REVISTA BIOTECNOLOGIA ED 17

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R$ 5,00R$ 5,00 ano III • nœmero 17 • novembro/dezembro de 2000ano III • nœmero 17 • novembro/dezembro de 2000
2 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
BIOTECNOLOGIA/KL3
REPETE FOTOLITO
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 3
BIOTECNOLOGIA/KL3
REPETE FOTOLITO
4 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
ENTREVISTA
Entrevista concedida a
Lucas Tadeu Ferreira
Expediçªo Humboldt 2000
Pesquisa científica na Amazônia do Caribe ao Atlântico
4 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
Partindo da experiŒncia
acumulada pelos viajantes naturalistas
que percorreram a grande floresta
Amazônica nos sØculos XVIII e XIX,
39 cientistas da Universidade de
Brasília – UnB, da Universidad Simon
Bolívar, da Venezuela, e de outras
instituiçıes de pesquisas brasileiras
realizaram ampla coleta de material e
informaçıes para o desenvolvimento
de pesquisas de ponta, contribuindo
assim, para o avanço do conhecimen-
to científico no sØculo XXI.
Defendendo os direitos dos
povos indígenas e da floresta, e
combatendo a biopirataria, os cientis-
tas que participaram dessa expediçªo
percorreram aproximadamente 10.000
km em busca de novos conhecimen-
tos a partir dos ‘achados’ amazônicos.
Assim, espera-se que os resultados da expediçªo proporcionem contribui-
çıes importantes para vÆrias Æreas do conhecimento humano, uma forma
inteligente que a comunidade científica encontrou para se vincular aos
problemas amazônicos contemporâneos e, principalmente, na busca de
soluçıes.
Para falar um pouco dessa aventura Humboldt 2000, o professor de
microbiologia da Universidade de Brasília - UnB -, CØsar Martins de SÆ, que
foi um dos principais coordenadores da Expediçªo, concedeu esta entrevis-
ta a Lucas Tadeu Ferreira para a revista BIOTECNOLOGIA CiŒncia &
Desenvolvimento.
O professor CØsar Martins Ø graduado em biologia e mestre em
biologia molecular pela UnB. Fez doutorado em Paris, no Instituto Jacques
Monod da Universidade de Paris VII. Voltou ao Brasil em 1989; foi contra-
tado e Ø professor do Departamento de Biologia Celular da UnB. Recente-
mente fez Pós-Doutoramento em San Diego, Califórnia, na Ærea de biologia
molecular de câncer.
Fotos: Juan Pratginestós
Professor CØsar na
biblioteca do barco
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 5Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 5
BC&D - Quais foram os princi-
pais objetivos da Expediçªo Hum-
boldt -Amazônia 2000?
CØsar Martins – Primeiramente, gos-
taria de explicar um pouco o porquŒ
da escolha do nome Humboldt para
nossa Expediçªo. Alexander Von
Humboldt, de origem alemª, foi um
dos maiores cientistas de sua Øpoca.
Em meados de 1799, juntamente
com seu amigo botânico, o francŒs
AimØ Bonpland, chegou à AmØrica
Latina, no delta do rio Orinoco, na
Venezuela. Os dois cientistas tinham
como objetivo estudar a Amazônia
atravØs de seus rios. Acreditavam
que, subindo o rio Orinoco e pas-
sando pelo canal do Cassiquiare,
que liga a bacia do Orinoco à bacia
do Rio Negro, poderiam chegar a
BelØm, no Brasil. O problema Ø que
Humboldt, quando chegou à fron-
teira do Brasil, foi impedido de en-
trar no país. Naquela Øpoca, o Brasil
era colônia portuguesa e ele ficou
uns dois meses na fronteira aguar-
dando um visto de entrada. Acabou
sendo impedido, pois os portugue-
ses pensaram que ele era um espiªo
espanhol. Dessa forma, a Amazônia
Brasileira deixou de ser estudada
pelo grande sÆbio. Assim, a nossa
expediçªo, homenageando Humbol-
dt, faz um resgate histórico: - duzen-
tos anos depois, fizemos o mesmo
percurso que ele fez na Venezuela e,
principalmente, o percurso que ele
nªo fez, no Brasil, que era chegar a
BelØm atravØs dos rios. Tendo como
patrono Humboldt, a expediçªo
obrigatoriamente deveria ser uma
expediçªo científica multidisciplinar,
pois Humboldt era um cientista uni-
versal: geógrafo, astrônomo e com
grande conhecimento em muitas ou-
tras Æreas da ciŒncia. Nossa expedi-
çªo teve como objetivo principal
contribuir para o desenvolvimento
de pesquisas voltadas para assegu-
rar o futuro da Amazônia.
BC&D - Qual foi o critØrio de
escolha e quantos
pesquisadores bra-
sileiros e venezue-
lanos integraram a
expediçªo “Hum-
boldt 2000” à Ama-
zônia?
