Griffiths cap 7

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Modelo em computador do DNA. (Kenneth Eward/Science Source/Getty Images.)
TÓPICOS
DNA | O material genético
Estrutura do DNA
Replicação semiconservativa
Visão geral da replicação do DNA
Replissomo | Uma máquina de replicação notável
Replicação em organismos eucariotos
Telômeros e telomerase | Término da replicação
RESULTADOS DE APRENDIZAGEM
Após ler este capítulo, você será capaz de:
Avaliar os tipos de evidências (históricas e modernas) que podem ser
utilizadas para demonstrar que o DNA é o material genético
Avaliar os dados utilizados para construir o modelo de dupla-hélice do
DNA
Explicar por que a estrutura helicoidal dupla sugere um mecanismo
específico de replicação do DNA
Ilustrar as características da replicação do DNA que contribuem para a sua
velocidade e a sua precisão
Explicar por que as extremidades dos cromossomos necessitam de
replicação especial
Prever as possíveis consequências para a saúde humana se a replicação da
extremidade for defeituosa.
ames Watson (um geneticista microbiano americano) e Francis Crick (um
físico inglês) solucionaram a estrutura do DNA em 1953. Seu modelo da
estrutura do DNA foi revolucionário. Eles propuseram uma definição para o
gene em termos químicos e, ao fazer isso, propiciaram a compreensão da ação
gênica e da hereditariedade no nível molecular. Uma medida da importância da
sua descoberta é que a estrutura em dupla-hélice se tornou um ícone cultural, que
é observado com cada vez mais frequência em pinturas, em esculturas e até
mesmo em playgrounds (Figura 7.1).
A história tem início na primeira metade do século 20, quando os resultados de
diversos experimentos levaram os cientistas a concluírem que o DNA é o material
genético, não outra molécula biológica, tal como um carboidrato, uma proteína ou
um lipídio. O DNA é uma molécula simples, composta por apenas quatro
diferentes elementos estruturais (as quatro bases de nucleotídios). Portanto, era
necessário compreender como essa molécula tão simples podia ser responsável
pela incrível diversidade de organismos sobre a Terra.
O modelo da dupla-hélice proposto por Watson e Crick foi construído com
base nos resultados de cientistas antes deles. Eles se basearam nas descobertas
anteriores da composição química do DNA e das proporções de suas bases. Além
disso, imagens de difração de raios X do DNA revelaram ao olho treinado que o
DNA é uma hélice de dimensões precisas. Watson e Crick concluíram que o DNA
é uma dupla-hélice composta por dois filamentos de bases de nucleotídios
ligados, que se enrolam um ao redor do outro.
A estrutura do material hereditário proposta imediatamente sugeriu como ela
poderia atuar como um molde e como poderia ser transmitida entre as gerações.
Primeiramente, a informação para a formação de um organismo está codificada na
sequência de bases nucleotídicas que compõem os dois filamentos da hélice de
DNA. Em segundo lugar, em virtude das regras da complementaridade de bases
descobertas por Watson e Crick, a sequência de um filamento dita a sequência do
outro filamento. Assim, as informações genéticas na sequência do DNA podem
ser transmitidas de uma geração para a próxima quando cada um dos filamentos
de DNA em separado atua como molde para a produção de novas cópias da
molécula.
7.1
FIGURA 7.1 (Neil Grant/Alamy.)
Neste capítulo, enfocamos o DNA, sua estrutura e a produção de cópias do
DNA em um processo denominado replicação. Precisamente como o DNA é
replicado ainda é uma área ativa de pesquisas, mais de 50 anos após a descoberta
da dupla-hélice. Nossa atual compreensão sobre o mecanismo da replicação
confere um papel central para uma estrutura proteica, denominada replissomo.
Esse complexo de proteínas coordena as diversas reações que são necessárias
para a replicação rápida e precisa do DNA.
DNA | O material genético
Antes de verificarmos como Watson e Crick solucionaram a estrutura do DNA,
revisaremos o que era conhecido a respeito dos genes e do DNA na ocasião em
1.
2.
3.
4.
5.
que eles iniciaram a sua colaboração histórica:
Os genes — os “fatores” hereditários descritos por Mendel — sabidamente
estavam associados a traços específicos, mas a sua natureza física não era
compreendida. De modo semelhante, as mutações sabidamente alteravam a
função dos genes, mas a natureza química precisa de uma mutação não era
compreendida.
A hipótese um gene—um polipeptídio (descrita no Capítulo 6) postulava que
os genes determinam a estrutura das proteínas e de outros polipeptídios.
Sabidamente os genes eram carreados nos cromossomos.
Observou-se que os cromossomos são compostos por DNA e proteínas.
Os resultados de uma série de experimentos com início na década de 1920
revelaram que o DNA é o material genético. Esses experimentos, descritos
em seguida, demonstraram que as células bacterianas que expressam um
fenótipo podem ser transformadas em células que expressam um fenótipo
diferente e que o agente transformante é o DNA.
Descoberta da transformação
Frederick Griffith fez uma observação enigmática durante os experimentos
realizados em 1928 com a bactéria Streptococcus pneumoniae. Essa bactéria,
que causa pneumonia em seres humanos, normalmente é letal em camundongos.
Entretanto, algumas linhagens dessa espécie bacteriana evoluíram para serem
menos virulentas (menos capazes de causar doença ou morte). Os experimentos de
Griffith estão resumidos na Figura 7.2. Nesses experimentos, Griffith utilizou duas
linhagens que são distinguíveis pelo aspecto de suas colônias quando cultivadas
em culturas de laboratório. Uma linhagem era um tipo virulento normal, mortal
para a maior parte dos animais de laboratório. As células dessa linhagem estão
envoltas por uma cápsula de polissacarídios, o que proporciona às colônias um
aspecto liso; portanto, essa linhagem é identificada como S. A outra linhagem de
Griffith era um tipo não virulento mutante, que cresce em camundongos, mas que
não é letal. Nessa linhagem, revestimento de polissacarídios não existe,
proporcionando às colônias um aspecto rugoso; essa linhagem é denominada R.
FIGURA 7.2 A presença de células S mortas pelo calor transforma as células R vivas em células S vivas. A.
O camundongo morre após a injeção da linhagem S virulenta. B. O camundongo sobrevive após a injeção da
linhagem R. C. O camundongo sobrevive após a injeção da linhagem S morta pelo calor. D. O camundongo
morre após a injeção de uma mistura da linhagem S morta pelo calor e da linhagem R viva. Células S vivas
foram isoladas do camundongo morto, indicando que a linhagem S morta pelo calor de algum modo transforma
a linhagem R na linhagem S virulenta.
Griffith matou algumas células virulentas por meio de fervura. Em seguida, ele
injetou as células mortas pelo calor em camundongos. Os camundongos
sobreviveram, demonstrando que os restos das células não causam a morte.
Entretanto, camundongos injetados com uma mistura de células virulentas mortas
pelo calor e células não virulentas vivas morreram. Além disso, células vivas
puderam ser recuperadas dos camundongos mortos; essas células formaram
colônias lisas e eram virulentas na injeção subsequente. De algum modo, os restos
celulares das células S fervidas haviam convertido as células R vivas em células
S vivas. O processo, já discutido no Capítulo 5, é denominado transformação.
A etapa seguinte foi determinar qual componente químico das células doadoras
mortas havia causado essa transformação. Essa substância modificou o genótipo
da linhagem receptora e, portanto, podia ser uma candidata para o material
hereditário. Esse problema foi solucionado por experimentos conduzidos em
1944 por Oswald Avery e dois colegas, Colin MacLeod e Maclyn McCarty
(Figura 7.3). Sua abordagem para o problema foi destruir quimicamente todas as
principais categorias de substâncias químicas em um extrato de células mortas,
uma por vez, e descobrir se o extrato havia perdido a capacidade de
transformação. As células virulentas apresentavam um revestimento liso de
polissacarídios,enquanto as células não virulentas não apresentavam; portanto, os
polissacarídios eram candidatos óbvios a serem o agente transformante.
Entretanto, quando os polissacarídios foram destruídos, a mistura ainda podia ser
transformada. Proteínas, lipídios e ácidos ribonucleicos (RNA) demonstraram,
todos, de modo semelhante, não serem o agente transformante. A mistura perdeu a
sua capacidade de transformação apenas quando a mistura doadora foi tratada
com a enzima desoxirribonuclease (DNase), que fragmenta o DNA. Esses
resultados implicam fortemente o DNA como o material genético. Agora se sabe
que os fragmentos do DNA transformante que conferem virulência entram no
cromossomo bacteriano e substituem seus correspondentes que conferem não
virulência.
CONCEITO-CHAVE A demonstração de que o DNA é o princípio
transformante foi a primeira demonstração de que os genes (o material
hereditário) são compostos por DNA.
FIGURA 7.3 O DNA é o agente que transforma a linhagem R em virulenta. Se o DNA em um extrato de
células da linhagem S mortas pelo calor for destruído, os camundongos sobrevivem quando injetados com uma
mistura das células mortas pelo calor e as células da linhagem R não virulenta vivas.
Experimento de Hershey-Chase
Os experimentos conduzidos por Avery e seus colegas foram definitivos, mas
muitos cientistas estavam relutantes em aceitar o DNA (em vez das proteínas)
como o material genético. Afinal, como uma molécula de tal baixa complexidade
como o DNA poderia codificar a diversidade da vida sobre este planeta? Alfred
Hershey e Martha Chase forneceram evidências adicionais em 1952 em um
experimento que fez uso do fago T2, um vírus que infecta bactérias. Eles
ponderaram que o fago infectante obrigatoriamente injetavam na bactéria as
informações específicas que ditam a reprodução de novas partículas virais. Se
eles pudessem descobrir qual material o fago estava injetando na hospedeira
bacteriana, eles teriam determinado o material genético dos fagos.
