CITOMETRIA DE FLUXO

Prévia do material em texto

A citometria de fluxo é uma tecnologia que permite a medida SIMULTÂNEA de 
MÚLTIPLAS características de uma única célula
-
Tamanho relativo○
Complexidade interna○
Intensidade de fluorescência○
FACS (citômetro de fluxo)-
Conteúdo de DNA e RNA○
Receptores de superfície○
Atividade enzimática○
Produção de citocinas e de íons○
○ Bactérias
○ Plaquetas
○ Detecção de populações celulares específicas
Pode ser utilizada na identificação, avaliação e diferenciação de diversas características 
celulares como:
-
Princípio: Baseia-se na detecção de substâncias fluorescentes (fluorocromos) acoplados a 
anticorpos (capazes de se ligar a determinada molécula de interesse presente nas 
células)
-
A citometria também permite a separação rápida e purificada de uma suspensão 
heterogênea de células - processo de Sorting
-
○ Preparar sempre a amostra em suspensão no tubinho
- Permite avaliar células ou partículas em suspensão
- Que tipo de célula o paciente tem, quantas células ele tem, o que essas células 
expressam
- Ex: identificar a taxa de linfócitos T CD4+ em pacientes HIV+
- BID (esferas que imitam as células, e são recobertas por anticorpos)
- Preparo da amostra (suspensão), levar o tubinho para análise no citômetro, informações 
recolhidas no computador, levar essas informações para um software
- Diferença com o método de fluorescência: esse método é feito em lâmina, enquanto a 
citometria é feita em suspensão
APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO LABORATÓRIO CLÍNICO
Análise de subpopulação linfocitária-
Acompanhamento de pacientes HIV+-
leucemias e linfomas○
Imunofenotipagem de células tumorais -
Ciclo celular e ploidia de tumor○
Análise de DNA -
Contagem de reticulócitos-
CITOMETRIA DE FLUXO
quarta-feira, 28 de novembro de 2018 22:57
 Página 1 de Imunologia 
Contagem de reticulócitos-
Quantificação de células progenitoras "stem cells"-
Análise de moléculas de sinalização intracelular-
Fatores de transcrição-
VANTAGENS
Mede vários parâmetros em uma única célula-
Muitas células analisadas simultaneamente-
Variedade de anticorpos específicos-
Analisar simultaneamente antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares-
A TÉCNICA
Resulta da reunião e aplicação de técnicas envolvidas na área da computação, na 
produção de anticorpos monoclonais e de fluorocromos, nos raios laser e na 
eletrônica
○
É um método utilizado para estudo de células-
Permite avaliar características físicas, químicas e biológicas de vários tipos celulares, 
previamente preparados e marcados com anticorpos monoclonais conjugados a 
fluorocromos, com afinidade por determinada molécula de interesse
-
É um ensaio com reagentes marcados que detectam e quantificam diretamente a 
interação antígeno-anticorpo por meio de marcadores fluorescentes
-
O sensor é chamado de fotomultiplicadores (PMTs), estes são capazes de converter 
a luz captada em sinais eletrônicos que serão enviados ao computados, 
possibilitando, através de software específico, uma análise de multi-parâmetros 
para obtenção dos resultados
○
Os fluorocromos são excitados por uma radiação a laser e emitem um comprimento de 
onda (cor) que é detectado pelo sensor
-
A análise é a realizada através de representações gráficas da intensidade de 
fluorescência emitida pelo fluorocromo e as respectivas características morfológicas das 
células
-
Emprego de uma radiação laser direcionada, que vai excitar substâncias 
fluorescentes (fluorocromos) 
○
As células são marcadas com esses fluorocromos○
Essa solução salina acomoda as células marcadas, de forma que, 
individualmente elas sejam interceptadas pelo laser
▪
As células marcadas são transportadas e protegidas por um fluxo hidrodinâmico 
contínuo (solução salina)
○
Ao ser excitado pela radiação do laser, o fluorocromo emite luz, que dependendo 
do comprimento de onda, possui cor característica
○
Os sistemas óticos (espelhos) e eletrônicos, coletam, filtram e convertem em 
pulsos elétricos os parâmetros de dispersão de luz e fluorescência emitidas
○
Os pulsos elétricos são então convertidos em dados e enviados a um computador○
No computador, os dados são avaliados em software específico que é capaz de 
reproduzir através de gráficos informações físicas, químicas e biológicas de cada 
○
Princípio básico-
 Página 2 de Imunologia 
reproduzir através de gráficos informações físicas, químicas e biológicas de cada 
célula, em função da intensidade de fluorescência e da luz dispersada
A câmara, além de receber a suspensão de células, é banhada pela solução salina, 
que é responsável pelo fluxo contínuo
