PROTOCOLO DE WESTERN BLOT

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PROTOCOLO DE WESTERN BLOT
Preparação do Gel:
1. Colocar as placas de vidro e os pentes sobre um papel e limpar os dois lados com álcool 70%
2. Montar os vidros e encher com água miliQ para verificar se há vazamentos
3. Preparar o gel de separação (resolving) de acordo com o peso da proteína desejada: 
Obs.: TEMED e APS são os agentes polimerizadores, devem ser adicionados por último quando tudo estiver pronto e a solução deve ser vertida nas placas de vidro assim que finalizada pois sua ação é rápida!!
4. Pipetar todos os ingredientes em um tubo falcon e homogeneizar por up-down (não demorar)
5. Despejar cuidadosamente até o marcador verde do encaixe (caso ocorra vazamentos adicione um pouco mais)
6. Cobrir o gel com metanol, logo em seguida, para retirar as bolhas (somente em casos extremos)
7. Aguardar aprox. 30 minutos para o gel polimerizar e preparar o stacking gel
8. Pipetar todos os ingredientes em um tubo falcon e homogeneizar por up-down (não demorar)
9. Despejar o gel até a borda do vidro cuidadosamente para não formar bolhas (não esquecer de retirar o metanol antes e dar um tempo para que o mesmo evapore caso tenha feito uso do mesmo)
10. Encaixar os pentes delicadamente e limpar com lenço o gel que escorrer
11. Aguardar aprox. 20 minutos para o gel polimerizar
Obs.: Os géis podem ser armazenados na geladeira por até 3 dias se mantido com o conjunto de placas e pente enrolado muito bem em papel filme.
Preparação das amostras:
1. Pipetar em eppendorfs (VF = 12 µl) o volume de amostra para a concentração desejada, H20 e 2 µl de Laemmli 1:6 (Sample Buffer). 
Ex.: 5,46 µl de amostra (60 µg) + 4,45 µl H2O + 2 µl Laemmli = 12 µl de amostra pronta para corrida.
2. Homogeneizar suavemente por up-down e colocar os eppendorfs por 5 minutos em banho fervente entre 50 a 90º (verificar no datasheet dos anticorpos o preparo das amostras). 
3. Dar spin nas amostras e em seguida armazena-las no freezer -20ºC até o momento da corrida.
Corrida do gel:
1. Montar os géis na cuba com o vidro menor para o lado interno
2. Preparar o tampão de corrida no dia do experimento e mantê-lo na geladeira
3. Colocar a quantidade de tampão equivalente ao número de géis e retirar os pentes
4. Dar spin nas amostrar e coloca-las no gel começando pelo marcador de peso molecular (8 µl). Obs.: Não esqueça de anotar a sequência das amostras.
IMPORTANTE: Não deixe pocinhos vazios.
5. Feche a cuba corretamente (verifique se os conectores estão ligados vermelho/vermelho e preto/preto. Ajuste a corrida inicial para 30V e deixe o gel correr até que as amostras comecem a descer
6. Quando começar a visualizar as amostras descendo no gel aumentar a corrida para 120V e aguardar descer até o marcador de interesse
Transferência Semi-Dry:
1. Preparar o sistema de transferência da seguinte maneira:
1 Esponja > 2 Membrana > 3 Gel > 4 Esponja > passar o rolinho
Obs.: as esponjas e a membrana devem ser previamente mergulhadas em tampão de transferência.
2. Transferir a 15V por 45 minutos (para duas membranas) e acrescentar 15 minutos para cada membrana adicional
Obs.: A transferência Semi-Dry é mais efetiva em proteínas de tamanho médio, entre 20 e 80 kDa, em caso de proteínas acima ou abaixo desta faixa média, é mais indicado a utilização de transferência molhada (Tank Blotting).
Transferência Tank Blotting:
1. Preparar o sistema de transferência da seguinte maneira: montar o sanduíche na parte preta do sistema (a transferência se dá da parte preta para a vermelha) colocando
esponja > 2 a 3 folhas de papel filtro > gel > membrana > 2 a 3 folhas de papel filtro > esponja
Obs.: As membranas, filtros e esponjas devem ser previamente molhados no tampão de transferência, e o sistema deve ser montado dentro de um recipiente com tampão.