O fago é relativamente simples em constituição molecular. A estrutura do T2 é
similar à do T4 demonstrada nas Figuras 5.22 a 5.24. A maior parte de sua
estrutura é de proteínas, com o DNA contido dentro da bainha proteica de sua
“cabeça”. Hershey e Chase decidiram marcar diferencialmente o DNA e a
proteína por meio da utilização de radioisótopos, de modo que eles pudessem
seguir os dois materiais durante a infecção. O fósforo não é observado nos
aminoácidos que formam os blocos de proteínas, mas é uma parte integrante do
DNA; contrariamente, o enxofre está presente nas proteínas, mas nunca no DNA.
Hershey e Chase incorporaram o radioisótopo do fósforo (32P) no DNA do fago e
aquele do enxofre (35S) nas proteínas de uma cultura de fagos em separado.
Conforme demonstrado na Figura 7.4, em seguida eles infectaram duas culturas de
E. coli com muitas partículas virais por célula: uma cultura de E. coli recebeu o
fago marcado com 32P e a outra recebeu o fago marcado com 35S. Após
possibilitar tempo suficiente para a ocorrência da infecção, eles fragmentaram as
carcaças vazias dos fagos (denominadas fantasmas) das células bacterianas por
meio de agitação em um liquidificador de cozinha. Eles separaram as células
bacterianas dos fantasmas dos fagos em uma centrífuga e em seguida mediram a
radioatividade nas duas frações. Quando os fagos marcados com 32P foram
utilizados para infectar E. coli, a maior parte da radioatividade estava dentro das
células bacterianas, indicando que o DNA do fago entrava nas células. Quando os
fagos marcados com 35S foram utilizados, a maior parte do material radioativo
estava nos fantasmas dos fagos, indicando que a proteína do fago nunca entrava na
célula bacteriana. A conclusão é inevitável: o DNA é o material hereditário. As
proteínas dos fagos são meros envoltórios estruturais, que são descartados após a
penetração do DNA viral na célula bacteriana.
7.2
1.
FIGURA 7.4 O experimento de Hershey-Chase demonstrou que o material genético dos fagos é o DNA, não
a proteína. O experimento utiliza dois conjuntos de bacteriófagos T2. Em um conjunto, o revestimento proteico
é marcado com enxofre radioativo (35S), não observado no DNA. No outro conjunto, o DNA é marcado com
fósforo radioativo (32P), não observado em aminoácidos. Apenas 32P é recuperado da E. coli, indicando que o
DNA é o agente necessário para a produção de novos fagos.
Estrutura do DNA
Até mesmo antes de a estrutura do DNA ter sido elucidada, estudos genéticos
indicavam que o material hereditário tinha necessariamente três propriedades-
chave:
Tendo em vista que essencialmente todas as células no corpo de um
organismo apresentam a mesma constituição genética, a replicação fiel do
material genético a cada divisão celular é crucial. Portanto, as
características estruturais do DNA precisam assegurar a replicação fiel.
Essas características estruturais serão consideradas posteriormente neste
2.
3.
capítulo.
Tendo em vista que ele precisa codificar a constelação de proteínas
expressas por um organismo, o material genético precisa ter um conteúdo
informativo. Como as informações codificadas no DNA são decifradas para
produzir proteínas será o assunto dos Capítulos 8 e 9.
Tendo em vista que alterações hereditárias, denominadas mutações,
fornecem a matéria-prima para a seleção evolutiva, o material genético tem
de ser capaz de mudar em ocasiões raras. Não obstante, a estrutura do DNA
deve ser estável, de modo que os organismos possam “confiar” em sua
informação codificada. Consideraremos os mecanismos de mutação no
Capítulo 16.
Estrutura do DNA antes de Watson e Crick
Considere a descoberta da estrutura da dupla-hélice do DNA por Watson e Crick
como a solução para um quebra-cabeça tridimensional complicado. Para
solucionar esse quebra-cabeça, Watson e Crick utilizaram um processo
denominado “construção de modelo”, no qual eles reuniram os resultados de
experimentos anteriores e em andamento (as peças do quebra-cabeça) para formar
o quebra-cabeça tridimensional (o modelo da dupla-hélice). Para compreender
como eles fizeram isso, primeiramente precisamos saber quais peças do quebra-
cabeça estavam disponíveis para Watson e Crick em 1953.
Elementos estruturais do DNA. A primeira peça do quebra-cabeça era o
conhecimento sobre as estruturas básicas do DNA. Como uma substância química,
o DNA é consideravelmente simples. Ele contém três tipos de componentes
químicos: (1) fosfato, (2) um açúcar denominado desoxirribose e (3) quatro
bases nitrogenadas — adenina, guanina, citosina e timina. O açúcar no DNA é
denominado “desoxirribose”, tendo em vista que ele apresenta apenas um átomo
de hidrogênio (H) no átomo de carbono 2′, contrariamente à ribose (um
componente do RNA), que apresenta um grupo hidroxila (OH) naquela posição.
Duas das bases, adenina e guanina, apresentam uma estrutura de anel duplo
característica de um tipo de substância química denominado purina. As outras
1.
2.
duas bases, citosina e timina, apresentam uma estrutura de anel único de um tipo
denominado pirimidina.
São atribuídos números aos átomos de carbono nas bases para facilidade de
referência. Também são atribuídos números aos átomos de carbono no grupo
açúcar — nesse caso, o número é seguido por apóstrofo reto (1′, 2′ e assim por
diante).
Os componentes químicos do DNA estão dispostos em grupos denominados
nucleotídios, cada um composto por um grupo fosfato, uma molécula de açúcar
desoxirribose e qualquer uma das quatro bases (Figura 7.5). É uma convenção
fazer referência a cada nucleotídio pela primeira letra da denominação de sua
base: A, G, C ou T. O nucleotídio com a base adenina é denominado
desoxiadenosina 5′-monofosfato, em que 5′ faz referência à posição do átomo de
carbono no anel de açúcar ao qual o único grupo fosfato (mono) está ligado.
Regras de Chargaff da composição de bases. A segunda peça do quebra-cabeça
utilizada por Watson e Crick teve origem em um trabalho realizado muitos anos
antes por Erwin Chargaff. Estudando uma grande seleção de DNA de diferentes
organismos(Tabela 7.1), Chargaff estabeleceu determinadas regras empíricas a
respeito das quantidades de cada tipo de nucleotídio observado no DNA:
A quantidade total de nucleotídios pirimidínicos (T + C) sempre é igual à
quantidade total de nucleotídios purínicos (A + G).
A quantidade de T sempre é igual à quantidade de A e a quantidade de C
sempre é igual à quantidade de G. Mas a quantidade de A + T não é
necessariamente igual à quantidade de G + C, conforme pode ser observado
na coluna à direita da Tabela 7.1. Essa proporção varia entre os diferentes
organismos, mas é virtualmente a mesma em diferentes tecidos do mesmo
organismo.
Análise do DNA por difração de raios X. A terceira e mais controversa peça do
quebra-cabeça teve origem nos dados de difração de raios X sobre a estrutura do
DNA que foram coletados por Rosalind Franklin quando ela estava no laboratório
de Maurice Wilkins (Figura 7.6). Nos referidos experimentos, foram disparados
raios X nas fibras de DNA e a dispersão dos raios a partir das fibras é observada
por meio da captação dos raios em filme fotográfico, sobre o qual os raios X
produzem pontos. O ângulo da dispersão representado por cada ponto no filme
fornece informações a respeito da posição de um átomo ou de determinados
grupos de átomos na molécula de DNA. Esse procedimento não é de fácil
realização (ou explicação) e a interpretação dos padrões de pontos exige
tratamento matemático complexo, que está além do escopo deste texto. Os dados
disponíveis sugeriam que o DNA é longo e fino e que apresenta duas partes
semelhantes, que são paralelas entre si e que estão localizadas ao longo do
comprimento da molécula. Os dados dos raios X demonstraram que a molécula é
helicoidal (semelhante a uma espiral). Sem o conhecimento de Rosalind Franklin,
sua melhor radiografia foi mostrada a Watson e Crick por Maurice Wilkins e foi
essa peça crucial do quebra-cabeça que possibilitou que eles deduzissem a
estrutura tridimensional que poderia explicar os padrões de pontos dos raios X.
FIGURA 7.5 Estes nucleotídios, dois com bases purina e dois com bases pirimidina, são os elementos
estruturais fundamentais do DNA. O açúcar é denominado desoxirribose, tendo em vista que é uma variação
de um açúcar comum, a ribose, que contém mais um átomo de oxigênio (posição indicada pela seta vermelha).
Tabela 7.1 Propriedades molares das bases* em DNA de diversas fontes.
Organismo Tecido Adenina Timina Guanina Cito
Escherichia
coli (K12)
— 26,0 23,9 24,9 25,2
Diplococcus
pneumoniae
— 29,8 31,6 20,5 18,0
Mycobacterium
tuberculosis
— 15,1 14,6 34,9 35,4
Levedura — 31,3 32,9 18,7 17,1
Paracentrotus
lividus
(ouriço-do-
mar)
Espermatozoide 32,8 32,1 17,7 18,4
Arenque Espermatozoide 27,8 27,5 22,2 22,6
Rato Medula óssea 28,6 28,4 21,4 21,5
Ser humano Timo 30,9 29,4 19,9 19,8
Ser humano Fígado 30,3 30,3 19,5 19,9
Ser humano Espermatozoide 30,7 31,2 19,3 18,8
*Definidas em moles de constituintes nitrogenados por 100 g átomos de fosfato
em hidrolisado.
Fonte: Dados de E. Chargaff e J. Davidson, eds., The Nucleic Acids. Academic
Press, 1955.
