiáveis, como é o caso das mem-
branas filtrantes (vide adiante), a esterilização por aquecimento tornou-se alterna-
tiva muito pouco utilizada. 
Para se ter uma idéia mais concreta a respeito da possibilidade do uso dessa 
técnica, pode-se citar o trabalhode DECKER et al./6 que determinaram as condi-
ções de esterilização, trabalhando com esporos de Bacillus globigii e usando um es-
terilizador de ar por resistores elétricos. Os resultados obtidos pelos citados 
pesquisadores encontram-se na Tabela 5.1. 
Tabela 5.1 - Esterilização de ar por calor seco. Ensaios com esporos de Bacillus globigii. 16 
Temperatura CC) Tempo de permanência* (s) r. -~ 
218 24 ~ 
246 10 ).~ -~ 
274 5 ·~ 
300 3 g 
.. 
:;;;...-~ ~ l:a'ltl.oi." - r:~ o.: ~ 
*Para destruição superior a 99,9999% 
• 
Conforme pode ser observado, apenas temperaturas relativamente elevadas 
permitem tempos de exposição da o:r:.dem de alguns segundos, o que claramente li-
mita a utilização dessa técnica, em se tratando de elevadas vazões de ar. 
Em virtude da facilidade de construção e de controle, a esterilização de ar 
por aquecimento através de resistores elétricos ainda encontra possíveis aplica-
ções, para o caso de ar de exaustão de câmaras assépticas, especialmente quando 
se trabalha com microrganismos patogênicos, ou para o fornecimento de ar esteri-
lizado para instalações de laboratório ou plantas piloto de pequenas dimensões. 
O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores elétri-
cos, onde o ar é aquecido e, através de sistema adequado, obrigá-lo a permanecer 
o tempo necessário a altas temperaturas. Um exemplo desse tipo de equipamento 
é o proposto pela New Brunswick Sei. Co./ 7 que permite vazões de até 200 litros 
de ar/min, o que poderia satisfazer a necessidade de um reator de 100 litros aera-
do com até 2 min·. É também possível esterilizar o ar que sai do reator, fazendo-o 
passar por um segundo sistema, o que pode ser de interesse quando se trabalha 
com patogênicos. 
-·-·------~- ·· · -····-~ 
Métodos para a esterilização de ar 77 
Na Figura 5.7 encontra-se um desenho esquemático de um equipamento desse 
tipo, observando-se que o ar ao entrar no sistema é preaquecido pelo ar que deixa o 
equipamento, sendo, a seguir, conduzido para o contato direto com os resistores, 
atingindo temperaturas da ordem de 370°C. O ar esterilizado, além de trocar calor 
com o ar que entra, ainda é resfriado por água em uma serpentina adicional. 
Controle de 
Resistências temperatura 
Resfriamento 
Saída de a=r--~ 
Figura .S.7 - Equipamento para a esterilização de ar por aquecimento através de resistores elétricos.
17 
Todo o trajeto do ar deve ser inicialmente esterilizado por vapor. Quando 
em operação, o sistema é controlado por p·ares termelétricos que comandam vál-
vulas solenóides, que apenas permitem a passagem do ar para o. tanque, ou a des-
carga de gases para a atmosfera, caso a temperatura das câmaras de esterilização 
_se mantenha em valores adequados. 
Um aspecto interessante a ser abordado neste momento, em se tratando de 
reatores de grande porte, diz respeito à necessidade de se comprimir o ar que é en-
viado aos reatores, até pressões efetivas da ordem de 3 kg* I cm2, a fim de vencer 
uma série de perdas de carga como a existente nos filtros para a esterilização do 
ar, no dispersar do ar no fundo do reator, altura da coluna líquida de meio de cul-
tivo e a sobrepressão mantida na "cabeça" do reator (da ordem de 0,2 a 0,5 
kg* /em\ a fim de evitar a entrada do ar ambiente que proporcionaria contamina-
ções (entende-se por "cabeça" do reator o volume interno acima do líquido) . 
........._____ ... . - ----- - ---·-------- ------ -.. __ __,_ ---. -·- -- - -- ----·-- ----- ----- ---------
78 Esterilização de ar 
Essa compressão obrigatória do ar provoca inevitavelmente um aquecimen-
to do ar, atingindo-se valores que não são desprezíveis. Assim, um compressores~ 
tacionário, tipo helicoidal, provoca, para uma vazão de ar de 170 m3 /min e 
descarga a 3 kglcm2, um aquecimento do ar de 20°C a cerca de 180°C, além de ser 
necessária uma certa filtração do ar, na entrada do compressor, para evitar um 
maior desgaste de suas partes móveis. · 
Justamente por esse motivo é necessária a instalação de um sistema deres-
friamento do ar após a compressão, para evitar a circulação do ar aquecido, assim 
como evitar a introdução de ar quente nos reatores, o que complicaria o controle 
de temperatura, além de possivelmente causar gradientes de temperatura ao lon-
go da altura da coluna líquida em fermentação: Esse resfriamento é efetuado logo 
à saída do compressor, de forma que o ar permanece aquecido por um pequeno 
intervalo de tempo (freqüentemente inferior a 1 segundo). 
Conforme já mencionado, temperaturas inferiores a 200°C são pouco efeti-
vas para a obtenção de ar esterilizado. Sabe-se, no entanto, que as temperaturas ci-
tadas são suficientes para inativar células vegetativas, apesar do baixo tempo de 
permanência, restando desta maneira os esporos e as células que possam estar 
protegidas de alguma forma . Por outro lado, caso se imaginasseatingir tempera-
turas da ordem de 300°C, a fim de obter ar esterilizado em poucos segundos de 
permanência (videTab. 5.1), significaria, dependendo do tipo de compressor e da 
vazão de ar necessária, comprimir o ar a pressões bem mais elevadas (da ordem 
de 10 a 12 kg* I cm2), o que traria um encarecimento ex~essivo tanto do equipamen-
to, quanto no que se refere ao consumo de energia, não sendo portanto uma solu-
ção de interesse. 
PARIS et ai} efetuaram a determinação da concentração de microrganismos 
após a compressão e o resfriamento do ar, determinações estas efetuadas em uma 
instalação industrial dotada de um compressor helicoidal, operando, à vazão de 
145m3 lmin e pressão de descarga de 2,5 kg* I cm2, o que permitia atingir cerca de 
160°C. Esses autores obtiveram valores médios da ordem de 1 a 2 partículas/m3. 
Assim sendo, a redução observada . é extremamente significativa, quando 
comparada ao valor da concentração de microrganismos suspensos no ar (vide 
item 5.2), o que sugere que o ar, após a compressão em instalações de grande por-
te, deve ser manuseado com certos cuidados, tendo em vista sua razoável desin-
fecção, evitando~se que novamente venha a ser contaminado pelo ar atmosférico. 
Outra sugestão seria efetuar, quando possível, o resfriamento do ar ein local n\ais 
próximo de sua utilização final e não imediatamente após a compressão, aumen-
tando-se o tempo de residência a altas temperaturas. 
Existe, inclusive, menção na literatura a respeito da condução de processos 
fermentativos com sucesso, sem a presença de sistemas para a esterilização do ar, 
contando-se apenas com essa destruição de contaminantes durante a compres-
são.18 Isso, de forma alguma, deve significar que essa idéia deva ser generalizada e 
que seriam dispensáveis os sistemas adicionais para a esterilização do ar, especial-
mente quando se está diante de processos de longa duração e empregando condi-
ções e meios de cultivo pouco seletivos._ 
-~--- ------ ______ _.... 
Métodos para a esterilização de ar 79 
5.4.2 - Esterilização por radiações 
Teoricamente, muitos tipos de radiações podem ser utilizadas para a esteri-
lização do ar. Entretanto, o emprego de urna determinada radiação deve levar em 
conta urna série de importantes fatores, tais corno: a eficiência na destruição de 
microrganismos, o custo envolvido na obtenção da radiação, a periculosidade ou 
os efeitos colaterais de sua '.Itilização. Assim excluem-se para esse tipo de aplica-
ção as partículas a., prótons e nêutrons, por serem excessivamente dispendiosos 
quanto à sua obtenção e aplicação prática, o mesmo ocorrendo com as radiações y. 
Quando se visa a esterilização de ar, apenas as radiações ultravioleta encon-
tram aplicação prática. Em virtude de seu baixo poder de penetração, os raios ul-
travioleta necessitam de tempos de exposição relativamente longos, fato este que, 
novamente, impede o uso deste tipo de radiação para a esterilização de ar para um 
processo ferrnentativo. 
Em se tratando do fornecimento de ar esterilizado para câmaras assépticas, 
imaginou-se instalar lâmpadas ultravioleta em certos trechos do duto que levao 
ar para a câmara. No entanto, mesmo para esse caso, dependendo das dimensões 
dessa câmara, as vazões de ar já podem ser muito elevadas, não permitindo tempo 
suficiente de exposição ao ultravioleta, havendo, assim, a necessidade da instala-
ção de sistemas adicionais (filtros) para a efetiva esterilização do ar. 
Com freqüência observa-se a i'nstalaçãode lâmpadas ultravioleta no interior 
de salas assépticas, especialmente sobre os locais de trabalho, visando a esteriliza-
ção do ar circundante e das superfícies das mesas e instrumentos empregados (por 
exemplo, no preenchimento asséptico de medicamentos). Corno o ar que se intro-
duz nessas câmaras é previamente esterilizado e corno se procl,lra manter o ar o 
menos movimentado possível, o emprego da radiação ultravioleta, para este caso, 
é mais efetivo. 
5.4.3 :...:: Esterilização por filtração 
A esterilização do ar por filtração é, sem dúvida, a solução mais adequada 
para a obtenção de altas vazões de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos 
envolvidos nesta operação, além de se dispor, presentemente, de filtros bastante 
confiáveis. Por esses motivos, a filtração é encontrada em praticamente todas as 
instalações industriais, tendo também dominado as aplicações em instalações de 
pequeno porte, corno é o caso de instalações piloto ou de laboratório. 
Historicamente, muitos materiais filtrantes foram empregados, tais corno 
carvão, algodão ou papel. Posteriormente esses materiais foram substituídos por 
outros materiais fibrosos, corno é o caso de filtros de lã de vidro. Estes últimos en-
contraram enorme aplicação, constituindo-se na solução mais adequada até rnea-
dos .ou o final da década de 70. 
Mesmo no início dos anos 70 surgiram os filtros de materiais sinterizados, 
·corno o vidro, metais (bronze, aço ,inoxidável) e materiais cerâmicos, aparecendo 
também os filtros de membranas ou placas porosas de materiais polirnéricos, tais 
corno o náilon, o teflon ou ésteres de celulose. 
80 Esterilização de ar 
De fato, era possível prever, em meados da década de 70, que os filtros de 
membranas polirnéricas porosas poderiam dominar essa operação/9 o que de fato 
acabou ocorrendo, havendo urna gradual substituição dos filtr.os de lã de vidro 
pelos filtros de membranas hidrofóbicas, especialmente a partir de meados da dé-
cada de 80. 
Mencionando-se o passado e o presente, poder-se-ia também imaginar que, 
no futuro, possivelmente se passe a empregar membranas seletivas, ou seja, mem-
branas que além de esterilizar o gás a ser introduzido no reator, também possam 
provocar um enriquecimento do gás em oxigênio.20 Na verdade, o principal objeti-
vo da aeração, em reatores aerados e agitados, consiste na transferência do oxigê-
nio da fase gasosa para a fase líquida, não tendo sentido a introdução no reator de 
enormes quantidades de nitrogênio. Assim, o uso de membranas poliméricas 
(corno o polietileno ou o silicone), além do possível emprego de membranas líqui-
das, poderá significar um enorme avanço nesse campo, corno já ocorre presente-
mente no cultivo de células animais. 
Antes de se passar ao detalhamento dos filtros disponíveis, convém alertar 
q'!le, qualquer que seja o sistema de esterilização do ar que se pretenda empregar, 
deve-se prever um filtro para cada reator, não se devendo optar, no projeto da ins-
talação, por um sistema centralizado de esterilização, seguido da distribuição do 
ar para os vários reatores. Esse procedimento centralizado não é conveniente, in-
dependentemente das dimensões dos reatores e, portanto, das vazões de ar neces-
sárias, pois coloca-se em risco todo o conjunto de reatores, caso ocorra a falha do 
sisternâ de filtração. A eventual economia que se possa fazer, quanto ao investi-
mento inicial, não justifica o risco que se irá correr ao longo da operação da planta. 
5.4.3.1 - Filtros de materiais fibrosos 
Apesar de se observar urna aplicação industrial menos intensa, os filtros de 
materiais fibrosos, particularmente os filtros de lã de vidro, ainda são ,encontrados 
em algumas instalaçõesi razão pela qual serão descritos no presente item. 
Nesses filtros observa-se que os poros ou interstícios e~.1tre as firtras, através 
dos quais ocorre a passagem do ar, são de dimensões maiores do que o diâmetro 
das fibras, empregando-se normalmente fibras com diâmetro médio da ordem de 
3 f.lnl, ou até mesmo fibras de 19 f.lnl. 
Por esse motivo a retenção dos microrganismos suspensos no ar não ocorre 
apenas por impacto direto, ou retenção mecânica, havendo a participação de diver- · 
sos outros mecanismos para a observada eficiência global da camada fibrosa filtran-
te.19Tarnbérn por essa razão a operação é designada corno filtração em profundida-
de, pois as partículas são retidas ao longo de toda a altura da camada filtrante. 
Na Figura 5.8 encontra-se o desenho esquemático de um filtro de lã de vi-
dro, assim corno alguns detalhes necessários para sua instalação. 
Corno se observa, consiste simplesmente num recipiente, normalmente em 
aço inoxidável, com dimensões da ordem de 2 a 3 rn de altura e 1 a 1,5 rn de diâ-
metro, dimensões estas que são variáveis, dependendo da quantidade de lã de vi-
dro que deve acomodar. Na parte inferior conecta-se a tubulação de entrada do ar 
e, na parte·superior, a de saída para o ferrnentador. 
. --~-- ·-·- ---.·-···· .. - .. __ ____. 
Entrada 
do ar -
Salda de 
condensados . 
Métodos para a esterilização de ar 81 
-Ar 
esterilizado 
Figura 5.8 - Esquema de um filtro tradicional de lã de vidro para a esterilização do ar. 
A camada filtrante ocupa a parte central do recipiente, apresentando dimen-
sões variáveis dependendo de uma série de fatores, tais como vazão de ar e diâ-
metro do recipiente (a eficiênçia de coleta de aerossóis depende da velocidade de 
passagem do ar através do leito filtrante e, portanto, depende da vazão do ar e do 
diâmetro do recipiente), compactação da camada filtrante (massa de fibras novo-
lume de filtração), diâmetro da fibra e eficiência de retenção desejada. 19 Apenas 
para se ter uma idéia a respeito da espessura de um leito filtrante desse tipo, po-
dem-se mencionar alturas da ordem de 1,3 a 1,8 m. 
A camada de lã de vidro é sustentada por uma grade de ferro e comprimida 
por uma segund~_ grade, colocada na parte superior da camada filtrante . Após o 
preenchimento do recipiente com a lã de vidro, coloca-se a tampa que veda perfei-
tamente o sistema. Nessa tampa existem hastes que servem para fixar a grade su-
perior, impedindo que ocorra a movimentação da camada · filtrante, quando 
submetida a elevadas vazões de ar. 
O preenchimento do filtro com a lã de vidro deve ser feito de forma muito 
cuidadosa, procurando-se distribuí-la uniformemente em todo o volume disponí-
vel, buscando evitar a ocorrência de zonas contendo menos fibras, o que propicia-
rá a formação de caminhos preferenciais para a passagem do ar. Obviamente esses 
caminhos preferenciais, com menor perda de carga, poderão comprometer a efi-
ciência do filtro. Nesse sentido, um cuidado todo especial deve ser dedicado à 
zona próxima às paredes do recipiente, local especialmente propício para a forma-
ção destes caminhos preferenciais. · 
Justamente para diminuir a possibilidade de formação de càminhos preferen-
ciais, busca-se trabalhar com camadas filtrantes bastante compactadas e, por isso 
mesmo, de menor espessura (menor altura da camada filtrante). Ainda, no caso de 
serem necessárias camadas filttantes muito · espessas, pode-se providenciar a colo-
cação de grades intermediárias ao longo da altura do leito filtrante . 
......_____ __ ·-· - ·-···· -- -·-· ·--- ----~~--- ------------~------~----~------------~.--·-----------
I 
! 
I 
I 
j_ 
82 EsterilizaÇão de ar 
A fim de evitar o deslocamento de fibras, há a possibilidade do uso de lã de 
vidro embebida em resinas e cornpactada em mantas de pequena espessura (por 
exemplo, mantas de cerca de 0,5 em de espessura). O emprego dessas mantas tor-
na o leito filtrante bem menos espesso,em virtude da maior compactação, obten-
do-se urna camada filtrante bem mais regular. 
Essas mantas são colocadas em recipientes corno o esquematizado na Figura 
5.8, se bem que de menores dimensões, sendo também comprimidas corno no caso 
anterior. Para evitar o problema da zona periférica, existem sistemas de vedação 
através de flanges, de forma a impedir a passagem do ar. 
Quando se trabalha com filtros de lã de vidro, sempre se busca fazer com 
que o ar passe através da camada filtrante a urna temperatura superior à ambien-
te, de forma a manter a camada aquecida e evitar a condensação de umidade. Sa-
be-se que urna camada fibrosa umedecida apresenta urna menor eficiência de 
retenção de aerossóis, provavelmente em virtude de urna menor contribuição do 
rnecani~rno de retenção devido à atração eletrostática (cargas elétricas distintas 
entre aerossóis e as fibras, causando atração que contribui para o choque das par-
tículas contra as fibras e sua retenção). 
Por esse motivo, o ar aquecido pela compressão normalmente é resfriado de 
forma a passar pelo leito filtrante a 40 ou 50°C. Alternativamente pode existir na 
parte inferior do recipiente, que contém o leito filtrante, um conjunto de resistores 
elétricos, com a finalidade de aquecer o ar. Esses resistores podem também ser 
empregados para a esterilização do filtro por calor seco, empregando-se, para esta 
finalidade, temperaturas da ordem de 180 a 200°C durante 2 horas. 
Corno seria de se esperar, antes de iniciar o fornecimento de ar para o reator, 
o filtro deve ser submetido a urna esterilização, a fim de evitar que microrganis-
mos aderidos às fibras possam ser arrastados para o tanque. 
Apesar de existir a possibilidade de executar essa esterilização por calor 
seco, conforme mencionado acima, o que evita o umedecimento das fibras, na 
maioria das instalações esta operação é executada através de vapor saturado, 
empregando-se vapor a urna pressão efetiva de 1 kg* I crn2 durante 2 h, ou vapor 
a 3 kg* I crn2 durante 1 h. Nesse caso~ fecha-se a comunicação entre o filtro e o re-
ator e o registro de entrada do ar, introduzindo-se o vapor pela parte superior do 
recipiente (vide Fig. 5.8), deixando-se o registro de saída de condensados inicial-
mente aberto. Após a completa expulsão do ar, operação esta de fundamental 
importância para o sucesso da esterilização, fecha-se esse último registro, permi-
tindo que as condições mencionadas sejam atingidas. 
Terminada a esterilização, passa'-se ar aquecido através da camada filtrante, 
a fim de secar completamente b leito fibroso, obtendo-se desta forma o filtro erri 
condições de operação. 
A esterilização pelo vapor pode causar urna certa contração do leito filtran-
te; especialmente no caso de filtros cjue tenham sido pouco cornpactados. Para 
esse caso, antes de iniciar o fornecimento de ar estéril para o processo, convém 
proceder-se à abertura do recipiente e observação da camada, cornpletando.;se 
com quantidade adicional de lã de vidro, caso seja necessário. Obviamente o filtro 
deve ser submetido a urna nova esterilização. · 
Métodos para a esterilização de ar 83 
Além desse problema, existem outros associados ao uso de vapor. Normal-
mente o filtro deve ser esterilizado ao final de cada processo fermentativo, de for-
ma a se iniciar o processo seguinte em perfeitas condições de segurança. Com isso 
os filtros são esterilizados com muita freqüência (da ordem de uma vez por sema-
na), ocorrendo uma deterioração da lã de vidro, a qual vai se tornando opaca e 
quebradiça, havendo um nítido aumento da perda de carga e diminuição da efi-
ciência de coleta da camaida filtrante (formação de canais preferenciais). Esses fa-
tos também ocorrem com as fibras impregnadas com resinas. 
A ocorrência de fibras quebradiças causa também o arraste de pequenos pe-
daços de fibras, juntamente com a corrente de ar. A perda de eficiência, o aumento 
da perda de carga e esse arraste, obrigam a se providenciar a troca completa da ca-
mada filtrante após algum tempo de operação. Esse tempo depende das condições 
de utilização do filtro, mas pode-se citar, como intervalo razoável, a troca do leito 
filtrante a cada 4 meses, quando se executa uma esterilização do filtro por semana. 
Essa operação de troca do material filtrante é sempre complicada na indús-
tria, pois, como se deve contar com um filtro para cada reator e freqüentemente 
dispõe-se de vários reatores, se estará manuseando lã de vidro com muita fre-
qüência, o que não é apreciado pelos operários incumbidos desta tarefa, aumen-
tando as possibilidades de uma operação não adequada, o que coloca em risco a 
condução asséptica do processo. 
Todos esses problemas permitiram o surgimento de filtros mais adequados, 
no caso os filtros de membranas poliméricas~porosas, que serão abordados no item 
seguinte. Tais filtros encontram hoje grande aplicação, conforme já salientado an-
teriormente . 
. Por essa razão não se pretende, no presente texto, apresentar mais detalhes 
sobre os vários mecanismos de coleta de aerossóis por materiais fibrosos, assim 
como não serão detalhad'os os procedimentos para o dimensionamento dos filtros 
de lã de vidro. Tais detalhes podem ser encontrados, caso o leitor tenha necessida-
de, no texto anterior a respeito desse tema.19 
5.4.3.2 - Filtros de membranas 
Os filtros de membranas microporosas, elaboradas a partir de materiais po-
liméricos, em geral apresentando carac.terísticas hidrofóbicas, prç>porcionam are-
tenção dos aerossóis microbianos na superfície do elemento filtrante, havendo 
portanto a retenção apenas por impacto qireto das partículas contra o filtro, o qual 
apresenta poros de dimensões menores do que os microrganismos a serem reti-
dos. Normalmente· utilizam-se membranas com poros de 0,2 ou 0,22 ~m, ou ainda 
membranas de 0,45 ~m. Essa é a razão pela qual esses filtros são também chama-
dos de filtros absolutos. 
Na realidade, no início do surgimento de alternativas aos filtros de materiais 
fibrosos, uma série de outros materiais foram empregados, como é o caso de metais 
sinterizados (como o bronze e o aço inoxidável), materiais cerâmicos e vidro sinte-
rizado. No entanto, com o decorrer do tempo; praticamente os materiais poliméri-
cos dominaram esse tipo de aplicação, encontrando-se especialmente filtros 
esterilizantes elaborados a partir do politetrafluoretileno (PTFE _,__ "teflon").21 
---·-- ·· · - .. --------·---·-- -·,----·· ··--·- ·· -.-··--·.····-·- ·····-···--.. .. . 
I 
84 Esterilização de ar 
O emprego de materiais poliméricos hidrofóbicos é aspecto de importância, 
pois estes filtros também devem ser esterilizados por vapor, antes do início da 
operação de esterilização d_o ar, havendo ainda a possibilldade da presença de 
umidade no ar a ser esterilizado.-Assim; essa água não deve permanecer no filtro, 
pois isto poderia causar o crescimento de microrganismos na superfície do ele-
mento filtrante, colocando em risco a obtenção de ar esterilizado, além de provo-
car um certo bloqueio à passagem do ar pelos poros, o que significaria um 
aumento inconveniente da perda de carga.6 
Normalmente, esses filtros são fornecidos na forma de discos, ou, mais fre-
qüentemente, para o caso de filtros para a esterilização do ar para instalações de 
grande porte, na forma de cartuchos contendo a membrana filtrante montada so~ 
bre uma estrutura de polipropileno. A Figura 5.9 ilustra a proposta desses filtros 
na forma de discos ou, cartuchos. 
' 
Figura 5.9 - Filtros de membranas poliméricas mieroporosas(gentileza de CUNO INC. - Com. lntertech do Brasil 
Ltda.) 
·~.~-------~-- ___ . ___ :.. _____ .,. __ _ ~-.-· - - --- ---- ·--··-·----
Métodos para a esterilização de ar 85 
Conforme se pode observar, os elementos filtrantes são acomodados no inte-
rior de recipientes em aço inoxidável, sendo que estes recipientes são construídos 
a fim de abrigar um número variável de elementos esterilizantes e, ainda, de di-
mensões distintas. Como se nota na Figura 5.9, o recipientemaior é destinado a 
abrigar vários cartuchos, cada um deles montados unindo-se três cartuchos de 
25,4 em (10") de comprimento. O ar entra e sai pela parte inferior do recipiente, 
sendo que a entrada é feita pela parte externa dos cartuchos, sendo o ar forçado a 
atravessar o elemento filtrante, saindo pela parte interna dos cartuchos. 
Tratando-se de filtros absolutos, em princípio, a retenção dos microrganis-
mos independe da velocidade de passagem do ar, ao contrário dos filtros de ca-
madas fibrosas, mas o aumento da velocidade superficial do ar acarreta um 
aumento da perda de carga no elemento filtrante. Além disso, velocidades exces-
sivas podem provocar vibrações inconvenientes, comprométendo os sistemas de 
vedação. 
