Replicação do DNA

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Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 1 Genética 
Replicação do DNA
OBJETIVOS DA AULA: 
1. Apresentar o processo de replicação 
do DNA e os seus principais 
componentes moleculares; 
2. Caracterizar a técnica de reação em 
cadeia da polimerase (PCR), 
correlacionando-a com a replicação 
do DNA in vivo; 
3. Explicar como a técnica de PCR pode 
ser utilizada para o diagnóstico 
molecular de processos infecciosos e 
patológicos. 
 Pergunta para iniciar o assunto: 
o Qual o principal motivo para uma célula 
replicar? 
Pelo simples motivo de haver uma divisão 
celular. Uma célula vai replicar o seu material 
genético quando ela for gerar novas células. 
Uma célula com 46 cromossomos, para 
conseguir gerar mais duas (cada uma com 46 
cromossomos), precisa antes duplicar o seu 
material genético (o que antes era 46 passa a 
ser 92) e, só depois disso, dividir e cada uma 
ficar com 46 cromossomos. Isso é justamente 
o foco dessa aula: como acontece essa 
replicação. Esse processo vai acontecer 
antes da fase M (fase de mitose); vai 
acontecer na fase de interfase. E dentro da 
interfase existe subfases, e uma delas é 
justamente onde acontece o processo de 
síntese de DNA (fase S). 
 
REPLIÇÃO SEMI-CONSERVATIVA: 
É um processo que vai gerar duas moléculas 
a partir de uma. Nesse processo, vai haver a 
conservação da metade do material 
genético inicial. Portanto, o material final tem 
uma característica híbrida, ou seja, nessa 
nova molécula vai conter uma parte velha e 
a outra parte nova. Isso acontece porque o 
processo conserva e usa como modelo as 
fitas velhas. 
 
Importância do processo semiconservativo: 
o Se não fosse semiconservativo não 
haveria a possibilidade de desenvolver os 
estudos de vínculos genéticos. Ex.: o teste 
de paternidade só é possível por causa 
desse processo; 
o Não haveria a possibilidade de entender 
sobre a evolução das espécies e também 
não seria possível construir uma arvore 
filogenética, uma vez que a conservação 
desse material é que garante o 
desempenho dos estudos. 
 
O modelo semiconservativo da 
replicação do DNA proposto por Watson e 
Crick tem por base a especificidade dos 
pares de bases ligados por pontes de 
hidrogênio. Os filamentos parentais, 
demonstrados em azul, atuam como 
moldes para a polimerização. Os 
filamentos recém-polimerizados, 
demonstrados em amarelo, apresentam 
as sequências de bases que são 
complementares aos seus respectivos 
moldes. 
 
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Explicando a imagem da direita: percebe-se 
na imagem que há uma fita velha, a qual se 
abre, e as duas fitas que foram geradas a 
partir dessa abertura (da desnaturação) são 
utilizadas como fitas moldes para que sejam 
criadas em cima delas novas fitas de DNA. As 
partes roxas são as fitas antigas, e as partes 
verdes são as novas fitas sendo formadas. 
 
CONCEITO-CHAVE: O DNA é replicado por 
meio da deselicoidização dos dois filamentos 
da dupla-hélice e da construção de um novo 
filamento complementar em cada um dos 
filamentos separados da dupla-hélice 
original. 
 
EXISTE UM PONTO ESPECÍFICO DE INÍCIO? 
Isso vai variar de organismo para organismo. 
Nas bactérias, por exemplo, como o seu DNA 
é circular, existe um único ponto de origem 
para a replicação. Já no caso da espécie 
humana e de outras espécies que 
contenham um material genético mais jovem 
e mais complexo, vai haver múltiplas origens 
(são os pontos de início desse processo). E 
essas origens estão espalhadas em torno do 
material genético. 
Esses locais de iniciação são ricos em adenina 
e timina (inclusive muito mais do que citosina 
e guanina. E isso se dá porque entre adenina 
e timina existem 2 pontes de hidrogênio, 
enquanto que citosina e guanina possuem 3 
pontes. E como essas origens precisam ser 
abertas para que o material se replique, essas 
ligações, então, precisam ser mais fracas 
para serem quebradas. Sendo assim, por isso 
que é mais vantajoso que a maioria das 
ligações sejam entre adenina e timina). Nesse 
processo de abertura das fitas, vão sendo 
formadas as bolhas de replicação – é o que 
se percebe na imagem da direita. Nessa 
mesma imagem percebe-se, também, 
através das setas, que esse é um processo 
bidirecional que vai para um lado e para o 
outro formando duas fitas e, no final do 
processo, tem-se a duplicação do material 
genético. Sempre ocorre no sentido 5’-3’. 
 