Dupla-hélice
Um artigo de 1953 de Watson e Crick no periódico Nature foi iniciado com duas
sentenças que conduziram a uma nova era da biologia: “Desejamos sugerir uma
estrutura para o sal do ácido nucleico desoxirribose (D.N.A.). Essa estrutura
apresenta características novas que são de interesse biológico considerável.”1 A
estrutura do DNA havia sido tema de grande debate desde os experimentos de
Avery e colaboradores em 1944. Conforme observamos, a composição geral do
DNA era conhecida, mas não se sabia como as partes se encaixavam. A estrutura
precisava atender as principais exigências em relação a uma molécula
hereditária: a capacidade de armazenar informações, a capacidade de ser
replicada e a capacidade de sofrer mutação.
A estrutura tridimensional derivada por Watson e Crick é composta por duas
cadeias de nucleotídios (“filamentos”), uma ao lado da outra, torcidas no formato
de uma dupla-hélice (Figura 7.7). Os dois filamentos de nucleotídios são
mantidos unidos por ligações de hidrogênio entre as bases de cada filamento,
formando uma estrutura semelhante a uma escada em espiral (Figura 7.8 A). O
arcabouço de cada filamento é formado por unidades de fosfato e açúcar
desoxirribose alternadas, que estão conectadas por ligações fosfodiéster (Figura
7.8 B). Podemos utilizar essas ligações para descrever como uma cadeia de
nucleotídios é organizada. Conforme mencionado anteriormente, os átomos de
carbono dos grupos de açúcar são numerados 1′ a 5′. Uma ligação fosfodiéster
conecta o átomo de carbono 5′ de uma desoxirribose ao átomo de carbono 3′ da
desoxirribose adjacente. Portanto, diz-se que cada filamento de açúcar e fosfato
apresenta uma polaridade, ou sentido, de 5′ para 3′ e a compreensão dessa
polaridade é essencial para compreender como o DNA atua. Na molécula de
DNA bifilamentar, os dois filamentos têm orientação oposta, ou antiparalela (ver
Figura 7.8 B).
FIGURA 7.6 Rosalind Franklin (esquerda) e seu padrão de difração de raios X do DNA (direita).
(Esquerda, Science Source; direita, Rosalind Franklin/Science Source.)
FIGURA 7.7 James Watson e Francis Crick com seu modelo do DNA. (A. Barrington Brown/Science
Source.)
Cada base está ligada ao átomo de carbono 1′ de um açúcar desoxirribose no
arcabouço de cada filamento e está voltada para dentro e em direção a uma base
no outro filamento. Ligações de hidrogênio entre os pares de bases mantêm os
dois filamentos da molécula de DNA unidos. As ligações de hidrogênio estão
indicadas pelas linhas tracejadas na Figura 7.8 B.
FIGURA 7.8 A. Modelo simplificado demonstrando a estrutura helicoidal do DNA. Os bastões representam
os pares de bases e as fitas representam o arcabouço de açúcar e fosfato das duas cadeias antiparalelas. B.
Diagrama químico preciso da dupla-hélice do DNA, desenrolada para demonstrar as espinhas dorsais açúcar-
fosfato (azul) e os degraus de pares de bases (roxo, laranja). As espinhas dorsais correm em direções
opostas; as extremidades 5′ e 3′ são denominadas em virtude da orientação dos átomos de carbono 5′ e 3′ dos
anéis de açúcar. Cada par de bases apresenta uma base purina, adenina (A) ou guanina (G) e uma base
pirimidina, timina (T) ou citosina (C), conectadas por ligações de hidrogênio (linhas tracejadas vermelhas).
Dois filamentos de nucleotídios complementares pareados de modo
antiparalelo assumem automaticamente uma conformação de dupla-hélice (Figura
7.9), principalmente por meio da interação dos pares de bases. Os pares de bases,
que são estruturas planares achatadas, ficam “empilhados” uns sobre os outros no
centro da dupla-hélice (ver Figura 7.9 A). O empilhamento aumenta a
estabilidade da molécula de DNA ao excluir as moléculas de água dos espaços
entre os pares de bases. A forma mais estável que resulta do empilhamento de
bases é uma dupla-hélice com dois tamanhos distintos de sulcos que ocorrem em
uma espiral: o sulco maior e o sulco menor, que podem ser observados em
ambos os modelos da fita e do preenchimento dos espaços da Figura 7.9 A e 7.9
B. A maior parte das associações DNA-proteína ocorre nos sulcos maiores. Um
filamento de nucleotídios único não apresenta estrutura helicoidal; o formato
helicoidal do DNA depende totalmente do pareamento e do empilhamento das
bases nos filamentos antiparalelos. O DNA é uma hélice com giro para a direita;
em outras palavras, ele apresenta a mesma estrutura de um parafuso que seria
parafusado em um local por meio de um movimento em sentido horário.
A dupla-hélice corresponde bem aos dados de difração dos raios X e às regras
de Chargaff. Ao estudar os modelos da estrutura que eles produziram, Watson e
Crick perceberam que o raio observado da dupla-hélice (conhecido a partir dos
dados de raios X) seria explicado se uma base purina sempre pareasse (por meio
de ligações de hidrogênio) com uma base pirimidina (Figura 7.10). O referido
pareamento explicaria a regularidade de (A + G) = (T + C) observada por
Chargaff, maspreveria quatro pareamentos possíveis: T A, T G, C A e
C G. Os dados de Chargaff, entretanto, indicam que T pareia apenas com A e
que C pareia apenas com G. Watson e Crick concluíram que cada par de bases é
composto por uma base purina e uma base pirimidina, pareadas de acordo com a
regra a seguir: G pareia com C e A pareia com T.
Observe que o par G-C apresenta três ligações de hidrogênio, enquanto o par
A-T apresenta apenas duas (ver Figura 7.8 B). Preveríamos que o DNA que
contém muitos pares G-C seria mais estável do que o DNA que contém muitos
pares A-T. De fato, essa previsão é confirmada. O calor causa a separação dos
dois filamentos da dupla-hélice do DNA (um processo denominado dissociação
do DNA ou desnaturação do DNA); DNA com mais alto conteúdo de G + C
necessita de temperaturas mais altas para se dissociar, em virtude da maior
atração do pareamento G-C.
CONCEITO-CHAVE O DNA é uma dupla-hélice composta por duas cadeias
de nucleotídios unidas por meio do pareamento complementar de A com T e
de G com C.
FIGURA 7.9 O diagrama do filamento (A) destaca o empilhamento dos pares de bases, enquanto o modelo
de preenchimento de espaços (B) demonstra os sulcos maior e menor.
1.
2.
3.
FIGURA 7.10 O pareamento das purinas com as pirimidinas explica exatamente o diâmetro da dupla-hélice
de DNA determinado a partir dos dados de raios X. Aquele diâmetro é indicado pelas linhas verticais
tracejadas.
A descoberta da estrutura do DNA por Watson e Crick é considerada por
algumas pessoas a descoberta biológica mais importante do século 20 e isso fez
com que eles recebessem o Prêmio Nobel com Maurice Wilkins em 1962
(Rosalind Franklin morreu de câncer em 1958 e o prêmio não é concedido
postumamente). O motivo para essa descoberta ser considerada tão importante é
que o modelo da dupla-hélice, além de ser consistente com os dados anteriores a
respeito da estrutura do DNA, preencheu os três requisitos em relação a uma
substância hereditária:
A estrutura da dupla-hélice sugeriu como o material genético poderia
determinar a estrutura das proteínas. Talvez a sequência de pares de
nucleotídios no DNA dite a sequência de aminoácidos na proteína
especificada por aquele gene. Em outras palavras, algum tipo de código
genético pode escrever as informações no DNA como uma sequência de
nucleotídios e em seguida traduzi-las em uma linguagem diferente de
sequências de aminoácidos na proteína. Como isso é realizado é o assunto
do Capítulo 9.
Se a sequência de bases do DNA especifica a sequência de aminoácidos,
então é possível a mutação por meio da substituição de um tipo de base por
outro em uma ou mais posições. As mutações serão discutidas no Capítulo
16.
Na medida em que Watson e Crick declararam nas palavras da conclusão de
seu artigo de 1953 na Nature que relatava a estrutura da dupla-hélice do
DNA: “Não escapou da nossa atenção que o pareamento específico que
postulamos sugere imediatamente um possível mecanismo de cópia em
relação ao material genético.”2 Para os geneticistas da época, o significado
dessa declaração estava claro, conforme veremos na próxima seção.
7.3 Replicação semiconservativa
O mecanismo de cópia ao qual Watson e Crick fizeram referência é denominado
replicação semiconservativa e está diagramado na Figura 7.11. Os arcabouços de
açúcar e fosfato são representados por fitas espessas e a sequência de pares de
bases é aleatória. Imaginemos que a dupla-hélice é análoga a um zíper que se
abre, com início em uma extremidade. Podemos observar que, se essa analogia
com o zíper é válida, a deselicoidização dos dois filamentos exporá bases únicas
em cada filamento. Cada base exposta apresenta o potencial de parear com
nucleotídios livres em uma solução. Tendo em vista que a estrutura do DNA
impõe estritas exigências de pareamento, cada base exposta irá parear apenas
com a sua base complementar, A com T e G com C. Portanto, cada um dos dois
filamentos únicos atuará como um modelo, ou molde, para direcionar a montagem
das bases complementares para formar novamente uma dupla-hélice idêntica à
original. Presume-se que os nucleotídios recentemente adicionados advenham de
um conjunto de nucleotídios livres que deve estar presente na célula.