O dimensionamento de um sistema: de filtração é tarefa bastante simplifica-
da, pois sabendo-se a vazão máxima de ar a ser empregada no processo (lembran-
do sempre a necessidade de se prever .um filtro para cada reator), pode-se 
especificar um ntJ.mero adequado de elementos filtrantes (cartuchos), que deverão 
ser acomodados no filtro, definindo desta forma uma área adequada de passagem 
deste ar, a fim de se ter baixa velocidade superficial e, portanto, baixa perda de 
carga no filtro (lembrando, também, que a pressão do ar, na descarga do compres-
sor, deve ser suficiente para vencer a coluna:. líquida no interior do reator, a sobre-
pressão na cabeça do reator e, ainda, as perdas de carga distribuídas nas válvulas 
e tubulações). Dessa forma, essa perda de pressão no filtro deve ser a mínima pos-
sível, através da manutenção de v~locidades relativamente baixas (Q = V5.S, onde: 
Q=vazão de ar, V5=velocidade superficial do ar e S=área do(s) elemento(s) filtran-
te(s) para a passagem do ar). 
As várias empresas capacitadas para fornecerem esse tipo de filtro já dis-
põem de propostas adequadas para as necessida~es de uma determinada planta, 
indicando-se nas Figuras 5.10 e 5.il alguns dados a respeito desta perda de pres-
são, em função da vazão de ar, para elementos filtrantes de 25 em (10") ou 100 em 
(40") de comprimento, respectivamente.22 · 
Conforme fica evidente nessas figuras, as perdas de carga são realmente re-
duzidas, e o aumento do comprimento do elemento filtrante, o que significa au-
mentar a área de passagem do ar, permite o emprego de vazões mais elevadas 
com menores perdas de carga. Observa-se, também, em ambas as figuras, que um 
aumento da pressão de entrada do ar para uma mesma vazão, acarreta uma menor 
perda de pressão, o que é devido a um aumento da densidade do gás com o au-
mento da pressão. 
A Figura 5.12 permite uma idéia simplificada a respeito da forma de instalar 
um filtro de membrana em uma linha de fornecimento de ar esterilizado para .um 
biorreator. Normalmente, com a finalidade de aumentar a vida útil do filtro, suge-
re-se a instalação de pré-filtros, construídos com materiais mais grosseiros e de 
baixo custo, a fim de retirar do ar partículas de poeira de maiores dimensões . 
...___ _____ -- ---~-·-···---- - --~--,--. ----~-~----·--·--- - - ---· - - ···- ·· 
86 Esterilização de ar 
Perda de carga (mbar) 
600 r-------~~~------~----------------. 
500 
400 
300 
200 
100 
50 1 00 150 200 250 300 350 400 
Vazao de ar (Nm %> 
Figura 5.1 O - Perda de carga em função da vazão de ar (expressa em metros cúbicos de ar, nas condições normais, 
por hora), para filtro tipo cartucho de I O", da Millipore Co. 
2 
400 
Perda de carga (mbar) 
300 
200 
100 
o 
o tO O 200 300 400 500 600 700 800 
Vaza o de ar (Nm %> 
Figura 5.11 - Perda de carga em função da vazão de ar, para fiH:ro tipo cartucho de 40" de comprimento, da Millipo-
re~.n o 
Como se pode observar, deve-se prever a entrada de vapor a fim de esterili-
zar o filtro, devendo este vapor ser devidamente filtrado, para evitar o acúmulo 
de sólidos na superfíCie do elemento filtrante. Nos instantes iniciais, a válvula de 
dreno do recipiente que contém o filtro (detalhe 1 na Fig. 5.12), deve ser mantida 
aberta para a expulsão do ar, para que se possa atingir a temperatura adequada de 
esterilizaÇão. Também, após a esterilização, passa-se ar peio sistema, permitindo 
que este ar saia pelo dreno de linha (detalhe 2 na Fig. 5.12), a fim de drenar a água 
que tenha ficado retida. Finalmente, pode-se fechar esse dreno e abrir a válvula 
que comunica o filtro com o reator. o 
Válvula 
Métodos para a esterilização de ar 87 
FiHro 
absoluto 
Reator 
Figura 5.12 - Esquema geral para a instalação de um filtro de membrana polimérica (absoluto). 
Não se procede à esterilização de pré-filtros. 
Os filtros existentes no mercado são bastante resistentes à esterilização, ha-
vendo menções da possibilidade de efetuar ·algo como 150 esterilizações a 145°C 
por 30 min. Novamente, supondo-se a execução de uma esterilização por semana, 
isto significaria algo como 3 anos de operação. No entanto, encontram-se suges-
tões na literatura6'15'23 segundo as quais se deve providenciar a troca dos elementos 
filtrantes uma vez por ano, o que significaria algo como 50 esterilizações. Clara-
mente há a possibilidade de operações mais prolongadas, mas deve ocorrer um 
aumento da perda de pressão nos elementos filtrantes, aumento este que depende 
da qualidade do ar que chega à membrana esterilizante. 
A troca dos elementos esterilizantes é muito simples, . requerendo pouco 
tempo para a sua realização. No entanto, tal operação deve ser efetuada com todo 
cuidado, a fim de não se ,danificar a membrana filtrante, além de posicionar ade-
quadamente os anéis de vedação do sistema. Após a operação de troca de cartu-
chos, deve-se efetuar testes de manutenção de pressão interna, a fim de verificar a 
existência de vazamentos, assim como é recomendável a realização de testes de 
efetiva obtenção de ar esterilizado, através do uso de amostradores. 
As diversas empresas fornecedoras desse tipo de filtros, normalmente ga-
rantem a integridade dos seus produtos, pois efetuam testes antes da entrega do 
material, de forma que falhas eventuais, mais freqüentemente, são atribuídas a um 
manuseio não adequado dos elementos filtrantes. 
5.4.3.3 - Filtros HEPA 
Os filtros HEP A ("High Efficiency Particulate Air") são os filtros especial-
mente empregados em câmaras assépticas, ou áreas limpas. São placas de acetato 
de celulose, apresentando24 uma eficiência de 99,97% na remoção de partículas de 
diâmetro médio 0,3 ,.tm, ou ainda elaborados a partir de fibra de vidro, apresen-
tando21 eficiência superior a 99,97% na remoção de partículas superiores a 0,5 ,.tm. 
Normalmente esses filtros são montados com vários elementos filtrantes se-
parados por folhas de alumínio, de forma a se obter uma grande área para a passa-
88 Esterilização de ar 
gem do ar e, desta forma, possibilitar o uso de ventiladores, evitando a necessidade 
de compressores, em virtude da baixa perda de pressão através do leito filtrante . 
Conforme salientado, esses filtros são empregados especialmente em câ-
maras assépticas, registrando-se que presentemente predominam as chamadas 
câmaras de fluxo laminar, ou seja, câmaras nas quais a velocidade de circulação 
do ar é baixa, de forma a se contar com um fluxo em regime laminar. Dessa forma, 
imagina-se que os contaminantes gerados no interior da câmara possam ser retira-
dos deste ambiente pelo próprio fluxo de ar, impedindo que um fluxo turbulento 
possa causar um acúmulo de contaminantes. 
Um exemplo de uma câmara desse tipo está indicado na Figura 5.13, a 
qual ilustra um sistema com circulação vertical de ar. O ar penetra pelo teto da 
câmara, saindo pelo piso da mesma, circulando a uma velocidade da ordem de 
50 cm/s.24 
filtro HEPA 
ventilador grade pré-filtro ventilador 
Figura 5. 13 - Câmara asséptica com fluxo laminar vertical de ar. 
24 
• 
Existem muitas outras idéias a respeito do assunto, conforme o tipo de tra-
balho a ser executado. Assim, existem câmaras de fluxo horizontal, nas quais o ar 
entra por uma das paredes e sai pelo lado oposto. 
Em uma câmarade fluxo laminar, não se deve contar com a presença de um 
número exagerado de equipamentos, ou mesmo de pessoas circulando, pois é fácil 
compreender que qualquer obstáculo provoca turbilhões no ar, não se obtendo um 
fluxo em uma determinada direção. 
Por esse motivo, nas câmaras onde se executá a embalagem de produtos 
com assepsia, não se podeimaginàr um fluxo laminar em toda a câmara, em virtu-
de de suas dimensões. Em alguns casos, tanto quanto possível, introduz-se no in-
terior de uma câmara convencional, no local onde se executa uma determinada 
operação mais delicada, um gabinete ou capela de fluxo laminar, o que torna a 
operação mais segura. 
Tais capelas de fluxo laminar de ar, São presentemente muito comuns em la-
boratórios que manuseiam culturas puras de microrganismos, ou mesmo para a 
··-·--·------·--·--·---;-- ---.-- ---· --. -'-----------·-··--- ···--___,. 
Métodos para a esterilização de ar 89 
execução de transferências de meios de cultura previamente submetidos à esterili-
zação. Na Figura 5.14 indica-se um esquema geral de uma capela desse tipo.24 
Em instantes anteriores à utilização da capela, recomenda-se efetuar uma 
desinfecção das superfícies, empregando-se etanol ou outras soluções desinfetan-
tes, permitindo-se ainda que a capela permaneça fechada durante algum tempo e, 
adicionalmente, ligando-se uma lâmpada ultravioleta para a desinfecção do seu 
interior. Ao iniciar a oper~ção asséptica, desliga-se a lâmpada ultravioleta, acio-
na-se a circulação do ar, tomando-se sempre a precaução de evitar um excesso de 
movimentação no interior da capela. 
O conceito de fluxo laminar encontrou várias aplicações, havendo diferentes 
sistemas operando em distintas condições, como é o caso de operar com velocida-
des de circulação do ar muito baixas, da ordem de 0,1 m/s e até 0,075 m/s.25 
vidraça 
corrediça 
Figura 5.14 - Capela de fluxo laminar. 
24 
ventilador 
ventilador 
Pode-se, inclusive, contar com câmaras de fluxo laminar portáteis, ou seja, 
que podem ser facilmente deslocadas pp.ra locais da indústria onde seja necessária 
uma dada operação asséptica. Essas câmaras são fechadas por uma cortina de ma-
terial plástico, havendo no teto um sistema de distribuição do ar. Esse ar é forneci-
do por uma unidade colocada ao lado da cabine, unidade esta que contém o filtro 
HEP A. Dessa forma o ar circula verticalmente, saindo pela parte de baixo das cor-
tinas. Quando adequadamente operados, esses sistemas portáteis permitem a ob-
tenção de ambientes protegidos, em princípio em qualquer lugar da indústria. · 
...._____ .. - ·-· ··-·· .. ··-·---·------------ -· -----------··· ·------·-- ---- ······- ... ... . 
90 Esterilização de ar 
5.5 - Considerações finais 
Conforme descrito anteriormente, a esterilização do ar para processos fer-
rnentativos que exigem urna rigorosa condução em condições de assepsia, sem dú-
vida encontrou solução mais adequada com o surgimento dos filtros de 
membranas polirnéricas hidrofóbicas, que substituíram os filtros de lã de vidro 
anteriormente empregados. 
No entanto, . deve-se lembrar que esses filtros devem ser adequadamente 
projetados, evitando-se o emprego de velocidades excessivas de ar através da 
membrana esterilizante, a fim de se contar com baixas perdas de pressão. Igual-
mente, deve haver todo o cuidado com a instalação, buscando urna efetiva veda-
ção do sistema, para que não ocorra contato entre o ar esterilizado e o ar 
atmosférico (perfeita vedação do recipiente que contém os cartuchos, perfeita ins-
talação dos cartuchos no recipiente, empregar cartuchos íntegros, utilizar regis-
tros apropriados no trajeto do ar esterilizado, etc.). É sempre útil o emprego de 
pré-filtros, os quais deverão ser substituídos com urna maior freqüência, a fim de 
ampliar o tempo de operação da membrana esterilizante. 
Deve-se, inclusive, lembrar que tanto os pré-filtros corno os filtros deverão 
ser substituídos, havendo a necessidade de um fácil acesso ao sistema, a fim de 
que esta operação possa ser rápida e efetuada com segurança. 
No caso dos processos ferrnentativos contínuos, nos quais espera-se opera-
ção ininterrupta por várias semanas, é interessante a instalação de dois filtros em 
paralelo para cada reator. Dessa forma, pode-se providenciar a esterilização de 
um filtro após certo tempo de operação (urna ou duas semanas, por exemplo), sem 
interromper o processo. 
Finalmente, cumpre destacar a expectativa do surgimento de novos materiais 
que permitam: a operação de separação dos contarninantes do ar atrno~férieo, mas 
também proporcionem um enriquecimento desse gás, permitindo a passagem pre-
ferencial do oxigênio, o que já é possível conforme salientado no textt>; seria po-
rém desejável que pudessem ser aplicáveis em instalações de grande porte. 
Referências bibliográficas 
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L_ ____ -- ---------- -- -- -------- ~--- -------------- --,----------------------------- --- --- ---- ------------, -- ----------
.,., .. ·· 
• 
----- -----~-____. 
93 
Haroldo Hiss 
6.1 - Introdução 
O estudo cinético de um processo fermentativo consiste inicialmente na aná-
lise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sis-
tema de cultivo, em função do tempo de (ermentação. Entende-se como compo-
nentes, o microrganismo (ou a biomassa), os produtos do metabolismo (ou meta-
bólitos) e os nutrientes ou substratos que compõem o meio de cultura. 
Tais valores experimentais de concentração (X, P e S respectivamente), 
quando representados em função do tempo, permitirão os traçados das curvas de 
ajuste, conforme ilustrad'ona Figura 6.1 e indicados por X=X(t), P=P(t) e S=S(t). 
X o 
~~~~------~--~ 
So 
~, .. o 
Figura 6.1 - Curvas de ajuste dos resultados de uma experiência idealizada de fermentação. X, P e S são as con-
centrações do microrganismo, do produto e do substrato residual no meio, respectivamente. 
~------------- --- -----~ ---·- -- ···· ----- --- ·- ··- -·--· 
94 Cinética de processos fermentativos 
Dentre os produtos formados, escolhe-se para o estudo cinético, o produto 
de interesse econômico. Quanto aos substratos, adota-se o denominado substrato 
limitante (comentado no subitem 6.2.3). 
Quando as conclusões sobre um cultivo forem baseadas unicamente em dois 
valores de X, S 0\1 P (como é comum, por exemplo, sobre valores finais e iniciais), 
não se pode afirmar que um estudo cinético do processo tenha sido realizado; é 
necessário, outrossim, o conhecimento dos valores intermediários, que permitam 
definir os perfis dÇts curvas ou a forma matemática destas, para uma análise ade-
quada do fenômeno sob o ponto de vista cinético. 
Assim, tais perfis representam o ponto de partida para a descrição quantita-
tiva de uma fermentação como, por exemplo, a identificÇtção da duração do pro-
cesso, geralmente baseada no instante em que X e P apresentam valores máximos 
(Xm e Prrv na Fig. 6.1). 
Uma vez que esses valores representam parte de um conjunto de dados, ne-
cessários ao dimensionamento de uma instalação produtiva, fica evidente que sem 
o conhecimento da cinética torna-se inviável a transposição de um experimento de 
laboratório para a escala industrial. 
Além desse aspecto, cabe mencionar que a cinética possibilita também uma 
comparação quantitativa entre as diferentes condições de cultivo (pH, temperatu-
ra, etc.), por intermédio de variáveis, como: as velocidades de transformação (su-
bitem 6.2.1) e os fatores de conversão (subitem 6.2.3), obtidos também a partir das 
curvas de ajuste X = X (t), P = P (t) e S = S (t). 
Afirmar que um determinado valor de pH, por exemplo, é melhor que um 
outro, equivale a dizer que o fator de conversão (substrato em produto, por ~xem­
plo) é maior no primeiro que no segundo caso. O mesmo pode ser afirmado quan~ 
do se comparam os desempenhos de cultivos sob diferentes temperaturas, 
diferentes variedades de uma dada espécie de microrganismo, diferentes compo-
sições de meio, etc. 
Convém frisar, entretanto, que os critérios de comparação entre diferentes 
condições são relativos, isto é, dependem do que se espera obter de um determina-
do processo fermentativo. Assim, quando o tempo de duração da fermentação for 
de primordial importância por razões econômicas, as produtividades (subitem 
6.2.1) devem ser empregadas como referências numéricas, em vez de algum fator 
de conversão. 
Outro aspecto que merece atenção é que os métodos comumente utilizàdos 
para a medida da concentração celular X, a saber: turbidimetria ou espectro~oto­
metria, biomassa seca, número total de células, número de células viáveis ou uni-
dades formadoras de colônias, volume do sedimento obtido por centrifugação, 
teor de um componente celular etc., representam uma informação muito simples 
do que ocorre em um fenômeno biológico. 
O microrganismo ou agente ativo promove a transformação dos componen-
tes do meio em produtos, graças às atividades de milhares de enzimas que, por 
sua vez, são sintetizadas pelo próprio microrganismo. Sendo essas sínteses contro-
ladas pelo meio externo (fenômenos de indução e repressão), torna-se.assim muito 
difícil, senão impossível, identificar qual medida ou medidas são realmente repre-
sentativas da transformação em estudo. 
Parâmetros de transformação 9 5 
Essa dificuldade ocorre mesmo nos sistemas mais homogêneos, quando o 
meio de fermentação for límpido, com as células isoladas umas das outras e quan-
do só uma dada espécie de microrganismo estiver suspensa no meio aquoso. 
A questão se complica ainda mais quando o sistema for constituído por uma 
cultura mista e, além disto, contiver sólidos em suspensão (alêm do microrganis-
mo), como nos processos biológicos de tratamento de resíduos domésticos e in-
dustriais. Nesse caso, medidas de sólidos suspensos voláteis, durante tal processo, 
são adotadas como uma avaliação indireta da biomassa presente. Os substratos a 
serem decompostos são simplesmente avaliados pelas determinações conhecidas 
como demandas química e biológica de oxigênio (DQO e DBO, respectivamente). 
Outros sistemas de fermentação, onde as medidas de biomassa são proble-
máticas, compreendem: células suspensas em meio aquoso, porém sob forma de 
flocos ou células filamentosas; células imobilizadas na superfície de materiais 
inertes ou biodegradáveis contidas no biorreator; células na presença de meio, co-
nhecido como semi-sólido, onde a matéria-prima é constituída por .m,aterial amilá-
ceo, por exemplo. Neste último caso, a presença do microrganismo, traduzida pela 
concentração de algum componente do mesmo (como proteína total), não pode ser 
interpretada como se a célula estivesse suspensa no meio aquoso. 
Finalmente, se o material a ser transformado pelo microrganismo (substrato) 
for parcialmente insolúvel no meio aquoso, como hidrocarbonetos líquidos ou só-
lidos, polímeros, minérios, etc., a concentração do substrato não possui significa-
do. Juntamente com essa variável será necessário avaliar a área de interface do 
material insolúvel com o meio aquoso, bem como a sua variação, à medida que o 
microrganismo promove a degradação do mesmo. Trata-se de um aspecto até ago-
ra não resolvido satisfatoriamente, a despeito de alguns método's propostos.1 
6.2 -:- Pa~âmetros de transformação 
6.2.1 - As velocidades instantâneas de transformação 
A Figura 6.1 ilustra as definições das velocidades instantâneas de crescimen-
to ou reprodução do microrganismo, consumo de substrato e formação de produ-
to, traduzidas respectivamente pelas seguintes expressões, para um tempo t: 
dX 
rx=-
dt 
(6.1) 
(6.2) 
dP 
fp =-
dt 
(6.3) 
~-- - ·- -- ·----- ····-~ - - -----··· ·· ---·- --- -- ------- - ___ , ____ .:__ __ ·_--.... --. ..--,.....-.-.---------------- -- ---------~---- ---;----------------- -.:·-· ... - - --------------- --- ------------- .... - -. -- - -·-··-- ···-
96 Cinética de processos fermentativos 
Tais velocidades, traduzidas pelos valores das inclinações das tangentes às 
respectivas curvas (Fig. 6.1) são também conhecidas como velocidades volumétri-
cas de transformação, cujas unidades correspondem a (massa) x (comprimentor3 x 
(tempor1• 
No item 6.3 é apresentado um exemplo de cálculo dessas velocidades. 
Uma definiçãoespecial de velocidade, cujo interesse prático está na avalia-
ção do desempenho de um processo fermentativo, é a produtividade em biomas-
sa, definida por: · 
P - Xm -Xo x-
tf 
(6.4) 
Os termos dessa equação, definidos na Figura 6.1, mostram que a produtivi-
dade representa a velocidade média de crescimento referente ao tempo _total ou fi-
nal de fermentação, tf. 
A mesma definição pode ser aplicada à concentração do produto, denomina-
da produtividade do produto: · 
(6.5) 
onde tfp não é necessariamente igual a tf. A concentração inicial do produto é ge-
ralmente desprezível frente ao valor final ou máximo, P m· 
6.2.2 - As velocidades específicas de transformação 
Devido ao fato de que a concentração microbiana X aumenta durante um 
cultivo descontínuo, aumentando conseqüentemente a concentração do complexo 
enzimático responsável pela transformação do substrato S no produto P, é mais 
lógico analisar os valores das velocidades instantâneas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8) com re-
lação à referida concentração microbiana, ou seja, especificando-as COwJll respeito 
aovalor de X em um dado instante, conforme indicam as expressões: 
(6.6) 
(6.7) 
( 
___ ,.)= 1 dP 
Jlp -·-
--- X dt 
(6.8) 
Essas são denominadas velocidades específicas de crescimento,_ consumo de 
substrato e formação de produto respectivamente, tendo sido GADEN2 o autor 
destas definições. 
----~------------------------------~-~ 
Parâmetros de transformação 97 
6.2.3 - Os fatores de conversão e os coeficientes específicos 
de manutenção 
Com referência à Figura 6.1, considerando um determinado tempo t de fer-
mentação, os correspondentes valores de X, Se P podem ser relacionados entre si, 
através dos fatores de conversão definidos por: 
' ~ 
~~~ ~ -X -Xo (6.9) ,J ~,,~,. "'::is -s 
"'- o ' 
/ 
X-X Yfti> = o 
" '))!_ P-P o 
P-P 
Y~'rs =--o 
t'..t1;>_ 5
0
-S 
(6.10) 
(6.11) 
Se tais fatores permanecerem constantes durante ó cultivo, o que não ocorre 
com freqüência, as três expressões ~nteriores podem ser aplicadas também no 
tempo final de fermentação, ondà ~-X~, ·~~ S d ó, resultando: 
(6.12) 
y - Xm -Xo 
X/P- p -P 
m o 
(6.13) 
Yr;s = Pm -Po (6.14) 
so 
Eliminando-se a grandeza X0 , pela combinaÇão das eqs. (6.9) e (6.12), ob-
tém-se: 
~ i x ~x ·· Y m . ·!X:/S• = s . 
·' 
(6.15) 
como uma forma alternativa para a definição deste fator . A'·eq: (6.15) poderá ser 
~mais conveniente para a avaliação de Y X I S' tendo em vista que as medidas de 
X 0 apresentam, na maioria dos casos, erros experimentais mais elevados do 
queXm:; 
Entretanto, nem sempre o substrato se esgota completamente quando a con-
centração celular apresentar seu valor máximo, podendo ainda existir uma 
' 1 
...___--:- --. ---·- --- -- -·. ------.,......------- - -~.:...---...,..-~-~-.... ~---~--..------------ -- - ---------------------·-------- -----.- -- ------ --- - - ·· --- ·---··------------· ------
,. 
; 
98 . Cinética de processos fennentativos 
concentração residual daquela súbstância no meio de cultura, ao término da fer-
mentação. Isso ocorre porque à medida que o microrganismo se reproduz, são 
formados produtos do metabolismo que inibem o crescimento celular, sem men-
cionar o próprio substrato, que pode dificultar a atividade microbiana (item 6.6). 
O fator de conversão Y XIS foi originalmente definido por MON00,3 tendo 
sido útil na análise de alguns processos. como, por exemplo, na produção de pro-
teínas unicelulares a partir de carboidratos ou hidrocarbonetos. Desde que seu 
valor seja conhecido, é possível calcular o valor de X, a partir de um valor conhe-
cido de S e vice-versa. 
Igualmente útíl é o emprego do referido fator na definição do substrato, de-
nominado limitante. 
Como o próprio nome indica, é o valor da sua concentração inicial S0 que 
definirá a concentração máxima Xm da população microbiana. Em outras palavras, 
em uma outra experiência de um cultivo descontínuo, onde a concentração S0 seja 
inferior à precedente, porém com concentrações idênticas dos demais componen-
tes (incluindo a concentração inicial da biomassa, X0 ), resultará um valor de Xm 
proporcionalmente menor, no final do cultivo. ' 
Isso equivale a colocar a expressão (6.12) sob a forma: 
r- --..... -....,. ~ \. . 
---~ \~)= Yx;s ·Só' + X 0 (6.16) 
No decurso de um cultivo descontínuo, sob condições especiais (meio tam-
ponado, concentração de S não muito elevada, agitação perfeita do meio), é possí-
vel verificar experimentalmente a constância do valor de Y XIS com o auxílio da 
expressão (6.15) sob a forma: ----._, . . 
(' ( ., ~,·· . . ~-· ! 
