Imunodiagnósticos: Métodos Não Invasivos

Prévia do material em texto

GABRIELA RIBAS – MÓDULO IV: SEMANA 11
IMUNODIAGNÓSTICOS
São métodos pouco invasivos de fácil análise através da ligação anticorpo e antígeno. Se utilizar no teste um antígeno o objetivo final é verificar a presença de anticorpo e vice-versa. Comparado ao diagnostico molecular é extremamente mais barato e acessível. Algumas metodologias empregadas no diagnóstico são: aglutinação, Microaglutinação, teste de coombs, floculação, entre outras.
AGLUTINAÇÃO 
Um dos componentes (antígeno ou anticorpo) é apresentado na forma insolúvel em suspensão, de forma natural em células, ou adsorvido artificialmente a micropartículas ou células. Um anticorpo é capaz de se ligar a 2 partículas formando um complexo insolúvel, aglutinado. Nessa aglutinação de Ac-Ag é possível verificar a aglutinação das partículas a olho nu. Vantagens: alta sensibilidade, baixo custo, facilidade de execução e leitura visual. Por exemplo, num teste para grupo sanguíneo, utiliza-se um reagente que tem anticorpos contra aglutinogênio A ou B. O antígeno está na superfície das hemácias, quando se coloca diretamente um anticorpo nessa região vai haver a reação de aglutinação. Pode ocorrer também dele ser adsorvido: o látex é uma partícula insolúvel que não possui antigenicidade e grudam nesse látex antígenos ou anticorpos, quando coloca a amostra do paciente no látex se houve a ligação Ag-Ac o látex vai aglutinar. 
A aglutinação pode ser direta quando o antígeno faz parte naturalmente da célula e assim haverá aglutinação dessas células, promovidas por anticorpos. Ocorre por exemplo no teste de tipagem sanguínea. 
Pode haver uma inibição da aglutinação direta, nesse caso o teste vai ser positivo quando a aglutinação for inibida. Existem vários vírus que possuem antígenos chamados hemoaglutinantes. Se coloca o antígeno desse vírus junto com amostra de sangue do paciente pode haver ou não reação. Se for positiva é sinal que tem anticorpos contra aquele vírus (o anticorpo vai neutralizar o antígeno viral e ele perde a capacidade de alglutinar as hemácias). Se a amostra for negativa os antígenos virais ficarão livres, e assim quando adiciona as hemácias elas se aglutinam nesses antígenos. 
A aglutinação também pode ser indireta ou passiva. Nesse caso ocorre adsorção de anticorpos/ antígenos na superfície de micropartículas inertes (como o látex). Por exemplo, paciente está com infecção e investiga a presença da proteína C reativa. Coloca antígenos ao redor do látex, se a pessoa tiver o anticorpo o látex vai aglutinar. É indireta porque não é contra o látex, é pela substancia ligada ao látex e aí ele aglutina. 
MICROAGLUTINAÇÃO
Tem o mesmo princípio da aglutinação. É um ensaio realizado em pequenos volumes utilizando micro cavidades de placas plásticas, através de hemácias de aves e mamíferos de preferência e pesquisando a presença de anticorpos. Por exemplo, quando ocorre ligação Ag-Ac, as hemácias se aglutinam e formam um tapete na microplaca e fica impossível observar o fundo dele (reação positiva). Quando não aglutinam, as hemácias com o tempo sedimentam no fundo da microplaca e formam um botão de hemácias (reação negativa).
TESTE DE COOMBS
O teste de Coombs é uma pesquisa de anticorpos contra antígenos eritrocitários, capaz de sensibilizar as hemácias, mas incapaz de aglutiná-las. Utiliza-se soro de coombs que vai reagir contra o anticorpo que a pessoa possui e vai promover a aglutinação. É um tipo de aglutinação utilizado em gestantes Rh- para verificar presença de anticorpos contra hemácias do feto, em doenças auto hemolíticas e em transfusões de sangue. O Coombs direto é a pesquisa de anticorpos presentes ao redor das hemácias, por exemplo na anemia hemolítica (produção de anticorpos nas hemácias e ligação deles com as hemácias). O Coombs indireto verifica os anticorpos que estão livres no plasma do indivíduo, por exemplo na eritroblastose fetal (a gestante Rh- tem anticorpos livres que poderão atravessar a placenta, se forem da classe IgG, e poderão atacar o feto – o teste é indireto porque não pesquisa os anticorpos ao redor das hemácias e sim a presença de anticorpos livres e por isso utiliza como reagente uma hemácia O+ onde esse Rh+ vai servir de antígeno). 