Se esse modelo estiver correto, então cada molécula-filha deve conter uma
cadeia de nucleotídios parental e uma cadeia de nucleotídios recentemente
sintetizada. Entretanto, um pouco de ponderação demonstra que existem no
mínimo três modos diferentes nos quais uma molécula de DNA parental pode
estar relacionada com as moléculas-filhas. Esses modos hipotéticos de replicação
são denominados semiconservativo (o modelo de Watson-Crick), conservativo e
dispersivo (Figura 7.12). Na replicação semiconservativa, a dupla-hélice de
cada molécula-filha de DNA contém um filamento da molécula de DNA original e
um filamento recém-sintetizado. Na replicação conservativa, a molécula de DNA
do genitor é conservada e uma única dupla hélice-filha é produzida, composta por
dois filamentos recém-sintetizados. Na replicação dispersiva, cada uma das
moléculas-filhas é composta por filamentos que contêm segmentos de ambos os
DNA parentais e do DNA recém-sintetizado.
Experimento de Meselson-Stahl
O primeiro problema na compreensão da replicação do DNA foi descobrir se o
mecanismo da replicação era semiconservativo, conservativo ou dispersivo. Em
1958, dois jovens cientistas, Matthew Meselson e Franklin Stahl, decidiram
descobrir quais dessas possibilidades descrevia corretamente a replicação do
DNA. A ideia deles era possibilitar que moléculas de DNA parental contendo
nucleotídios de uma densidade replicassem em um meio contendo nucleotídios de
densidade diferente. Se o DNA fosse replicado de modo semiconservativo, as
moléculas-filhas seriam metade antigas e metade novas e, portanto, de densidade
intermediária.
Para realizar o seu experimento, Meselson e Stahl cultivaram E. coli em um
meio contendo o isótopo pesado de nitrogênio (15N), em vez do tipo leve (14N)
normal. Esse isótopo foi inserido nas bases nitrogenadas, que em seguida foram
incorporadas em filamentos de DNA recém-sintetizados. Após muitas divisões
celulares em 15N, o DNA das células estava bem-marcado com o isótopo pesado.
Em seguida as células foram removidas do meio com 15N e colocadas em um meio
com 14N; após uma e duas divisões celulares, foram coletadas amostras e o DNA
foi isolado de cada amostra.
FIGURA 7.11 O modelo semiconservativo da replicação do DNA proposto por Watson e Crick tem por base
a especificidade dos pares de bases ligados por pontes de hidrogênio. Os filamentos parentais, demonstrados
em azul, atuam como moldes para a polimerização. Os filamentos recém-polimerizados, demonstrados em
amarelo, apresentam as sequências de bases que são complementares aos seus respectivos moldes.
FIGURA 7.12 Dos três modelos alternativos para a replicação do DNA, o modelo da estrutura do DNA de
Watson-Crick produziria o primeiro modelo (semiconservativo). As linhas amarelas representam os
filamentos recém-sintetizados.
Meselson e Stahl foram capazes de distinguir o DNA de diferentes densidades
porque as moléculas podem ser separadas umas das outras por meio de um
procedimento denominado centrifugação em gradiente de cloreto de césio. Se o
cloreto de césio (CsCl) for centrifugado em velocidades tremendamente altas
(50.000 rpm) durante muitas horas, os íons césio e cloreto tendem a ser
empurrados pela força centrífuga para o fundo do tubo. Finalmente, é estabelecido
um gradiente de íons no tubo, com a mais alta concentração de íons, ou densidade,
no fundo. O DNA centrifugado com o cloreto de césio forma uma banda em uma
posição idêntica à sua densidade no gradiente (Figura 7.13). O DNA de diferentes
densidades formará bandas em locais diferentes. As células inicialmente
cultivadas no isótopo pesado 15N demonstraram DNA de alta densidade. Esse
DNA está demonstrado em azul à esquerda da Figura 7.13 A. Após o cultivo
dessas células no isótopo leve 14N por uma geração, os pesquisadores
observaram que o DNAera de densidade intermediária, demonstrando uma
metade azul (15N) e uma metade dourada (14N) na parte intermediária da Figura
7.13 A. Observe que Meselson e Stahl continuaram o experimento durante duas
gerações de E. coli, de modo que puderam distinguir a replicação
semiconservativa da dispersiva. Após duas gerações, foram observados tanto
DNA de densidade intermediária quanto de densidade baixa (à direita da Figura
7.13 A), precisamente como previsto pelo modelo de replicação
semiconservativa de Watson e Crick.
CONCEITO-CHAVE O DNA é replicado por meio da deselicoidização dos
dois filamentos da dupla-hélice e da construção de um novo filamento
complementar em cada um dos filamentos separados da dupla-hélice original.
Forquilha de replicação
Outra previsão do modelo de replicação do DNA de Watson-Crick é que um zíper
de replicação, ou forquilha, será observado na molécula de DNA durante a
replicação. Essa forquilha é o local no qual a dupla-hélice é desenrolada para
produzir os dois filamentos únicos que atuam como moldes para a cópia. Em
1963, John Cairns testou essa previsão ao possibilitar a replicação do DNA em
células bacterianas para incorporar a timidina tritiada ([3H]timidina) — o
nucleotídio da timidina marcado com um isótopo de hidrogênio radioativo
denominado trítio. Teoricamente, cada molécula-filha recentemente sintetizada
deve conter um filamento radioativo (“quente”) (com 3H) e outro filamento não
radioativo (“frio”). Após intervalos variados e quantidades variadas de ciclos de
replicação em um meio “quente”, Cairns lisou cuidadosamente as bactérias e
possibilitou que os conteúdos celulares assentassem em lâminas de microscopia
eletrônica. Finalmente, Cairns cobriu as lâminas com emulsão fotográfica e a
expôs ao escuro durante 2 meses. Esse procedimento, denominado
autorradiografia, possibilitou que Cairns desenvolvesse uma imagem da
localização de 3H no material celular. Na medida em que o 3H decai, ele emite
uma partícula beta (um elétron energético). A emulsão fotográfica detecta uma
reação química que ocorre sempre que uma partícula beta atinge a emulsão. Em
seguida, a emulsão pode ser revelada como uma impressão fotográfica, de modo
que o rastro de emissão de partículas beta aparece como pontos ou grãos pretos.
Após um ciclo de replicação em [3H]timidina, apareceu um anel de pontos na
autorradiografia. Cairns interpretou esse anel como um filamento radioativo
recentemente formado em uma molécula-filha de DNA circular, conforme
demonstrado na Figura 7.14 A. Portanto, estava aparente que o cromossomo
bacteriano é circular — um fato que também surgiu a partir da análise genética
descrita anteriormente (Capítulo 5). No segundo ciclo de replicação, as
forquilhas previstas pelo modelo de fato foram observadas. Além disso, a
densidade dos grãos nos três segmentos foi tal que a interpretação demonstrada na
Figura 7.14 B pode ser realizada: a curva espessa de pontos que corta o interior
do círculo de DNA seria o filamento-filho recém-sintetizado, dessa vez composto
por dois filamentos radioativos. Cairns observou todos os tamanhos desses
padrões autorradiográficos em formato de lua, correspondendo à movimentação
progressiva das forquilhas de replicação, ao redor do anel.
FIGURA 7.13 O experimento de Meselson-Stahl demonstra que o DNA é copiado por meio da replicação
semiconservativa. O DNA centrifugado em um gradiente de cloreto de césio (CsCl) formará bandas de acordo
com a sua densidade. A. Quando as células cultivadas em 15N são transferidas para um meio com 14N, a
primeira geração produz uma única banda de DNA intermediária e a segunda geração produz duas bandas:
uma intermediária e uma leve. Este resultado corresponde às previsões do modelo semiconservativo de
replicação do DNA. B e C. Os resultados previstos em relação à replicação conservativa e replicação
dispersiva, demonstrados aqui, não foram observados.
FIGURA 7.14 Um cromossomo bacteriano replicando apresenta duas forquilhas de replicação. A. Esquerda:
autorradiografia de um cromossomo bacteriano após uma replicação em timidina tritiada. De acordo com o
modelo de replicação semiconservativa, um dos dois filamentos deve ser radioativo. Direita: interpretação da
autorradiografia. A hélice amarela representa o filamento tritiado. B. Esquerda: autorradiografia de um
cromossomo bacteriano na segunda rodada da replicação em timidina tritiada (3H). Nesta molécula, a dupla-
hélice recentemente replicada que cruza o círculo pode ser composta por dois filamentos radioativos (se o
filamento parental for o filamento radioativo). Direita: a espessura dupla do traçado radioativo no
autorradiograma aparenta confirmar a interpretação demonstrada aqui.
DNA polimerases
Um problema confrontado pelos cientistas era compreender justamente como as
bases são trazidas até o molde da dupla-hélice. Embora os cientistas suspeitassem
que enzimas desempenhassem um papel, essa possibilidade não foi comprovada
até 1959, quando Arthur Kornberg isolou a DNA polimerase de E. coli e
demonstrou sua atividade enzimática in vitro. Essa enzima adiciona
desoxirribonucleotídios na extremidade 3′ de uma cadeia de nucleotídios em
1.
2.
3.
crescimento, utilizando como molde um filamento único de DNA que foi exposto
pela deselicoidização localizada da dupla-hélice (Figura 7.15). Os substratos
para a DNA polimerase são as formas trifosfato dos desoxirribonucleotídios,
dATP, dGTP, dCTP e dTTP. A adição de cada base ao polímero em crescimento é
acompanhada pela remoção de dois dos três fosfatos na forma de pirofosfato
(PPi). A energia produzida pela clivagem dessa ligação de alta energia e a
subsequente hidrólise do pirofosfato em duas moléculas de fosfato inorgânico
auxiliam no direcionamento do processo endergônico de construção de um
polímero de DNA.
Atualmente sabe-se que existem cinco DNA polimerases na E. coli. A primeira
enzima que Kornberg purificou atualmente é denominada DNA polimerase I, ou
pol I. Essa enzima apresenta três atividades, que aparentam estar localizadas em
diferentes partes da molécula:
Uma atividade de polimerase, que catalisa o crescimento da cadeia no
sentido 5′ para 3′.
Uma atividade de exonuclease 3′ para 5′, que remove bases incorretamente
pareadas.