'·E5\ 'xm•\ Y XI S :,~ ) (6.17) 
.._ , _. " I ·-- ., . ' 
Uma representação dos valores experimentais de X, em função dos valores 
experimentais de S, deverá resultar em uma reta, com coeficiente angular igual à 
Y XIS e a ordenada na origem igual à Xm. 
As mesmas considerações se aplicam aos demais fatores (eqs. 6.10 e 6.11). 
Contudo, se Y XIS' Y XIP ou Y p IS não forem constantes, então somente seus 
valores instantâneos deverão ser levados em conta, ou seja: 
dX 
Yx;s =-·- · 
-àS 
dX 
Yx;P =-
dP 
dP 
Yp;s =--
-àS 
(6.18) 
(6.19) 
(6.20) 
-- --·-··· -··-.-· ·----------
Parâmetros de transformação 99 
Considerando as definições de velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades 
específicas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8), resultam as seguintes relações: 
. rx Jlx 
Yx;s =-. =-
rs Jls 
rx Jlx Yx; r =-=-
rp Jlp 
rp Jlp 
Yr; s =-=-. 
rs Jls 
(6.21) 
(6.22) 
(6.23) 
Ainda, dessas expressões ou das igualdades (6.9),(6.10) e (6.11), tem-se: 
y XI S = y X/P . y P / S (6.24) 
Em fermentações industriais, dificilmente são observados valores constantes 
desses fatores de conversão. Embora dependam da espécie do microrganismo, 
com relação a um determinado substrato, não dependem somente da natureza 
deste; os demais componentes do meio também exercem influência sobre tais con-
versões, bem como o tempo de mistura e a transferência de oxigênio do sistema de 
agitação do biorreator.3 
Além dessas influências, há de se considerar o fenômeno em que as células 
utilizam a energia de oxidação do substrato, não somente para o crescimento, mas 
também para finalidades de maimtenção. 
Em outras palavras,' um determinado consumo de substrato (50 -S), não pro-
duzirá sempre um aumento proporcional na biomassa (X-X0 ), sendo que uma 
parcela da energia, proveniente daquele consumo, é destinada à manutenção das 
funções vitais do microrganismo. 
Essas funções vitais compreendem: o trabalho osmótico para manter os gra-
dientes de concentração de substâncias entre o interior da célula e o seu meio am-
biente, as modificações de componentes celulares que requeiram energia e a mobi-
lidade celular. 
Esse conceito, introduzido por PIRT,4 através do consumo específico para 
manutenção m: 
m = (rs)m 
X 
(6.25) 
onde (rs)m é a velocidade de consumo de substrato devida a manutenção, permite 
combiná-lo -com o balanço material · 
(6.26) 
no que resulta 
L ._ .. . . .. .. ................... .. -.---·----·-.. -- -.. -·-.. ·---~---~---- ----·--~- .... ------·----·--·--.. -·----- ----·--. ___ ...... ... ....... _ 
I 00 Cinética de processos fermentativos 
rs =(rs)c +m ·X (6.27) 
onde (r5)c se refere ao consumo do substrato, destinado somente ao crescimento 
ou reprodução microbiana. r5 é o consumo global observado, tàl como é definido 
pela expressão (6.2). 
Com a definição de um novo fator de conversão: 
Y
, rx 
. X/S =--· 
(rs)c 
e sua introdução na eq. (6.27), tem-se 
rx 
rs =-, -+m·X 
· Yx;s 
ou, de acordo com as eqs. (6.6) e (6.7): 
Jlx 
Jls =--+m 
YX:;s 
(6.28) 
(6.29) 
(6.30) 
Note que se m=O, Y'x;s coincide com a definição de Yx;s da eq. (6.21). Esse 
fator, definido pela eq. (6.28) é algumas vezes denominado fator de conversão 
"verdadeiro". 
Se Y'x;s em forem constantes, a relação entre Jls e Jlx deverá ser linear. Esta 
- nova definição do fator de conversão, aliada ao coeficiente específico de manuten-
ção, é mais geral do que a eq. (6.21), possibilitandoassim que ~m maior número 
de processos fermentativos apresentem valores constantes de Y'x;s em. 
Uma generalização mais ampla ainda,5 pode ser introduzida no balanço da 
eq. (6.26), ao ser considerada mais uma parcela de consumo de substrilto, ou seja, 
na formação de produto, (rg)p: 
(6.31) 
onde (rs)cp e (rs)!nP são as velocidades de consumo de substrato para o crescimen-
to e manutenção, respectivamente levando em conta a formação de produto. 
Introduzindo: 
Y , - rp .·· P/S ---
(rs}p 
e um novo coeficiente específico de manutenção 
· (rs)mP 
mp = X 
bem como um novo fator de conversão para o crescimento 
(6.32) 
(6.33) 
Cálculos das velocidades I O I 
Y " rx (6.34) XIS=---
(rs)cp 
· resulta, com a (6.31): 
. rx rp 
·' 's =--+--+mp ·X 
Yx;s Yr;s 
(6.35) 
ou, com as equações 6.6, 6.7 e 6.8: 
f.lx f.lr f.ls =--+--+mp 
Yx;s Yr;s 
(6.36) 
Uma regressão linear múltipla com três variáveis {f.ls, f.lx e f.! r) poderá ser 
verificada, se os fatores e o novo coeficiente mp forem constantes ou se este último 
for desprezível. · 
Pode-se, enfim, estender o balanço com a inclusão de termos adicionais, 
referentes a outros produtos do metabolismo (incluindo aqueles presentes nos 
gases de saída do biorreator), cujos valores experimentais sejam conhecidos, re-
sultando com isto novos valores dos fatores de conversão e do coeficiente de 
manutenção. 
Do exposto, verifica-se assim que as conclusões a respeito de um determina-
do cultivo dependem muito da quantidade de dados experimentais disponíveis 
sobre o sistema. · 
6.3 - Cálculos das velocidades 
Pelas definições apresentadas nos subitens 6.2.1 e 6.2.2, conclui-se que os 
cálculos das velócidades e velocidades específicas 'de transformação necessitam, 
em primeiro lugar, dos traçados das curvas a partir dos pontos experimentais (Fig. 
6.1). 
Esses traçados ou ajustes podem ser realizados manualmente, com progra-
mas de computador ou através de curvas representadas por equações conhecidas. 
Iniciaremos pelas considerações referentes aos traçados manuais, ficando os j 
comentários dos ajustes com equações para o final deste item. I 
O traçado manual exige um bom conhecimento do processo em estudo. l 
Como uma experi~ncia inicial, deve-se ter em mente que para um grande número 
1
! 
de casos os perfis apresentados na Figura 6.1 são característicos, isto é, as curvas 
de formação do microrganismo (X= X(t)) e do produto (P = P(t)) exibem a forma j 
"S" ou sigmoidal crescente, enquanto a do substrato residual no meio (S = S(t)) se I 
caracteriza pelo perfil em "S" decrescente. ·! 
~··cu::•:~~:;;~::~:_n_:m_x_:=,-~_~.:~~_:_:~;~~:~~::.ocoinci:r, istoé,:m:s _ . J 
I 02 Cinética de processos fermentativos 
100+"-··---
s 
80 
40 
20 
· o 2 4 s 6 
Tempo (h) 
8 
40 
20 ::::J s· 
0.. 
o 
x · 4 
3 
2 
10 
Figura 6.2 - Resultados obtidos em uma fermentação alcoólica. S, concentração de açúcar; P, concentração de 
etano!; X, concentração de levedura (expressa em gramas de matéria seca por litro), segundo BORZANI.6 
Para exemplificar o cálculo das velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades 
específicas (expressões 6.6, 6.7 e 6.8), estão representados na Figura 6.2 os resulta-
dos experimentais obtidos em uma fermentação alcoólica descontínua. 6 ' 
Para t = 5 horas, por exemplo, a velocidade de consumo de açúcar é calcula-
da pela inclinação da reta tangente AB à curvaS= S(t), a saber: 
_ dS = 100-70 = 30g I L = 7,9g I L. h 
dt 7,1-3,3 3,8h 
• 
onde os valores numéricos de cada parcela co.rrespondem às coordenadas dos 
pontos arbitrários A e B, escolhidos sobre a reta. 
De modo semelhante, para as velocidades de produção de etanol e cresci-
mento da levedura, no instante t = 5 h tem-se, respectivamente: 
dP = 20-0,0 =20giL = 4,0giL·h 
dt 8,3-3,3 5,0h 
dX 4,0-2,0 
dt 6,2-1,8 
2,0giL =045 IL · h 
4 4h I g 
I 
calculadas com as coordenadas dos pontos arbitrários sobre as retas C,D e E,F res-
pectivamente. · 
A curva de cresdmento microbiano I 03 
Por outro lado, para t = 5,0 h tem-se X= 3,5 g/L (Figura 6.2). Assim, os valo-
- res das velocidades específicas de consumo de açúcar, produção de etanol e cresci-
mento da levedura, no instante t = 5 h, serão, respectivamente: 
= 7,9 =2 3h-1 
J.l. 5 3/5 I i 
-4,0 -llh-1 
Jlp - 3,5- I 
- 0,45- o 13h-1 
e J.l.x- 3,5 - ' 
Esses cálculos, aplicados em cada instante de fermentação, permitem deter-
minar as formas das funções J.l.s = J.l.s (t), J.l.p = J.l.p (t) e J.l.x = J.l.x (t), cuja utilidade será 
comentada no item 6.5. 
Cumpre frisar que o cálculo das mesmas depende não somente dos ajustes 
manuais efetuados (Fig. 6.2), mas também do traçado das retas tangentes, em um 
dado instante t do cultivo, 
Essa última operação, tão subjetiva quanto os ajustes manuais, pode ser efe-
tuada por outros métodos, que devem atenuar as discrepâncias entre os resulta-
dos de cálculo de um mesmo conjunto de dados experimentais, provenientes de 
operadores diferentes. 
O leitor interessado poderá consultar a bibliografia específica a respeito dos _ 
métodos gráficos para o traçado das tangentes/ o método geométrico8 e os ajustes 
baseados em equações, cujas derivadas possibilitam também os cálculos das velo-
cidades de transformação e velocidades específicas.9'10 Os critérios estatísticos 
. para a escolha dessas equações, 11'12'13 bem como os erros que afetam as medidas 
dessas velocidades,14'15'16 são encontrados na literatura. 
No final deste capítulo, encontra-se no Apêndice um exemplo de cálculo 
através do método geométrico} com auxílio de uma planilha eletrônica. 
6.4 - A curva de crescimento microbiano 
Após a inoculação de um meio de cultura, favorável ao desenvolvimento do 
mi~rorganismo em estudo, sob temperatura controlada e agitação adequada, ob-
serva-se um comportamento nos valores da concentração celular, conforme indica 
a Figura 6.3. 
As seguintes fases no crescimento são observadas: 
Fase 1 -Conhecida como fase "lag" ou de latência, que se segue imediata-
mente após a inoculação do meio com o microrganismo em questão. Trata-se de 
um período de adaptação durante o qual a célula sintetiza as enzimas necessárias 
ao metabolismo dos componentes presentes no meio. 
Purante essa primeira fase, não há reprodução celular e, assim, X = X0 = 
constante. 
A duração dessa fase varia principalmente com a concentração do in óculo (e . 
portanto com o valor de X0 ), com a idade do microrganismo (tempo de pré-cul-
tivo) e com o seu estado fisiológico. · · 
./ 
i-_-~- --- ---- ---- ---- - - --------~-----~~-- -----------'----~----------:-- - --------c~----------- ----- ------ ---------··-··----:--:----:-----
I 04 · Cinética de processos fennentativos 
X ................................................. . 
m 
X ...................................... . 
d • 
A 
Xc ............................ . 
X;················, 
Xo i 
o 1 i 2" i 3 i 4 i 5 j 6 7 
xm ················<···········r·······r·········-"'---
xc : : . 
-~ ········r······r········· B 
l l 
:~ + I 
o 
Figura 6.3 - Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontínuo, representada em ordenadas lineares 
(A) e semilogarítmica (8). As sete fases estão descritas no texto. 
Com efeito, se as células forem pré-cultivadas em um meio de. composição 
diferente, o tempo referente ao fenômeno de indução podê ser apreciável; caso 
contrário, é possível que tal fase não exista. . . 
Fase 2 -:- Essa é a fase de transição (Fig. 6.3) em que se observa o início da re-
produção microbiana propriamente dita. 
Há um aumento gradual, tanto da velocidade de reprodução (eq. 6.1) como 
da velocidade específica de crescimento (eq. 6.6), onde nem todos os microrganis-
mos completam a fase anterior simultaneamente. No fim dessa fase, a população 
inteira começa a se dividir em um intervalo regular médio de tempo (eq. 6.41). 
Fase 3 - É denominada fase logarítmica ou exponencial onde a velocidade 
específica de crescimento (J..tx =J..tm) é constante e máxima. Nessas circunstâncias, a 
eq. 6.6 permite concluirque a velocidade de crescimento é diretamente proporcio-
nal à concentração X, isto é: 
dX 
-=J..t · X dt m 
(6.37) 
A curva de crescimento microbiano I O 5 
Uma integração da equação 6.37, entre o início dessa fase (de coordenadas 
(ti, Xi), Fig. 6.3) e um instante arbitrário t, compreendido entre ti e te resulta em: 
' 
X ln- = 11 o (t- t o) X - rm 1. 
I 
(6.38) 
ou 
(6.39) 
Desse modo, pela expressão 6.38, uma representação sem:ilogarítmica da 
concentração celular com o tempo de cultivo deverá resultar em uma reta (Fig. 
6.3.:B), válida até te, também denominado tempo crítico. 
Ao lado da velocidade específica f.!m, a fase exponencial também é caracteri-
z~~a freqüentemente pelo tempo de ge:ação tg, que é o intervalo de tempo neces-
sano para dobrar o valor da concentraçao celular. · 
Aplicando esta definição na eq. 6.38, tem-se: 
2·X · ln--1 :::::11 ·t X - rm g 
I 
(6.40) 
ou 
ln2 0,693 
f.!m=--=--
tg tg 
(6.41) 
Da equação (6.41), conclui-se que o tempo de geração é constante, pelo fato 
de f.!m ser constante nesta fase. 
Para certas bactérias o tempo de geração é relativamente curto, como no 
caso da Escherichia coli, que pode apresentar um valor da ordem de 20 minutos na 
temperatura de cultivo em 37°C. Outras bactérias, do tipo termófilas, cultivadas a 
55°C, chegam a apresentar um tempo de geração de cerca de 15 minutos. 
Para as leveduras, o valor mínimo está compreendido entre 1,5 e 2 horas. 
Uma interpretação para a existência da fase logarítmica ou exponencial de . 
crescimento, é apresentada no subitem 6.6.1. 
Fase 4 - Conhecida como fase linear de crescimento, por apresentar a veloci- · 
dade de reprodução constante(rx = rk, na eq. 6.1). Essa fase pode ocorrer sem a pré-
via existência da fase logarítmica, como é o caso de microrganismos filamentosos, 
onde h
1
á limitaçdão no tfra~dsporh~ de nutrient~s ddo ~~i~pdara o inf terio(dr da céludla. d I 
ntegran o a re en a equação a partu o rmcw essa ase e coor ena as l 
(te, Xc), Fig. 6.3) e um instante arbitrário t, compreendido entre te e td, tein-se: I 
(64~ - - J 
lo..__~- - ·- ....... --- · -- .... - -------- --· .--------------- - -·---------'------~--·-- · ............ ............... ' .. ---- ... --- . .. - c· ........ ------- -- --- - ·- - --
I 06 · Cinética de processos fennentativos 
ou 
(6.43) 
Da equação 6.43, deduz-se que a concentração celular X é uma função linear 
do tempo de cultivo t (Fig. 6.3-A), justificando-se assim a denominação de cresci-
mento linear para esta fase. 
Contrariamente à fase exponencial antes comentada, a velocidade específica 
de crescimento não é constante na fase linear, conforme se pode deduzir das equa-
ções 6.6 e 6.43: 
2_ dX=~= rk 
X dt X rk ·t+Xc -rk ·te 
o (6.44) 
De acordo com essa equação, a velocidade específica decresce com o aumen-
to da concentração celular e, portanto, com o tempo t de cultivo. 
A existência do crescimento linear indica, conforme mencionado, a presença 
de certas limitações no transporte de nutrientes à interface microrganismo-meio 
como, por exemplo, com respeito ao oxigênio dissolvido no meio. 
REUSS e WAGNER10 verificaram que um aumento no coeficiente volumétri- · 
co de transferência do oxigênio dissolvido, entre o meio e a citada ·interface, pro-
vocava o desaparecimento do crescimento linear. 
Outro caso de limitação do transporte de nutrientes ao microrganismo ocOr-
re quando este se desenvolve na forma de um biofilme, imobiliz~do na superfície 
da parede do reator, ou sobre partículas sólidas em suspensão, empregadas como 
suporte. 
Modelos que interpretam o crescimento celular nesses _sistemas são encon-
trados na literatura.10 • Fase 5 - Desaceleração. Devido ao esgotamento de um ou mais componentes 
do meio de cultura, necessários ao crescimento e, também, devido ao acúmulo de 
metabólitos inibidores, ambas as velocidades (de crescimento, eq. 6.1 e específica, 
eq. 6.6) diminuem até se anularem, no tempo tf. 
Durante essa fase, o tempo de geração aumenta no decurso do cultivo, pois 
nem todos os microrganismos se reproduzem em intervalos regulares de tempo. 
Fase 6- Estacionária. Nessa fase, X atinge o valor máximo e constante Xm 
(Fig. 6.3), onde há um balanço entre a velocidade de crescimento e a velocidade de 
morte do microrganismo, ocorrendo também modificações na estrutura bioquími-
ca da célula. 
Fase 7- Declínio ou lise. O valor da concentração celular dimiimi a uma ve-
locidade que excede a velocidade de produção de células novas. 
Pode-se observar, às vezes, entre a fase anterior e a de declínio, um período 
de transição apresentando uma diminuição logarítmica na referida concentração. -
Ocorre, durante o declínio, uma "lise" celular, autólise ou rompimento dos 
microrganismos, provocado pela ação de enzimas intracelulares. --------
Classificação dos processos fermentativos I 07 
6.5 - Classificação dos processos fermentativos 
Os comportamentos relativos das funções f.1 = f.l(t), fornecem a base para 
uma importante classificação dos processos fermentativos proposta por GADEN2 
(subitem 6.2.2). 
As Figuras 6.4, 6.5 e 6.6 representam, esquematicamente, a variação das ve-
locidades específicas para t;rês tipos característicos de fermentações . 
No primeiro caso (Fig. 6.4), as velocidades específicas de consumo de açúcar 
(f.ls) ~a produção de etanol (f.lp), apresentam perfis semelhantes, correlacionando-se 
assim muito bem. A veloc;idade específica de crescimento (f.lx) do microrganismo 
apresenta, aproximadamente, o andamento das outras duas curvas. Diz-se então que 
a formação de produto (o metabólito primário) está associada ao crescimento. 
Essa configuração representa o caso em que o produto formado (o metabóli-
1 
to primário) está diretamente ligado às reações do catabolismo ou decomposição 
do substrato (os açúcares) . 
Consumo de 
açúcar 
~ 
Crescimento 
Tempo 
Figura 6.4 - Variação das velocidades específicas em uma fermentação alcoólica. 
As produções de certas vitaminas e aminoácidos também se enquadram nes-
se tipo de cinética de fermentação. 
No segundo caso (Fig. 6.5), observam-se duas fases distintas: uma 1ª- fase, 
onde a velocidade específica de consumo do açúcar está diretamente relacionada à 
de crescimento do microrganismo, não havendo praticamente formação do produ-
t~ (ácido cítrico); uma segunda fase, em que há uma boa semelhança entre os per-
fís das três velocidades específicas e que portanto se correlacionam bem. Esse é o 
caso conhecido como formação do produto parcialmente associada ao cresCimen-
to; sua formação não está diretamente ligada ao caminho metabólico produtor de 
energ"ia. · · · 
. I 08 Gnética de processos fermentativos 
~ 
&;:::: 
u 
Q) 
c. 
C/) 
Q) 
Q) 
-o ro 
-o ·c:; 
o 
~ 
Tempo 
Produção 
de ácido 
/ 
Figura 6.5 - Variação das velocidades específicas em uma fermentação cítrica. 
B 
<+= 
'õ 
Q) 
o. 
Ul 
Q) 
Q) 
'C 
. lll 
'C 
"õ 
o 
~ 
Tempo 
• 
Figura 6.6 - Variação das velocidades específicas em uma fermentação penicilínica. Curva I -produção de antibió-
tico; curva 2 - consumo de açúcar; curva 3 - consumo de oxigênio; curva 4 - crescimento do microrganismo. 
Além da produção do ácido Cítrico por fermentação, pode-se incluir a do áci-
do lático comopertencente a este grupo. 
Neste particular foi obtida uma expressão empírica por LUEDEKING; PI-
RET/7 que relaCionaram a velocidade específica de formação do ácido lático (J.lp), 
Classificação dos processos fermentativos I 09 
com a velocidade específica de crescimento do microrganismo (~x), na produção 
descontínua desta substância pelo Lactobacíllus delbrueckii em pH consta_t1te, a sa-
ber: · .· ·· · 
Jlp=a·~x+~ (6.45) 
Essa equação, onde 0; e ~ são constantes empíricas funções do pH, indica a 
existência de dois mecanismos de produção de ácido lático: um deles associado à 
reprodução de bactérias (representado pela parcela a · ~ x) e outro independente 
do crescimento do microrganismo (representado pelo termo~). 
Finalmente, no terceiro caso, se enquadram asfermentações complexas, aqui 
exemplificadas pela produção de penicilina (Fig. 6.6). A máxima velocidade espe-
cífica de produção do antibiótico ocorre quando as demais velocidades específi-
cas, indicadas na Figura 6.6, sofreram uma redução significativa. No começo da 
fermentação predominam transformações produtoras de energia com formação de 
biomassa, sendo que o antibiótico é formado quando o metabolismo oxidativo se 
encontra atenuado. 
Obviamente, nesse grupo de fermentações não há uma associação clara en-
tre as referidas velocidades que permita estabelecer alguma relação cinética defi-
nida, como no caso da eq. (6.45). O produto formado é historicamente denomina-
do como metabólito secundário. 
Além dos antibióticos, as toxinas microbianas pertencem a esse grupo. 
É importante frisar que esta classificação não enquadra, de um modo abso-
luto, um determinado processo fermehtativo em um dos três grupos antes citados. 
Como exemplo, merece ser comentado novamente o caso da fer~entação al-
coólica onde, dependendo das condições de operação, a produção do etanol pode-
rá não estar inteiramente associada à reprodução do microrganismo e ao consumo 
de açúcar, enquadrando-se' assim no segundo caso18 (Fig. 6.5) em vez de no prime-
iro (Fig. 6.4). 
Caso semelhante é observado na produção do butanodiol por Klebsiella pneu-
moniae, em cultivo contínuo19 a partir da glicose onde, dependendo do valor da ve-
locidade específica de crescimento (abaixo ou acima de 0,18 h-l),o processo é do 
tipo inteiramente associado ao crescimento ou independente do mesmo, respecti-
vamente. 
Outra classificação, baseada nas associações entre formação do r,roduto ·com 
mic~~mismos em reprodução ou não, é devida a KONO; ASAI/0'2 '22 que apre-
sentam três grupos característicos: 
• processos em que a formação de produto está associada apenas à ativida-
de de células em reprodução como, por exemplo, na produção de sorbose. 
• processos em que a formação de produto está associada à atividade de to-
das as células, em reprodução ou não, citando-se como exemplo a produ-
ção de ácido lático. 
• processos em que a formação de produto está associada apenas à ativida-
de das células que não se reproduzem, como no caso da produção de áci-
do cítrico e novobiocina. 
i i 
......___ __ _ .. ··- ------···----------- ------------·-·-·-,--·--'---------·-··- ---·:-· --··--· -----.-·- -·----------·- ·---------·- :- -· . ·; ; __ :li 
I I O Cinética de processos fermentativos . 
. 6.6 - Influência da concentração do substrato sobre 
a velocidade específica de crescimento 
6.6. I - A equação de Monod: interpretação da fase exponencial 
de crescimento 
A seguinte equação empírica, proposhipor MONOD/3 tem sido comumente 
empregada para explicar a relação entre a concentração 5 do substrato limitante 
no meio, com a velocidade específica ~xde reprodução do microrganismo: 
. (6.46) 
onde ~m representa a máxima velocidade específica de crescimento ou reprodu-
ção, e K5 a constante de saturação, cujo significado será comentado a seguir. 
Na Figura 6.7 está representada a eq. de Monod. O significado de Ks pode 
ser deduzido fazendo-se 5 = Ks na eq. (6.46). Resulta imediatamente que: · ~X = 
~m/2, isto é~ a referida constante representa a concentração do substrato na qual a 
velocidade específica de crescimento é a metade do seu valor máximo. 
~m ---------- ----- ----- - ----------------- ~ --- -
0,10 
o~.--.-.-.~.-r-.-.--.-.----
0 0,50 1,00 
S(mg/L) . 
·Figura 6.7 - Equação 6.46 para Jlm = O, 14 h-1 e Ks = 0,60 mg/L (valores hipotéticos). 
Esta condição está assinalada na Figura 6.7 onde, para Ks = 0,60 mg/L, 
tem-se ~X= ~m/2 = 0,07 h~l. 
A expressão de Monod é formalmente igual à expressão de Michae-
lis-Menten (capítulo 7, volume I). 
