exercicios resolvidos

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Universidade Federal do Pará 
Faculdade de Biotecnologia 
Engenharia de Bioprocessos 
Engenharia Genética e Transgênica 
Professor: Diego Assis 
Andre da luz de Freitas 
Matrícula: 20174440017 
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01 – Quais as características gerais de transcrição? 
 
A transcrição é o processo no qual um gene da sequência de DNA é copiado para 
fazer uma molécula de RNA. É composta de três etapas: iniciação, alongamento e 
terminação e a RNA polimerase é a principal enzima responsável por esse processo 
de transcrição. A transcrição começa quando a RNA polimerase se liga a uma 
sequência promotora diretamente ou através de proteínas auxiliares. A RNA 
polimerase usa uma das fitas de DNA (a fita molde) como uma referência para fazer 
uma molécula de RNA nova (alongamento). Dependendo da sequência de RNA, a 
transcrição termina quando ocorre sinalização que deve terminar. 
 
02 – Qual a cadeia da RNA polimerase reconhece a região promotora dos genes? 
 
Subunidade sigma de RNA polimerase reconhece a região promotora de um gene. 
Local onde se inicia a síntese do gene. 
 
03 – Como ocorre a terminação da transcrição? 
 
Ocorre a Formação de ligações fosfodiésters entre os primeiros ribonucleotídeos na 
cadeia de RNA nascente. Em procariotos existem dois mecanismos de terminação: 
Rho-dependente no qual o RNA contém um sítio de ligação para uma proteína 
chamada fator Rho. O fator Rho se liga à essa sequência e começa a "subir" o 
transcrito em direção à RNA polimerase. Quando ele alcança a polimerase na bolha 
de transcrição, o Rho puxa a transcrição do RNA e o molde de DNA se separa, 
liberando a molécula de RNA e terminando a transcrição. Terminações Rho-
independentes dependem das sequências específicas do modelo do DNA. Enquanto 
a RNA polimerase se aproxima do final do gene que está sendo transcrito, ele atinge 
uma região rica em nucleotídeos C e G. O RNA transcrito desta região se dobra de 
volta para si mesmo e os nucleotídeos complementares C e G se ligam. O resultado 
é um grampo de cabelo estável que faz com que a RNA polimerase fique presa. 
 
04 – Quais os componentes genéticos básicos que precisam existir numa região 
do DNA pra um sistema de expressão gênica ser funcional? Explique a função 
de cada um. 
 
Um promotor contém sequências de DNA que deixam a RNA polimerase ou as suas 
proteínas auxiliares se ligarem ao DNA. Uma vez formada a bolha de transcrição, a 
polimerase pode iniciar a transcrição. O operador é um sítio de ligação de uma 
molécula repressora, no qual é formado por cerca de 25 a 30 pares de bases de DNA. 
A sequência de Shine-Dalgarno é característica exclusiva dos procariotos. A 
sequência de Shine Dalgarno, ou sítio de ligação do ribossomo, é uma sequência de 
bases no RNAm procariótico que existe próximo ao códon AUG – códon de iniciação. 
O cístron é um dos conceitos de gene. Chama-se cístron ao segmento de DNA que 
contém as informações para a síntese de uma proteína ou de um polipeptídeo. Sítio 
de terminação são locais onde a RNA-pol para e o RNA nascente é liberado. 
 
 
05 – Descreva como ocorre o controle da transcrição do operon da arginina. 
 
Quando a célula necessita de arginina o óperon da arginina começa a sintetizar essa 
molécula. Esse aminoácido quando abundante na célula funciona como um co-
repressor. A arginina se liga a uma proteína repressora específica, a repressora de 
arginina, presente na célula. A proteína repressora é alostérica; isto é, sua 
conformação é alterada quando o co-repressor se liga a ela. Ao se ligar ao seu efetor, 
a proteína repressora se torna ativa, ligando-se, então, a uma região específica do 
DNA próxima ao promotor do gene, chamado de operador. Essa região originou o 
termo óperon, que corresponde a um grupo de genes arranjados de forma linear e 
consecutiva, cuja expressão é regulada por um único operador. Todos os genes de 
um óperon são transcritos como uma única unidade, originando um único RNAm. Se 
o repressor se liga ao operador, a transcrição é fisicamente bloqueada, uma vez que 
a RNA-polimerase não pode nem se ligar e nem continuar. Assim, os polipeptídios 
codificados pelos genes do óperon deixam de ser sintetizados. Se o RNAm for 
policistrônico, todos os polipeptídios codificados por este RNAm serão reprimidos. 
 