Uma atividade de exonuclease 5′ para 3′, que degrada filamentos únicos de
DNA ou RNA.
Retornaremos à significância das duas atividades de exonuclease posteriormente
neste capítulo.
Embora a pol I atue na replicação do DNA (ver próxima seção), alguns
cientistas suspeitavam de que ela não fosse responsável pela maior parte da
síntese do DNA, tendo em vista que ela era muito lenta (aproximadamente 20
nucleotídios/s) e muito abundante (aproximadamente 400 moléculas/célula), além
de se dissociar do DNA após a incorporação de apenas 20 a 50 nucleotídios. Em
1969, John Cairns e Paula DeLucia resolveram essa questão quando
demonstraram que uma linhagem de E. coli com uma mutação no gene que
codifica a DNA pol I ainda era capaz de crescer normalmente e replicar o seu
DNA. Eles concluíram que outra DNA polimerase, atualmente denominada pol III,
7.4
catalisa a síntese de DNA na forquilha de replicação.
FIGURA 7.15 A DNA polimerase catalisa a reação de alongamento da cadeia. A energia para a reação
advém da quebra da ligação fosfato de alta energia do substrato trifosfato.
Visão geral da replicação do DNA
Na medida em que a DNA pol III avança, a dupla-hélice é continuamente
desenrolada à frente da enzima para expor comprimentos adicionais de filamentos
de DNA simples que atuarão como moldes (Figura 7.16). A DNA pol III atua
como a forquilha de replicação, a zona na qual a dupla-hélice está desenrolando.
Entretanto, tendo em vista que a DNA polimerase sempre adiciona nucleotídios na
extremidade 3′ em crescimento, apenas um dos dois filamentos antiparalelos
pode atuar como molde para a replicação na direção da forquilha de replicação.
Em relação a esse filamento, a síntese pode ocorrer de modo contínuo e suave na
direção da forquilha; o novo filamento no sentido líder, é denominadofilamento
contínuo (no sentido líder, leading).
A síntese do outro filamento também ocorre na extremidade em crescimento 3′,
mas essa síntese ocorre no sentido “errado”, tendo em vista que, em relação a
esse filamento, o sentido 5′ para 3′ da síntese está longe da forquilha de
replicação (ver Figura 7.16). Conforme veremos, a natureza do maquinário de
replicação requer que a síntese de ambos os filamentos ocorra na região da
forquilha de replicação. Portanto, a síntese que se afasta da forquilha de
crescimento não pode prosseguir por muito tempo. Ela tem de ocorrer em
segmentos curtos: a polimerase sintetiza um segmento, em seguida se movimenta
de volta para a extremidade 5′ do segmento, onde a forquilha em crescimento
expôs o novo molde e inicia o processo novamente. Esses trechos curtos (1.000 a
2.000 nucleotídios) de DNA recém-sintetizado são denominados fragmentos de
Okazaki.
FIGURA 7.16 A forquilha de replicação se movimenta na síntese de DNA na medida em que a dupla-hélice é
continuamente desenrolada. A síntese do filamento contínuo (leading) pode prosseguir suavemente sem
interrupções na direção do movimento da forquilha de replicação, mas a síntese do filamento descontínuo
(lagging) deve prosseguir na direção oposta, para longe da forquilha de replicação.
Outro problema na replicação do DNA surge em virtude de a DNA polimerase
conseguir estender uma cadeia, mas não iniciar uma cadeia. Portanto, a síntese do
filamento contínuo e de cada fragmento de Okazaki tem de ser iniciada por um
primer, ou uma cadeia curta de nucleotídios, que se liga ao filamento-molde para
formar um segmento de ácido nucleico dúplex. O primer na replicação do DNA
pode ser observado na Figura 7.17. Os primers são sintetizados por um conjunto
de proteínas denominado primossomo, do qual um componente central é uma
enzima denominada primase, um tipo de RNA polimerase. A primase sintetiza um
trecho curto (aproximadamente 8 a 12 nucleotídios) de RNA complementar a uma
região específica do cromossomo. No filamento contínuo, é necessário apenas um
primer inicial, tendo em vista que, após a ação do primer inicial, o filamento de
DNA em crescimento atua como primer para a adição contínua. Entretanto, no
filamento descontínuo, cada fragmento de Okazaki necessita de seu próprio
primer. A cadeia de RNA que compõe o primer em seguida é estendida como
uma cadeia de DNA pela DNA pol III.
Uma DNA polimerase diferente, pol I, remove os primers de RNA com sua
atividade de exonuclease 5′ para 3′ e preenche as lacunas com sua atividade de
polimerase 3′ para 5′. Conforme mencionado anteriormente, a pol I é a enzima
originalmente purificada por Kornberg. Outra enzima, a DNA ligase, une a
extremidade 3′ do DNA que preencheu a lacuna à extremidade 5′ do fragmento de
Okazaki dowstream. O novo filamento assim formado é denominado filamento
descontínuo (lagging). A DNA ligase une os fragmentos do DNA ao catalisar a
formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5′-fosfato de um
fragmento e o grupo 3′-OH adjacente de outro fragmento.
Um marco da replicação do DNA é a sua precisão, também denominada
fidelidade: em geral, é inserido menos de um erro por 1010 nucleotídios. Parte do
motivo da precisão da replicação do DNA é que ambas a DNA pol I e a DNA pol
III possuem atividade de exonuclease 3′ para 5′, que atua como uma função de
“revisão” por meio da excisão de bases incorretamente inseridas.
Em virtude da importância da revisão, veremos mais de perto como ela atua.
Um par de bases incorretamente pareado ocorre quando a atividade da
polimerase 5′ para 3′ insere, por exemplo, uma A em vez de uma G para parear
com uma C. A adição de uma base incorreta com frequência ocorre em virtude de
um processo denominado tautomerização. Cada uma das bases no DNA pode se
apresentar em uma de diversas formas, denominadas tautômeros, que são
isômeros que diferem nas posições de seus átomos e nas ligações entre os átomos.
As formas estão em equilíbrio. A forma ceto de cada base normalmente está
presente no DNA, mas em casos raros, uma base pode ser alterada para a forma
imino ou enol. As formas imino e enol podem parear com a base errada,
formando um par errôneo (Figura 7.18). Quando uma C é alterada para a sua
forma rara imino, a polimerase adiciona uma A em vez de uma G (Figura 7.19).
Felizmente, tal erro normalmente é detectado e removido pela atividade de
exonuclease 3′ para 5′. Após a remoção da base incorreta, a polimerase tem outra
chance de adicionar a base G complementar correta.
Conforme seria esperado, linhagens mutantes sem uma exonuclease 3′ para 5′
funcional apresentam uma taxa mais alta de mutação. Além disso, tendo em vista
que a primase não apresenta uma função de revisão, o primer de RNA apresenta
maior probabilidade de conter erros do que o DNA. A necessidade de manter a
alta fidelidade da replicação é um motivo pelo qual os primers de RNA nas
extremidades dos fragmentos de Okazaki precisam ser removidos e substituídos
por DNA. Apenas após a remoção do primer de RNA a DNA pol I catalisa a
síntese do DNA para substituir o primer. O assunto do reparo do DNA será
comentado em detalhes no Capítulo 16.
FIGURA 7.17 Etapas na síntese do filamento descontínuo (lagging). A síntese de DNA prossegue por meio
da síntese contínua no filamento leading e da síntese descontínua no filamento lagging.
FIGURA 7.18 Pareamento de bases normal, em comparação com o de bases incorretamente pareadas. A.
Pareamento entre as formas normais (ceto) das bases. B. Formas tautoméricas raras de bases resultam em
pareamentos incorretos.
CONCEITO-CHAVE A replicação do DNA ocorre na forquilha de
replicação, onde a dupla-hélice está desenrolando e os dois filamentos estão
se separando. A replicação do DNA prossegue continuamente na direção da
forquilha de replicação em deselicoidização no filamento contínuo. O DNA é
sintetizado em segmentos curtos, na direção para longe da forquilha de
replicação, no filamento descontínuo. A DNA polimerase necessita que um
primer, ou uma cadeia curta de nucleotídios, já esteja posicionado para
iniciar a síntese.
7.5
FIGURA 7.19 A DNA polimerase remove o pareamento incorreto A-C com a utilização da sua atividade de
exonuclease 3′ para 5′.
Replissomo | Uma máquina de replicação notável
Outro marco da replicação do DNA é a velocidade. O tempo necessário para que
a E. coli replique o seu cromossomo é tão breve quanto 40 min. Portanto, seu
genoma de aproximadamente 5 milhões de pares de bases deve ser copiado a uma
velocidade de aproximadamente 2.000 nucleotídios por segundo. A partir do
experimento de Cairns, sabemos que a E. coli utiliza apenas duas forquilhas de
replicação para copiar o seu genoma inteiro. Portanto, cada forquilha tem de ser
capaz de se movimentar a uma velocidade de até 1.000 nucleotídios por segundo.
O que é notável a respeito de todo o processo de replicação do DNA é que ele
não sacrifica a velocidade pela precisão. Como ele consegue manter ambas, a
velocidade e a precisão, tendo em vista a complexidade das reações na forquilha
de replicação? A resposta é que a DNA polimerase é parte de um grande
complexo “nucleoproteico” que coordena as atividades na forquilha de
replicação. Esse complexo, denominado replissomo, é um exemplo de uma
“máquina molecular”. Você encontrará outros exemplos nos capítulos posteriores.
A descoberta de que as principais funções da célula — replicação, transcrição e
tradução, por exemplo — são realizadas por grandes complexos de
multissubunidades alterou o modo como pensamos a respeito das células. Para
começar a compreender o motivo, vejamos o replissomo mais de perto.