No início do cultivo, onde 5 é alto, o microrganismo apresenta uma velo-
cidade específica próxima à máxima, podendo a mesma situar-se nesta região 
durante uma boa parte do processo, mesmo que o metabolismo celular provoque · 
uma diminuição apreciável no valor de S. 
·-·-···- ·--·· ·· - ----~-____. 
Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento I I I 
_ Quanto menor for o valor da constante de saturação K5, tanto mais amplo 
será este ·"patamar" quase horizontal da curva e que se encontrará mais próximo 
do valor de f.lm, conforme ilustra a Figura 6.8 (curva A). 
Embora, a rigor, pela equação 6.46, nunca seja atingido o valor de f.lm, por 
mais alta que seja a concentração inicial S, na prática, os valores experimentais po-
dem ser considerados como tal, tendo em vista os erros que afetam os valores cal-
. culados da velocidade espe.cífica de crescimento.15'16 . . 
Nessas circunstâncias, a curva · apresentada pela velocidade específica de 
crescimento em função do tempo (Figura 6.9), poderá apresentar um trecho máxi-
mo constante (AB), após um curto período inicial de transição ou adaptação do 
microrganismo ao meio. 
Essa fase inicial do crescimento (O a 4 horas, Fig. 6.9), corresponde à fase 1 
("lag") e à fase 2 (de transição) da Figura 6.3, não previstas pela expressão de Monod. 
A citada expressão (6.46) considera f.lx elevado e próximo do valor máximo, 
logo que o microrganismo é colocado na presença de um meio, com uma concen-
traçap inicial de substrato relativamente elevada. O microrganismo é, nessas cir-
cunstâncias, considerado adaptado. 
Uma baixa constante de saturação Ks implica em uma maior duração da fase 
exponencial, conforme ilustra a Figura 6.8: para Ks = 0,60 mg/L, os valores de f.lx 
logo se distanciam de f.lm, à medida que o substrato vai sendo consumido; para K5 
= 0,030 mg/L, f.lx é praticamente igual à f.lm para uma mesma variação de S (entre 
1,20 e 0,50 mg/1). 
Assim, a duração do "patamar" AB (Fig.-6.9), dependerá da magnitude desta 
constante de saturação, 
-----------------------------------------------------
A 
0,10 
~mn- --- --------------- --·-· : 
' ' 
o 
KsA j Kss 
"" o 0,50 1,00 S(mg/L) 
. Figura 6.8 - Equação 6.46 para os valores hipotéticos de: Jlm =O, 14 h- 1, K5 = 0,60 mg/l. (curva 8), Ks = 0,030 
mg/l.(curva A). · 
~----- -.. ------ ---- -------~---- - -- : ____ ____ _: __ ~~-- -------~-- - -- -- ~ ~--~,-------. ---------------- - -- ---· ....... . ----------------·--:·-- .. : ... ~ _j 
I 12 Cinética de processos fermentativos. 
flx 
(h-1) 
0,10 
A B 
tg 
(h) 
50 
o~----~~~--~~o 
o 4 8 12 
t (h) 
Figura 6.9 - Variação da velocidade específica de crescimento (1-lx) e do tempo de geração (tg), 
no cultivo descontínuo. 
6.6.2 - Outros modelos 
A expressão de Monod (eq. 6.46) é um modelo que não leva em conta o efei-
to inibidor, tanto pelo substrato como pelo produto formado. Essa, porém, não é 
a única interpretação referente a uma tal condição ideal de cultivo. 
Outras equações foram propostas10 e que merecem ser citadas: 
• equação de Teissier (6.47) 
• Moser (6.48) 
• Contois e Fujimoto 
s 
• (6.48) 
• Powell 
s 
fl x = ~ m . -(K_s_+_K_o_)_+_S (6.50) 
Há pelo menos mais seis outras expressões, propostas por outros autores, 
também citadas na mesma referência10 e que não levam em conta ofenômeno da 
inibição. 
A ausência da inibição é, na verdade, uma situação pouco comum na práti-
ca, principalmente durante um cultivo descontínuo, onde há um crescente acúmu-
lo de metabólitos que acabam interferindo desfavoravelmente sobre o metabolis-
mo e crescimento microbianos. 
O problema poderia ser atenuado se fosse, por exemplo, utilizado um valor 
inicial relativamente baixo da concentração de substrato e que assim resultasse em 
baixas concentrações de produtos inibidores. 
Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento I 13 
Essa é, entretanto, uma alternativa pouco interessante do ponto de vista in-
dustrial, onde baixas concentrações de produtos acarretariam custos elevados, na 
fase posterior de separação e purificação da substância de interesse. 
Nessas circunstâncias, a inibição pelo substrato é um fenômeno que não 
podeser ignorado. 
O efeito do substrato se manifesta quando um valor alto da concentração 
inicial S pode, ao invés de áproximar flx de flm (como nas Figs. 6.7 e 6.8 ), provocar 
um efeito contrário, ocasionando uma inibição no crescimento celular. 
Este fenômeno está ilustrado na Figura 6.10, onde se pode verificar que a ex-
pressão de Monod (eq. 6.46) somente se aplica para valores relativamente baixos 
de S, menores ou iguais a K5. Acima deste, onde a inibição pelo substrato se mani-
f~s~, a curva tende para flm até um certo valor de S, para depois se afastar, a par-
tu .deste valor. 
,...m - - - - - :... =- -=- --- -
A 
ks ..J k~ . kl,s kí.s S 
Figura 6.10 - Cinética de inibição pelo substrato (curva A) e sem inibição(---; eq. 6.46). 
Com o objetivo de explicar essa redução na velocidade específica de cresci-
mento (!lx), provocada pelos altos valores iniciais da concentração de substrato 
(S), uma modificação na expressão de Monod (eq. 6.46), foi proposta:10 
S KI,s· 
flx =flm. Ks +S KI,S +S 
(6 .51) 
Nessa nova expressão, que traduz o andamento da curva A (Fig. 6.10), K5 é a 
constante de saturação definida pela eq. (6.46). 
K1 5, por outro lado, é a constante de inibição pelo substrato que se refere, 
como K~, ao valor de S para o qual flx = flm/2, porém para um valor de S que pro-
voque a inibição, sendo assim superior ao correspondenteS da equação de Monod. 
Para uma melho; compreensão da influência do valor de K1,5 sobre o efeito 
inibidor do substrato, é oportuno analisar o fator K1,5 / (K1,5 + S), da equação 6.51 
sob a forma: 
1 
s 
1+ - -
Kr,s 
-------- -.-----~----~------- ~-- ----- ----
(6.52) 
I .I 
I 
I 
I 
' . 
' ' ~ . 
I 14 · Cinética de processos ferrnentativos 
Se K1,s >> S, então: SI K1,s =O e a equação anterior se reduz à unidade. Con-
seqüentemente a eq. 6.51 se transforma na 6.46, não existindo assim o efeito inibi-
dor do substrato sobre o crescimento. 
Em outras palavras, um valor relativamente alto dessa constante (K1,5) re-
quer igualmente valores muito altos de S para que o efeito inibidor se manifeste 
(eq. 6.52, menor do que um), ou seja, a inibição pelo substrato poderá ser pouco 
pronunciada. Inversamente, valores baixos de K1,5, representam um substrato 
muito inibidor perante uma dada espécie de microrganismo. 
Quanto à inibição pelo produto, um equacionamento semelhante foi realiza-
do por JERUSALIMSKY e NERONOV A: 10 . 
s Kl,P 
f.lx =f.lrn. K
5 
+S Kl,P +P 
(6.53) 
sendo que as considerações prévias, referentes à eq. (6.52), também se aplicam 
nesta expressão, mas levando em conta unicamente o efeito inibidor pelo produto, 
representado pela sua concentração P, n,o meio. Mais informações sobre as expres-
sões (6.51) e (6.53), assim como outros modelos de inibição, poderão ser encontra-
dos na literatura.10 
Agradecimentos 
O autor agradece aoEngenheiro (Mestre em Engenharia Química) Andreas 
Karoly Gombert pela elaboração do Apêndice e à Engenheira (Mestre em Enge-
nharia Química) Júlia Baruque Ramos, pelo trabalho de datilografia. 
Apêndice 
Andreas Karoly Gombert 
. Para ilustrar uma forma bastante prática e simples de calcular velocidades 
específicas a partir de dados experimentais de cultivos de células, será apresen-
tada uma planilha em Microsoft Excel que contém as equações do método geo-
métrico de cálculo de derivadas proposto por LE DUY; ZAJIC.8 O objetivo não é 
apresentar detalhes sobre esse método, mas apenas ilustrar como o mesmo pode 
ser utilizado; para obter detalhes do método, sugere-se consultar a referência 
original. 
Apêndice I I 5 
A) Apresentação da planilha 
No artigo original escrito por LE DUY; ZAJIC,8 é apresentada uma sub-rotina 
em Fortran para o cálculo de velocidades específicas. No entanto, em função da fa-
cilidade e praticidade no uso de planilhas eletrônicas, como é o caso do Microsoft 
Excel, torna-se bem mais simples calcular velocidades específicas lançando mão 
--~deste tipo de planilha. No Quadro 6.1, são apresentadas as equações de uma plani-
, ·lha que executa o cálculo de velocidades específicas. 
Alguns cuidados devem ser tomados para o bom funcionamento da planilha: 
1) A primeira linha de equações é diferente das outras. A partir da segunda linha 
de equações, existe repetição das mesmas. Portanto, basta copiar a segunda li-
nha de equações para o número de linhas que forem necessárias ao número de 
dados de entrada disponíveis. 
2) Deve-se manter uma linha em branco após a última linha de entrada de dados, 
sendo esta a forma utilizada pela planilha para que possa ser calculada aderi-
vada no último ponto. · 
3) A coluna B deverá conter sempre dados de concentração celular. A coluna C 
poderá conter dados de concentração celular, caso se deseje calculara veloci-
dade específica de crescimento; dados de concentração de substrato, caso se 
deseje calcular a velocidade específica de consumo de substrato; dados de con-
centração de produto, caso se deseje calcular a velocidade específica de forma-
ção deste produto. 
4) Após a entrada das equações (conforme Quadro 6.1), pode-se iniciar a utiliza-
ção da planilha, devendo-se utilizar apenas as colunas A, B e C para entrada de 
dados numéricos. A velocidade específica para cada instante aparecerá auto-
maticamente na coluna E. 
5) Os dados de 1-ls aparecerão com sinal negativo na planilha, por causa do sinal 
negativo da derivada dS I dt. No entanto, como 1-ls deve assumir valores positi-
vos, deve-se fazer a correção necessária, multiplicando-se os valores obtidos 
na plàri.~lha por -1. 
Sugere-se acompanhar o seguinte exemplo de caso para verificar o bom fun-
cionamento da planilha. 
,. 
B) Exemplo de caso: dados de um cultivo descóntínuo de Saccharomyces cerevisiae 
Na Tabela 6.1 são apresentados os dados de concentração celular, de subs-
trato e de produto obtidos num cultivo descontínuo de Saccharomyces cerevisiae.24 
Esses dados, obtidos ao longo do cultivo a cada 4 horas e sujeitos a alguma flutua-
ção experimental, devem ser ajustados a uma tendência que represente bem o fe-
nômeno em questão, ajuste este que pode ser denominado "alisamento". O 
alisamento dos pontos experimentais, que pode ser realizado por ajuste manual 
em papel milimetrado ou pelo ajuste por uma ou mais equações polinomiais, deve 
ser feito anteriormente ao cálculo das velocidades específicas de crescimento, de 
consumo de substrato e de formação de produto. Os dados resultantes do alisa-
mento dos pontos apresentados na Tabela 6.1 encontram-se na.Tabela 6.2 (no caso, 
foi feito um ajuste por polinômios de 4. o grau) . 
I 16 Cinética de processos fermentativos 
Tabela 6 .. 1 - Dados experimentais de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae. 24 
Tempo (h) X (g/L) S (g/L) p (g/L) ro'Jol' 
o 0,91 106,9 0,0 ~ t 
4 0,91 106,9 0,0 '1 8 1,61 96,8 6,2 ·~ 
1 • 
12 2,42 83,6 15,0 . ' ';:J 
i 16 3,59 59,9 23,5 . 20 4,71 31,6 34,3 ' 
24 5,51 10,6 42,2 
~~ ... f, ;. ,_ 
~-, 
~ ~ ~ m ~ 
.... :. ~ · • .. ... ~\ •. ~-. ~-.· • .:;-· •. •• ·-. ....,, -• ~-t ' ....... . . 1~-~-,,;.· ~"'·~~{~<~ ,.oá\~{!;~tf ·>·.-.:·"-;.S;r'.ry·{'··• >''ó• ~· "~;'' ·~q<p < 'Jt)~~f \íi' ;r • ; . '11. •• ~#.' .. • ' • " • • ' • .. • , • • .... ~ • • 
Tabela 6.2 - Dados resultantes do alisamento de dados experimentais de um cultivo descontínuo 
de S. cerevisiae (ver Tabela 6. 1 ). · 
Tempo (h) X (g/L) S (g/L) .P (g/L) Tempo (h) X (g/L) S (g/L) p (g/L) 
o 0,89 106,9 0,00 15 3,31 65,7 21,8 
1 0,89 106,9 0,00 16 3,60 59,2 24,4 
2 0,89 106,9 0,00 17 3,89 52,5 27,0 
3 0,91 106,3 0,04 18 4,18 45,7 29,6 
4 0,97 105,6 0,68 19 4,45 38,9 • 32,1 
5 1,07 104,6 1,59 20 4,71 32,2 34,4 
6 1,19 103,1 2,76 21 4,95 25,9 36,6 
7 1,35 101,1 4,17 22 5,17 20,0 38,6 I 
8 1,52 98,6 5,80 23 5,35 14,8 40,3 
9 1,73 95,6 7,65 24 5,49 10,5 41,7 
10 1,95 91,9 9,68 25 5,57 7,4 42,7. 
11 2,20 87,7 11,9 26 5,57 7,0 42,8 
12 2,46 82,9 14,2 27 5,57 7,0 42,8 
13 2,73 77,6 16,7 28 5,57 7,0 42,8 
14 3,01 71,9 19,2 
j 
----·-~·--· -. . ·---·-- , , . . "~""'~ 
/ -
Apêndice I 17 
É importanteobservar que o intervalo de tempo entre dois pontos consecuti-
vos resultantes do alisamento, os quais serão utilizados no cálculo das_ velocida-
des específicas, deve ser adequado ao caso em estudo. No presente exemplo, 
foram utilizados dados de 1 em 1 hora, pois verificou-se que este intervalo é sufi-
ciente para que fossem obtidas boas curvas de velocidades específicas. 
Utilizando os dados da Tabela 6.2 para o cálculo de velocidades específicas, 
obtêm-se os dados constarites da Tabela 6.3. Para ilustrar o aspecto da planilha no 
momento de sua utilização, é apresentado no Quadro 6.2 o cálculo das velocida-
des específicas de crescimento (dados de concentração celular na coluna C) . 
Tabela 6.3 - Velocidades específicas de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae . 
Tempo (h) J.lx (h-1) J.ls (h-1) J.1p (h-1) Tempo (h) J.lx (h-1) J.ls (h-1) J.lp (h-1) 
o 0,00 0,00 0,00 15 0,09 1,92 0,79 ;~,:~ 
1 0,00 0,11 0,00 16 0,08 1,83 0,72 
2 0,01 0,33 0,02 17 0,07 1,74 0,67 
3 0,04 0,58 0,32 18 0,07 1,63 0,61 1:_:; __ ;: 
4 0,08 0,85 0,78 19 0,06 1,52 0,54 
5 0,10 1,11 0,96 20 0,05 . 1,38 0,48 
- I< 6 0,12 1,43 1,07 21 0,05 1,23 0,42 ' 
-
7 0,12 1,63 1,12 22 0,04 1,07 0,35 
8 0,12 1,78 1,14 23 0,03 0,87 0,29 l~t: 
9 0,12 1,90 1,12 24 0,02 0,64 0,21 
:~~ 
10 0,12 2,01 1,09 25 0,01 0,12 0,07 
11 0,12 2,03 1,03 26 0,00 0,03 0,01 -~ 
12 0,11 2,04 0,97 27 0,00 0,00 0,00 ' 
13 0,10 2,01 0,92 28 0,00 0,00 0,00 t . 
14 0,10 1,97 0,85 
·' . t ·-f: ' ~-- ~ ....... i'l'l·.,..., -,;- ~·-..-:•':i\wr-, ;. -: "":,ilr-t' r- • .l. l».,,"~-~- _;. -:,. ,. 
--- --- - .. .......... - P""",--- ·---- -- ~---- - ·-- --. 
I 18 Cinética de processos fermentativos 
Quadro 6.1 - Organização da planilha para cálculo de uma determinada velocidaae específica 
(observe também o Quadro 6.2). 
A) Para deixar um espaço razoável para a caracterização dos cálculos que serão efetuados, imagina-se a entrada 
de dados a partir da linha 8 da planilha: · 
·Célula da Planilha Dados de entrada Tipo 
'' AS tempo (h) texto M: 
~~· 
~ 
8S X (g/L) texto f :'I :i>A ...,, 
CS M (g/L) texto ~ 
:"'j 
~ 
DS dM/dt texto i~ 
. r, 
ES llM texto -~ • > -
FS i texto · ~ '" 
'~ 
GS mAB texto Aj, 
r~ 
HS mBC texto 
:l·~ 
IS dCX · texto ~ 
JS mNO texto ~ 
-~ 
-r~ 
KS nNO texto ~· 
~l ,,., 
LS mMO texto I~ 
C• 
MS texto ~~-
1~--------------+---------------~---------------i 
nMO 
1~------:--:------~r-------:x-~-~------_,----~-:-:-:-::--. ~--~~~ 
1~------------~------------~--------~.~. ----~~J 
PS dX/dt texto ~ 
!C:;;.& . .&i~$.;.~.-;.". ;;i::~,._ ":..:)!1Z.~~·~~~'~fél; ~ .!:·~''·"'·' ~~ 
B) Para os cálculos relativos ao primeiro ponto, o método obtém a derivada traçando uma reta entre o segundo 
e o primeiro ponto, devendo-se, portanto, entrar com os seguintes dados na linha 9: 
Célula da Dados de entrada Tipo Planilha 
A9 tempo inicial número 
89 concentração celular inicial número 
C9 concentração inicial do composto M número 
09 = +(ClO - C9) I (AlO - A9) equação 
E9 = +09/89 equação 
F9 1 número 
---~----··--'---------------------------------- -------------------- ·----·---·-- . - ·-.. -.-~ 
Apêndice I 19 
C) Para os demais pontos, o cálculo é feito através das equações abaixo (estão indicadas as entradas da linha I 0). 
Quando da utilização da planilha, após a entrada dos dados numéricos (resultantes do alisamento) nas colunas 
1 , A, B e C, deve-se preencher as colunas D a P copiando as células da linha I O até a última linha de entrada de 
dados: 
Célula da Dados de entrada Tipo Planilha 
AlO segundo dado de tempo número 
BlO segundo dado de cone. celular número 
C lO segundo dado de cone. do composto M número 
010 =SE (ABS (GlO-HlO) <=0,001 ; IlO;PlO) equação 
ElO =+DlOIBlO equação 
FlO =+F9+1 equação 
GlO =+ (Cl0-C9) I (A10-A9) equação 
H lO =+ (Cll-ClO) I (All-AlO) equação 
110 =SE (A11<>0;0,5* (GlO+HlO); (Cl0-C9) I (Al0-A9)) equação 
JlO =SE ( (Cll-Cl0)<>0; (AlO-All) I (Cll-ClO) ;99000000000) equação 
KlO =0,5* (ClO+Cll)- (Jl0*0,5* (Al0+A11) ) equação 
L lO =SE ( (Cl0-C9) <>0; (A9-Al0) I (Cl0-C9) ; 99000000000) equação 
MlO =0,5* (C9+Cl0)- (L10*0,5* (A9+Al0) ) equação 
NlO = (KlO-MlO) / (LlO-JlO) equação 
010 =+LlO*NlO+MlO equação 
PlO =SE (All<>O; (NlO-AlO) I (Cl0-010); (C10-C9) I (Al0-A9)) equação 
L . - ···--· ... ·- ---· ------ --- -- ---- --- . --------- ---- ---- -- ----------- ---------- -- ---- --
I 
.I 
I 
A I B I 
1 
2 I I 
3 
4 
5 
6 
7 
8 tempo (h) X(g/L) 
9 o 0,89 
10 1 0,89 
11 2 0,89 
12 3 0,91 
13 4 0,97 
14 5 1,07 
15 6 1,19 
16 7 1,35 
17 8 1,52 
18 9 1,73 
19 10 1,95 
20 11 2,20 
21 12 2,46 
22 13 2,73 
23 14 3,01 
24 15 3,31 
25 16 3,60 
26 17 3,89 
27 18 4,18 
28 19 4,45 
29 20 4,71 
30 21 4,95 
31 22 5,17 
32 . 23 5,35 
33 24 5,49 
34 25 5,57 
35 26 5,57 
36 27 5,57 
37 28 5,57 
Quadro 6.2 - Exemplo de cálculo de velocidade específica de crescimento para dados de um cultivo 
de S. cerevisiae. 
c D E F G I H I I I L K I L I M 
Planilha para o cálculo de velocidades específicas pelo método proposto por LE DUY; ZAJIC8 
I I 
Exemplo de aplicação; dados de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae 
Entrar somente com os dados de temp_o (coluna A), de concentração celular (coluna B) e de concentração do coml"'sto M• 
(células, substrato ou produto), cuja velocidade específica de consumo ou de produção se desea determinar (coluna C): 
M(g/L) dM/dt 11m i mAB mBC dCX mNO nNO mMO nMO 
0,89 0,00 0,00 . 1 
0,89 0,00 0,00 2 0,00 0,00 0,00 1E+11 -1E+11 1E+11 -5E+10 
0,89 0,01 0,01 3 0,00 0,02 0,01 -50,00 125,90 1E+11 -1E+11 
0,91 0,04 0,04 4 0,02 0,06 0,04 -16,67 59,27 -50,00 125,90 
0,97 0,08 0,08 5 0,06 0,10 0,08 -10,00 46,02 -16,67 59,27 
1,07 0,11 0,10 6 0,10 0,12 0,11 -8,33 46,96 -10,00 46,02 
1,19 0,14 0,12 7 0,12 0,16 0,14 -6,25 41,90 -8,33 46,96 
1,35 0,16 0,12 8 0,16 0,17 0,17 -5,88 45,55 -6,25 41,90 
1,52 0,19 0,12 9 0,17 0,21 0,19 -4,76 42,10 -5,88 45,55 
1,73 0,21 0,12 10 0,21 0,22 0,22 -4,55 45,02 -4,76 42,10 
1,95 0,23 0,12 11 0,22 0,25 0,24 -4,00 44,08 -4,55 45,02 
2,20 0,25 0,12 12 0,25 0,26 0,26 -3,85 46,56 -4,00 44,08 
2,46 0,26 0,11 13 0,26 0,27 0,27 -3,70 48,89 -3,85 46,56 
2,73 0,27 0,10 14 0,27 0,28 0,28 -3,57 51,08 -3,70 48,89 
3,01 0,29 0,10 15 0)8 0,30 0,29 -3,33 51,49 -3,57 51,08 
3,31 0,29 0,09 16 0,30 0,29 0,30 -3,45 56,90 -3,33 51,49 
3,60 0,29 0,08 17 0,29 0,29 0,29 -3,45 60,64 -3,45 56,90 
3,89 0,29 0,07 18 0,29 0,29 0,29 -3,45 64,38 -3,45 60,64 
4,18 0,28 0,07 19 0,29 0,27 0,28 -3,70 72,83 -3,45 64,38 
4,45 0,26 0,06 
.. ·., . 20 0,27 0,26 0,27 -3,85 79,58 -3,70 72,83 
4,71 0,25 0,05 2L 0,26 0,24 0,25 -4,17 90,25 -3,85 79,58 
4,95 0,23 0,05 22 ·o,24 0,22 0,23 -4,55 102,79 -4,17 90,25 
5,17 0,202 0,04 23 0,22 0,18 0,20 -5,56 130,26 -4,55 102,79 
5,35 0,16 0,03 24 0,18 0,14 0,16 -7,14 173,28 -5,56 130,26 
5,49 0,11 0,02 .. 25 0,14 0,08 0,11 -12,50 311,78 -7,14 173,28 
5,57 0,04 0,01 26 0,08 0,00 0,04 1E+11 -3E+12 -12,50 311,78 
5,57 0,00 0,00 27 0,00 0,00 0,00 lE+ll -3E+12 lE+ll -3E+12 
5,57 0,00 0,00 28 0,00 0,00 0,00 1E+11 -3E+12 1E+11 -3E+12 
5,57 0,00 0,00 29 0,00 0,20 0,00 -5,03 73,16 1E+11 - 3E+12 
I N I o p 
I I 
I 
t(c) ex c r dX/dt 
#DIV /0! #DIV /0! #DIV /0! 
1,50 50,90 0,01 
2,00 25,96 0,04 
1,99 26,!'4 0,08 
-{),57 51,68 0,11 
2,43 26,69 0,14 
-9,95 104,08 0,16 
3,08 27,43 0,19 
-13,49 106,36 0,21 
1,74 37,13 0,23 
-16,16 108,71 0,25 
-16,36 109,48 0,26 
-16,58 110,30 0,27 
-1,72 57,22 0,29 
47,07 -105,39 0,29 
#DIV /0! #DIV /0! #DIV /0! - - 0,29 33,10 -49,75 0,28 
47,36 -102,57 0,26 
33,28 -48,42 0,25 
33,11 -47,70 0,23 
27,20 -20,84 0,20 
27,10 -20,30 0,16 
25,85 -11,39 0,11 
25,50 -6,97 0,04 
IIDlV /OI IIDIV/0! IIDIV/01 
#DIV /0! IIDIV /0! #DIV/01 
27,50 -65,08 0,00 
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105-131, 1968. . 