CØsar Martins – A
escolha privilegiou
cientistas brasileiros.
Nós começamos a
desenhar a expediçªo hÆ dois anos
e como íamos fazer um percurso
dentro da Venezuela, que Ø a parte
do rio Orinoco, fizemos contato
com professores da Universidade
Simon Bolívar, em Caracas. Nessa
parte, a expediçªo ficou sendo bina-
cional. Participaram quatro profes-
sores venezuelanos, que foram es-
colhidos por eles mesmos. Essa equi-
pe deixou a expediçªo na fronteira
com o Brasil. Do nosso lado adota-
mos alguns critØrios de seleçªo: pri-
meiro, os cientistas deveriam ter
disponibilidade de longos períodos
de tempo, jÆ que a expediçªo durou
65 dias. Segundo, esses pesquisado-
res deveriam ter um certo conheci-
mento do que era uma navegaçªo e
convivŒncia dentro de um barco
com espaço reduzido. Terceiro, o
critØrio cientifico, que Ø a escolha de
especialistas em diferentes Æreas.
Levamos muitos pesquisadores jo-
vens, inclusive estudantes, porque
achamos muito importante para as
geraçıes que estªo vindo conhece-
ram um pouco da Amazônia. Parti-
ciparam 39 cientistas ao longo de
toda a expediçªo. Nem todos pude-
ram ficar os 65 dias corridos. En-
quanto um grupo viajava, outros
iam entrando e saindo em diferentes
percursos.
BC&D - Quais os principais tre-
chos percorridos na Amazônia
brasileira e venezuelana?
CØsar Martins – O início da expe-
diçªo foi no dia 1” de setembro de
2000. Partimos de Brasília por aviªo
atØ Manaus. Daí, com destino a
“...seguramente, tŒm achados
biológicos que pela primeira vez
serªo descritos e identificados.
Encontramos, por exemplo, um
microrganismo luminescente.
BioluminescŒncia tem sido
muito utilizada em biologia,
medicina e agricultura como
rastreadores moleculares”
Equipe trabalhando na
biblioteca do barco
Flor de guaranÆ
6 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento6 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
Ciudad Guayana no baixo
Orinoco Venezuelano. Esse
percurso foi feito por terra,
atravessando o estado de
Roraima, a serra de Pacara-
ima e as savanas venezuela-
nas. De Ciudad Guayana a
Puerto Ayacucho, a viagem
foi feita de barco. O segun-
do trecho foi feito de Puerto
Ayacucho às cidades de Es-
meralda e San Carlos del Rio
Negro no Cassiquiare, e
Cucuí, jÆ na fronteira com o Brasil.
Nós tivemos alguns problemas de
segurança na travessia desse trecho
por causa do recrudescimento da
guerrilha na fronteira com a Colôm-
bia e assim tivemos que percorrŒ-lo
em helicóptero da força aØrea vene-
zuelana. O terceiro trecho compre-
endeu a descida, de barco, pelo rio
Negro atØ Manaus, com escala de 10
dias em Sªo Gabriel da Cachoeira.
Naquela cidade as atividades foram
intensas graças ao apoio do ExØrcito
Brasileiro. Parte da equipe subiu o
rio UaupØs atØ IauaretØ próximo à
fronteira colombiana; outra foi ao
morro dos Seis Lagos, próximo do
parque do Pico da Neblina e outra
parte permaneceu pesquisando em
Sªo Gabriel da Cachoeira. O quarto
trecho foi de Manaus a SantarØm,
passando pela foz do rio NhamundÆ,
pelo ParanÆ do Ramos, baixo Trom-
betas e subimos o Tapajós atØ For-
dlândia e outros. O quinto trecho da
expediçªo desceu o rio Amazonas,
passando pelo rio Xingu e pelas
cidades de Monte Alegre, Prainha,
Almerim, Laranjal do Jari, Santana e
chegou a MacapÆ. No AmapÆ, fomos
por terra atØ o rio Oiapoque, no
extremo norte do Brasil. De lÆ, al-
guns pesquisadores seguiram ao
norte atØ a foz do rio Oiapoque para
pesquisa de microrganismos maríti-
mos. A equipe de hidrólogos tam-
bØm fez mediçıes importantes de
vazªo e sedimentos no Estreito de
Óbidos e na foz do Amazonas.De
MacapÆ, fomos atØ BelØm. Passamos
por quatro estados brasileiros: Rora-
ima, Amazonas, ParÆ e o AmapÆ.
Nossa expediçªo percorreu quase
10.000 km na Amazônia.
BC&D - Quem coordenou, quan-
to custou e quais foram as insti-
tuiçıes que financiaram a expe-
diçªo?