Alguns dos componentes do replissomo na E. coli em interação estão
demonstrados na Figura 7.20. Na forquilha de replicação, o centro catalítico da
DNA pol III for parte de um complexo muito maior, denominado holoenzima pol
III, que é composto por dois centros catalíticos e muitas proteínas acessórias. Um
dos centros catalíticos lida com a síntese do filamento contínuo, enquanto o outro
lida com a síntesedo filamento descontínuo. Algumas das proteínas acessórias
(não visíveis na Figura 7.20) formam uma conexão entre os dois centros
catalíticos, coordenando, assim, a síntese dos filamentos contínuo e descontínuo.
O filamento descontínuo está demonstrado fazendo uma alça, de modo que o
replissomo consegue coordenar a síntese de ambos os filamentos e se movimentar
para a forquilha de replicação. Uma proteína acessória importante, denominada
grampo β, circunda o DNA como uma rosquinha e mantém a pol III ligada à
molécula de DNA. Portanto, a pol III é transformada de uma enzima que pode
adicionar apenas 10 nucleotídios antes de sair do molde (denominada enzima
distributiva) em uma enzima que permanece na forquilha em movimento e que
adiciona dezenas de milhares de nucleotídios (uma enzima processiva).
Resumidamente, por meio da ação de proteínas acessórias, a síntese de ambos os
filamentos contínuo e descontínuo é rápida e altamente coordenada.
FIGURA 7.20 O replissomo e as proteínas acessórias realizam uma diversidade de etapas na forquilha de
replicação. A topoisomerase e a helicase desenrolam e abrem a dupla-hélice na preparação para a replicação
do DNA. Quando a dupla-hélice foi desenrolada, proteínas de ligação a filamento simples evitam que a dupla-
hélice se forme novamente. A ilustração é uma representação do assim denominado modelo em trombone
(denominado em virtude da sua semelhança com um trombone em virtude da alça do filamento descontínuo),
demonstrando como se imagina que os dois centros catalíticos do replissomo interajam para coordenar os
diversos eventos de replicação dos filamentos contínuo e descontínuo.
Observe que a primase, a enzima que sintetiza o primer de RNA, não está
tocando na proteína grampo. Portanto, a primase atua como uma enzima
distributiva — ela adiciona apenas alguns ribonucleotídios antes de se dissociar
do molde. Esse modo de ação faz sentido, tendo em vista que o primer precisa ser
apenas longo o suficiente para formar um ponto inicial dúplex adequado para a
DNA pol III.
Deselicoidização da dupla-hélice
Quando a dupla-hélice foi proposta em 1953, uma objeção importante era que a
replicação de uma referida estrutura exigiria a deselicoidização da dupla-hélice
na forquilha de replicação e a quebra das ligações de hidrogênio que mantêm os
filamentos unidos. Como o DNA poderia ser desenrolado tão rapidamente e,
ainda que pudesse, como não helicoidizar excessivamente o DNA atrás da
forquilha e o tornar extremamente emaranhado? Atualmente sabemos que o
replissomo contém duas classes de proteínas que abrem a hélice e evitam a
helicoidização excessiva: elas são as helicases e as topoisomerases,
respectivamente.
As helicases são enzimas que rompem as ligações de hidrogênio que mantêm os
dois filamentos da dupla-hélice juntos. Assim como a proteína grampo, a helicase
se adéqua como uma rosquinha ao redor do DNA; a partir dessa posição, ela
rapidamente desenrola a dupla-hélice à frente da síntese do DNA. O DNA
desenrolado é estabilizado por meio de proteínas de ligação a filamento simples
(SSB, do inglês, single-strand-binding), que se ligam ao DNA unifilamentar e
evitam a reestruturação do dúplex.
O DNA circular pode ser torcido e espiralado, de modo muito semelhante às
espirais extras que podem ser introduzidas em um elástico torcido. O desenrolar
da forquilha de replicação pelas helicases causa torção extra em outras regiões e
são formadas superespirais para liberar a tensão da torção extra. Tanto as torções
quanto as superespirais têm de ser removidas para possibilitar que a replicação
continue. Essa super-helicoidização pode ser criada ou relaxada por enzimas
denominadas topoisomerases, das quais um exemplo é a DNA girase (Figura
7.21). As topoisomerases relaxam o DNA super-helicoidizado por meio da
quebra de um único filamento de DNA ou de ambos os filamentos, o que
possibilita que o DNA gire tornando-se uma molécula relaxada. As
topoisomerases encerram reunindo os filamentos da molécula de DNA agora
relaxada.
CONCEITO-CHAVE Uma máquina molecular denominada replissomo realiza
a síntese do DNA. Ela inclui duas unidades de DNA polimerase para lidar
com a síntese em cada filamento e coordena a atividade das proteínas
acessórias necessárias para o priming, a deselicoidização da dupla-hélice e
a estabilização dos filamentos separados.
FIGURA 7.21 A DNA girase, uma topoisomerase, remove torções extras durante a replicação. A. Regiões
extratorcidas (positivamente super-helicoidizadas) se acumulam à frente da forquilha na medida em que os
filamentos parentais se separam para a replicação. B. Uma topoisomerase, tal como a DNA girase, remove
estas regiões por meio de corte nos filamentos de DNA, possibilitando que eles girem, e, em seguida, reúne os
filamentos.
Montagem do replissomo | Início da replicação
A montagem do replissomo é um processo ordenado que tem início em locais
precisos no cromossomo (denominados origens) e que ocorre apenas em
determinadas ocasiões na vida da célula. A replicação da E. coli tem início a
partir de uma origem fixa (um locus denominado oriC) e em seguida prossegue
em ambas as direções (com forquilhas movendo-se em ambas as extremidades,
conforme demonstrado na Figura 7.14), até que as forquilhas se fundam. A Figura
7.22 demonstra o processo de montagem do replissomo. A primeira etapa é a
ligação de uma proteína denominada DnaA a uma sequência de 13 pares de bases
(pb) específica (denominada “DnaA box”), que é repetida cinco vezes em oriC.
Em resposta à ligação da DnaA, a origem é deselicoidizada em um grupo de
nucleotídios A e T. Relembre que os pares de bases AT são mantidos juntos por
apenas duas ligações de hidrogênio, enquanto os pares de bases GC são mantidos
juntos por três. Portanto, é mais fácil separar (dissociar) a dupla-hélice em
trechos de DNA que são enriquecidos com bases A e T.
7.6
FIGURA 7.22 A síntese de DNA é iniciada nas origens de replicação em procariotos. As proteínas se ligam à
origem (oriC), onde separam os dois filamentos da dupla-hélice e recrutam componentes do replissomo para
as duas forquilhas de replicação.
Após o início da deselicoidização, proteínas DnaA adicionais se ligam às
regiões de filamentos simples recém-deselicoidizadas. Com a DnaA revestindo a
origem, duas helicases (proteína DnaB) agora se ligam e deslizam de 5′ para 3′ a
fim de iniciar a abertura da hélice na forquilha de replicação. A primase e a
holoenzima DNA pol III são recrutadas para a forquilha de replicação por meio
de interações proteína-proteína e a síntese do DNA tem início. Você pode estar
pensando o motivo de a DnaA não estar presente na Figura 7.20, que demonstra o
replissomo. A resposta é que, embora ela seja necessária para a montagem do
replissomo, ela não é parte da máquina de replicação. Em vez disso, sua função é
posicionar o replissomo no local correto no cromossomo circular para a
iniciação da replicação.
Replicação em organismos eucariotos
A replicação do DNA em procariotos e eucariotos utiliza um mecanismo
semiconservativo e emprega a síntese de filamentos contínuo e descontínuo. Por
esse motivo, não deve ser uma surpresa que os componentes do replissomo
procariótico e aqueles do replissomo eucariótico sejam bastante semelhantes.
Entretanto, na medida em que os organismos aumentam em complexidade, o
número de componentes do replissomo também aumenta.
Origens da replicação eucariótica
Bactérias tais como E. coli normalmente completam um ciclo de replicação e
divisão em 20 a 40 minutos, mas, em eucariotos, o ciclo pode variar de 1,4 hora
em leveduras a 24 horas em células animais cultivadas e pode durar de 100 a 200
horas em algumas células. Os eucariotos têm de resolver o problema da
coordenação da replicação de mais de um cromossomo.
Para compreender as origens da replicação eucariótica, primeiramente
voltaremos a nossa atenção para a levedura, um eucarioto simples. Muitas
proteínas eucarióticas que atuam nas origens de replicação foram identificadas
pela primeira vez em leveduras, em virtudeda facilidade da análise genética em
pesquisas com leveduras (ver Organismo-modelo, Levedura, no Capítulo 12). As
origens de replicação em leveduras são muito semelhantes à oriC em E. coli. As
origens de 100 a 200 pb apresentam uma sequência de DNA conservada que
inclui uma região rica em AT que se dissocia quando uma proteína iniciadora se
liga aos sítios de ligação adjacentes. Contrariamente aos cromossomos
procarióticos, cada cromossomo eucariótico apresenta muitas origens de
replicação para replicar rapidamente os genomas eucarióticos muito maiores.
Aproximadamente 400 origens de replicação estão dispersas pelos 16
cromossomos de levedura e estima-se que existam milhares de forquilhas de
replicação nos 23 cromossomos dos seres humanos. Portanto, em eucariotos, a
replicação prossegue em ambos os sentidos a partir de múltiplos pontos de
origem (Figura 7.23). As duplas-hélices que estão sendo produzidas em cada
origem da replicação alongam e finalmente se unem umas às outras. Quando a
replicação dos dois filamentos está completa, resultam duas moléculas-filhas de
DNA idênticas.
CONCEITO-CHAVE Onde e quando ocorre a replicação são cuidadosamente
controlados pela montagem ordenada do replissomo em um local preciso,
denominado origem. A replicação prossegue em ambos os sentidos a partir de
uma única origem no cromossomo procariótico circular. A replicação
prossegue em ambos os sentidos a partir de centenas de milhares de origens
em cada um dos cromossomos eucarióticos lineares.