(23) MONOD, J. The growth of bacterial cultures. Ann. Review of Microbiol. vol3, p . 
371-394, 1949. 
(24) BORZANI, W. Kinetics of sugar uptake by yeast cells in batch, fed-batch and conti-
nuous ethanol fermentation. Braz. J. Chem. Eng., vol. 13, n . 2, p. 99-105, 1996. 
--~-------------_ .. -....,.......~--· ------··-- -----. -~-----:----=-'-
I -
7 .I - Introdução 
123 
Antonio Bonomi 
Willibaldo Schmidell 
Apesar de a engenharia bioquímica compreender diferentes tipos de proces-
sos, englobando transporte de calor e massa e recuperação de produtos, incluindo 
vários constituintes e fenômenos dominantes, _a pesquisa em modelagem matemá-
tica reportada na literatura técnica especializada refere-se basicamente às reações 
biológicas e, recentemente, às reações que ocorrem no interior das células. Dessa 
forma, a modelagem matemática de processos fermentativos pode ser definida 
como a tentativa de representar, através de equações matemáticas, os balanços de 
massa para cada componente no biorreator, associados às complexas transforma-
ções bioquímicas que ocorrem no processo e às velocidades com que essas trans-
formações se processam. Em razão da complexidade do processo real (que envolve 
leis físico-químicas, bioquímicas e genéticas), somadà às limitações matemáticas, os 
modelos são baseados, geralmente, na idealidade e, em geral, fornecem uma repre-
sentação fiel de apenas algumas das propriedades do processo.1 A formulação de 
um modelo matemático deve, segundo os autores, possuir um comprom~timento 
entre grau de complexidade razoável e solução (esforço computacional) economi-
camente desejável. Por sua vez, a simulação do processo corresponde à sua aná-
lise (por exemplo, s':la otimização) através da utilização do modelo matemático 
proposto. 
Do ponto de vista da engenharia bioquímica, o desenvolvimento da mo-
delagem matemática dos processos fermentativos permite atingir, entre ou-
tros, os seguintes objetivos: organizar informações desconexas a respeito dos 
fenômenos biológicos num conjunto coerente; pensar (e calcular) logicamente 
a respeito de quais componentes e interações são importantes num sistema 
complexo; descobrir novas estratégias para explicar b comportamento das cé-
lulas submetidas a determinados ambientes; corrigir falhas eventualmente 
124 Modelagem matemática e simulação de proc~ssos fermentativos 
existentes no entendimento convencionado de determinados fenômenos e, fi-
nalmente, entender as características qualitativamente essenciais de determi-
nados processos. 2 
O objetivo principal da modelagem matemática e simulação, como ferra-
menta do desenvolvimento tecnológico de processos fermentativos, é prever o 
comportamento dinâmico e estacionário do processo, inclusive em condições não 
testadas empiricamente, possibilitando a determinação das condições operacio-
nais economicamente ótimas do sistema, auxiliando no projeto e ajuste de algorit-
mos de controle, no qual o modelo matemático formulado passa a ser parte 
integrante do mesmo.3 
Os processos fermentativos incorporam uma série de características que os 
diferenciam dos processos químicos, o que pode explicar as dificuldades encontra-
das na formulação de modelos matemáticos que representem adequadamente es-
tes processos, ao contrário do que ocorre com os processos químicos 
convencionais. Entre essas características podem ser citadas as seguintes: baixas 
concentrações e baixas velocidades de reação, como resultado da utiliZação de um 
meio diluído; complexidade da mistura reagente e capacidade do sistema (células 
microbianas) de sintetizar seu próprio catalisador; conhecimento insuficiente de 
vários dos fenômenos limitantes das velocidades de produção e falta de sensores 
para automação on-line; problemas de esterilidade, segurança e eventualmente da 
toxicidade dos processos fermentativos. 4 
Neste capítulo serão apresentados os principais tipos de modelos empre-
gados para representar os processos fermentativos, destacat:tdo as estratégias 
empregadas na formulação dos modelos matemáticos conhecidos como feno-
menológicos, não estruturados, bem como as metodologias utilizadas no ajuste 
desses modelos a um conjunto de experimentosrealizados . Posteriormente, se-
rão introduzidas e aplicadas técnicas estatísticas, que permitem discriminar di-
versos modelos ajustados, definindo sua validade. Finalmente, será discutida 
. . 
brevemente a utilização dos modelos matemáticos visando otimizar um proces-
so, através da definição de uma função objetivo e o emprego de diversas técni-
cas de otimização. 
~ 7.2 - Formulação dos modelos matemáticos de processos 
fermentativos · 
Inicialmente, deve-se reconhecer que, num processo fermentativo, estão en-
volvidos dois sistemas que interagem continuamente: a fase biológica (ou biótica) 
composta pela população microbiana ou pela cultura de células animais ou vege-
tais e a fase ambiental (ou abiótica) ou o meio de cultura, como é comumente co-
nhecido e que contém os substratos e produtos do processo. A Figura 7.1 resume 
os principais parâmetros, fenômenos e interações que influenciam o comporta-
mento cinético de uma população microbiana ou de células na presença do seu 
meio de cultura.5 
· ··---~---"--- -·- ···-'·-·· .. -----~ 
Fonnulação dos modelos matemáticos de processos fennentativos 125 
AMBIENTE 
(meio de cultura) 
Multicomponentes 
Reações em solução 
Equilíbrio iônico 
pH, T, ... variáveis 
Propriedades reológicas 
variáveis (viscosidade) 
Sistema multifase (G-L; 
L-L; G-L-L; G-L-S) 
Não uniformidade 
Nutrientes/Substratos .. 
Produtos 
Calor 
Interações Mecânicas 
POPULAÇÃO 
(células) 
Multicomponentes 
Heterogeneidade entre 
células 
M ultirreações 
Controle interno 
Adaptabilidade 
Sistema estocástico 
Variações genéticas 
Figura 7 .I - Esquema das principais características da interação população microbiana/células animais ou vegetais 
e o meio de cultura. 
As células consomem nutrientes e convertem substratos do ambiente em 
produtos. As células geram calor, que é dissipado para o meio e, em contraparti-
da, a temperatura do meio define a temperatura das células. Interações mecânicas 
ocorrem através de pressão hidrostática, de efeitos do fluxo do meio para as célu-
las, de choque entre partículas (células ancoradas em suportes) e de mudanças na 
viscosidade do meio em função do acúmulo de cél~las e de produtos metabólicos. 
Há . que se considerar ainda que as características de operação do processo 
fermentativo empregado, tais como: 
• batelada, contínuo, batelada alimentada, etc.; 
• submerso e semi-sólido; 
• alta densidade celular (reciclo, imobilização de células, etc.); 
entre outras, permitem interferir na relação população microbiana - ambiente, no 
sentido de controlar e, se possível, aumentar as velocidades e os rendimentos des-
ta interação. 
Pelo exposto, fica claro que num desenvolvimento de processo, quando se 
utilizam as técnicas de modelagem matemática e simulação para o projeto e di-
mensionamento de biorreatores otimizados, dever-se-á analisar, da forma mais 
abrangente e integrada possível, os principais fenômenos que caracterizam as in-
terações população microbiana- meio ambiente- tipo de processo fermentati-
vo. A seguir listamos alguns desses fenômenos característicos: 
...__ __ - ·-----· -·· ... --------------------------------:-------.---------------' 
126 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
• influência da "história" da população microbiana no processo (fase lag e 
de adaptação, mutações, perda de viabilidade, etc~); · 
• influência da composição do meio de cultivo nas velocidades de cresci-
mento ou de produção da população microbiana (um único ou múltiplos 
substratos limitantes, substratos inibitórios, substratos que provocam os 
fenômenos de indução e repressão, etc.); 
• consumo de substratos para crescimento e também, na maioria dos casos, 
para manutenção da vjabilidade celular; 
• geração de produtos associada ou não ao crescimento celular; 
• transferência de substratos do meio para o interior das células e de produ-
tos da célula para o meio; 
• velocidades de respiração em processos aeróbios (transferência de oxi-
gênio da fase gasosa para a fase líquida através da agitação e aeração 
do biorreator); 
• tipo de processo (submerso ou semi-sólido, batelada ou batelada alimen-
tada ou contínuo, com e sem reciclo, células imobilizadas ou livres, uma 
ou múltiplas fases de processo, etc.); 
• influência de variáveis físico-químicas no processo (temperatura~ pH, 
pressão interna do biorreator, viscosidade, densidade, umidade do meio 
de cultivo, umidade relativa do ar, etc.); 
• influência das variações na síntese dos componentes celulares- necessida-
de de incluir "estrutura" nos modelos matemáticos dos processos; 
• homogeneidade ou heterogeneidade do processo; 
• influência das condições operacionais na morfologia da população micro-
biana. 
Admite-se, idealmente, que a modelagem de uma fermentação deveria pre-
dizer o r~sultado das milhares de transformações químicas que ocorrem pela 
ação de uma população microbiana, ou de uma cultura de células animais ou ve-
getais. Sem dúvida, uma descrição completa de todas as vias e intera~ões meta-
bólicas pertinentes ao desenvolvimento microbiano seria extremamente comple-
xa e mesmo impossível. Felizmente, sabe-se que, ao menos na área das ciências 
exatas, muitos problemas podem ser estudados usando uma média das várias 
propriedades das diversas entidades em questão. Nesse sentido, é importante 
lembrar que o modelo ainda pode ser válido se somente um número limitado de 
mecanismos governantes são considerados em detalhe. Portanto, na elaboração . 
de modelos de processos fermentativos são, geralmente, introduzidas simplifica-
ções, de maneira a se obter modelos passíveis de serem manuseados e generali-
zados.6 . 
7.2.1 - Classificação dos modelos matemáticos de processos 
fermentativos 
Vários autores apresentam classificações para os diversos tipos de modelos 
comumente usados em engenharia bioquímica.5'6' 7 Iniciaremos essa ~lassificação 
pela definição de dois grandes grupos de modelos matemáticos de processos fer-
mentativos, definidos a seguir. · · 
~~. . ------'-----·-'---·. __ ___....... 
Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 12 7 
Modelos fenomenológicos: baseiam-se na formulação de hipóteses e correla-
ções teóricas ou empíricas para explicar os fenômenos e o comportamento das va-
riáveis do processo observados experimentalmente; 
Modelos entrada-saída: estabelecem relações empíricas para correlacionar o 
efeito de lr'ariações nas variáveis de entrada ou manipuláveis (caso, por exemplo, 
das concentrações iniciais em sistemas operados em batelada ou das concentra-
ções e vazões de alimenta~ão nos sistemas operados de forma contínua) nos valo-
res das variáveis de saída ou medidas do processo (caso do perfil de 
concentrações possíveis de serem medidas no interior do biotreator, ou no seu 
efluente, ao longo do tempo). 
7.2.1.1. Modelos fenomenológicos 
Um modelo fenomenológico é constituído por um conjunto de relações ma-
temáticas entre as variáveis de interesse do sistema em estudo. 
É desejável que os modelos sejam, na medida do possível, fundamentais, ou 
seja, baseados nas equações de conservação de massa, energia e quantidade de mo-
vimento e em princípios físico-químicos, uma vez que isto confere maior confiança 
em interpolações e extrapolações, quando comparado com modelos puramente 
empíricos. Entretanto, mesmo em modelos fundamentais, é freqüente que o cálcu-
lo de um ou mais parâmetros seja baseado em equações empíricas. . 
Na formulação de um modelo matemático fenomenológico convencional 
são, normalmente, utilizadas equações que podem ser classificadas em: 
• equações de balanço ou de conservação (de massa, energia, quantidade de 
movimento), baseadas em princípios físico-químicos f';lndamentais; 
• equações de velocidade, que podem ser: (a) equações' de velocidade de 
transporte de massa, energia e componentes ou espécies químicas, através 
das fronteiras do 'sistema considerado ou (b) equações de velocidade de 
geração ou consumo de espécies dentro dosistema; as equaçÕes de veloci-
dade são normalmente equações empíricas, construídas a partir do conhe-
cimento advindo de ensaios realizados no laboratório; 
• equações termodinâmicas, que relacionam propriedades termodinâmicas 
· do sistema (pressão, temperatura, densidade, concentração), por exemplo, 
equações de estado e relações de equilíbrio termodinâmico (como é o caso 
da lei de · Henry para transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase 
líquida). 
Enquanto as equações de balanço, de velocidade de transporte e termodinâ-
micas são passíveis de pàdronização através de estudos teóricos de fenômenos de 
transporte e termodinâmica aplicados há décadas na engenharia química, as equa-
ções de velocidade de transformação, ou equações cinéticas, são específicas para 
os processos fermentativos e constituem os chamados modelos cinéticos. 
Freqüentemente, em processos com células livres; as informações sobre a ci-
nética de fermentação são obtidas a partir de ensaios em laboratório realizados em 
~- proposição de um modelo Cinético para um processo fermentativo, diversos níveis 
reatores operados de forma descontínua, descontínua alimentada ou contínua. Na j 
L ...... ------ ·----- . ---- --------------------- -------------------:---------'- -- -- ,_ ... _________ __ _ ----- -- ---- -:--- .. ... .. --- ------ --- -------- --.. --- -- -----------
128 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
de detalhamento podem ser adotados. Algumas das aproximações, permitem sim-
plificar a representação da cinética dos processos ferrnentativos: 
• consideranili>-se que, na formulação do meio de cultura, todos os com-
ponentes, rri.enos um número preestabelecido, estão em concentrações 
suficientemente elevadas (mas não inibitórias), de modo que apenas as 
concentrações destes outros componentes, previamente escolhidos, sejam 
limitantes e/ ou inibitórias-para a velocidade do processo; eventualmente, 
é necessário incluir no equacionarnento outros componentes do meio, por 
exemplo, um produto inibidor que se acumula no meio de cultura ao lon-
go do processo; 
• considerando-se, em geral, que alterações em outras variáveis detectadas 
num experimento de um processo típico não afetam significativamente a 
cinética no intervalo de tempo escolhido para a modelagem; além disso, 
controles do biorreator podem regular e manter constantes alguns parâ-
metros do ambiente, por exemplo, pH, temperatura e concentração de oxi-
gênio dissolvidO'; 
• introduzindo-se no modelo, se necessário, urna descrição rnulticornponen-
te e rnultivariável da população rnicrobiana ou de células, para represen-
tar adequadamente o comportamento cinético desejado. 
Os modelos cinéticos de processos ferrnentativos podem ser classificados, 
quanto ao número de componentes usados na representação celular, em dois ti-
pos, conforme se detalha a seguir. 
Modelos não estruturados: o material celular é representado por urna úniça va-
riável, por exemplo, a massa celular ou o número de células, sem considerar varia-
ções . de componentes intracelulares, ou usar tais variações ria previsão do 
comportamento cinético do processo; 
Modelos estruturados: as células são descritas com maiores detalh~s, conside-
rando, por exemplo, componentes intracelulares, perrnitindo~descrever o estado 
das células e sua adaptação às mudanças do meio ambiente. · • 
Quanto à heterogeneidade da população rnicrobiana, os modelos cinéticos 
também são classificados em duas categorias, descritas a seguir. 
Modelos não segregados: a população celular é considerada homogênea, isto é, 
todas as células apresentam o mesmo comportamento; 
Modelos segregados: as células são consideradas discretas, corno indivíduos 
de urna população heterogênea, com distribuição de idade, de tamanho e de pro- · 
priedades celulares. 
Obviamente, os modelos segregados e estruturados oferecem urna descrição 
mais detalhada do comportamento cinético do processo ferrnenhitivo que os não 
segregados e os não estruturados, mas à custa de maior complexidade e maior es-
forço computacional requerido- em muitos casos a qualidade e a reprodutibili-
dade dos resultados obtidos não justificam a complexidade e a perda de 
generalidade introduzida. 
É possível encontrar na literatura algumas tentativas de generalizar a mode-
lagem matemática de processos ferrnentativos, utilizando proposições não estru-
. , __ ___... 
Formulação dos modelos matemáticos de pr~sso5 fermentativos 12 9 
turadas de modelos, visando a utilização em módulos da etapa de fermentação em 
simuladores de processo.8 Verifica.:se, entretanto, que essas proposições, por não 
acoplarem etapas de ajuste de parâmetros e de otimização de processo, são extre-
mamente limitadas, urna vez que exigem do usuário um conhecimento aprofunda-
do do processo o que, geralmente, não ocorre; 
7.2.1.2 - Modelos entraqa-saída 
Denomina-se modelo entrada-saída de um processo à correlação que permi-
te calcular urna ou mais respostas do sistema (suas saídas), a partir de um número 
definido de variáveis de entrada medidas. O principal exemplo de modelos entra-
da-saída, muito estudado hoje para representar sistemas complexos (caso dos pro-
cessos ferrnentativos), são as redes neurais. Essas redes foram concebidas a partir 
de urna analogia com o funcionamento do cérebro humano. Neste, a informação é 
processada em unidades chamadas neurônios. Cada neurônio recebe a informa-
ção proveniente de inúmeros outros neurônios através de terminais de entrada 
chamados dendritos. Essas informações são sintetizadas no núcleo e, se forem 
·suficientemente fortes, produzirão um sinal que se propaga através do axônio até 
seus terminais de saída, chamados de sinapses. Finalmente, estas se ligarão a urna 
nova camada de neurônios. 
As redes neurais artificiais têm urna estrutura análoga à descrita, sendo que 
a síntese das informações de entrada é feita por urna ponderação dos diversos si-
nais, através de ajustes de coeficientes e urna posterior transformação não linear, 
comumente do tipo sigrnóide. Há diversas proposições de corno interconectar os 
diversos neurônios, cada urna definindo urna arquitetura de rede. A escolha de 
qual arquitetura, bem corno o número de neurônios e de camadas intermediárias, 
será feita sempre ernpiricarnente a partir dos resultados fornecidos pela rede.9 
A rede passa a descrever o sistema corretamente quando o erro entre o re-
sultado medido e o_ calculado por ela, a partir dos mesmos dados de entrada, es-
tiver dentro do especificado. Para urna predição correta é 'necessário que se 
forneça antes à rede um conjunto casado entrada-saída, onde se faráo ajuste dos 
coeficientes descritos anteriormente. Esse ajuste, que terncorno critério a rninirni-
zação do erro medida-predição, é também designado por fase de treinamento. Fin-
da essa etapa, faz-se sua validação submetendo-se à análise um conjunto de dados 
ainda não apresentados à rede. 
Devido ao escopo introdutório do presente capítulo, não se pretende 
apresentar em detalhe a aplicação de redes neurais à modelagem de processos 
ferrnentativos. O leitor interessado poderá encontrar na literatura várias aplica-
ções: SYU; TSA0/0 na modelagem do crescimento de células em processo batela-
da; WILLIS et al., 11 na modelagem da produção de penicilina via fermentação; 
BHAT et al.,12 no controle de urna torre de destilação; ZORZETT0,13 na utilização 
de redes neurais híbridas para modelar a: etapa ferrnentativa do processo de 
produção de vitamina C e SIMUTIS et al./4 na utilização de diferentes redes neu-
' rais para representar fases distintas da fermentação alcoólica na produção de .... 
~ cerveja. 
L~.....,.----- ---- - · -·----~-------.. ·-- - ---- - --~-~ ------------------.--.. ---- -------- ---- -- ---- ----_--
'· 
i 
!( 
130 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
7.2.2 - Formulação dos modelos fenomenológicos não estruturados 
O primeiro passo na formulação de um modelo matemáticç fenomenológico 
é oestabelecimento das variáveis de estado dó processo, isto é, aquelas variáveis 
que definem em cada instante o estado do sistema (por exemplo, concentrações de 
substratos e produtos). Inclui-se também na definição do estado de um processo 
fermentativo a capacidade (velocidade) das células presentes de executar suas 
funções vitais, quais sejam: o crescimento ou morte celular, a geração de produtos 
e o consumo de substratos. Em sistemas mais complexos o estado de processos 
fermentativos pode incluir a fração de células que preservam a capacidade de ge-
rar um determinado produto (capacidade esta introduzida, por exemplo, através 
de técnicas de engenharia genética e que pode ser perdida em função da instabili-
dade do microrganismo gerado), a concentração de um substrato necessário ao 
crescimento celular e que é gerado pela ação de uma enzima introduzida no pro-
cesso, a ação de populações mistas de células, entre outros fenômenos. 
Para estudar a dinâmica de um processo fermentativo, deve-se buscar: 
. • identificar os processos que alteram o estado das populações envolvidas 
(crescimento celular, reprodução celular, manutenção da viabilidade celu-
lar, morte celular, lise celular, motilidade celular, alterações morfológicas 
das células, como é o caso da formação de esporos e finalmente os proces-
sos físicos que incluem entre outros a aderência das células a superfícies 
sólidas); 
• identificar os fenômenos ambientais que afetam as velocidades de altera-
ção do estado das populações; 
• identificar como as velocidades de alteração do estado das populações são 
afetadas; 
• identificar como o ambiente é afetado pelos processos de alteração do es-
tado das populações. • 
7.2.2.1 - Equações de balanço 
As equações de balanço do processo devem ser formuladas para cada variá-
vel de estado e para o volume de controle do sistema em estudo. Para os processos 
fermentativos realizados em biorreatores homogêneos, o volume de controle cor-
responde ao próprio volume útil do biorreator. 
Como a formulação e detalhamento das equações de balanço será vista nos 
capítulos que tratam dos biorreatores, será apresentada apenas a equação geral do 
balanço a título de revisão: 
Velocidade de 
acúmulo no volume 
de controle 
Velocidade de 
entrada no volume 
de controle 
Velocidade de 
saída do volume 
de controle 
Fonnulação dos modelos matemáticos de processos fennentativos I 3 I 
Termos de entrada: 
• fluxo global através das fronteiras geométricas; 
• difusão através das fronteiras geométricas (importante apenas para bior-
reatores heterogêneos, onde os volumes de controle são infinitesimais); 
• transporte através das fronteiras entre fases (caso do transporte de oxigê-
nio da fase gasosa para a fase líquida); 
I 
• geração dentro do volume de controle (geralmente crescimento celular e 
produção de produtos metabólicos). 
Termos de saída: 
• fluxo global através das fronteiras geométricas; 
• difusão através das fronteiras geométricas; 
• transporte através das fronteiras entre fases; 
• consumo dentro do volume de controle (geralmente morte celular ou con-
sumo de substratos). 
Dessa forma, para um processo fermentativo homo§êneo, as equações de ba-
lanço podem ser escritas na seguinte forma generalizada: 5 
1 d (Vy) 
--- = Lrger - Lrcons + Dye - yDy v dt 
onde: V ... volume de controle; 
y ... concentração da variável de estado no biorreator; 
(7.1) 
r ger ... velocidades de 9eração do componente representado pela variável de 
estado; 
rcons ... velocidades de consumo do componente representado pela variável 
de estado; 
D ... vazão específica de alimentação; 
Ye ... concentração na alimentação; 
r ... relação entre a vazão de alimentação e de retirada do biorreator. 
Em função dos balanços de conservação de massa, os modelos matemáticos 
fenomenológicos de processos fermentativos podem ser constituídos pelos seguin-
tes tipos de equações: 
• equações algébricas: neste caso, os modelos representam apenas os estados 
estacionários de sistemas homogêneos; 
• equações diferenciais ordinárias: neste caso, os modelos representam o compor-
tamento dinâmico de sistemas homogêneos ou os estados estacionários de 
sistemas heterogêneos numa única direção do espaço; 
• equações diferenciais parciais: neste caso, os modelós representa!Jl o compor-
tamento dinâmico de sistemas heterogêneos. 
. ----· ·- -- -· J. 
13 2 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
7.2.2.2 - Identificação do sistema de reações metabólicas 
Inicialmente, para a construção das equações de balanço de massa do pro-
cesso e posteriormente na elaboração das equações cinéticas, que representam a 
influência das variáveis de estado nas suas velocidades de geração e de consumo, 
é fundamental identificar o sistema de reações metabólicas inerente ao processo 
em estudo.16'17 Por sistema de reações metabólicas entende-se o conjunto simplifi-
cado de reações que permite correlacionar os substratos consumidos aos produtos 
gerados (entre os quais está incluída a população microbiana). 
Considere-se, a título de exemplo, um processo fermentativo no qual foram 
identificadas, a partir de um conjunto de experimentos realizados, 6 variáveis de 
estado: a concentração celular (X), as concentrações de 3 substratos (51, 52 e 53) e 
as concentrações de 2 produtos (P1 e P2). Pode-se formular 3 proposições de mo-
delo de reações metabólicas, conforme indicado a seguir. 
Proposta 1 
Nesta proposta assume-se que o substrato 51 é consumido pela população 
microbiana para crescer e, juntamente com o substrato 52, produzir o produto me-
tabólico P1; o substrato 53 é consumido pela população microbiana para produzir o 
produto P2• Os parâmetros k1 a k4 representam os coeficientes estequiométricos 
desse sistema de reações metabólicas, que é ilustrado a seguir: 
k1S1 ~X 
kzSl + k3S2 ~ P1 
k4S3~P2 
Nas propostas 2 e 3, detalhadas a seguir, são apresentadas outras duas alter-
nativas para o sistema de reações metabólicas representativas do processo. 