 
ABERTURA DA DUPLA FITA: 
1. DNA HELICASE: Promove a quebra das 
pontes de hidrogênio entre as bases 
nitrogenadas para a fita de DNA iniciar o 
processo de replicação. Recebe esse 
nome porque ela desfaz a dupla hélice do 
DNA. 
 
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2. TOPOISOMERASES: São enzimas 
importantes para abertura da fita de DNA, 
junto com as helicases, no processo de 
desnaturação. Com o formato helicoidal 
da estrutura molecular do DNA, essas 
topoisomerases atuam desenrolando e 
relaxando a molécula, desfazendo a 
tensão nela e evitando que ela se quebre. 
A principal topoisomerase é a girase, que 
atua desenrolando a molécula de DNA, 
aliviando a tensão dessa molécula e 
relaxando-a no momento em que ela está 
sendo tensionada pela helicase. 
Existem alguns tipos de topoisomerases; elas 
diferem na sua função. Podem estar 
distribuídas em quantidades diferentes, em 
diferentes espécies celulares (procariontes e 
eucariontes). 
 
 
PROTEÍNAS LIGADORAS DE FITA SIMPLES (SSB): 
Atuam de maneira a manter a fita simples 
separada uma da outra, evitando o 
anelamento. À medida que a helicase passa, 
vai separando as fitas e quando ela chega ao 
final do material genético, o seu início pode 
voltar a se ligar. Para que isso não aconteça 
(renaturação do DNA) e para mantê-las 
separadas, é usada a proteína ligadora de 
fita simples ou SSB, elas têm uma afinidade 
química muito grande quando o material 
genético está linear em fita simples; por 
questões de pH (são proteínas básicas 
enquanto nosso DNA é ácido) e por 
apresentarem, também, aminoácidos com 
carga positiva (o DNA tem carga negativa). 
Essas proteínas, portanto, ajudam a evitar a 
renaturação, reaproximação e consequente 
estabelecimento das ligações de hidrogênio 
(até então desfeitas pela helicase). 
 
DNA POLIMERASE: 
É a protagonista de todo esse processo. É a 
enzima que faz o polímero de DNA. 
É a enzima que gera o encadeamento, faz a 
união entre os monômeros (nucleotídeos) e 
forma o monômero chamado de DNA. Essa 
enzima atua polimerizando o material 
genético. Basicamente, vai unir por ligações 
fosfodiéster (ligação estabelecida entre o 
fosfato e a pentose de nucleotídeos vizinhos) 
os nucleotídeos. Elas constroem a nova fita de 
DNA em cima da fita molde. 
 