2. Transferir a 120V por aprox. 40 minutos em tampão de transferência resfriando o sistema com gelo picado.
3. Após 40 minutos, desligar o sistema, trocar a pedra de gelo da cuba e transferir por mais aprox. 10 minutos.
4. Após esse período verificar se a amperagem se mantém constante durante 3 minutos e então desligar o sistema.
 - Proteínas acima de 80 kDa: transferência overnight (15h40m) a 30V ou 3h 70V com metanol 5% na geladeira
- Proteínas abaixo de 20 kDa: transferência overnight (15h40m) a 30V ou 1h30m a 70V com tampão sem glicina na geladeira. Utilizar de preferencia uma membrana com poros de 0.2 µm.
Bloqueio - BSA:
1. Retirar com cuidado os géis e membranas do aparato, cortar os excessos de membrana e lavar 1x com basal rapidamente
2. Banhar as membranas em conrante Ponceau para averiguar se as proteínas foram transferidas e lavar cuidadosamente com H2O corrente até retirar o excesso de coloração
3. Incubar as membranas com albumina 5% em basal gelada (4ml por membrana) por 2h em temperatura ambiente no agitador
4. Após o bloqueio, lavar as membranas em basal por 10 minutos, 3x no agitador e em temperatura ambiente
Incubação com anticorpo primário:
1. Diluir o anticorpo primário em 3% albumina e azida 1:1000 de acordo com as orientações do datasheet ou padronização prévia do laboratório
2. Anticorpos já diluídos em uso ficam na geladeira (duração de 1 semana)
3. Incubar as membranas sob velocidade ata de agitação na geladeira (4ºC) overnight
Incubação com anticorpo secundário e revelação:
1. Retirar o anticorpo primário e guardar na geladeira
2. Lavar as em basal por 10 minutos, 3x no agitador em temperatura ambiente 
3. Preparar o anticorpo secundário de acordo com o primário
4. Incubar as membranas por 2h no agitador em temperatura ambiente
5. Retirar o anticorpo secundário e guardar na geladeira
6. Lavar as em basal por 10 minutos, 3x no agitador em temperatura ambiente 
7. Adicionar o ECL (1mL da solução A e 1mL da solução B) por 5 minutos em câmara escura (ECL é sensível a luz) sob agitação em temperatura ambiente
Stripping:
1. 
Incubação com padrão (GAPDH):
1. Repetir o bloqueio com BSA 5%
2. Lavar rapidamente a membrana com basal
3. Preparar o GAPDH (1:1000) e incubar por 2h sob agitação em temperatura ambiente
4. Lavar as em basal por 10 minutos, 3x no agitador em temperatura ambiente 
5. Incubar com anticorpo secundário anti-mouse 1:10000 por 45 minutos
6. Lavar as em basal por 10 minutos, 3x no agitador em temperatura ambiente 
7. Revelar
1 gel2 géis4 géis1 gel2 géis4 géis1 gel2 géis4 géis1 gel2 géis4 géis1 gel2 géis4 géis
H
2
O (mL)1,663,326,641,342,6135,360,941,883,760,651,32,6000
Glicerol (mL)0,91,83,60,91,83,60,91,83,60,91,83,60,91,83,6
Tampão (mL)4,59181,733,466,922,134,268,522,555,110,23,236,4612,92
Acrilamida (mL)1,42,85,61,733,466,922,134,268,522,555,110,23,236,4612,92
APS 10% (µL)150300600150300600150300600150300600150300600
TEMED (µL)102040102040102040102040102040
Total (mL)8,6217,2434,488,6317,2634,528,6317,2634,528,7617,5235,048,7917,5835,16
6,50%8%10%12%15%
RESOLVING
H
2
O (mL)
1,723,446,88
Tampão (mL)2,244,488,96
Acrilamida (mL)0,40,81,6
APS 10% (µL)120240480
TEMED (µL)51015
STACKING1 a 2 géis 3 a 4 géis 5 a 6 géis