Proposta 2 
Proposta 3 
k1S1 + k2S2 ~X 
k3S1 + k4 S2 + k5S3 ~ P1 
k6S3~P2 
k1S1 + k2S2 + k3S3 ~X 
k4S1 + ksSz ~ P1 
k6 S 3 ~P2 
• 
Para as 3 propostas de modelo de reações metabólicas elaboram~se. os balan-
ços para os 3 substratos. 
Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 13 3 
Proposta 1: 
dS 1 1 dX 1 dP1 -=---------
dt Y x/51 dt Y Pl/51 dt 
(7.2) 
dS2 1 dP1 -=---- (7.3) 
dt Yp1152 dt 
dS3 1 dP2 -=---- (7.4) 
dt YP2/S3 dt 
e integrando as eqs. (7.2) a (7.4) do instante "O" até o instante "i" correspondente a 
um ponto experimental, obtém-se: 
Proposta 2_: 
(7.8) dS 1 1 dX 1 dP1 -=---------
dt Yx/51 dt YPl/51 dt 
(7.9) dS 2 1 dX 1 dP1 -=---------
dt Y x/52 dt Y Pl/52 dt 
(7;10) dS3 1 dP1 1 dP2 -=--------
dt Y Pl/53 dt Y P2/S3 dt 
e integrando, novamente, as eqs. (7.8) a (7.10) do instante "O" até o instante "i" 
correspondente a um ponto experimental, obtém-se: 
(7.11) 
~·~- ~ - ...... -- .. -~-- - · --· ··--
· !~ j 
·l 
' ·j 
' 
\ 
I i 
', 
'· 
134 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
Proposta 3: 
dS 1 1 dX 1 dP1 -==---------
dt Y x/ 51 dt Y Pl/ 51 dt 
(7.14) 
dS 2 , 1 dX 1 dP1 -==---------
dt Y x/52 dt Y Pl/52 dt 
(7.15) 
dS3 1 dX 1 dP2 -==--------
dt Y X/53 dt Y P2/ 53 dt 
(7.16) 
e integrando, mais uma vez, as eqs. (7.14) a (7.16) do instante "O" até o instante "i" 
correspondente a um ponto experimental, obtém-se: 
Para cada proposta e para cada uma das 9 eqs. lineares (7.5) a (7.7), (7.11) a 
(7.13) e (7.17) a (7.19), obtidas para as 3 propostas de modelo metabólico formu-
ladas, calcula-se a regressão linear ou multilinear, dependendo do caso, obten-
do-se os coeficientes de correlação para cada ensaio e para o conjunto de ensaios 
disponíveis. Escolhe-se, como a mais apropriada, a proposta que apresenta o me-
lhor conjunto de coeficientes de correlação, analisando as duas situações (por en-
saio e global). · 
Formulação dos modelos matemáticos de processosfermentativos 13 5 
EXEMPLO NUMÉRICO 
Será desenvolvido ao longo deste capítulo, como estudo da modelagem ma-
temática de processos fermentativos, a modelagem do processo de produção de 
etanol a partir de hidrolisado de mandioca. 18'19 
Nesse processo foram identificadas 3 variáveis de estado: a concentração de 
leveduras (X), a concentraçã9 de etanol (P) e a concentração de substrato limitan-
te, a glicose de hidrolisado do amido de mandioca (S). São apresentados na Tabela 
7.1 os dados experimentais obtidos em 4 ensaios realizados no laboratório, num 
biorreator operado em batelada, partindo de diferentes concentrações iniciais de 
açúcares redutores.' Observe-se que esses dados experimentais foram ligeiramente 
modificados, em relação aos originais (reportados nos trabalhos referenciados), 
com o intuito de tornar mais didáticos alguns aspectos dos exemplos apresentados 
ao longo deste capítulo. 
EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 1 
Considerem-se duas propostas de modelo de reações metabólicas para re-
presentar o processo em estudo: 
Proposta 1: k 1S~ X 
k 1S~P 
Nessa primeira proposta, considera-se que a glicose é consumida pela leve-
dura para crescer e para produzir etanol. 
Proposta 2: k3S ~ P 
Nessa segunda proposta, as leveduras não consomem glicose para o seu 
crescimento (crescem a partir de outra fonte de carbono não limitante no processo 
e portanto não incluída como variável de estado caso, por exemplo, do extrato de 
levedura). ·. 
Elaborando os balanços de massa do substrato S para as 2 propostas de mo-
delo metabólico, obtém-se: 
Proposta 1: ó.S = -aflX - MP 
Proposta 2: ó.S =-eM 
Realizando a regressão multilinear para ó balanço de massa obtido com a 
Proposta 1 e a regressão linear para a Proposta 2 com os dados experimentais 
apresentados (Tab. 7.1), obtém-se o resultado sintetizado na Tabela 7.2. Essas 
regressões são realizadas considerando, em cada instante de tempo "i", o subs-
trato consumido e as células e produto produzidas desde o instante "O" até o 
instante "i". 
- - ------------ --- .,.- -· . ··- .. ----- - ·c-----·--- -· -- ·· -- · - ··- -- - --- ---- -------.......... , .. ~-- - -- - - - --· 
136 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
Tabela 7.1 - Dados experimentais(•) do processo de produção de etano! a partir de hidrolisado de mandioca-
Exemplo numérico. 
Ensaio 1 Ensaio 2 
t (h) X (g/L) p (g\L) S (g/L) t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L) 
0,0 0,378 1,92 20,8 0,0 0,845 2,44 85,1 
1,0 0,652 2,54 17,6 1,0 1,08 2,88 76,8 
2,0 1,17 3,54 14,8 2,0 ' 1,88 3,54 76,3 
3,0 1,54 4,65 10,3 3,0 2,98 5,34 74,8 
4,0 1,84 5,96 5,80 4,0 3,92 7,52 56,9 
5,0 2,36 6,64. 2,34 5,0 5,77 10,5 42,2 
6,0 2,20 7,19 0,512 6,0 7,14 17,6 28,8 
7,0 2,23 6,74 0,088 7,0 10,6 22,8 7,65 
8,0 10,3 24,7 0,198 
9,0 7,70 24,4 0,002 
Ensaio 3 Ensaio 4 
t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L) t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L) 
0,0 0,410 2,71 136 0,0 1,12 - 2,02 227 
1,0 0,819 2,78 130 1,0 1,29 2,56 236 
2,0 1,14 3,06 131 2,0 2,29 2,90 221 
3,0 1,72 3,43 134 3,0 2,68 3,82 213 
4,0 2,57 4,78 130 4,0 4,36 4,44 198 
5,0 4,01 6,78 120 5,0 6,18 6,69 198 
6,0 4,68 8,34 106 6,0 7,70 9,31 195 
7,0 6,60 11,7 100 7,0 11,1 11,3 178 
8,0 9,51 15,4 69,8 8,0 13,6 15,2 160 
9,0 12,6 23,0 47,5 9,0 18,3 21,0 123 
10,0 12,3 28,1 18,3 10,0 18,6 31,2 76,4 
11,0 14,2 38,2 0,812 11,0 22,3 39,4 46,2 
12,0 15,2 37,7 0,003 12,0 29,9 53,8 11,9 
13,0 25,2 54,4 0,054 . 
(*) Dados experimentais foram gerados considerando um erro experimental aleatório obedecendo uma· 
distribuição normal (média = 0,0 e desvio padrão = I ,0) de I 0% para as medidas de X e 5% para as me-
didas de S e P. 
Fonnulação dos modelos matemáticos de procêssos fennentativos 137 
Pelos resultados obtidos, verifica-se que a Proposta 1 é a mais adequada, 
pois todos os coeficientes de correlação obtidos para cada ensaio são melhores ou 
· iguais (caso do Ensaio 1), o mesmo ocorrendo com o coeficiente de correlação obti-
do quando é considerado o conjunto dos 4 ensaios. A discrepância dos valores de 
a e b obtidos para o Ensaio 1 (estimativas de 1/Yx;s e 1/Yp;s respectivamente) em 
relação aos outros· 3 ensaios é explicada pelo erro experimental introduzido nos 
dados. Urna possível estimativa preliminar dos valores de Yx;s e Yp;s num futuro 
ajuste de um modelo matemático aos dados apresentados na Tabela 7.1, serão os 
valores de a e b ajustados na regressão obtida com o conjunto de 4 ensaios. De-
ve-se destacar que, na presente análise, considerou-se que o erro experimental e as 
ineficiências do processo estão distribuídas entre X e P, o que explica porque o va-
lor de Yp;s obtido não é o valor estequiornétrico 0,511. 
Tabela 7.2 ·- Resultado das regressões multi linear e linear para as 2 propostas do Exemplo numérico - Etapa I. 
ENSAIO PROPOSTA I PROPOSTA2 
ô.S=-aô.X-btl.P ô.S=-ctl.P •.. 
~-
a = 0,745; b = 3,66 c= 3,95 ·'!= 
1 
_\.;·,. 
':'i:. R= 0,992 R= 0,992 ·#f 
·r 
th 
a = 2,31; b = 2,94 c= 3,90 .~·,C; 
2 
.:-rJ) 
.') 
R= 0,987 R= 0,983 f]~ 
a = 2,73; b = 2,84 c= 4,11 J)l 
3 1 ~1 1 R= 0,994 R= 0,989 
1 ~1 . 
a = 2,39; b = 3,19 c= 4,53 I ~·( "' 4 , .. R= 0,993 R= 0,988 .· .... ~. 
... a = 2,81; b = 2,88 c= 4,33 ~~ Global 
R= 0,993 R= 0,987 ~~ 
r~"i ·<:7)\W .. , r:;;•,··r ,'~!';_ •. :f~li":_'!fdJ/•·:·,' ; :' • •,'1: "'·"·· ~ ''":1 ~ . 
~ ~. ~)):': .. r.~· 
7.2.2.3 - Equações cinéticas 
Conforme já indicado anteriormente, é na construção das equações cinéticas 
que reside toda a dificuldade e, portanto, toda a arte da formulação dos modelos 
fenomenológicos dos processos ferrnentativos. São as equações cinéticas que indi-
cam corno as variáveis de estado do processo em estudo interferem nas velocida-
des de crescimento e morte celular, de geração de produtos metabólicos e de 
consumo de substrato. 
Para formular os modelos cinéticos, a partir de dados experimentais, é ne-
cessário executar três etapas básicas, descritas a seguir. 
Tratamento dos dados experimentais 
Entende-se por tratamento dos dados experimentais, medidos em laborató-
rio, a correção ou transformação dos mesmos buscando adequá-los à análise dese-
138 Modelagem matemática e simulação de processos ferrnentativos 
jada. Quando os ensaios são conduzidos em processos batelada e contínuo, a 
volume constante, deve-se tratá-los, por exemplo, desprezando pontos experimen-
tais que apresentem erros grosseiros, podendo-se, geralmente, trabalhar na análi-
se dos dados experimentais com base nas concentrações dos componentes (ou 
seja, as próprias variáveis de estado medidas). Em processos fermentativos, onde 
se obtêm altas concentrações celulares de microrganismos em biorreatores, são 
empregados processos operados em bateladas sucessivas ou bateladas alimenta-
das (volume variável) e, neste segundo caso, costuma-se tratar os dados, medidos 
em concentração, transformando-os em massa. Para o cálculo das velocidades es-
pecíficas e dos fatores de conversão, utiliza-se, efetivamente, a massa consumida 
ou produzida ao longo do processo. Normalmente, quando é realizada uma corre-
ção dos valores medidos, corrige-se apenas o volume do reator considerando ovo-
lume evaporado, alimentado, da amostragem e da adição de ácido ou base para o 
controle de pH. Contudo, não é considerado que, com a retirada de meio para 
amostragem, ocorram modificações no estado do processo, pois as massas de to-
dos os componentes do biorreator (substratos, produtos e células) são alteradas. 
Para tanto, necessita-se corrigir os valores experimentais das variáveis de 
estado, reproduzindo uma situação de ausência de perturbações, ou seja, a situa-
Ção na qual nenhuma massa de produto, substrato e célula estivesse sendo retira-
da. Por meio de balanços de massa, aplicados a cada variável de estado inerente 
ao processo, obtêm-se os valores em massa destas variáveis, já devidamente corri-
gidos. T AKANO et al. 20 mostram em seu trabalho que, quando ocorrem grandes 
perturbações do sistema, deve-se corrigir os dados experimentais antes de proce-
der ao cálculodas velocidades específicas e dos fatores de conversão, pois o erro 
destes parâmetros do processo torna-se significativo, podendo causar problemas 
quando da formulação e do ajuste dos parâmetros do modelo matemático, ou 
quando estes parâmetros do processo forem utilizados para o projeto do biorrea-
tor em escala industrial. 
Uma vez tratados os dados experimentais, procede-se à identificação do sis-
tema de reações metabólicas, obtendo-se uma primeira estimativa do~ fatores de 
conversão, conforme ilustrado na Etapa 1 do exemplo numérico. 
Cálculo das velocidades específicas 
Nessa etapa são calculadas as velocidades específicas de crescimento e de 
geração de produtos necessárias para identificar o comportamento cinético da po-
pulação microbiana; o cálculo das velocidades específicas de consumo dos subs-
tratos limitantes do processo é importante para identificar possíveis consumos 
desses substratos para manutenção. O cálculo das velocidades específicas de cres-
cimento e produção é o primeiro passo para uma boa formulação é ajuste de um 
modelo matemático de processos fermentativos. Sua importância reside funda-
mentalmente em dois aspectos: 
• formulação de relações cinéticas que, juntamente com os balanços de mas-
sa, são a base para a construção do modelo; 
• obtenção de estimativas preliminares dos parâmetros por meio de simpli-
ficações e linearizações do modelo a serem usadas, posteriormente, como 
ponto de partida nas metodologias para ajuste de parâmetros/l 
Fonnulação dos modelos matemáticos de processos fennentativos IJ 9 
Dessa forma, caracteriza-se a importância do cálculo cuidadoso das veloci-
dades específicas de crescimento e de produção de produtos metabólicos a partir 
dos dados experimentais, cálculo este que é dificultado pela forte influência que 
pequenas alterações das variáveis exercem sobre o cálculo da sua velocidade. A 
seguir são listadas as etapas de uma metodologia que pode ser empregada para o 
cálculo da velocidade específica de crescimento. 22 
(a) Detecção da fase de l:rescimento exponencial. Traça-se o gráfico (ln X) vs. (t) 
para diferentes limites iniciais e finais de tempo, determinando-se, através do melhor 
coeficiente de correlação, o início e a duração da fase exponencial de crescimento; o 
coeficiente angular da melhor correlação fornecerá o valor de 1-lm - velocidade especí-
fica máxima de crescimento. 
(b) Aprimoramento da curva de (X) vs. (t). Recuperando-se os valores de X que 
satisfazem a regressão linear escolhida na etapa anterior, aprimora-se a curva de 
(X) vs. (t) durante a fase exponencial. 
(c) Cálculo da velocidade especifica de crescimento. Com a nova curva (X) vs. (t) 
obtém-se a curva da velocidade específica de crescimento, utilizando-se um dos 
três métodos descritos a seguir: 
Método de ajuste polinomial. Ajusta-se um polinômio de grau n no tempo aos 
valores de X disponíveis, obtendo-se, desta forma, a função de X com o tem-
po. Análises visuais e quantitativas (através do coeficiente de correlação) de-
finem o grau do polinômio a ser ajustado. Obtido o polinômio, sua derivada 
fornece os valores da velocidade de crescimento, permitindo o cálculo das 
velocidades específicas no instante.23 
Método "splíne". Existem diferentes métodos ditos "spline" na literatura téc-
nica. Um dos métodos "spline" que pode ser empregado ajusta um polinô-
mio de grau n a um intervalo de dois pontos de X, incorporando um número 
de pontos "à frente" do intervalo a ser definido; além disto, o método obriga 
a que a derivada do polinômio _ajustado no intervalo anterior seja igual à de-
rivada do polinômio ajustado no novo intervalo, no ponto de intersecção 
(característica dos métodos "spline"). Através de testes visuais define-se o 
grau do polinômio a ser ajustado, bem como o número de pontos "à frente" 
incluídos no ajuste.24 
Método geométrico. Esse método calcula a circunferência que passa por três 
pontos (o valor de X correspondente ao instante de tempo no qual se quer 
calcular a velocidade de crescimento, o anterior e o posterior). A derivada é 
calculada pela tangente à circunferência no ponto25 -vide; neste mesmo vo-
lume, o Adendo ao Capítulo 6: Cinética de Processos Fermentativos . 
Para o cálculo das velocidades específicas de geração de produtos meta-
bólicos, utiliza-se um procedimento semelhante ao descrito para o cálculo da 
velocidade específica de crescimento. É .evidente que, quando a geração do 
produto não é totalmente associada ao crescimento, não é possível realizar as I' 
~ :~~i:,~~=~;~d~;~~i!::I::~:~·-~resc•m.en.to,. na medida em .qu~~ã~ exiSte .. . . --·~ 
140 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 2 
Será exemplificado o cálculo da velocidade específica de crescimento para o 
Ensaio 1, cujos dados foram fornecidos na Tabela 7.1. Sendo que 'o Ensaio 1 é, dos 
quatro ensaios fornecidos, aquele em que a quantidade de produto formada é me-
nor, será também o ensaio com possibilidade de apresentar o mais próximo de 
uma fase exponencial de crescimento. A seguir, serão aplicadas as três etapas des-
critas anteriormente para o cálculo da velocidade específica de crescimento. 
(1) Determinação da fase exponencial de crescimento- regressão linear dos 
dados de (ln X) vs. (t)- Figura 7.2. 
Ensaio 1 
• • • • 0,5 • 
o >< 
.f: o 4 6 8 
-0,5 
-1 
y = 0,5649 X- 0,9795 
R2 = 0,9996 
-1,5 
Tempo (h) 
Figura 7.2 - Definição da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (X= concentração celular em g/L) . . 
Para a definição da fase exponencial de crescimento assumiu-se que ela tem 
início no instante t =O h, na medida em que o Ensaio 1 foi realizado com 50 baixo, 
portanto, sem inibição pelo substrato. Assumiu-se também como desprezível a fase 
de adaptação. . 
·A Tabela 7.3 apresenta o resultado da determinação da fase exponencial de 
crescimento. 
• 
Tabela 7.3 - Resultados da determinação da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (Tabela 7.1 ). 
Duração da fase exponencial 
llm (h-1) R ; ~ (h) 
I~ 
2 0,565 0,9998 
1~·. 3 0,480 0,989 : 
4 0,402 0,975 
"l;: 
t 
5 0,358 0,973 
.. ~ ... 
~~ 
~:" ·i;~;-.~: ·.:t~:"' ~~t.i,k,;i .'!.:..:. rtcc <-:--!..:-'"· ~ 'P~'·"'· -;;~.:,_.,~~ar. ~,~,.J.: D 
Pelos resultados apresentados na Tabela 7.3, é evidente que uma possível 
fase exponencial para o Ensaio 1 tem a duração de 2 h e uma estimativa preliminar 
de flm é 0,565 h -1. . 
Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 14 I 
(2) Determinação da curva de (X) vs. (t), obtendo-se um melhor detalhamen-
to ao longo da fase exponencial, utilizando sua definição (regressão linear) obtida 
na etapa anterior. O gráfico de (X) vs. (t) é apresentado na Figura 7.3. 
3 
2,5 
:::::;-
2 
:9 1,5 
>< 
1 
0,5 
o 
o 2 4 6 8 
Tempo (h) 
Figura 7.3 - Gráfico de X em função do tempo, onde ( •) representa, além dos valores experimentais, os valores 
obtidos da definição da fase exponencial (Fig. 7.2) e(-) representa a curva traçada visualmente. 
(3) A partir dos dados de (X) vs. (t) obtidos com base na curva traçada na Fi-
gura 7.3, é obtido o gráfico de (/l) vs. (t), utilizando o método geométrico, descrito 
anteriormente, utilizando a planilha apresentada no Adendo ao Capítulo 6 deste 
volume. A Figura 7.4 apresenta o resultado dos valores de ll calculados, verifi-
cando-se a concordância da fase exponencial previamente definida, com o valor 
de Jl = llm (patamar da Fig. 7.4). 
0,7 
0,6 
0,5 
:ê' 0,4 ..--··-:( 0,3 
0,2 
0,1 
o 
o 2 4 6 8 
Tempo (h) 
Figura 7.4 - Gráfico da velocidade específica de crescimento calculada a partir da curva de X (Fig. 7 .3) utilizando o 
Método Geométrico2s. 
Identificação dos fenômenos . 
Nessa etapa busca-se definir os principais fenômenos que interferem no pro-
cesso produtivo em análise: limitações e inibições por substratos, principalmente 
no que se refere à existência e ao número de substratos limitantes e/ ou inibidores, 
tipo de produto gerado- existência ou não de associação com o crescimento,entre 
outros. 
142 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
Uma vez obtidos gráficos que permitem analisar o comportamento das velo-
cidades específicas de crescimento, de geração de produto metabólico e de consu-
mo de substratos, é possível identificar os principais fenômenos él serem incluídos 
na construção de um modelo matemático não estruturado de processos fermenta-
tivos. O Quadro 7.1 sintetiza os modelos cinéticos mais empregados para repre-
sentar os fenômenos comumente identificados em processos fermentativos, alguns 
dos quais já foram abordados em detalhe no Capítulo 6: Cinética de Processos Fer-
mentativos. 
EXEMPLO NUMÉRICO- ETAPA 3 
Com o intuito de exemplificar a identificaçãb dos fenômenos, necessária à 
construção do modelo matemático, será identificado qual tipo de inibição do cres-
cimento celular pelo produto (etanol) ocorre na fermentação alcoólica utilizada 
como caso estudo neste Capítulo. A Tabela 7.4 apresenta os dados de f.lx e P obti-
dos (por interpolação) para os ensaios definidos na Tabela 7.1, no instante em que 
a quantidade de 5 residual no biorreator é igual para todos os 4 ensaios - foram 
consideradas duas situações 5 = 20,0g/L e 10,0 g/L. 
Quadro 7 .I - Modelos cinéticos não estruturados, descritos na literatura, para representação 
de diversos fenômenos identificados em processos fermentativos. 
(1) Crescimento num único substrato limitante: 
(MONOD)26 
- J.lrnsn (MOSER)27 
f.lx- K~ +Sn • 
J.lrnS (CONTOIS)
28 
f.l x = 
K5 X+S 
(2) Morte celular: 
f.lct =-Kct (SINCLAIR; KRISTIANSEN)15 
(3) Crescimento num único substrato limitante e inibidor: 
l-las 
1-lx = . 2 
5 K +5+-
s K -• 
(ANDREWS/9 
(7.20) 
(7.21) 
(7.22) 
(7.23) 
(7.24) 
Formulação dos modelos matemáticos de processos ferrnentativos 143 
Quadro 7 .I - (continuação) 
(WU et al/0 (7.25) 
(4) Crescimento com múltiplo substrato limitante (uso preferencial de 51): 
(5) Crescimento com múltiplo substrato limitante (uso simultâneo de 51 e 
(MEGEE et al.)32 (7.27) 
(TSAO; HANSON)33 (7.28) 
(6) Consumo do substrato limitante para manutenção: 
(PIRT)34 (7.29) 
1 S -5* =-- +m +Ll max ----
Jl s Y x/ s J.l X s J.l s K * + S - S * 
(ZENG; DECKWER)35 (7.30) 
(7) Produção de produto metabólico associado e não associado 
ao crescimento: 
(LUEDEKING; PIRET modificado)36 (7.31) 
íl.....____ ---- - --· ·· ·· ·- . - ·-·· --~----·. -- ------ - - ---·-···-- ------ .-------- - -·---- . --------- - -- --- - - -
144 · Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
Quadro 7.1 -(continuação) 
(8) Produção de produto metabólico inibitório: 
(7.32) 
I s K' 
f.!=~ p 
P K'+SK'+P s p 
(AIBA; SHODA)37 (7.33) 
(7.34) 
f.!~S -K·P f.! - e p 
P- K' +5 
s 
(AIBA et al.)38 (7.35) 
(7.36) 
- f.!~S (1 p J 
f.! P - K ~ + S - P:n 
(GHOSE; TYAGI)39 (7.37) 
onde: f.!x .. ... velocidade específica de crescimento • 
f.!ct .. ... velocidade específica de morte 
f.!p ..... velocidade específica de produção 
f.!s ..... velocidade específica de consumo de substrato 
S, Sv 52, 53 •••• concentrações de substratos limitantes 
5* .... . concentração de S para manter f.!x 
X ..... concentração celular 
P .. ... concentração de produto 
Yx/s ... fator de conversão de substrato em células 
m • ..... consumo de substrato para manutenção 
f.!m, K., n, Kct, f.!a, K;, f.!m1' f.!mz, K.v K.z, K.3, 
f.!o, f.! I, f.!z, l1f.! :;ax, K*' O., J3m, K~., KP, f.!~' 
K , K' P P' ~ t . 't" s, p, mt rn ... . .. param e r os Cine lCOS 
Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 145 
Tabela 7.4 - Valores de llx e P quando Sresidual = 20 e I O g/L 
Sresidual = 20,0 g/L 
Ensaíos 
Sresidual = 10,0 g/L 
,_ 
p (g/L) f.!x (h -1) p (g/L) f.!x (h -1) 
1 2,12 0,565 4,78 0,255 
2 1&',0 0,219 21,2 0,161 
3 30,0 0,129 33) 0,0901 
4 50,5 0,0523 54,7 0,0364 
-~-
' ' "' 
-- ' '-· 1 '- -· ,. '.:r,..· 7•· ·--.- .· ,. ,,. 