VISÃO GERAL DA REPLICAÇÃO DO DNA: 
A DNA polimerase III catalisa a síntese de DNA 
na forquilha de replicação. Na medida em 
que a DNA pol III avança, a dupla-hélice é 
continuamente desenrolada à frente da 
enzima para expor comprimentos adicionais 
de filamentos de DNA simples que atuarão 
como moldes. 
A DNA pol III atua como a forquilha de 
replicação, a zona na qual a dupla-hélice 
está desenrolando. Entretanto, tendo em vista 
que a DNA polimerase sempre adiciona 
nucleotídios na extremidade 3′ em 
crescimento, apenas um dos dois filamentos 
antiparalelos pode atuar como molde para a 
replicação na direção da forquilha de 
replicação. Em relação a esse filamento, a 
síntese pode ocorrer de modo contínuo e 
suave na direção da forquilha; o novo 
filamento no sentido líder, é denominado 
filamento contínuo (no sentido líder, leading). 
A síntese do outro filamento também ocorrena extremidade em crescimento 3′, mas essa 
síntese ocorre no sentido “errado”, tendo em 
vista que, em relação a esse filamento, o 
sentido 5′ para 3′ da síntese está longe da 
forquilha de replicação. 
A natureza do maquinário de replicação 
requer que a síntese de ambos os filamentos 
ocorra na região da forquilha de replicação. 
Portanto, a síntese que se afasta da forquilha 
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de crescimento não pode prosseguir por 
muito tempo. Ela tem de ocorrer em 
segmentos curtos: a polimerase sintetiza um 
segmento, em seguida se movimenta de 
volta para a extremidade 5′ do segmento, 
onde a forquilha em crescimento expôs o 
novo molde e inicia o processo novamente. 
Esses trechos de DNA recém-sintetizado são 
denominados fragmentos de Okazaki. 
Outro problema na replicação do DNA surge 
em virtude de a DNA polimerase conseguir 
estender uma cadeia, mas não iniciar uma 
cadeia. Portanto, a síntese do filamento 
contínuo e de cada fragmento de Okazaki 
tem de ser iniciada por um primer, ou uma 
cadeia curta de nucleotídios, que se liga ao 
filamento-molde para formar um segmento 
de ácido nucleico dúplex. 
Os primers são sintetizados por um conjunto 
de proteínas denominado primossomo, do 
qual um componente central é uma enzima 
denominada primase, um tipo de RNA 
polimerase. A primase sintetiza um trecho 
curto (aproximadamente 8 a 12 nucleotídios) 
de RNA complementar a uma região 
específica do cromossomo. 
No filamento contínuo, é necessário apenas 
um primer inicial, tendo em vista que, após a 
ação do primer inicial, o filamento de DNA em 
crescimento atua como primer para a adição 
contínua. Entretanto, no filamento 
descontínuo, cada fragmento de Okazaki 
necessita de seu próprio primer. A cadeia de 
RNA que compõe o primer em seguida é 
estendida como uma cadeia de DNA pela 
DNA pol III. 
Uma DNA polimerase diferente, pol I, remove 
os primers de RNA com sua atividade de 
exonuclease 5′ para 3′ e preenche as lacunas 
com sua atividade de polimerase 3′ para 5′. 
Outra enzima, a DNA ligase, une a 
extremidade 3′ do DNA que preencheu a 
lacuna à extremidade 5′ do fragmento de 
Okazaki. O novo filamento assim formado é 
denominado filamento descontínuo 
(lagging). A DNA ligase une os fragmentos do 
DNA ao catalisar a formação de uma ligação 
fosfodiéster entre a extremidade 5′-fosfato de 
um fragmento e o grupo 3′-OH adjacente de 
outro fragmento. 
Tendo em vista que a primase não apresenta 
uma função de revisão, o primer de RNA 
apresenta maior probabilidade de conter 
erros do que o DNA. A necessidade de 
manter a alta fidelidade da replicação é um 
motivo pelo qual os primers de RNA nas 
extremidades dos fragmentos de Okazaki 
precisam ser removidos e substituídos por 
DNA. Apenas após a remoção do primer de 
RNA a DNA pol I catalisa a síntese do DNA 
para substituir o primer. 
 
 
Sobre a imagem acima: A forquilha de 
replicação se movimenta na síntese de DNA 
na medida em que a dupla-hélice é 
continuamente desenrolada. A síntese do 
filamento contínuo (leading) pode prosseguir 
suavemente sem interrupções na direção do 
movimento da forquilha de replicação, mas a 
síntese do filamento descontínuo (lagging) 
deve prosseguir na direção oposta, para 
longe da forquilha de replicação 
 