06 – Descreva como ocorre o controle da transcrição do operon da lactose. 
 
Dois reguladores "ligam" e "desligam" o operon em resposta aos níveis de lactose e 
glicose: o repressor lac e a proteína ativadora de catabólito (CAP). O repressor lac 
atua como um detector de lactose. Ele normalmente bloqueia a transcrição do operon, 
mas para de atuar como repressor quando a lactose está presente. O repressor lac 
detecta a lactose indiretamente, através do isômero alolactose. A proteína ativadora 
de catabólito (CAP) atua como um detector de glicose. Ela ativa a transcrição do 
operon, mas somente quando os níveis de glicose estão baixos. A CAP detecta a 
glicose indiretamente, através da molécula "com fome de sinalizar" AMPc (AMP 
cíclico). 
 
07 – Descreva o funcionamento das enzimas de transcrição. 
 
A RNA polimerase I catalisa a síntese de apenas um tipo de pré-rRNA que é o 
precursor dos rRNAs 18S, 5,8S e 28S, que farão parte do ribossomo. O complexo 
RNAP I é composto por duas subunidades maiores e por quatro a dez subunidades 
menores, algumas dessas comuns as RNAP II e RNAP III. Os promotores para RNAP 
I são compostos por dois domínios, um localizado entre -45 e +25 (domínio central ou 
núcleo do promotor), e o outro localizado entre -107 e -180 (domínio upstream ou 
elemento a montante). Todos os pré-mRNAs das células são sintetizados pela RNA 
polimerase II (RNAP II), que transcreve a maior parte dos RNA heterogêneos 
nucleares (hnRNA) precursores dos mRNAs. As RNAPs II possuem três subunidades 
maiores de 210, 140 e 50 kDa e vários componentes menores (de 6-8). As três 
subunidades maiores relacionam-se com os componentes β’, β e α da RNAP de E. 
coli. A RNA polimerase III sintetiza os tRNA, rRNA 5S, e outros RNAs. Essas 
polimerases catalisam a síntese de cerca de 10% do RNA da célula, do rRNA 5S, dos 
tRNAs, e de outro pequenos RNAs. A enzima é a mais complexa das RNAPs, com 
tamanho aproximado de 700 kDa, sendo formado por cerca de 14 subunidades. Assim 
como as outras RNAPs, 2 subunidades são maiores, com 160 e 128 kDa, e têm 
identidade com as correspondentes subunidades de RNAP II. 
 
08 – Quais os componentes dos vetores de clonagem? 
 
Um vector de clonagem deve apresentar uma sequência que permite a sua replicação 
no interior de uma célula hospedeira bacteriana (leveduras, no caso dos YAC’s). Deve 
apresentar um local de clonagem, isto é, um local para inserir o DNA alvo, uma origem 
de replicação, Gene marcador dominante selecionável, sítio de clivagem e resistência 
antibióticos. Existem 4 tipos de vectores de clonagem: plasmídeos, fagos, cosmídeos 
e YAC’s. Algumas características que um vector de clonagem deve apresentar: locais 
de reconhecimento para enzimas de restrição; Permitir a replicação; ser de fácil 
isolamento; ter pequenas dimensões e permitir a sua multiplicação dentro da célula 
com um elevado número de cópias 
 
09 – Diferencie um vetor de clonagem molecular de um vetor de expressão 
gênica quanto a composição de elementos genéticos. 
 
Um vetor de clonagem é um fragmento de DNA composto de origem de replicação, 
Gene marcador dominante selecionável, Sítio de clivagem e Resistência antibióticos, 
que é inserido num elemento genético auto-replicante geralmente um vírus ou um 
plasmídeo chamado vector, com função apenas de se replicar no hospedeiro. Já um 
vetor de expressão são vetoresde clonagem que possuem todos os elementos 
genéticos que permitem a expressão de proteínas recombinantes (Vários promotores: 
Constitutivos, Induzidos, Reprimidos, Produção de proteínas, Overexpression, lac, trp, 
trc). Se os elementos genéticos permitem a expressão em células bacterianas, este é 
um vetor de expressão procarioto. 
 
