Relatório 1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
DISCIPLINA CBS01020 – BIOQUÍMICA
	
		
	AULA PRÁTICA Nº 1
EXTRAÇÃO E DOSAGEM DE GLICOGÊNIO
MARIA MANOELA REZENDE SEVERO
(00314741)
PORTO ALEGRE, 10 DE SETEMBRO DE 2020
1- INTRODUÇÃO
 O glicogênio é um homopolissacarídeo de reserva animal, armazenado em grânulos do citoplasma das células. É constituído por resíduos de glicose, do tipo α-D-glicose, formando um polímero ramificado. Esses resíduos estão unidos por ligações glicosídicas do tipo α1→4, entre os resíduos de glicose da cadeia principal, e α1→6, entre um resíduo de glicose da cadeia principal e um resíduo de glicose da ramificação. 
 No fígado, o glicogênio representa 10% do seu peso total, sendo ele o órgão com maior abundância desse composto. Isso ocorre, pois, no jejum, é o glicogênio hepático que fornece glicose para a circulação sanguínea e, consequentemente, para os outros tecidos do corpo, através da glicogenólise, a qual é regulada pelo hormônio glucagon. O glicogênio também pode ser encontrado nos músculos, mas, desta vez, representa de 1 a 2% do seu peso total, e é estocado para uso único e exclusivo das células musculares - visto que não possui a enzima glicose-6-fosfatase responsável pela liberação de glicose na circulação pelo fígado - também através da glicogenólise, porém é regulada pela epinefrina. 
 No laboratório, a extração do glicogênio de fígado e de músculo de ratos é feita a partir da técnica de fracionamento celular, que utiliza a centrifugação como princípio. Do processo de extração é retirada uma alíquota para a dosagem do glicogênio em cada tecido, obtida através do método de Krisman. Esse método, que é um princípio de determinação colorimétrica, baseia-se na coloração âmbar-violácea produzida quando as hidroxilas dos resíduos de glicose, que compõem a estrutura do glicogênio, entram em contato com moléculas de iodo, sendo a coloração produzida proporcional à concentração de hidroxilas presentes.
2- OBJETIVO
 O objetivo desta primeira aula prática é extrair dosar os níveis de glicogênio de amostras de fígado e de músculo de ratos alimentados ou submetidos a um jejum de 24 horas, através do método de Krisman.
3- PROTOCOLO
3.1- Extração do glicogênio
- Pipetar 5 mL de KOH em um tubo de ensaio.
- Adicionar 500 mg de tecido (fígado ou músculo).
- Aquecer em banho-maria fervente por 20 min e deixar esfriar. 
- Retirar 1 mL e passar para um tubo de centrífuga.
- Retirar também 1 mL de outros tecidos solubilizados em KOH pelos colegas, de forma que cada dupla terá uma amostra de 1 mL de cada tipo de tecido estudado.
- Nesse ponto, cada grupo deve ter quatro tubos conforme a tabela abaixo:
	Tubos
	Tecido
	5
	Fígado alimentado
	6
	Fígado jejum
	7
	Músculo alimentado
	8
	Músculo jejum
	
- Adicionar 1,5 mL de etanol 95%(v/v), misturar com bastão de vidro e aquecer a 70°C por 10 min.
- Esfriar imediatamente em gelo por 15 min (pois o glicogênio, quando tratado com etanol a quente, se aglomera em flocos quando é resfriado).
- Centrifugar por 10 min a 3.000 rpm.
- Após a centrifugação, descartar o sobrenadante virando o líquido de uma vez só e ressuspender o sedimento segundo o esquema abaixo: 
	Tubo
	Tecido
	H2O
	HCl 5N
	5
	Fígado alimentado
	3,8 mL
	0,2 mL
	6
	Fígado jejum
	0,8 mL
	0,2 mL
	7
	Músculo alimentado
	0,8 mL
	0,2 mL
	8
	Músculo jejum
	0,8 mL
	0,2 mL
- Agite os tubos e utilize estas amostras para a dosagem a seguir.