CONCEITO-CHAVE: A replicação do DNA 
ocorre na forquilha de replicação, onde a 
dupla-hélice está desenrolando e os dois 
filamentos estão se separando. A replicação 
do DNA prossegue continuamente na 
direção da forquilha de replicação em 
deselicoidização no filamento contínuo. O 
DNA é sintetizado em segmentos curtos, na 
direção para longe da forquilha de 
replicação, no filamento descontínuo. A DNA 
polimerase necessita que um primer, ou uma 
cadeia curta de nucleotídios, já esteja 
posicionado para iniciar a síntese. 
 Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 5 Genética 
CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES DA DNA 
POLIMERASE: 
o Enzima que catalisa a adição de 
nucleotídeos a extremidades 3’ de uma 
fita de DNA; 
o Precisa de um molde – cadeia molde 
complementar; 
o Mecanismo de polimerização é no 
sentido 5’-3’ (5’ com fosfato e 3’ com 
pentose); 
o Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter 
extremidade 3’OH livre); 
o Possui mecanismo de correção de erros 
no sentido 3’-5’. 
 
As fitas de DNA são antiparalelas, atuando 
em sentidos opostos sendo, portanto, um 
processo bidirecional. 
A extremidade com 3’OH livre é encontrada 
na ribose (açúcar do RNA), ou seja, a 
replicação começa com nucleotídeos de 
RNA. 
Com isso, irão ficar pedaços de RNA 
misturados com os DNAs, porém, no final do 
processo, isso será removido e substituído por 
nucleotídeos de DNA. 
 
O primer (iniciador), é uma estrutura que 
contém cerca de 10 nucleotídeos de RNA (só 
os nucleotídeos de RNA que vão conter OH 
no final da estrutura); e essa OH livre permite 
que a polimerase continue se estendendo. Ao 
final do processo de replicação, o primer é 
removido. Ele só serve para iniciar o processo. 
 
 
O fato dessa enzima sintetizar fitas novas 
apenas no sentido 5’-3’ e também as fitas de 
DNA serem antiparalelas corrobora para que 
a duplicação seja um processo que ocorre 
em duas direções (bidirecional). 
 
 
 Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 6 Genética 
Explicando esta última imagem: A Fita líder 
segue o mesmo sentido do movimento da 
forquilha de replicação. A fita atrasada é 
formada em fragmentos (fragmentos de 
Okazaki), no sentido contrário ao da abertura 
da molécula. 
 
CONCLUSÕES: 
o A replicação é um processo que ocorre 
para que a célula seja dividida, e 
acontece na fase S do ciclo celular 
(interfase), antes da mitose; 
o A replicação é semiconservativa 
(conserva metade do material genético 
da fita mãe); 
o É um processo bidirecional, pelo fato da 
polimerase trabalhar em um único sentido 
(5’-3’) e as fitas serem antiparalelas; 
o Tem um repertório muito grande de 
enzimas, o que torna o processo 
relativamente complexo. 
 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE: 
o É uma técnica que foi 
descoberta/inventada na década de 80. 
É uma das técnicas mais utilizadas 
atualmente para o diagnóstico molecular, 
sendo utilizado para um diagnóstico mais 
preciso. Atualmente está sendo bastante 
utilizada devido à pandemia; 
o Método in vitro de replicação do DNA, 
portanto acontece em tubos de ensaio, 
onde é possível replicar o DNA. 
Diferentemente do que foi visto na 
replicação do DNA in vivo, na técnica PCR 
a replicação é feita em algumas regiões 
do DNA, de forma que amplifica 
sequencias especificas de DNA; 
o Processo realizado em vários ciclos com 
diferentes temperaturas, que serão 
importantes para substituir algumas 
funções de enzimas que são utilizadas no 
processo in vivo da replicação. 
 
O QUE É UTILIZADO NA REAÇÃO DE PCR: 
o Amostra do paciente ou do vírus ou da 
bactéria - DNA a ser amplificado. É preciso 
amplificar a estrutura do DNA, porque ele 
está em um nível sub microscópico 
(molecular) e, dessa forma, é essencial 
aumentar a quantidade de cópias até 
atingir um nível que seja visível; 
o Primers: Vão dar a região 3’ OH livre para 
a polimerase trabalhar. E o primer é 
desenhado tanto para a fita de cima 
quanto para a de baixo – Forward e 
Reverse, respectivamente (Sence e anti 
Sence); 
o dNTPs: Nucleotídeos; 
o DNA polimerase; 
o MgCl2: Funciona como co-fator para a 
ativação da polimerase (a polimerase 
não funciona bem sem ele); 
o H2O, RNASE e DNASE FREE (água 
específica livrede enzimas RNASE E 
DANSE: para isso existem processos de 
purificação da agua, como destilações, 
juntamente com irradiações ultravioletas, 
para retirar essas enzimas da água); 
o Tampão: utilizado para manter o pH 
estável da reação. 
 