○
A forma cônica da câmara e o fluxo, forçam a acomodação das células uma atrás 
de outra, de forma que deixem a câmara por um pequeno buraco e sejam 
interceptadas individualmente pela radiação laser (uma por uma)
○
O encontro entre as células e o laser resulta na refração da luz do laser e 
naemissão de fluorescência de acordo como fluorocromos presentes na célula
○
Após a preparação da amostra, o tubo que tem a suspensão de células é acoplado ao 
citômetro de fluxo e as células são aos poucos aspiradas por um sistema de pressão e 
levadas a uma câmara de fluxo
-
FLOROCROMOS
São moléculas fluorescentes, que inicialmente estão em repouso e que são excitados por 
uma determinada fonte luminosa (laser), emitindo uma luz de comprimento de onda 
(cor) característica
-
Podendo caracterizar um tipo celular, um evento bioquímico ou um tipo de 
resposta imunológica
▪
O receptor de superfície CD3+ está presente na membrana de todos os 
linfócitos T. Se usarmos um anticorpo anti-CD3+ acoplado a um 
fluorocromo, todo linfócito T da amostra, ao ser interceptado pelo 
laser, terá o fluorocromo excitado e o comprimento de onde que ele 
emite será captado pelo PMT (sensor) através da configuração ótica
□
Exemplo:▪
Os fluorocromos são acoplados a anticorpos com afinidade por determinada 
estrutura química das células
○
Anticorpos conjugados a fluorocromos ou substâncias fluorescentes, ambos capazes de 
emitir cor, é a base para esse protocolo citofluorimétrico
-
A maioria dos fluorocromos é excitada por um laser argônio (em comprimento de onda -
 Página 3 de Imunologia 
A maioria dos fluorocromos é excitada por um laser argônio (em comprimento de onda 
de 488 nm), que está presente em todos os citômetros de fluxo
-
SISTEMA ÓPTICO
Para isso é preciso que a luz emitida pelo fluorocromo e a luz laser refratada pela 
célula passem por filtros com propriedades específicas (de permitir a passagem de 
determinados comprimentos de onde e refletir outros) e direcionando assim a luz 
para os PMTs 
○
A luz precisa atingir um determinado PMT para que as informações de luz (que 
representam propriedades da célula) sejam determinadas
-
○ Ex: 60 células azul brilhante, 70 células vermelhas brilhante e 30 células verde 
brilhante
- O citômetro vai identificar fluorescências diferentes (que são específicas de cada tipo de 
células)
Quanto maior for a partícula, maior será o ângulo de incidência da luz do 
laser, dispersada pela partícula, que atinge o foto-sensores
▪
Forward Scatter: A luz dispersada na mesma direção do laser e permite analisar o 
tamanho celular
○
Side Scatter: ao mesmo tempo que o evento anterior ocorre, devido a 
granularidade celular e a luz emitida pelos fluorocromos, a luz do laser refratada é 
captada e enviada por lentes que as direcionam lateralmente para os PMTs
○
A luz do laser argônio, além de excitar os fluorocromos, ao encontrar a célula, é refratada 
e dispersada.
-
Células não marcadas, ou seja, que não possuem a molécula de interesse, também são 
interceptadas pelo laser
-
- As células absorvem um comprimento de onda específico e emitemoutro comprimento 
de onda
EQUIPAMENTO
Fluídica○
Óptico○
Eletrônico○
O citômetro de fluxo é um equipamento baseado na combinação de 3 sistemas:-
Os fótons captados pelos PMTs são convertidos em pulsos elétricos, enviados para o 
computador e utilizados para representar a intensidade de fluorescência detectada em 
cada PMT
-
- Detecta tamanho, granulosidade, fluorescência da partícula
- Quando o laser incide na célula, excita as células, que emitem uma luz de volta (essa luz 
detectada pelos detectores, os fotosensores, vai ser respectiva a qual tipo de célula está 
passando)
 Página 4 de Imunologia 
 Página 5 de Imunologia 
CELL SORTING
Além do recurso de análise de células e promover informações acerca de suas -
 Página 6 de Imunologia 
Essas populações purificadas se tornam disponíveis para avaliações morfológicas 
ou genéticas
○
Além do recurso de análise de células e promover informações acerca de suas 
características, alguns citômetro permitem a SEPARAÇÃO de populações celulares puras 
e homogêneas a partir de uma amostra heterogênea, de acordo com critérios biológicos 
predefinidos
-
Alto grau de pureza das amostras○
Integridade das células após separação○
Condições estéreis em que o processo é realizado○
Alta especificidade (é possível determinar o número de células a ser separado)○
Vantajoso pois tem a capacidade de isolar populações celulares em um processo 
relativamente rápido, à condições estéreis, à pureza e integridade das células isoladas
-
 Página 7 de Imunologia