3.2- Determinação colorimétrica do glicogênio/ Dosagem do glicogênio
- Preparar uma placa, seguindo o esquema abaixo:
- Curva Padrão:
	Local na placa
	Identificação
	Solução padrão de glicogênio 5mg/100mL (P)
	H2O destilada
	A1 e A2
	B
	-
	40 µL
	B1 e B2
	1
	10 µL
	30 µL
	C1 e C2
	2
	20 µL
	20 µL
	D1 e D2
	3
	30 µL
	10 µL
	E1 e E2
	4
	40 µL
	-
 
- Amostras:
	Local na placa
	Identificação
	Amostra da extração
	H2O destilada
	A3 e A4
	5 (Fígado alimentado)
	10 µL
	30 µL
	B3 e B4
	6 (Fígado jejum)
	15 µL
	25 µL
	C3 e C4
	7 (Músculo alimentado)
	15 µL
	25 µL
	D3 e D4
	8 (Músculo jejum)
	20 µL
	20 µL
- Adicionar 200 µL de reagente de iodo em todos os poços, tanto da curva padrão, quanto da amostra.
- Agitar bem e ler em 460 nm.
4- DISCUSSÃO 
 Após a leitura da placa no espectrofotômetro, os resultados obtidos foram os seguintes: 
 Tabela 1: Resultado das absorbâncias Tabela 2: Resultado das absorbâncias 
 obtidas da Curva Padrão. obtidas das Amostras.
	Tubo
	Abs
	B
	0
	1
	0,15
	2
	0,27
	3
	0,35
	4
	0,51
	 Tubo
	Abs
	5 (FA)
	0,23
	6 (FJ)
	0,28
	7 (MA)
	0,18
	8 (MJ)
	0,22
1) Quantidade de glicogênio em cada tubo da curva padrão:
 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
50mg - 100ml 50mg - 100ml 50mg – 100ml 50mg – 100ml
 x - 0,01ml x - 0,02ml x - 0,03ml x - 0,04ml
 x = 0,005mg x = 0,01mg x = 0,015mg x = 0,020mg
2) Fatores de calibração parciais e o fator de calibração médio:
Os cálculos foram realizados utilizando a fórmula representada no campo abaixo:
	Fator de Calibração = Quantidade ÷ Absorbância
FCP 1 0,005/0,15 = 0,03333
FCP 2 0,01/0,27 = 0,03703
FCP 3 0,015/0,35 = 0,04285
FCP 4 0,020/0,51 = 0,03921
FCM = (0,03333+0,03703+0,04285+0,03921)/4
FCM = 0,038105
 
3) Quantidade de glicogênio nas amostras avaliadas:
Os cálculos foram realizados utilizando a fórmula representada no campo abaixo:
	Quantidade = FCM x Absorbância
Tubo 5 0,038105 x 0,22 = 0,008383mg
Tubo 6 0,038105 x 0,18 = 0,006858mg
Tubo 7 0,038105 x 0,28 = 0,010669mg
Tubo 8 0,038105 x 0,23 = 0,008764mg
4) Concentração de glicogênio das amostras avaliadas em MG de glicogênio por 100 mL de solução (mg%):
 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8
0,008383 - 20 µL 0,006858 - 15 µL 0,010669 - 15 µL 0,008764 - 10 µL 
 x - 100000 µL x - 100000 µL x - 100000 µL x - 100000 µL
 x = 41,915 mg% x = 45,72 mg% x = 71,12 mg% x = 87,64mg%
5) Curva Padrão de glicogênio:
6) Questionário técnico sobre a obtenção e dosagem de glicogênio:
1- Por que foram usadas amostras de fígado e de músculos para obtenção de glicogênio? 
Pois são nos hepatócitos (células do fígado) e nos miócitos (células dos músculos) em que o glicogênio pode ser encontrado em maior quantidade, quando comparada com o restante do corpo. O glicogênio representa, no fígado, 10% do seu peso total e, no músculo, equivale de 1 a 2% do seu peso total. 
2- Qual a função da solução de KOH 30% a quente?
Ele é usado com o objetivo de extrair o glicogênio. Isso acontece, pois o KOH 30% a quente dissolve o tecido, hidrolisando proteínas e alguns tipos de lipídios, e, com isso, libera o glicogênio para a solução.
3- Qual a função do etanol 95% a quente? Por que se resfria o extrato em gelo? Por que na sequência se centrifuga as amostras?
A adição do etanol 95% a quente e, na sequência, o resfriamento do extrato em gelo, têm como objetivo precipitar o glicogênio da solução alcalina de KOH 30%, tratada anteriormente. As amostras são centrifugadas, posteriormente à precipitação do glicogênio, pois é dessa forma que ele irá sedimentar no fundo do tubo, possibilitando a sua coleta através da decantação do sobrenadante.