REAÇÃO DE PCR – DIVIDIDA EM 3 FASES: 
1. DESNATURAÇÃO: A fase de desnaturação 
é a quebra das pontes de hidrogênio, e 
consequentemente, separação da dupla 
fita (in vivo quem tinha essa função era a 
helicase). No processo in vitro, quem vai 
assumir esse papel é a temperatura. Foi 
comprovado que, com o aumento da 
temperatura para mais de 90° no tubo de 
ensaio, ocorre a quebra das pontes de 
hidrogênio e por consequência a 
separação da dupla fita; 
 
Esta imagem mostra o termômetro marcando 
acima de 90º, desnaturando, quebrando as 
pontes de hidrogênio e, por conseguinte, 
ocasionando na separação da dupla fita. 
 Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 7 Genética 
2. HIBRIDIZAÇÃO OU ANELAMENTO DOS 
PRIMERS: É quando os primers se encaixam 
na sequência de interesse a ser 
amplificada, ou seja, quando eles formam 
um pareamento especifico em 
determinada região e deixam a 
extremidade 3’ OH livre, para que o DNA 
polimerase possa estender o restante da 
fita. Nesse momento, o anelamento é feito 
com variação de temperatura (entre 40 a 
70°C – um pouco menor que a 
desnaturação, para que consiga ligar 
moléculas) conforme o par de primers. 
São os primers que determinam a 
especificidade da ligação, porque eles 
são sequências de nucleotídeos. 
 
Percebe-se na imagem acima que a 
temperatura agora é um pouco menor 
(aproximadamente 60º) do que a fase de 
desnaturação. Isso acontece para que as 
fitas não permaneçam separadas e para que 
possa haver ligação de moléculas. 
 
 
Nesta imagem existe uma sequência de 
nucleotídeos. Se caso essa sequência se 
encaixar com o primer e depois de estender 
é porque o paciente está infectado. É um 
exame direto, uma vez que vai no vírus, 
bactéria, microrganismo que quer buscar. Ele 
não busca anticorpos. 
Pode-se afirmar, então, que na amostra 
recolhida terá amostras do DNA humano e 
DNA viral, o primer é que será específico para 
a identificação do DNA viral. Se o vírus não 
estiver presente, o primer não exercerá a sua 
função e não terá a replicação da 
sequência. 
3. EXTENSÃO: É quando todo o fragmento é 
estendido, com a atuação da enzima Taq 
DNA POLIMERASE – thermos aquáticos 
(não é a polimerase humana, que é muito 
sensível a alterações de temperatura). É 
uma polimerase que foi extraída de uma 
bactéria que vive em ambientes quentes 
com altas variações de temperatura, e 
dessa forma é mais resistente que a 
polimerase humana. E mesmo sendo 
extraída de uma bactéria, ele consegue 
fazer a síntese do DNA, consegue fazer a 
replicação do DNA, pelo fato de o DNA 
ser quimicamente universal. A 
temperatura ótima, para a atuação da 
Taq DNA polimerase é em torno de 72°C. 
 
 
A imagem acima mostra a temperatura 
aumentada para 72ºC, temperatura ótima 
para que a Taq DNA polimerase execute a 
sua função. 
 
 Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 8 Genética 
RESUMO DAS FASES: 
 
 
ELETROFORESE: 
É uma técnica de separação de fragmentos 
moleculares. Pode ser utilizada para 
proteínas, RNA, DNA. Após a técnica de PCR, 
pode-se utilizar a técnica de eletroforese, que 
utiliza uma matriz gelatinosa para a 
separação desses fragmentos e posterior 
visualização deles. 
o Esses géis são submetidos à coloração 
com corantes específicos para aquilo que 
está sendo separado (DNA, RNA ou 
proteína). Esses corantes têm uma alta 
afinidade química por esse material, que 
foi previamente amplificado; 
o É possível identificar o material genético 
após a eletroforese utilizando uma luz 
ultravioleta que evidencia esse material; 
o O gel fica em um polo negativo e o DNA 
irá migrar para o polo oposto que é o polo 
positivo, por ter muito fosfato. 
 
 
 
 
TIPOS DE PCR: 
o PCR convencional: É o mais utilizado; 
o Nested PCR: é utilizado quando, ao fazer 
uma amplificação, o resultado sai bem 
fraco. E aí vai ser preciso fazer um PCR do 
PCR para, só a partir disso, aumentar a 
intensidade da banda e se ter uma melhor 
detecção; 
o PCR em tempo real (q PCR): Não precisa 
de eletroforese; o resultado sai de 
imediato. O “q” é porque ele é 
quantitativo, mostra o número de cópias. 
Ou seja, mostra se o paciente tem carga 
viral baixa ou alta; 
o RT-PCR: é uma reação que faz uma 
transcrição reversa antes de começar. RT 
significa transcriptase reversa. Utiliza o RNA 
e com a transcriptase ele se transforma 
em DNA; isso tudo porque o PCR trabalha 
exclusivamente com DNA, por isso que 
tem que haver essa transformação antes. 
o PCR multiplex: No mesmo tubo faz o 
diagnóstico de 4 a 5 vírus diferentes com 
uma única amostra. 
 
APLICAÇÕES DO CONHECIMENTO: 
o É importante para o diagnóstico de 
infecções: bactérias, vírus, fungos e 
protozoários; 
o Quantificação de DNA ou RNA viral/célula 
hospedeira; 
o Diagnóstico de mutações gênicas e 
doenças genéticas. 
 
CONCLUSÕES: 
o A PCR é um processo de replicação do 
DNA dentro dos tubos de ensaio (in vitro); 
o Amplifica fragmentos específicos do DNA 
total; 
o Ocorrem em três etapas: desnaturação, 
anelamento dos primers e extensão; 
o O papel da maior parte das enzimas é 
substituído por temperatura ou reagentes 
utilizados na técnica; 
o É aplicada para fins diagnósticos na 
identificação, quantificação e análise de 
processos fisiopatológicos. 
 
 Fernanda Carvalho, 4º semestre - TUT 04 9 Genética 
 QUESTÕES: 
1. Descreva os tipos de ligações químicas 
na dupla-hélice do DNA; 
2. Em qual fase ocorre a replicação do 
DNA e para que fim isso ocorre? 
3. Explique qual é o significado do termo 
replicação semiconservativa e qual a 
sua importância; 
4. Qual o sentido do mecanismo de 
polimerização? 
5. Qual é o significado de primer e por 
que os primers são necessários para a 
replicação do DNA? 
6. O que são helicases e topoisomerases 
e qual a principal topoisomerase? 
7. Por que a síntese do DNA é contínua 
em um filamento e descontínua no 
filamento oposto? 
8. É essencial que os primers de RNA nas 
extremidades dos fragmentos de 
Okazaki sejam removidos e substituídos 
por DNA, porque, de outro modo, qual 
dos eventos a seguir resultaria? 
a) O RNA interferiria com a função da 
topoisomerase. 
b) O RNA apresentaria maior 
probabilidade de conter erros, tendo 
em vista que a primase não apresenta 
uma função de revisão. 
 c) O grampo β do dímero da DNA pol 
II liberaria o DNA e a replicação seria 
interrompida. 
 d)Os primers de RNA provavelmente 
formariam ligações de hidrogênio 
entre si, originando estruturas 
complexas que podem interferir com a 
formação adequada da hélice de 
DNA; 
9. Qual a finalidade da PCR e quais seus 
tipos; 
10. Quais as fases de reação de PCR? Fale 
brevemente sobre cada uma delas; 
11. O que é a eletroforese e como ela 
funciona.