FLOCULAÇÃO 
É uma variante da aglutinação indireta, porém a aglutinação é vista a olho nu e a floculação é necessário a presença de um microscópio. O teste de floculação mais utilizado é o VDRL (pesquisa de sífilis). Ocorre a interação direta de anticorpos específicos com o antígeno que leva à formação de imunocomplexos em meio líquido. Se formar floquinhos é uma reação positiva e se for homogênea é uma reação negativa. Tanto nesse quanto na aglutinação é possível titular as amostras em diversos divisores e analisando até quando vai ser positivo: se consegue diluir a amostra em 2 tubos, é 2:1. Durante o tratamento da sífilis a titulação do VDRL vai diminuindo. 
ENSAIOS LÍTICOS
Permitem a detecção de antígenos ou anticorpos como produto final à presença ou ausência de hemólise. Verifica a presença de complemento e a consequente lise das hemácias. Faz-se a inserção de hemácias ligadas à anticorpos no soro; se existe complemento no sangue do indivíduo, ele vai se ligar nas hemácias e pode haver a formação do MAC gerando a hemólise. 
IMUNOENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS
Identifica a presença de antígenos ou anticorpos, empregando moléculas marcadas com compostos detectáveis (conjugados). São eles: imunofluorescência, radioimunoensaio, ELISA, Western Blotting e imunocromatografia. 
Imunofluorescência direta 
Observa-se o antígeno conjugado a uma molécula que emite fluorescência (ligada ao anticorpo). Verifica se um tecido tem a presença de uma bactéria; coloca o anticorpo contra a bactéria conjugado a uma molécula fluorescente e espera o tempo da ligação e lava a amostra; se o anticorpo realmente atingir o antígeno da bactéria, ele forma complexo e não vai ser removido com a lavagem gerando fluorescência ao redor do parasita. Na imunofluorescência indireta faz-se a pesquisa da presença do anticorpo ao invés de pesquisar antígeno. Prepara lâmina com antígeno pesquisado e coloca o soro do paciente, mas não vai gerar fluorescência. Aí coloca um segundo anticorpo fluorescente que vai se ligar ao primeiro anticorpo que está ligado ao antígeno. 
Radioimunoensaio
Verifica-se o quanto de radiação a amostra emite, quanto mais radiação maior será a ligação Ag-Ac.
ELISA
Faz-se a quantificação do anticorpo ou do antígeno. Tem-se um poço e grudado na sua parede tem-se antígenos. Se coloca o soro do paciente haverá a formação de Ag-Ac – lava para jogar as outras imunoglobulinas de excesso fora. No segundo passo coloca anticorpo secundário contra o anticorpo humano conjugado a uma enzima – lava novamente. Na terceira etapa coloca-se o substrato da enzima que, ao ser quebrado, gera uma coloração. Quanto mais anticorpo na amostra do paciente, mais anticorpos com enzimas serão ligados, mais substrato será quebrado e maior será a intensidade da coloração no final. 
Western Blotting
Primeiro separa as proteínas através da eletroforese, criando-se um campo elétrico no qual as moléculas migram em direção a cargas opostas. As proteínas virais ficam separadas e utiliza-se um anticorpo específico contra a proteína pesquisada. O anticorpo só vai se ligar na fração proteica que nos interessa. A proteína do HIV é a p24 e observa-se que a carga viral vai de D2 a D30 onde estão os indivíduos acometidos.
Imunocromatografia
É feito rapidamente com uma fitinha que tem impregnada antígenos ou anticorpos. Nesse caso tem-se anticorpos pesquisando os antígenos. Num aparelhinho, tem-se um local onde é colocada a amostra; se ela tiver antígeno essa amostra vai se ligar ao anticorpo correspondente na fita junto com uma substancia que gera a cor. A amostra vai correndo na fita: tem uma listra na fita que tem um anticorpo contra o antígeno então nessa região tem acúmulo de Ag-Ac e tem uma coloração bem forte. A amostra continua correndo e colore outra fita, que é o controleque é sempre positivo. Se colorir as duas linhas é um teste positivo, mas se colorir só a linha do controle é um teste negativo.