10 – O que são as análises ômicas? 
 
O termo ômica é derivado do sufixo “oma” que significa “conjunto de”, assim, podemos 
definir as áreas acima da seguinte maneira: Transcriptômica ou Genômica Funcional 
que se refere ao estudo das moléculas de RNA formadas a partir do processo de 
transcrição (DNA → RNA) e que determinam o produto da expressão gênica as 
proteínas (Proteoma) a serem formadas pela célula. Esses RNAs são denominados 
RNA mensageiros (mRNA) e o conjunto de mRNA é denominado Transcriptoma; A 
Metabolômica estuda alterações na expressão de pequenas moléculas orgânicas 
denominadas metabólitos; ao conjunto de metabólitos de uma célula, de um tecido ou 
de um organismo. 
 
11 – Explique por que não existe um transcriptoma e/ou um proteoma total de 
uma célula? 
 
 
O perfil do transcritoma e ou proteoma pode variar segundo o momento como por 
exemplo em durante o ciclo celular, estado fisiológico, estímulos físicos, químicos, 
biológicos ou doenças. Como são os RNAm os codificadores das proteínas e, 
portanto, o centro dos interesses da pesquisa de genômica funcional; na prática ficou 
estabelecido que o transcritoma abrange o conjunto desta espécie de RNA. 
Entretanto, recentemente, os pesquisadores incluíram os microRNAs no conceito de 
transcritoma por representarem uma classe muito importante de pequenos RNAs 
(contendo aproximadamente 20 a 22 nucleotídeos) que controlam a expressão gênica 
ao nível pós-transcricional, impedindo a tradução dos RNAm em proteínas. Por isso, 
não é possível se obter um transcriptoma ou proteomoma completo de uma célula 
devido essas variedades na funcionalidade da célula. 
 
12 – Explique os princípios dos métodos de sequenciamento de nova geração. 
 
Existe uma variedade de técnicas de sequenciamento de nova geração que usam 
diferentes tecnologias. No entanto, a maioria tem algumas características em comum 
que as distinguem do sequenciamento Sanger: Alto paralelismo: muitas reações de 
sequenciamento ocorrem ao mesmo tempo. Microescala: reações são pequenas e 
muitas podem ser realizadas de uma vez em um chip. Rapidez: pelas reações serem 
feitas em paralelo, resultados são obtidos muito mais rápido. Baixo custo: sequenciar 
um genoma é mais barato do que com o sequenciamento Sanger. Menor 
comprimento: leituras tipicamente variam entre 505050 -700700700 nucleotídeos de 
comprimento. Conceitualmente, o sequenciamento de nova geração é algo como 
conduzir um grande número de pequenas reações Sanger de sequenciamento em 
paralelo. Graças a essa paralelização e pequena escala, grandes quantidades de 
DNA podem ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com métodos de 
próxima geração do que com sequenciamento Sanger. 
 
13 – Quais as vantagens de utilizarmos RNA-seq ao invés de abordagens por 
hibridização? 
 
Análise de RNA-Seq é um método pelo qual todas as moléculas de RNA da célula são 
sequenciadas. Desde que a sequência do genoma esteja disponível para 
comparação, esta irá revelar não somente os genes que foram transcritos, mas 
quantas cópias de cada RNA foram feitas. RNA-Seq é utilizado tanto para medir a 
expressão de RNAm quanto para identificar e caracterizar pequenos RNAs não 
codificadores. 
 
14 – Descreva o método de eletroforese bidimensional da análise proteômica. 
 
Na eletroforese bidimensional, as proteínas são submetidas a dois processos 
consecutivos (duas dimensões) de separação, baseados em propriedades diferentes 
das proteínas. Assim, durante a primeira dimensão, denominada focalização 
isoelétrica (IEF), as proteínas são separadas em um gel de poliacrilamida, que forma 
um gradiente de pH, e migram até atingirem uma posição estacionária onde possuam 
carga líquida zero (ponto isoelétrico). Na segunda dimensão, as proteínas separadas 
pela IEF são submetidas a uma eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, 
que separa as proteínas de acordo com suas massas moleculares. Como os 
parâmetros usados na primeira dimensão (ponto isoelétrico) e na segunda dimensão 
(massa molecular) são independentes, uma grande resolução é atingida. Mais de 
8.000 proteínas podem ser separadas em um único gel bidimensional.