FIGURA 7.23 A replicação do DNA prossegue em ambos os sentidos a partir de uma origem de replicação.
As setas pretas indicam o sentido do crescimento das moléculas-filhas de DNA. A. Começando na origem, as
DNA polimerases se movimentam para o exterior em ambos os sentidos. As setas amarelas longas
representam os filamentos contínuos e as setas amarelas curtas unidas representam os filamentos
descontínuos. B. Como a replicação prossegue no nível cromossômico. Três origens de replicação estão
demonstradas neste exemplo.
Replicação do DNA e ciclo celular de levedura
A síntese do DNA ocorre na fase S (síntese) do ciclo celular eucariótico (Figura
7.24). Como o início da síntese do DNA está limitado a esse estágio único? Em
leveduras, o método de controle é ligar a montagem do replissomo ao ciclo
celular. A Figura 7.25 demonstra o processo. Em leveduras, são necessárias três
proteínas para iniciar a montagem do replissomo. O complexo de reconhecimento
da origem (ORC) se liga primeiramente às sequências nas origens de leveduras,
de modo muito semelhante como a proteína DnaA o faz em E. coli. A presença de
ORC na origem atua para recrutar duas outras proteínas, Cdc6 e Cdt1. Ambas as
proteínas mais o ORC em seguida recrutam a helicase, denominada complexo
MCM, e os outros componentes do replissomo.
A replicação está ligada ao ciclo celular por meio da disponibilidade de Cdc6
e Cdt1. Em leveduras, essas proteínas são sintetizadas durante o final da mitose e
o intervalo 1 (G1) e são destruídas por proteólise após o início da síntese. Desse
modo, o replissomo pode ser montado apenas antes da fase S. Quando a
replicação tem início, não pode haver formação de novos replissomos nas
origens, tendo em vista que Cdc6 e Cdt1 são degradadas durante a fase S e
deixam de estar disponíveis.
FIGURA 7.24 O DNA é replicado durante a fase S do ciclo celular.
FIGURA 7.25 Este exemplo de levedura demonstra a iniciação da síntese de DNA em uma origem de
replicação em um eucarioto. Assim como na iniciação da replicação procariótica (ver Figura 7.20), as
proteínas do complexo de reconhecimento da origem (ORC) se ligam à origem, onde separam os dois
filamentos da dupla-hélice e recrutam os componentes do replissomo nas duas forquilhas de replicação. A
replicação está ligada ao ciclo celular por meio da disponibilidade de duas proteínas: Cdc6 e Cdt1.
Origens de replicação em eucariotos superiores
Conforme já declarado, a maior parte das aproximadamente 400 origens de
replicação em leveduras é composta por sequências de DNA motifs semelhantes
(100 a 200 pb de comprimento), que são reconhecidas pelas subunidades de
ORC. Curiosamente, embora todos os eucariotos caracterizados apresentem
proteínas ORC semelhantes, as origens de replicação em eucariotos superiores
são muito mais longas, possivelmente de até dezenas de milhares ou centenas de
milhares de nucleotídios. Significativamente, os eucariotos apresentam
semelhança limitada de sequências. Portanto, embora o ORC de levedura
reconheça se-quências de DNA específicas em cromossomos de levedura, o que
os ORC correlatos de eucariotos superiores reconhecem não está claro nesse
momento, mas a característica reconhecida provavelmente não é uma sequência
de DNA específica. O que essa incerteza significa em termos práticos é que é
muito mais difícil isolar origens de replicação de seres humanos e outros
eucariotos superiores, tendo em vista que os cientistas não conseguem utilizar
uma sequência de DNA isolada de uma origem humana, por exemplo, para
realizar uma pesquisa computadorizada de toda a sequência do genoma humano
para encontrar outras origens.
Se os ORC de eucariotos superiores são interagem com uma sequência
específica dispersa pelos cromossomos, então como eles encontram as origens de
replicação? Acredita-se que esses ORC interajam indiretamente com as origens
por meio da associação com outros complexos proteicos que estão ligados aos
cromossomos. Um referido mecanismo de reconhecimento pode ter evoluído de
modo que os eucariotos superiores possam regular o momento da replicação do
DNA durante a fase S (ver Capítulo 12 para mais a respeito da eucromatina e da
heterocromatina). Há algum tempo sabe-se que as regiões cromossômicas ricas
7.7
em genes (a eucromatina) são replicadas inicialmente na fase S, enquanto as
regiões pobres em genes, incluindo a heterocromatina condensada, são replicadas
tardiamente na fase S. A replicação do DNA não poderia ser programada por
região se os ORC estivessem ligados às sequências relacionadas dispersas pelos
cromossomos. Em vez disso, os ORC, por exemplo, apresentam uma afinidade
maior por origens na cromatina aberta e se ligar a essas origens primeiro e
posteriormente se ligar à cromatina condensada apenas após as regiões ricas em
genes terem sido replicadas.
CONCEITO-CHAVE A origem da replicação de levedura, assim como a
origem em procariotos, contém uma sequência de DNA conservada que é
reconhecida pelo ORC e outras proteínas necessárias para montar o
replissomo. Em contrapartida, as origens de eucariotos superiores têm sido
difíceis de isolar e estudar, tendo em vista que são longas e complexas e não
contêm uma sequência de DNA conservada.
Telômeros e telomerase | Término da replicação
A replicação da molécula de DNA linear em um cromossomo eucariótico
prossegue em ambos os sentidos a partir de diversas origens de replicação,
conforme demonstrado na Figura 7.23. Esse processo replica a maior parte do
DNA cromossômico, mas existe um problema inerente na replicação das duas
extremidades das moléculas de DNA lineares, as regiões denominadas
telômeros. A síntese contínua no filamento leading pode prosseguir até a ponta
do molde. Entretanto, a síntese do filamento descontínuo necessita de primers à
frente do processo; assim, quando o último primer é removido, faltam sequências
no final daquele filamento. Consequentemente, uma ponta unifilamentar
permanece em uma das moléculas-filhas de DNA (Figura 7.26). Se o
cromossomo-filho com essa molécula de DNA fosse replicado novamente, o
filamento com sequências ausentes na extremidade se tornaria uma molécula
bifilamentar encurtada após a replicação. A cada ciclo de replicação subsequente,
o telômero continuaria a encurtar, até que finalmente seriam perdidas informações
codificantes essenciais.
FIGURA 7.26 (Parte superior) A replicação de cada fragmento de Okazaki no filamento descontínuo tem
início com a inserção de um primer. (Parte inferior) O destino do filamento inferior na bolha de transcrição.
Quandoo primer do último fragmento de Okazaki do filamento descontínuo é removido, não há como
preencher a lacuna por meio da replicação convencional. Resultaria um cromossomo encurtado quando o
cromossomo que contém a lacuna fosse replicado.
As células desenvolveram um sistema especializado para evitar essa perda. A
solução envolve a adição de múltiplas cópias de uma sequência não codificadora
simples ao DNA nas pontas do cromossomo. Portanto, cada vez que um
cromossomo é duplicado, ele fica mais curto e apenas essas sequências repetidas,
que não contêm informações, são perdidas. As repetições perdidas são, em
seguida, adicionadas novamente às extremidades do cromossomo.
A descoberta de que as extremidades dos cromossomos são compostas por
sequências repetidas em tandem foi feita em 1978 por Elizabeth Blackburn e Joe
Gall, que estavam estudando o DNA no macronúcleo incomum do ciliado
unicelular Tetrahymena. Assim como outros ciliados, o Tetrahymena apresenta
um micronúcleo convencional e um macronúcleo incomum, no qual os
cromossomos são fragmentados em milhares de pedaços do tamanho de um gene
com novas extremidades adicionadas a cada pedaço. Com tantas extremidades
cromossômicas, Tetrahymena apresenta aproximadamente 40.000 telômeros e,
como tal, era a escolha perfeita para determinar a composição do telômero.
Blackburn e Gall foram capazes de isolar os fragmentos que continham os genes
para RNA ribossômico (fragmentos denominados rDNA; ver Capítulo 9 para mais
sobre os ribossomos) por meio da utilização da centrifugação em gradiente de
CsCl, a técnica desenvolvida por Meselson e Stahl para isolar DNA de E. coli
recém-replicado (ver anteriormente). As extremidades dos fragmentos de rDNA
continham arranjos em tandem da sequência TTGGGG. Atualmente sabemos que
virtualmente todos os eucariotos apresentam repetições curtas em tandem nas
extremidades de seus cromossomos; entretanto, a sequência não é exatamente a
mesma. Os cromossomos humanos, por exemplo, terminam em aproximadamente
10 a 15 kb de repetições em tandem da sequência TTAGGG.
A questão sobre como essas repetições de fato são adicionadas às
extremidades dos cromossomos após cada rodada de replicação foi abordada por
Elizabeth Blackburn e Carol Grieder. Elas formularam a hipótese de que uma
enzima catalisava o processo. Novamente trabalhando com extratos do
macronúcleo de Tetrahymena, elas identificaram uma enzima, que denominaram
telomerase, que adiciona repetições curtas às extremidades 3′ das moléculas de
DNA. Curiosamente, a proteína telomerase carrega uma pequena molécula de
RNA, parte da qual atua como um molde para a síntese da unidade de repetição
telomérica. Em todos os vertebrados, incluindo seres humanos, a sequência de
RNA 3′-AAUCCC-5′ atua como o molde para a unidade de repetição 5′-
TTAGGG-3′ por meio de um mecanismo demonstrado na Figura 7.27.