As Figuras 7.5 a 7.7 apresentam a representação das formas linearizadas das 
3 diferentes alternativas de modelo para a inibição do crescimento celular pelo 
produto consideradas neste Capítulo (vide Quadro 7.1). 
(1) Inibiâo hiperbólica:37 
onde 
(2) Inibição exponencial:38 
(3) Inibição linear:39 
1 1 1 
-=-+---P 
• *K 1-L x 1-Ls 1-Ls p 
• 
11 =li•- 1-Ls P 
r- x r-s p 
m 
(7.38) 
(7.39) 
(7.40) 
Pelos resultados apresentados nas Figuras 7.5 a 7.7, é evidehte que o modelo 
cinético de inibição do crescimento microbiano pelo produto, que representa ade-
quadamente os dados experimentais de fermentação alcoólica, é o modelo de ini-
bição exponencial38 (Fig. 7.6). · _ 
L_ - -· --- -- ---·· -·· - ··--- - ·- ------------- --- -·-··------·------ -----· -------·- --
146 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
(A) S = 10 g/L 
30 
25 • y = 0,4773x- 1 ,4723 
20 R2 = 0,8937 
:2 
15 ....... . 
.f 10 
5 • o 
o 20 40 60 
p (g/L) 
25 
20 
;s 15 
X 
~ 10 
5 
o o 
• 
(B) S = 20 g/L 
y = 0,3597x - 0,745 
R2 = 0,9277 
20 40 
p (g/L) 
Figura 7.5 - Tentativa de representação da inibição pelo produto através do modelo hiperbólico. 
37 
(A) S,esidual = I 0,0 g/L e (B) S,esidual = 20,0 g/L. 
(A)S=10g/L (B) S = 20 g/L 
3,5 3,5 
3 3 
2,5 
~ 
2,5 
~ 2 2 c .E: 
' 1,5 1,5 
• 
y = 0,0397x + 1 ,094 1 y = 0,0486x + 0,5484 
0 ,5 R2= 0,9897 0,5 R2 = 0 ,9933 
00 20 40 60 00 20 40 
p (g/L) p (g/L) 
Figura 7.6 - Tentativa de representação da inibição pelo produto através do modelo exponencia1.38 
0,3 
0,25 • 
0,2 
,s 0,15 
X 
~ 
0,1 
0,05 
o o 
(A) S,. ,;dual = I 0,0 g/L e (B) Sresidual = 20,0 g/L. • 
(A) S = 10 g/L 
y = -0,0044x + 0,2615 
R2 = 0,9612 
20 
p (g/L) 
,s 
X 
~ 
60 
0,6 
0,5 • 
0,4 
0,3 
0,2 
0,1 
o 
-0,1 o 
(B) S = 20 g/L 
y = -0,0101 X+ 0,496 
R2 = 0,8325 
• 
20 40 
p (g/L) 
Figura 7.7 - Tentativa de representação da inibição pelo produto através do modelo linear39 
(A) S,.,;dual = I 0,0 g/L e (B) S,.,;dua = 20,0 g/L. 
60 
60 
60 
Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 147 
7.2.2.4 - Modelos fenomenológicos não estruturados com culturas mistas 
A existência de múltiplas populações de microrganismos num processo fer-
mentativo provocará o aparecimento de interações, nas quais uma população 
exercerá algum efeito sobre as outras. Considerando duas espécies microbianas A 
e B, três tipos de interações poderão ocorrer entre elas: um efeito positivo(+) (be-
néfico), um efeito negativo(-) ou um efeito neutro (0). O Quadro 7.2 ilustra as di-
ferentes alternativas de interações entre as diversas populações microbianas 
presentes num processo fermentativo. 
A formulação dos modelos não estruturados com culturas mistas segue a 
mesma estratégia já apresentada para os modelos com culturas puras, sendo a ób-
via e única dificuldade adicional a necessidade de medir e identificar os fenôme-
nos inerentes a cada população integrante do sistema. O leitor interessado poderá 
encontrar mais detalhes sobre modelos não estruturados com culturas mistas em 
FREDRICKSON; TSUCHIYA.7 
Quadro 7.2 - Diferentes interações entre populações microbianas. 
População microbiana 
Tipo de interação 
A B 
Neutralismo o o 
Mutualismo + + 
Competição 
Comensalismo o + 
+ o 
Parasitismo ou Predação + 
+ 
Amensalismo o 
o 
7.2.3 - Modelos fenomenológicos estruturados 
Entende-se por crescimento balanceado o crescimento microbiano no qual a 
velocidade de produção de um componente da biomassa por unidade de biomassa 
é constante, igual para todos os componentes da biomassa e igual à velocidade es-
pecífica de crescimento da própria biomassa. Somente nessa condição de cresci-
mento é que a formulação de modelos não estruturados é perfeitamente 
justificada. Na prática o crescimento balanceado só ocorre no estado estacionário 
em fermentações contínuas e durante a fase exponencial de crescimento em fer-
! 
~ 
I 
I 
·- . . J 
148 Modelagem matemática e simulação de processos fennentativos 
mentações em batelada. Dessa forma, na maioria dos casos, a caracterização da 
atividadebiológica simplesmente pela concentração total de biomassa é insufici-
ente para uma representação adequada de dados experimentais ·pelo modelo ma-
temático formulado. 40' 41'42 Vários experimentos têm mostrado que a composição da 
biomassa de uma população microbiana varia em resposta a alterações nas condi-
ções do ambiente. Variações na composição da biomassa são acompanhadas por 
alterações na natureza de processos subcelulares. Essas variações na atividade da 
biomassa por unidade de concentração de biomassa podem ser causadas por: 
• perda de plasmídeos; 
• indução e repressão de genes; 
• variação no conteúdo de RNA da célula microbiana; 
• variação no conteúdo enzimático da célula microbiana; 
• acúmulo de materiais de reserva da célula microbiana; 
• alterações morfológicas, por exemplo ramificação de organismos filamen-
tosos, relação volume/superfície de células de leveduras e bactérias, etc. 
Essas variações na atividade e composição da biomassa microbiana reque-
rem uma descrição mais complexa do metabolismo celular e uma estratégia mais 
estruturada para modelar a cinética microbiana. Em geral, é muito difícil obter ex-
perimentalmente um conhecimento mecanístico, a respeito do metabolismo celu-
lar, para o desenvolvimento de um modelo estruturado "realista". A estimativa de 
parâmetros pode ser muito difícil e a aplicação de métodos numéricos complexos 
pode facilmente levar a resultados sem significado físico. Por esse motivo, mode-
los estruturados de processos fermentativos raramente são utilizados com vistas à 
utilização no projeto de biorreatores e na implementação de uma estratégia de 
controle. 
Além das dificuldades acima expostas, um cuidado adicional deve ser toma-
do na formulação dos modelos estruturados, quando da montagem das equações 
de balanço para os componentes intracelulares - deve ser considerado um termo 
de diluição do componente provocado pelo crescimento celular.43 • 
Não serão apresentados mais detalhes dos modelos estruturados de proces-
sos fermentativos, em função da sua complexidade e das questões práticas já 
apontadas, que dificultam sua utilização. O leitor interessado poderá encontrar na 
literatura especializada excelentes revisões e textos que lhe permitirão aprofundar 
seus conhecimentos nessa categoria de modelos.43 
7.3 - Ajuste de parâmetros do modelo formulado 
Em um processo fermentativo, conduzido num biorreator homogêneo, o 
modelo formulado, conforme detalhado no item anterior, é representado por 
equações matemáticas do tipo equações diferenciais ordinárias de condição inicial 
(EDO). O ajuste do modelo aos dados é feito pelo cálculo do melhor conjunto de 
parâmetros, que tornam mínima a diferença entre os dados previstos pelo modelo 
e os dados experimentais. 
O problema de estimação de parâmetros em EDO pode ser resolvido, em 
princípio, por duas abordagens distintas:44 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado 14 9 
• diferenciação dos dados experimentais, para obtenção direta dos valores 
das velocidades de reação; neste caso, transforma-se o problema em um de 
estimação com equações algébricas- é o chamado "método diferencial"; 
dependendo do modelo, as equações podem ser linearizadas, facilitando a 
obtenção dos parâmetros (vide item 7.3.1); 
• integração analítica (quando o modelo é simples) ou numérica das EDO 
do modelo, ajustando-se o modelo aos dados diretamente medidos- é o 
chamado "método integral indireto" (vide itens 7.3.2 e 7.3.3). 
A primeira técnica é conceitualmente simples, mas apresenta um inconveni-
ente bastante sério na operação de diferenciação de dados experimentais. Essa 
operação costuma ampliar drasticamente os erros experimentais, levando a valo-
res pouco confiáveis das derivadas, especialmente se o conjunto de dados não for 
denso e se a dispersão dos dados não for pequena. A segunda técnica é conceitual-
mente mais adequada, mas requer maior esforço computacional. 
7.3.1 - Linearização do modelo 
Essa técnica, conceitualmente simples, de ajuste de parâmetros de um mode-
lo matemático de um processo fermentativo, exige a diferenciação dos dados ex-
perimentais, obtendo-se valores das velocidades específicas de crescimento e/ ou 
produção. Se for tomado como exemplo um crescimento microbiano num biorrea-
tor operado em batelada e que obedece à cinética de Monod, obtém-se o seguinte 
modelo matemático: 
dS 1 dX 
dt = ; Yx;s dt 
(7.41) 
(7.42) 
Nesse modelo existem 3 parâmetros a serem ajustados a um conjunto de da-
dos experimentais: Jlm, K5 e Yx;s· Esse ajuste pode ser obtido através de 2 regres-
sões lineares. A primeira correlaciona o inverso da velocidade específica de 
crescimento (1/J.t)o com o inverso da concentração de substrato (1/5)0 no instante 
inicial, conhecido como o gráfico de Lineweaver-Burk, onde o coeficiente angular 
é igual a (K5 /Jlm) e o coeficiente linear a (1/J.tm) (Fig. 7.8) . 
Geralmente, sugere-se construir o gráfico de Lineweaver-Burk a partir de 
valores iniciais de 1 I Jl e 1 I S obtidos para diferentes ensaios (nos quais é determi-
nada a velocidade específica de crescimento inicial para diferentes valores de S no 
instante inicial), visando reduzir possíveis efeitos inibitórios de produtos metabó-
licos gerados durante o crescimento microbiano, na velocidade específica calcula-
da. É claro que, se o intuito for determinar a existência ou não desses efeitos, é 
interessante traçar o gráfico de Lineweaver-Burk a partir de um ou mais ensaios, 
mas considerando relações entre 1/Jl e 1/S em diferentes tempos de crescimento. 
L ___ _ 
I SÓ Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
A partir do gráfico da Figura 7.81 é possível obter a estimativa dos valores de 
Jlm e Ks. 
25~--------------------------~ 
20 
~ 15 
.! 10 ..... 
5 
y = 1,7112x + 3,3244 
R2 = 0,992 
o+--------.-------.---------l 
o 5 10 15 
1/S (Ug) 
Figura 7.8 - Gráfico de Lineweaver-Burk para o cálculo de 1-lm e Ks para o crescimento em batelada segundo o mo-
delo cinético de Monod. Os dados do gráfico são apenas ilustrativos, não refletindo valores obtidos experimentalmente. 
= 1 =0 301 h-1 
Jlm 3 3244 1 
I ' 
Ks =117112 *Jlm =01515g/L 
A segunda regressão linear para ajuste dos parâmetros do modelo proposto 
correlaciona os dados disponíveis de X produzido em relação ao consumo de S 
para diferentes intervalos de tempo. O coeficiente angular dessa correlação é igual 
ao parâmetro Yx;s (Fig. 7.9). 
A regressão linear representada no gráfico da Figura 7.9 permite obter o va-
lor de Y x;s: . 
Yx;s = 01545g I g 
• sendo que o coeficiente linear da regressão deveria ser nulo; o valor 01076 obtido 
reflete imprecisões do modelo e erro experimental inerente a dados obtidos em la-
boratório. 
120 
100 
::J 80 :§ 
o 60 X 
' 
>< 40 
y = 0,545x + 0,076 
20 R2 = 0,991 
o 
o 100 200 300 
SO- Si (g/L) 
Figura 7.9 - Gráfico para obtenção de Y x;s· Os dados do gráfico são apenas ilustrativos, não refletindo 
valores obtidos experimentalmente. 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado I 5 I 
DOWD; RIGGS45 avaliaram estatisticamente qual a melhor forma de lineari-
zar a equação de Michaelis-Menten para a cinética enzimática, aplicável, por ana-
logia, ao ajuste do modelo de crescimento segundo Monod. Propuseram 3 formas 
diferentes de linearização: 
(7.43) 
(7.44) 
(7.45) 
Nesse estudo estimativas de K5 e J.lm, obtidas a partir de "dados experimentais" 
(construídos introduzindo um erro aleatório em dados simulados), são compara-
das em cada caso com os seus valores verdadeiros (utilizados na simulação para 
obtenção dos dados sem erro), de modo que o comportamento das transformações 
(7.43) a (7.45) foi avaliado. O resultado dessa análise pode ser assim sintetizado: 
• obter estimativas de J.lm e K5 pelo método de Lineweaver-Burk (3." transfor-
mação) eram destacadamente as menos confiáveis, qualquer que fosse o erro 
na determinação de J.t; . 
• plotar (SI J.l) contra (S) é ligeiramente melhor do que plota~ (J.t) contra (J.t/ S), 
quando o erro nos valoresde J.l é pequeno, mas o inverso ocorre quando o 
erro de J.l é grande (situação que geralmente ocorre nos processos fermentati-
vos); 
• plotar (J.t) contra (J.t/ S) tem a vantagem adicional de avisar o pesquisador 
quando os seus dados desviam da relação teórica visto que, normalmente, 
este ajuste exagera esse desvio; 
• utilizar a transformação de Lineweaver-Burk leva à obtenção de um bom 
ajuste, mesmo com pontos não confiáveis - esta pode ser a justificativa 
para a popularidade desta transformação. 
EXEMPLO NUMÉRICO- ETAPA 4 
Ajuste para o modelo de fermentação alcoólica18.19 a partir de hidrolisado de 
mandioca em um sistema batelada. O modelo matemático não estruturado, pro-
posto após a identificação dos principais fenômenos envolvidos no processo (vide 
discussões nas etapas 2 e 3), é composto pelas eqs. (7.46) a (7.50). 
(7.46) 
'I 
r 'r 
I 
I I 
:i 
I, 
' l 
I 
I 52 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
onde: 
-= --flxX +--flpX dS {1 1 ) 
dt Yx;s Yr;s 
dP 
-=flpX 
dt 
flraS -K' P 
fl = e " 
p 52 
K5' +5+-
K~ 
I 
(7.47) 
(7.48) 
(7.49) 
(7.50) 
A seguir será exemplificada a obtenção da estimativa preliminar dos parâ-
metros através da linearização e simplificação do modelo, e seu ajuste aos dados 
experimentais (Tab. 7.1). 
(1) Estimativa de KP e K~ 
A partir das equações (7.49) e (7.50), obtém-se: 
• 
(7.51) 
(7.52) 
onde: f.!: e fl~· são os termos funções de Sem flx e f.!p, quando Sé constante. 
Para um valor de S constante, por exemplo, S = 10g/L (utilizando o mes-
mo procedimento exemplificado na Etapa 3 para identificação do tipo de inibi-
ção pelo produto) são traçados os gráficos de ln(f.!x) vs. P (Fig. 7.6(A)- Etapa 3) 
e ln(f.!p) vs. P (Fig. 7.10) com os dados de flx, flp e P correspondentes a esse valor 
de S nos 4 ensaios disponíveis. Os coeficientes angulares das retas ajustadas 
são as estimativas de KP e K~. Pela metodologia proposta, torna:-se evidente 
que a estimativa obtida será tão mais precisa quanto maior for o número de en-
saios disponíveis. 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado 153 
0,8 .,--------- -----, 
0,7 
0,6 
~ 0,5 
~ 0,4 
0,3 • 
0,2 
.0,1 ~ y = 0,0142 X + 0,0219 
R2 = 0,9674 
o+----.~~~~~-~ 
o 20 40 60 
p (g/L) 
Figura 7 .I O - Gráfico para obtenção da estimativa de K~ . 
(2) Estimativa de 1-lxa, K5, 1-lPa e K ~ 
Para um ensaio com valores de 5 suficientemente baixos (Ensaio 1, por 
exemplo), é possível desconsiderar a existência dos termos de inibição das veloci-
dades específicas de crescimento e produção pelo substrato (eqs. 7.49 e 7.50, ter-
mos 52 I K; e 52 I Ki). Dessa forma, é possível linearizar essas equações. 
e -KPP Ks 1 1 
--=---+-- (7.53) 
1-l x 1-lxa 5 1-l xa 
e -K~P Ks 1 · 1 
--=---+-- (7.54) 
1-lp 1-l Pa 5 1-l Pa 
Com os valores de KP e K~ estimados no item ,anterior, é possível traçar os grá-
ficos de (e-KPP I 1-lx) vs. (1/5)- Fig. 7.11(A) e (e -KPP /~-t p ) vs. (115)- Fig. 7.11(B), 
com os dados de P, 5, 1-lx e 1-lP disponíveis para o Ensaio 1. Os coeficientes lineares e 
angulares das retas ajustadas fornecerão as estimativas de 1-lx., K5, 1-lPa e K~. 
(A) (B) 
160 70 
g 140 60 n. 
)( 120 ~ 50 
~ 100 fl-~ a.. Q.OJ 40 a. 80 li:::--
f 60 l~ 30 a. a. 20 )( 40 )( Ql Ql y = 3,3837x + 0,9144 
20 y = 8,3514x + 2,2624 10 
R2 = 0,9975 R
2 = 0,9978 
o o 
o 10 20 o 10 20 
1/S (Lig) 1/S (Lig) 
Figura 7 .li - Gráficos para obtenção das estimativas de (A): f.!x. e Ks e (B): f.! ra e K~. 
154 Modelagem matemática e simula~o de processos fermentativos 
(3) Estimativa de Ki e Ki 
Para um ensaio com valores de S suficientemente elevados (início do Ensaio 
4, por exemplo), é possível desprezar os valores de K5 e K~ nas equações das velo-
cidades específicas (eqs. 7.49 e 7.50). Dessa forma, é possível linearizar essas equa-
ções. 
e~KP P 1 1 
--- S+- (7.55) 
f.lx Kifl xa f..lxa 
e -K~ P 1 1 
--=--5+- (7.56) 
f.lp Kif-lPa flPa 
Com os valores de Kp e K~ estimados anteri9rmente, é possível traçar os grá-
ficos de (e -K.P I f.l x) vs. S- Figura 7.12(A) e (e -K.P I f.lp) vs. S- Fig. 7.12(B) com 
os dados de P, S, f.lx e f.lp disponíveis para valores elevados de S no início do Ensaio 
4. Os coeficientes angulares das retas ajustadas fornecerão as estimativas de Ki e 
Ki, considerando os valores de f.lxa e f.lra estimados novamente através dos coefici-
entes lineares das retas ajustadas. 
(A) (B) 
3 4 
;s 2,5 
~ 
3,5 
/. >< a. 3 ~ 2 :I. 11.. ~Oi 2,5 ~ 1,5 ~:c; 2 ...!.,.. iCl 1,5 a. ~~ 
X y = 0,0037 X + 1 ,6498 a. 1 y = 0,0123x + 0,6599 Q) 
0,5 
X 
R2 = 0,9541 
Q) 0,5 . R2= 0,9151 
o o 
o 100 200 300 o 100 200 300 
S (g/L) S (g/L) 
Figura 7.12 - Gráficos para obtenção das estimativas de (A): K; e (B): Kí . 
( 4) Estimativa de Y x1s e Yp1s 
Na construção do modelo assumiu-se que Yp15 é um parâmetro fixo e igual a 
0,511 (conversão estequiométrica de glicose em etanol) . Dessa forma, todas as 
"ineficiências" do sistema estarão incluídas no valor de Yx1s estimado. A estimati-
va de Y x1s é obtida correlacionando o L1X produzido com o l1Sx consumido (subs-
trato consumido para produzir X, obtido descontando do total de substrato 
consumido o substrato consumido para produzir P) para os 4 ensaios disponíveis. 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado 155 
A Figura 7.13 apresenta o gráfico de (L1X) vs . (L1Sx), cujo coeficiente angular da reta 
que passa pela origem, fornece a estimativa de Yx;s· 
A Tabela 7.5 apresenta o resultado da estimativa dos parâmetros para o mode-
lo matemático da fermentação alcoólica do hidrolisado de mandioca operada em ba-
telada, ajustado preliminarmente aos dados experimentais disponíveis (Tab. 7.1). 
i 35 
30 
~ 25 
-9 
20 ô 
>< 15 ' 
8. 10 
5 
o 
o 50 
• 
y = 0,2158 X 
R2 = 0,9399 
100 
(S0 - S;).(g/L) 
Figura 7.13 - Gráfico para obtenção da estimativa de Y XJS · 
7.3.2 - Integração analítica do modelo 
150 
Essa técnica para estimativa de parâmetros só é aplicável para casos em que 
o modelo matemático é bastante simples, permitindo uma integração analítica do 
seu sistema de equações diferenciais ordinárias. ONG46 desenvolveu o ajuste de 
parâmetros para um crescimento microbiano num biorreator operado em batelada 
e que obedece à cinética de Monod (eqs. 7.41 e 7.42). 
Integrando a eq. (7.42) obtém-se: 
X=X 0 +Yx;s (50 -S) (7.57) 
Substituindo as eqs. (7.41) e (7.57) na eq. (7.42), rearranjando e integrando, 
obtém-se: 
s s t 
J Ks+ dS=-J.lm Jdt 
s S[Xo +Yx;s(So -S)] Yx; s o 
o 
(7.58) 
!1n~ = b {In [1 + a(S0 - S)]} _ d 
t 50 t 
(7.59) 
onde: 
Yx;s a=-- (7.60) 
Xo 
156 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
b = 1 + _(X_o_+_Y x--'-;_sS_o_) 
Yx;sKs 
d = llm (Xo + Y x;sSo) 
Yx;sKs 
(7.61) 
(7.62) 
Portanto, b e d podem ser obtidos por regressão linear (da eq. 7.59) desde que 
se conheça a. 
Tabela 7.5 - Estimativa preliminar dos parâmetros do modelo obtidos por linearização e simplificação do modelo. 
Parâmetro Valor estimado 
·'" 
llxa (h-1) 0,524(a) I;' 
J.lra (h-1) 1,305(a) I 
Ks (g/L) 3,69 
K' s (g/L) 3,70 
Ki (g/L) 446 ' 
K' (g/L) 53,7 l5 1 . 
KP (L /g) 0,0442 
I'<" 
K' p (L /g) 0,0142 
~ ~~ 
Yx/s (g/g) 0,216 
Yp/s (g/g) 0,511 (fixo) 
,. 
(a) Média dos valores estimados quando da estimativa 
de K5 , K~ e Ki, Kj. ' 
.. - ' .•,; " - . c .. 
Estatisticamente, uma regressão linear pode ser avaliada pelo valor do coefi-
ciente de correlação r, dado por: 
(7.63) 
onde: n ... número de pares de pontos (x, y) a serem ajustados 
ln [1 +a( 50 - S)] X= ------=---
(7.64) 
t . 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado I 57 
ln (S- 50 ) (7.65) y=--_____;;-
t 
A solução do ajuste de parâmetros do modelo (J..lm, K5 e Yx;s) reduz-se, então, 
à solução do seguinte problema de otimização: "Minimizar a função objetivo: -r2 = 
f (a), sujeita às condições a > O e eq. (7.64) e (7.65)". 
Os valores de b e d sãb obtidos pelas equações: 
b = (nLxy- LXLY) 
nLx 2 -(LX) 2 
d = (Ly- bLx) 
n 
(7.66) 
(7.67) 
Assim como o método de ajuste do modelo por linearização, essemétodo 
por integração também deve ser utilizado com muito cuidado, pois também resu-
me o problema de estimativa de parâmetros numa linearização por transforma-
ção de variáveis. Há alguns sérios inconvenientes em usar transformações de va-
riáveis, entre os quais podemos destacar: 
• as faixas de variações de logaritmos (por exemplo, utilizados na transfor-
mação de variáveis) podem ser muito diferentes das faixas de variações 
das variáveis de origem (no caso dos logaritmos, muito menores); 
• ao utilizar a equação linearizada, o que estará sendo minimizado é a dife-
rença quadrática (quando esta for a forma de cálculo dos resíduos) entre a 
forma transformada "experimental" e a calculada; os parâmetros assim 
obtidos não serão 'necessariamente ótimos em relação aos desvios da va-
riável original; 
. · - -. 
• as variáveis transformadas podem não preservar as propriedades da dis-
tribuição de erros das variáveis originais do problema, o que pode consti-
tuir uma objeção muito séria sobre a validade do procedimento. 
AUGUSTO et al.47 tentaram utilizar o ajuste de parâmetros por regressão linear 
a partir da integração do modelo, aplicado ao crescimento microbiano obedecendo 
à cinética de Andrews, sem conseguir bons resultados pelos motivos expostos aci-
ma. 