4- Por que os sedimentos de glicogênio são tratados com água e HCl 5N? Por que os volumes são diferentes?
A água e o HCl 5N são utilizados como forma solubilizar o glicogênio. Os volumes são diferentes com o objetivo de garantir que os volumes finais sejam iguais.
5- Qual o princípio do método de Krisman (iodo+iodeto de potássio+cloreto de cálcio)?
O método de Krisman baseia-se na interação das hidroxilas dos resíduos de glicoses, que compõem a estruturade glicogênio, com as moléculas de iodo. Tal interação produz uma coloração “âmbar-violácea”, que será proporcional à quantidade de resíduos de glicose presentes. O cloreto de cálcio (CaCl2) é o sal utilizado na reação com o objetivo de catalisá-la, facilitando a interação das hidroxilas com as moléculas de iodo.
6- Por que são usados volumes diferentes nas amostras? 
Para garantir que os volumes finais sejam iguais.
7) Questionário interpretativo:
1- Como ocorre o processo de glicogenólise? 
O glicogênio sofre fosforilação pela enzima glicogênio fosforilase, a qual cliva as ligações α1→4 e adiciona um fosfato, iniciando pelas extremidades não redutoras, e tem como produto a glicose-1-fosfato.
A atividade da fosforilase cessa quando restam quatro resíduos de glicose para o ponto de ramificação, dando lugar à enzima transferase. A transferase cliva as ligações α1→4 e transfere três, dos quatro, resíduos para a extremidade não redutora. Com isso, a enzima glicosidase irá clivar o resíduo restante, de ligação α1→6, gerando glicose livre de fosfato, a qual é sintetizada, aqui, em valores muito menores do que a glicose-1-fosfato.
2- Qual é a enzima reguladora da glicogenólise? Quais são seus mecanismos de ativação? Qual a sua especificidade enzimática?
A enzima reguladora da glicogenólise é a glicogênio fosforilase. Ela é ativada por altos níveis de glucagon, que ocorre no jejum, quando há baixo nível glicêmico, e inativada no estado alimentado, quando há altos níveis de insulina no sangue. A especificidade enzimática da é o substrato na qual a enzima se liga para realizar a sua função, no caso da glicogênio fosforilase, a sua especificidade é a molécula de glicogênio, mais especificamente a ligação α1→4 dessa molécula.
3- Qual é o hormônio responsável pela mobilização do glicogênio hepático no jejum? Qual é a glândula que o libera? Qual o tipo celular desta glândula que o produz?
O glucagon. Ele é sintetizado e secretado pelas células alfa das ilhotas de Langerhans, que estão localizadas na porção endócrina do pâncreas. 
4- Qual é a enzima presente no fígado e ausente no músculo que permite ao fígado contribuir com a manutenção da glicemia no jejum de 24 horas?
A enzima glicose-6-fosfatase, responsável por converter a glicose -6-fosfato em glicose.
5- Explique por que o percentual de redução do glicogênio hepático obtido de rato em jejum foi de 90% e o percentual de redução do glicogênio obtido do músculo de rato em jejum foi de 15%.
Isso se deve ao fato de que os miócitos não possuem a enzima glicose-6-fosfatase, presente no fígado e fundamental para a transformação do glicogênio de volta em glicose.No caso do músculo, por não possuir tal enzima, a glicose-6-fosfato, último produto da glicogenólise, não pode ser desfosforilada e, então, entra na via glicolítica.
5- CONCLUSÃO
 A partir da aula prática de número 1 foi possível aplicar as técnicas de extração e dosagem dos níveis de glicogênio em amostras de fígado e de músculo de ratos alimentados ou submetidos a um jejum de 24 horas.
 Além disso, foi possível perceber a grande importância desse polissacarídeo para a vida, pois representa a principal reserva de energia nas células animais e bactérias.
6- REFERÊNCIAS
https://scielo.org/
http://www.ufrgs.br/gcoeb/obtencaodosagemglicogenio/
(2018) Liberman & Peet - Marks Basic Medical Biochemistry 5th Ed 
Quantidade de Glicogênio x Absorbância
ABS	5.0000000000000027E-3	1.0000000000000005E-2	1.4999999999999998E-2	2.0000000000000011E-2	0.15000000000000008	0.27	0.35000000000000014	0.51	Quantidade de glicogênio (µg)
ABSORBÂNCIA