Brevemente, a RNA telomerase primeiro se liga ao prolongamento 3′ do DNA,
que em seguida é estendido com a utilização dos dois componentes da telomerase:
o pequeno RNA (como molde) e a proteína (como atividade de polimerase). Após
a adição de alguns nucleotídios ao prolongamento 3′, a RNA telomerase se
movimenta ao longo do DNA, de modo que a extremidade 3′ possa ser
adicionalmente estendida por meio da sua atividade de polimerase. A
extremidade 3′ continua a ser estendida pela movimentação repetida da RNA
telomerase. A primase e a DNA polimerase em seguida utilizam o prolongamento
3′ muito longo como molde para preencher a extremidade do outro filamento de
DNA. Trabalhando com Elizabeth Blackburn, um terceiro pesquisador, Jack
Szostak, prosseguiu até demonstrar que também existem telômeros na levedura.
Pela contribuição para a descoberta de como os telômeros protegem os
cromossomos do encurtamento, Blackburn, Grieder e Szostak receberam o Prêmio
Nobel em Medicina ou Fisiologia de 2009.
FIGURA 7.27 A telomerase carreia uma molécula de RNA curta (letras vermelhas), que atua como um
molde para a adição de uma sequência de DNA complementar, que é adicionada ao prolongamento 3′ (letras
azuis). Para adicionar outra repetição, a telomerase transloca-se para a extremidade da repetição que acabou
de adicionar. O prolongamento 3′ estendido em seguida pode atuar como um molde para a replicação do DNA
convencional.
Uma característica notável dessa reação é que o RNA serve como o molde para
a síntese de DNA. Conforme você verificou no Capítulo 1 (e revisará no Capítulo
8), o DNA normalmente atua como molde para a síntese de RNA no processo
denominado transcrição. É por esse motivo que se diz que a polimerase da
telomerase apresenta atividade de transcriptase reversa. Revisaremos a
transcriptase reversa nos Capítulos 10 e 15.
Além de prevenir a erosão do material genético após cada rodada de
replicação, os telômeros preservam a integridade cromossômica por meio da
associação com proteínas para formar capuzes protetores. Esses capuzes isolam o
prolongamento unifilamentar 3′, que pode ter até 100 nucleotídios de comprimento
(Figura 7.28). Sem esse capuz, as extremidades bifilamentares dos cromossomos
seriam confundidas pela célula com quebras bifilamentares e seriam tratadas de
acordo. Conforme você verá posteriormente, no Capítulo 16, quebras
bifilamentares são possivelmente muito perigosas, tendo em vista que podem
resultar em instabilidade cromossômica que pode levar ao câncer e a uma
diversidade de fenótipos associados ao envelhecimento. Por esse motivo, quando
uma quebra bifilamentar é detectada, a célula responde de vários modos,
dependendo, em parte, do tipo celular e da extensão da lesão. Por exemplo, a
quebra bifilamentar pode fundir-se com outra quebra ou a célula pode limitar o
dano para o organismo interrompendo a divisão celular (denominada
senescência) ou iniciando uma via de morte celular (denominada apoptose).
CONCEITO-CHAVE Os telômeros são estruturas especializadas nas
extremidades dos cromossomos que contêm repetições em tandem de uma
sequência curta de DNA, que é adicionada à extremidade 3’ pela enzima
telomerase. Os telômeros estabilizam os cromossomos ao prevenir a perda de
informação genômica após cada rodada de replicação do DNA e por meio da
associação com proteínas para formar um capuz que “esconde” as
extremidades dos cromossomos do maquinário de reparo do DNA da célula.
Surpreendentemente, embora a maior parte das células germinativas apresente
telomerase em abundância, as células somáticas produzem muito pouca ou
nenhuma telomerase. Por esse motivo, os cromossomos de células somáticas
proliferativas se tornam progressivamente mais curtos a cada divisão celular, até
que a célula interrompe todas as divisões e entra em uma fase de senescência.
Essa observação levou muitos investigadores a suspeitarem que havia uma
ligação entre o encurtamento dos telômeros e o envelhecimento. Geneticistas que
estudam doenças humanas que levam ao fenótipo de envelhecimento precoce
recentemente revelaram evidências que amparam essa conexão. Pessoas com
síndrome de Werner apresentam manifestação precoce de muitos eventos
relacionados com a idade, incluindo enrugamento da pele, catarata, osteoporose,
branqueamento dos cabelos e doença cardiovascular (Figura 7.29). Estudos
genéticos e bioquímicos observaram que pessoas afetadas apresentam telômeros
mais curtos do que aqueles de pessoas normais em virtude de uma mutação em um
gene denominado WRN, que codifica uma proteína (uma helicase) que está
associada a proteínas que formam a estrutura de revestimento do telômero (TRF2,
ver Figura 7.28). Formula-se a hipótese de que essa mutação rompe o telômero
normal, resultando em instabilidade cromossômica e no fenótipo de
envelhecimento precoce. Pacientes com outra síndrome de envelhecimento
precoce denominada disqueratose congênita também apresentam telômeros mais
curtos do que aqueles de pessoas saudáveis da mesma idade e também
apresentam mutações em genes necessários para a atividade da telomerase.
FIGURA 7.28 Um “capuz” protege o telômero na extremidade de um cromossomo. O prolongamento3′ é
“escondido” quando desloca um filamento de DNA em uma região na qual as repetições teloméricas são
bifilamentares. As proteínas TRF1 e TRF2 se ligam às repetições teloméricas e outras proteínas, incluindo
WRN, ligam-se a TRF1 e TRF2, formando, assim, o capuz protetor do telômero.
Os geneticistas também estão muito interessados em conexões entre telômeros e
câncer. Contrariamente às células somáticas normais, a maior parte das células
cancerosas apresenta atividade de telomerase. A capacidade de manter telômeros
funcionais pode ser um motivo pelo qual as células cancerosas, mas não as
células normais, conseguem crescer em culturas celulares durante décadas e são
consideradas imortais. Como tal, muitas empresas farmacêuticas estão buscando
capitalizar essa diferença entre as células cancerosas e normais com o
desenvolvimento de fármacos que têm por alvo seletivo as células cancerosas por
meio da inibição da atividade da telomerase.
FIGURA 7.29 Uma mulher com síndrome de Werner aos 15 e aos 48 anos de idade. (International Registry
of Werner Syndrome, www.wernersyndrome.org.)
RESUMO
Trabalhos experimentais sobre a natureza molecular do material hereditário
demonstraram conclusivamente que o DNA (e não proteínas, lipídios ou
carboidratos) é de fato o material genético. Com a utilização de dados obtidos
por outros pesquisadores, Watson e Crick deduziram um modelo de dupla-hélice
com dois filamentos de DNA, enrolados um ao redor do outro, de modo
antiparalelo. A ligação dos dois filamentos tem por base o pareamento da adenina
(A) com a timina (T) e da guanina (G) com a citosina (C). O primeiro par é unido
por duas ligações de hidrogênio; o segundo, por três.
O modelo de Watson-Crick demonstra como o DNA pode ser replicado de
modo ordenado — requisito indispensável para o material genético. A replicação
é realizada de modo semiconservativo tanto em procariotos quanto em eucariotos.
Uma dupla-hélice é replicada para formar duas hélices idênticas, cada uma com
seus nucleotídios na ordem linear idêntica; cada uma das duas novas duplas-
hélices é composta por um filamento antigo e um filamento recém-polimerizado
de DNA.
A dupla-hélice de DNA é desenrolada em uma forquilha de replicação e os
dois filamentos únicos assim produzidos atuam como moldes para a
polimerização de nucleotídios livres. Os nucleotídios são polimerizados pela
enzima DNA polimerase, que adiciona novos nucleotídios apenas à extremidade
3′ de uma cadeia de DNA em crescimento. Tendo em vista que a adição é apenas
nas extremidades 3′, a polimerização em um molde é contínua, produzindo o
filamento contínuo (leading) e, no outro, é descontínua em trechos curtos
(fragmentos de Okazaki), produzindo o filamento descontínuo (lagging). A síntese
do filamento contínuo e de cada fragmento de Okazaki é iniciada por um primer
de RNA curto (sintetizado pela primase) que fornece uma extremidade 3′ para a
adição de desoxirribonucleotídios.
Os eventos múltiplos que têm de ocorrer com precisão e rapidez na forquilha
de replicação são realizados por uma máquina biológica denominada replissomo.
Esse complexo proteico inclui duas unidades de DNA polimerase, uma para atuar
no filamento contínuo e uma para atuar no filamento descontínuo. Desse modo, a
síntese é mais demorada e a união dos fragmentos de Okazaki em um filamento
contínuo pode ser temporalmente coordenada com a síntese menos complicada do
filamento contínuo. Onde e quando a replicação ocorre é cuidadosamente
controlado pela montagem ordenada do replissomo em determinados locais nos
cromossomos, denominados origens. Os genomas eucarióticos podem apresentar
dezenas de milhares de origens. A montagem dos replissomos nessas origens
ocorre apenas em uma fase específica no ciclo celular.
As extremidades dos cromossomos lineares (telômeros) apresentam um
problema para o sistema de replicação, tendo em vista que sempre há um trecho
curto em um filamento que não pode ser iniciado. A enzima telomerase adiciona
várias sequências curtas e repetitivas para manter o comprimento. A telomerase
carrega um RNA curto que atua como o molde para a síntese das repetições
teloméricas. Essas repetições teloméricas não codificadoras associam-se a
proteínas para formar um revestimento telomérico. Os telômeros encurtam com a
idade nas células somáticas, tendo em vista que a telomerase não é produzida
naquelas células. Indivíduos que apresentam telômeros defeituosos sofrem
envelhecimento precoce.
TERMOS-CHAVE
antiparalela
base
base complementar
ceto
código genético
desoxirribose
DNA ligase
dupla-hélice
enol
enzima distributiva
enzima processiva
filamento contínuo (líder, leading)
filamento descontínuo (lento, lagging)
forquilha de replicação
fosfato
fragmento de Okazaki
helicase
holoenzima polimerase III (pol III)
imino
modelo ou molde
molécula-filha
nucleotídio
origem
pirimidina
primase
primer
primossomo