7.3.3 - Integração numérica e ajuste por regressão não-linear 
A estimação de parâmetros recai, na grande maioria dos casos, em problema ~­
de regressão não-linear, envolvendo o uso de métodos numéricos de minimização 
da função objetivo através de procedimentos iterativos.48 No caso do ajuste de pa-
râmetros, a função objetivo a ser minimizada reflete o resíduo calculado entre os 
valores experimentais e os valores simulados das variáveis de estado. Os proble-
mas freqüentemente encontrados ao efetuar regressões não-lineares são: 
• aproximação numérica de derivadas parciais; 
158 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
• obtenção de uma estimativa inicial adequada dos parâmetros; 
• existência de mínimos locais na função objetivo, isto é, a função resíduo 
apresenta · diversos valores mínimos, que atraem a solução do método 
de regressão empregado, dificultando a convergência para o mínimo 
absoluto; 
• a própria escolha da função objetivo mais adequada (mínimos quadrados, 
máxima verossimilhança, etc.); 
• interação entre parâmetros, o que pode levar a grandes intervalos de con-
fiança dos parâmetros. 
Este último problema é ainda mais acentuado quando o modelo contém ex-
pressões hiperbólicas, e este é freqüentemente o caso em processos fermentativos 
-por exemplo, modelos derivados da expressão de MONOD.49 
Entre os métodos disponíveis para resolver problemas de ajuste de parâme-
tros por regressão não-linear podem ser citados:50'51 
• Métodos de ordem "0". Métodos que não exigem o cálculo das derivadas 
das EDO em relação aos parâmetros do modelo. O método de ordem "O" 
mais utilizado é o de Nelder & Mead ou método dos poliedros flexíveis. 
• Métodos de 1." ordem. Métodos que necessitam do cálculo das derivadas das 
EDO em relação aos parâmetros do modelo. Os métodos de t.• ordem 
mais conhecidos são os de Gauss-Seidel, Gradiente e Marquardt,52 sendo 
este último o mais empregado no ajuste de parâmetros de modelos mate-
máticos pela sua alta eficiência computacional. 
Entretanto, o método de Nelder & Mead tem se mostrado mais efetivo em 
comparação ao método de Marquardt, quando o número de parâmetros a serem 
estimados é muito grande, casá c:,ios modelos matemáticos de processosfermenta-
tivos. Por es~e motivo, será detalhado apenas o método de Nelder & Mead de oti-
mização para estimativa de parâmetros por regressão não linear. • 
7.3 .3.1 - Métodos dos poliedros flexíveis (NELDER & MEAD?' 
Há muito tempo sabe-se que determinar o mínimo de funções de n variáveis 
pelo conceito mais simples- caso do estabelecimento de uma rede de pontos em 
e e valorando-se a função em cada ponto desta rede, ou a busca de um mínimo 
através de movimentos randômicos - é extremamente ineficiente. O método de 
Nelder & Mead é um método simplex geométrico flexível, conhecido como o mé-
todo dos poliedros flexíveis. O método dos poliedros flexíveis minimiza uma fun-
ção de n variáveis independentes, usando (n+l) vértices de um poliedro no espaço 
En ~ Cada vértice é definido por um vetor x (neste caso, por um conjunto de parâ-
metros). O vértice em e que fornece o maior valor da função objetivo (neste caso 
o maior resíduo entre as variáveis calculadas e as variáveis experimentais) é proje-
tado através do centro de gravidade dos vértices remanescentes. Melhores (meno-
res) valores da função objetivo são obtidos, substituindo, sucessivamente, o ponto 
com maior valor de f(x) por pontos melhores, até se obter o mínimo de f(x). 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado I 59 · 
Sejam: 
i=1, ... ,n+1 
i-ésimo vértice em e no k-ésimo estágio da busca 
f [!~k) ] valor da função objetivo no vértice <k) 
!~~)2 centro de gravidade de todos os vértices excluído !hk) 
x<k) . =_!_~(~x~k))-x<~>] j = 1, ... , n 
- n+2,J n L. IJ hJ 
i=l 
(7.68) 
onde o índice "j" designa cada coordenada do vértice. 
O procedimento para obter um vértice em En no qualf(x) tem um valor "me-
lhor", envolve 4 operações descritas a seguir. 
(1) Reflexão: Refletir !hk) através do centro de gravidade !~~)2 
x<k) = x<k) +a(x(k) - x<k)) 
-n+3 - n+2 -n+2 -h 
(7.69) 
onde a > O ... é o coeficiente de reflexão. 
x<k) =x(k) +y(x(k) -x(k) ) 
-n+4 - n+2 -n+3 -n+2 
(7.70) 
onde y > 1 ... é o coeficiente de expansão. 
Se f [!~:_>4 ]<f [!\k) 1 substituir!~) por !~l4 e continuar do passo (1) com k = 
k+l. Caso contrário, substituir!~) por !~l3 e continuar do passo (1) com k = k+l. 
~-. ·-·· -o- -· ---··- ----- --,--~-- --- -· -·-:--- -- ---- ----- -- -........ ,, ______ .. - •. . -·-. 
I 
I 
I 
_______ j 
I 60 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
(3) Contração: Se f L!.~:l3 ]>f [!~k) 1 para todo i =t h, contrair o vetor (!hk) - !~:)2 ), cal-
culando: 
x(k) = x(k) + A(x(k) _ x(k) ) 
-n+S -n+2 1-' -h -n+2 
(7.71) 
onde O < p < 1 ... é o coeficiente de contração. 
Substituir !hk) por !~:ls e continuar do passo (1) com k = k+l. 
(4) Redução: Se /[!~::3 ]> f[!hk)] reduzir todos os vetores (!~k) -!\kl), i= 1, 2, ... , 
n+1, por um fator de meio, a partir de !\k), calculando: 
x\k) =x(k) +0 S(x\kl -x(k)) i= 1, ... , n+1 
-1 -1 I -1 -1 
(7.72) 
e continuar do passo (1) com k = k+l. 
O critério usado por Nelder & Mead para término da busca, consiste em ve-
rificar se: 
(7.73) 
isto é, a convergência ocorre se a raiz quadrada da média dos quadrados das dife-
renças entre a função objetivo calculada em cada vértice e a função objetivo calcula-
da no centro de gravidade for menor que um determinado valor s. A Figura 7.14 
apresenta um fluxograma que ilustra a aplicação do método dos poliedros flexíveis 
para a solução de um problema de otimização. 
Os valores de a, p e y recomendados por Nelder & Mead são: a = 1, p = 0,5 e 
y = 2. Na prática observa-se, entretanto, que seria necessário ajustá-los caso a caso. 
PICCOLI et al. 53 estabeleceram os seguintes valores ao ajustar modelos com 9, 13 e 
24 parâmetros: a= 1,0, p = 0,8 e y = 1,5. 
Trabalho recente de AUGUSTO et al.47 buscou comparar a aplicação do méto-
do de regressão não-linear sem cálculo de derivadas (poliedros flexíveis de Nelder 
& Mead), e com cálculo de derivadas (Marquardt), ao ajuste dos parâmetros de 
dois modelos de processos fermentativos. Para um processo descontínuo de cres-
cimento microbiano com um único substrato limitante e inibitório (modelo com 4 
parâmetros), a metodologia de Marquardt levou a um ajuste satisfatório para um 
maior número de casos (por "caso" entendem-se diferentes formas de cálculo do 
resíduo e diferentes estimativas iniciais dos parâmetros) em relação ao método 
dos poliedros flexíveis; no que se refere ao tempo de processamento, o método de 
Marquardt, como era de se esperar, mostrou ser muito mais eficiente na grandemaioria dos casos testados. Para um processo que, além dos fenômenos descritos 
no caso anterior, apresenta também a formação de um produto metabólico asso-
ciado e não associado ao crescimento, e que inibe o processo (modelo com 8 parâ-
Ajuste de parâmetros do modelo fonnulado 161 
metros), quando a mesma forma de cálculo dos resíduos for empregada, o método 
dos poliedros flexíveis produziu um maior número de ajustes satisfatórios em re-
lação ao método de Marquardt. Como os modelos matemáticos de processos fer-
mentativos têm, geralmente, um número de parâmetros maior do que 8, a metodo-
logia apresentada para ajuste, por regressão não linear, dos parâmetros (poliedros 
flexíveis), está de acordo com este resultado. 
Substituir o pior vértice 
pelo vértice da reflexão 
N 
maior F.O. = Pior vértice 
menor F. O. = Melhor vértice 
FIM 
Parâmetro 
0,1 <Beta< 0,9 
Figura 7.14 - Fluxograma ilustrativo do método dos poliedros flexíveis 
Um aspecto que se tem mostrado crucial no ajuste de parâmetros por dife-
rentes métodos de regressão não linear é o da definição da função objetivo, isto é, 
I 
1 
li 
j 
- l 
.. J 
16 2 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
a forma de calcular o resíduo entre os valores calculados pelo modelo e os valores 
experimentais.54 A Tabela 7.6 apresenta várias formas possíveis para o cálculo dos 
resíduos entre os valores calculados e os valores experimentais indicando, quando 
for o caso, os problemas observados quando da sua utilização. Na Tabela 7.6 são 
indicadas as fórmulas para cálculo dos resíduos que apresentaram melhores resul-
tados. Sabe-se, entretanto, que a melhor fórmula para cálculo do resíduo depende 
do método de ajuste e também da estimativa inicial dos parâmetros empregada. 
Tabela 7.6 - Diferentes fórmulas para cálculo dos resíduos . 
Número Fórmula de cálculo Problemas na utilização 
1 R= LÜli -yY Variáveis com elevado valor ab-i soluto privilegiadas no ajuste. 
( - r 
Tendência a ajustar melhor as va-R = L _jfj_- _jfj_ 
2 i (yi )m (y; )m riáveis próximas aos valores má-
ximos. 
R=L(Yi:Y;r 
Resíduos muito elevados para va-
3 i Yi lores muito pequenos da variável 
calculada 
R=L(yi-Yir Resíduos muito elevados para va-
4 i Yi lores muito pequenos da variável 
experimental. 
[ J Resíduos elevados para valores R= y~ -yi ' 5 ~ <y?') muito pequenos e diferentes das variáveis calculada e experimen-
tal. 
6 
Idem fórmula "5", R só é calculada 
-
quando Yi > e(yi )m 
R =:E /r -1/ +:E/a -1/ 
7 (r e a são calculados para cada va- -
riável e para cada ensaio) 
R =/r -1/+ /a-1/ 
(r e a são calculados com todas as 
8 variáveis normalizadas e todos os -
ensaios ajustados por uma única 
reta.) 
R ... resíduo 
Yi ... valor experimental da variável 
Yi ... valor calculado da variável 
(yi)m ... máximo valor da variável experimental 
r ... coeficiente de regressão linear entre as variáveis experimentais e calculadas 
a ... coeficiente angular combinado entre as variáveis experimentais e calculadas. 
Ajuste de parâmetros do modelo formulado 163 
EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 5 
Nessa etapa do exemplo é apresentado o ajuste, por regressão não-linear, 
utilizando o método dos poliedros flexíveis, do modelo matemático (eqs. 7.46 a 
7.50- etapa 4 do exemplo numérico) da fermentação alcoólica de hidrolisado de 
mandioca em um sistema batelada. O modelo é ajustado simultaneamente ao con-
junto de 4 ensaios experimentais, ilustrados na Tabela 7.1. 
O ajuste global dos ehsaios 1 a 4 (Tabela 7.1) será realizado pelo método de 
regressão não-linear de ordem "O" - método dos poliedros flexíveis, utilizando 
um software desenvolvido em linguagem Fortran. As principais características do 
ajuste realizado e o resultado obtido são listados a seguir. 
(1) Parâmetros do método: 
• a= 1,0 
• f3 = 0,8 
• y = 1,5 
• e< 10-5 (convergência). 
(2) Parâmetros ajustados: 9 (J.tx., J.lr., K5, K~, Ki, Kj, KP, K~, Yx15). 
(3) Parâmetros fixos do modelo: 1 (Yr15). 
(4) Estimativa inicial dos parâmetros empregada: resultado do ajuste preliminar 
dos parâmetros (Tab. 7.5). · 
(5) Fórmula de cálculo do resíduo empregada: "fórmula 6" (Tab. 7.6). 
(6) Valor do resíduo com a estimativa preliminar dos parâmetros - condição 
inicial do programa de ajuste: 
• Resíduo= 24,1 
• Coeficiente angular da regressão linear entre todos os valores calculados e 
experimentais = 0,923 
• Coeficiente de correlação da regressão linear entre todos os valores calcu-
lados e experimentais= 0,928. 
(7) Resultado do ajuste obtido: 
• Número de iterações = 971 
• Resíduo = 1,43 
• Coeficiente angular da regressão linear entre todos os valores calculados e 
experimentais = 1,00 
• Coeficiente de correlação da regressão linear entre todos os valores calcu-
lados e experimentais = 0,990. 
• Valores dos parâmetros (Tab. 7.7) 
A Figura 7.15 ilustra a qualidade de ajuste obtido para o Ensaio 4. Para os 
outros 3 ensaios o resultado é semelhante, como pode se:r atestado pelo valor do 
resíduo obtido. · 
'!!ri 
lj 
fi 
I 
~ 
J:j 
1
1 
j 
li 
J:J 
fl 
r1 
''i 
11 
I! 
I' d 
i i 
[I 
lj 
I 
i 
' l 
164 Modelagem matemática e simulação de ·processos fermentativos 
Tabela 7.7 - Valores dos parâmetros do modelo obtidos por regressão não -linear aplicando o método 
dos poliedros flexíveis. 
Parâmetro Valor estimado 
~i . 
J..lxa (K
1
) 
.... 
0,672 .. •1 
J..lpa (h-1) 2,08 j 
K5 (g/L) 6,16 .. 
Ks (g/L) 7,88 fl 
K; (g/L) 347, { 
Ki (g/L) 37,4 ~i 
I' 
KP (l/g) 0,0436 
K~ (l/g) 0,0153 
)! 
Yx;s (g/g) 0,215 
'"'}.:!? 15 (g/ g) 0,511 (fixo) -, .. ,.,,, .... , ' .. ·;.,·,;r;,· '.\·;'_ ·- ~-
"·' .. .. '"''' ' . _;(" -,'.1.1;::.1 
7.4 - Avaliação do modelo matemático 
A última etapa do processo de formulação e ajuste de um modelo matemáti-
co fenomenológico consiste na realização de uma análise estatística que visa vali-
dar o modelo, seguida da identificação da necessidade de realizar novos 
experimentos no laboratório, para aprimorar o conhecimento do processo, visan-
do melhorar a qualidade do modelo. 
Ensaio 4 
70 250 
60 
200 
:::J 50 
:§ 40 150 :::J • 
[l_ 
30 
:§ 
x 100 (/) 
20 
10 50 
o 
5 10 15 
Tempo (h) 
Figura 7 .I S - Resultado do ajuste global dos ensaios (T ab. 7 .I) utilizando o método dos poliedros flexíveis ilustrado 
para o Ensaio 4. Os pontos indicados são os pontos experimentais (+ X , .Â. P, * S) e as curvas foram traçadas utilizan-
do o modelo (equações 7.46 a 7.50) com os parâmetros indicados na Tab. 7.7. 
7.4. I - Análise estatística 
O ajuste dos parâmetros do(s) modelo(s) proposto(s) a um conjunto de ensaios 
experimentais é normalmente avaliado e considerado satisfatório ou não, por 
simples inspeção visual do conjunto de ensaios, além da análise do resíduo míni-
mo obtido (conforme descrito no item anterior deste capítulo). Essa avaliação é 
Avaliação do modelo matemático 1·65 
tanto mais válida, na medida em que for levada em conta a falta de reprodutibili-
dade e o grande erro experimental inerente aos processos biológicos. Apesar dessa 
constatação, é importante submeter os ajustes obtidos a uma análise estatística es-
pecífica, com dois objetivos básicos: 
• verificar se é possível discriminar um ou mais modelos propostos em rela-
ção aos outros, nos casos em que foi possível ajustar mais de um modelo 
matemático ao conjri.nto de dados experimentais disponíveis (teste do x2 
de Bartlett); 
• verificar se o(s) modelo(s) remanescente(s) representam adequadamente o 
conjunto de dados experimentais disponíveis (teste F e teste de randomici-
dade). 
7.4.1 .1 - Teste do X2 de BARTLETI55 
Para saber se há modelos não adequados, entre um conjunto de modelos 
ajustados, testa-se a homogeneidade das estimativas do erro experimentat ou 
seja, testa-se se o valor da variância de algum modelo é estatisticamente diferente 
dos demais. Isso é feito usando o teste do x2, calculando o x ~ale através da fórmula 
de Bartlett: 
m m 
ln(s 2) ~)d.f.L - ~)d.f. )i (st) 
2 i=l i=l 
Xcalc = I I 
1 + 1 ! - 1 _ m 1 
3(m-1) i=l (d.f.L ~(d.f.)i 
onde: sf ... estimativa da variância do Modelo "i" 
y<k) .. . valor experimental 
y~k) ... valor calculado (Mod."i") 
52 •• • estimativa combinada da variância 
m 
L(d.f.)isf 
52 = .::..i=-=1 __ _ 
m 
L:<d.f.)i 
i=l 
(d.{); = n- p; ... graus de liberdade Modelo "i'; 
n ..... número de pontos experimentais 
(7.74) 
i 
I 
I 
I 
I 
. I 
'U 
166 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 
Pi .... número de parâmetros Modelo "i" 
m .. .. . número de modelos ajustados. 
Se X ~ale > x ~ab (a, m - 1) ... o modelo ao qual corresponde o maior valor de s ~ 
é descartado, e assim sucessivamente, até restar apenas 1 modelo; o valor de 
X~ab(a, m-1) é obtido em tabelas estatísticas56 onde é o nível de significância esco-
lhido (geralmente 5%). 
Se x ~ale <X ~b (a, m -1) ... nenhum dos modelos pode ser descartado; faz-se 
novos experimentos, até ser possível definir a não adequação de algum modelo 
pelo critério do x2 • 
7.4.1.2 - Teste F51 
A análise estatística realizada no item anterior não garante que o(s) mode-
lo(s) aprovados representem satisfatoriamente o conjunto de ensaios ajustados. 
Para obter esse resultado utiliza-se o Teste F, que se baseia na obtenção do chama-
do "erro experimental", obtido a partir de uma série de repetições do mesmo en-
saio (ensaio padrão). Essa estimativa do "erro experimental" deve levar em conta, 
entre outros, a falta de reprodutibilidade de processos fermentativos (devida prin-
cipalmente à influência da "história" da população microbiana), a dificuldade em 
manter condições homogêneas dentro do biorreator e os próprios erros analíticos 
e de amostragem corriuns na atividade laboratorial. Para a avaliação do erro expe-
rimental, deve ser feito um certo número de experimentos repetidos, em pelo me-
nos uma condição experimental. 
Assim, definindo~se Fcaic como a relação entre o erro obtido pela falta de 
ajuste e a estimativa do erro experimental, obtém-se para a formulação do Teste F: 
• 
onde: s~ ... estimativa da variância do erro do Modelo 
n ... número de pontos por variável 
v ... número de variáveis (concentrações de células, produtos e substratos) 
(nv)c ... número de pontos ajustados (para todos os ensaios e variáveis) 
p ... número de parâmetros do Modelo 
· y ij ••• valor da variável calculado pelo Modelo 
y ij ... valor experimental da variável. 
(7.75) 
Avaliação do modelo matemático 16 7 
s; ... estimativa da variância do erro experimental 
v n 
LL(Yii -yJ 2 
2 i=l j=l s =------
e (nv)e-v 
(nv)e ... número de pontos experimentais (para todos os ensaios repetidos 
e variáveis) 
y i ... média da variável para os ensaios repetidos. 
Como o valor da distribuição F, Ftab[a,(nv)c -p,(nv)e -v]~1 (quando a= 
5%, (nv)c ~ oo e (nv)e ~ oo)56 uma vez que (nv)c e (nv)e são, normalmente elevados, 
então para que o modelo represente adequadamente os dados experimentais ajus-
tados (ou, em outras palavras, não apresente falta de ajuste), é necessário que: 
ou 
7.4.1.3 - Teste de randomicidade57 
O teste de randomicidade é útil na verificação de eventuais tendências no 
ajuste de um modelo matemático a um conjunto de dados experimentais. Os resí-
duos verificados entre os dados experimentais e os dados do modelo podem ser 
positivos ou negativos, mas se eles são verdadeiramente aleatórios, o sinal dos 
mesmos deve mudar de maneira randômica. Essa randomicidade, ou ausência da 
mesma, pode ser detectada visualmente plotando, por exemplo, os resíduos versus 
a variável independente (tempo), ou versus as variáveis dependentes (variáveis de 
estado). A seguir, revisaremos alguns conceitos estatísticos necessários para o en-
tendimento do teste. 
Distribuição normal: distribuição contínua de probabilidades, também cha-
mada de distribuição gaussiana; é dada por: 
f( ) _ 1 -(y-y)' /2cr2 y ---e 
cr-fbr 
onde: y ... média da distribuição 
cr ... desvio padrão da distribuição. 
(7.76) 
Variável Z: variável padronizada correspondente a y; que possui média O e 
desvio padrão 1 e, portanto, é dada por: 
y-y 
Z=--
cr 
(7.77) 
168 Modelàgem matemática e simulação de processos fermentativos 
Nível de significância: ao testar uma hipótese, a probabilidade máxima com 
que desejamos arriscar um erro do tipo 1 (rejeitamos a hipótese quando ela deve-
ria ser aceita) é chamada nível de significância do teste; na prática costuma-se 
adotar um nível de significância de 0,05 ou de 0,01, embora outros valores possam 
também ser usados; no caso do teste de randomicidade será adotado um valor de 
0,05 para o nível de confiança. 
Região crítica: conjunto de valores de Z exteriores ao intervalo de -1,96 a 
1,96. 
Região de aceitação: conjunto de valores deZ interiores ao intervalo de -1,96 a 
1,96. 
A randomicidade dos resíduos entre os valores das variáveis calculadas, uti-
lizando o modelo ajustado e os valores experimentais é quantificada, medida e 
testada segundo o procedimento descrito a seguir. 
Definindo: N1 ••. número de resíduos positivos (Ycalc > Yexp); 
N2 ••• número de resíduos negativos (Ycalc < Yexp); 
R ... número de vezes que a sequência de resíduos muda de sinal. 
A distribuição de R é então aproximada pela distribuição normal. A média e 
o desvio padrão desta distribuição são calculados através das eqs. (7.78) e (7.79), 
apresentadas a seguir. 
2N1N 2(2N1N 2 -N1 -N2 ) 
(N1 +N2 )
2 (N1 +N2 -1) • 
A forma padronizada (Z) da variável (R) é dada então pela eq. (7.80) 
Z=R-R 
crR 
sendo distribuída com média O e desvio padrão 1. 
(7.78) 
(7.79) 
(7.80) 
Para testar a hipótese de que os desvios são randômicos, Z é comparada com 
a distribuição normal padrão. Se o valor de Z é muito baixo, b modelo é inadequa-
do; por outro lado, se o valor deZ é muito alto, os dados experimentais contêm os-
cilações que precisam ser consideradas pelo modelo. Se o valor de Z cair na região 
de aceitação, então a hipótese de randomicidade pode ser aceita. Dessa forma, 
existem 3 casos possíveis exemplificados a seguir. 
Caso Randômico: N1 = 21; N2 = 30; R= 29; R= 25,7; crR = 3,42 
Z = 0,965 (dentro da região de aceitação)- ajuste satisfatório. 
Avaliação do modelo matemático 169 
Caso Oscilante: N1 = 26; N2 = 25; R = 50; R = 26,5; crR = 3,5 
Z = 6,7 (fora da região de aceitação) . 
À primeira vista, esse seria um bom ajuste. Entretanto, um exame mais crite-
rioso detectaria urna oscilação padrão do resíduo em relação a zero. A adi-
ção de um termo que introduza comportamento oscilatório ao modelo em 
questão, poderia melhorar consideravelmente o ajuste do modelo aos dados 
experimentais. 
Caso positivo/negativo: N 1 = 32; N 2 = 19; R= 3; R= 24,8; crR = 3,3 
Z = -6,6 (fora da região de aceitação). 
Clara tendência dos resíduos de positivo para negativo ou vice-versa, detec-
tada pelo fato de R ser baixo. Por exemplo, para baixos valores da variável 
independente, o resíduo é positivo e para altos valores da variável indepen-
dente, o resíduo é negativo. O modelo deve ser corrigido para minimizar 
essa distorção. 
EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 6 
Nessa etapa é apresentada a análise estatística do modelo ajustado (Etapa 5) 
para a fermentação alcoólica de hidrolisado de mandioca em um sistema batelada 
ao conjunto de 4 ensaios (Tab. 7.1). 
Na medida em que existe um único rnoqelo ajustado aos dados experimen-
tais, serão aplicados apenas os testes estatísticos para verificar a adequação deste 
modelo. 
(1) Teste F. Para aplicar o Teste F é calculada a estimativa do erro do modelo 
ajustado na Etapa 5 deste exemplo numérico (Tab. 7.7 e Fig. 7.15). Calcula-se a es-
timativa da variância do erro do modelo (s~) comparando os valores das variáveis 
de estado obtidas pelo modelo ajustado em relação aos dados experimentais dis-
poníveis: 
v n 
LLÜlij- Yij) 2 = 3023,74 
i=l j=l 
(nv)c = 135 (número total de variáveis de estado medidas nos 4 ensaios) 
p = 9 (parâmetros ajustados do modelo) 
s2 = 3023,74 = 24 0 
C 135-9 I 
Na medida em que não se dispõe de urna medida precisa da estimativa do 
erro experimental,