CØsar Martins – A expediçªo foi
organizada pelo Nœcleo de Estudos
Amazônicos da UnB e coordenada
por mim e pelo historiador profes-
sor Vítor Leonardi, especialista em
história da Amazônia. Foi difícil le-
vantar todo o recurso necessÆrio e
tivemos de fazer muitos cortes. Ao
todo ficou em torno de R$ 180.000,00.
O principal financiador foi o Minis-
tØrio do Meio Ambiente, atra-
vØs da Secretaria da Amazô-
nia; o Banco do Brasil, atra-
vØs da BB-Tour, que nos for-
neceu as passagens aØreas.
O WWF, que financiou toda
a parte de fotografia e a Fun-
daçªo UniversitÆria de Brasi-
lia-FUBRA . Contamos tam-
bØm com o apoio do ExØrci-
to Brasileiro atravØs do 5”
Batalhªo de Infantaria de Sel-
va, que nos alojou em Sªo
Gabriel da Cachoeira e o Governo
do AmapÆ, que forneceu veículo e o
alojamento em Oiapoque.
BC&D - Que Æreas do conheci-
mento humano foram explora-
das e investigadas na expediçªo?
CØsar Martins – A expediçªo con-
tou com quatro microbiologistas,
especialistas em ornitologia (pÆssa-
ros), botânicos, mastozoologia, saœ-
de pœblica, hidrologia, antropólo-
gos, indigenistas e historiadores.O
restante da expediçªo era composta
de uma equipe de cinegrafia, foto-
grafia e documentaçªo; ao todo, a
expediçªo contemplou 14 Æreas es-
pecíficas do conhecimento.
BC&D - Poderia descrever, sucin-
tamente, os principais achados
que, potencialmente, permitem
Parte da equipe Humboldt e o
apoio dos militares do 5” Bis
Equipe Humboldt
navegando pelo Rio Tapajós
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 7Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 7
aprofundar os conheci-
mentos sobre a floresta
Amazônica?
CØsar Martins – Na Ærea da
biologia, realizamos muitos le-
vantamentos e coletas ao lon-
go de nosso percurso. Todo
esse material serÆ agora pro-
cessado pelos pesquisadores
em suas respectivas unidades
de trabalho. Dizer atualmente
que vamos ter descobertas novas na
Ærea de biologia, em funçªo do que
foi coletado, ainda Ø um pouco
prematuro. Precisamos de muitas
anÆlises de laboratório e anos de
estudos para isso; mas, seguramen-
te, tŒm achados biológicos que pela
primeira vez serªo descritos e iden-
tificados. Encontramos, por exem-
plo, um microrganismo luminescen-
te que eu nªo sei ainda sua natureza.
BioluminescŒncia tem sido muito
utilizada em biologia, medicina e
agricultura como rastreadores mole-
culares. Esse achado Ø muito pro-
missor. Na parte de ciŒncias huma-
nas e saœde, os pesquisadores visita-
ram Instituiçıes Pœblicas de vÆrios
municípios, pesquisaram arquivos,
gravaram muitas entrevistas com ci-
entistas da regiªo, lideranças indíge-
nas e de populaçıes ribeirinhas.
Certamente, o conhecimento exis-
tente sobre a Amazônia vai ser am-
pliado a partir dessa expediçªo. Um
fato interessante ocorrido
na regiªo do ParanÆ do
Ramos, foi a descoberta pela
equipe de arqueólogos do
Museu Amazônico de um
sitio arqueológico, atØ ago-
ra desconhecido. Tudo in-
dica que aquele sítio fora
habitado por uma socieda-
de estÆvel e bem estrutura-
da hÆ, pelo menos, dois mil
anos. Trata-se de uma des-
coberta inØdita que serÆ co-
municada ao IPHAN.
BC&D – O Senhor mencionou o
achado de um organismo lumi-
nescente. De que forma a carac-
terística deste microrganismo
poderÆ vir a ter, potencialmente,
alguma aplicaçªo prÆtica?
CØsar Martins – O nosso interesse
estÆ na utilizaçªo desses microrga-
nismos em biotecnologia. Dentro
“Por que coletar recursos
biológicos da Amazônia para
pesquisar no exterior? Por que
nªo fazer tudo isso aqui dentro
do nosso próprio país ou com
as nossas universidades e
empresas, ou instalando labora-
tórios, tal como se instalam
empresas multinacionais?”
desse contexto, eu vejo gran-
de chance de sucesso. Os mi-
crorganismos foram coletados
no solo amazônico, onde a
degradaçªo da biomassa se dÆ
de forma intensa e natural.
Assim, seguramente esses mi-
croorganismos podem tam-
bØm ser utilizados na degra-
daçªo da biomassa originÆria,
por exemplo, do bagaço da
cana-de-açœcar, do farelo de
arroz, entre muitos outros, cujos
produtos de hidrólise podem ser
utilizados na agroindœstria. Por ou-
tro lado, a bioluminescŒncia encon-
trada Ø de longe a mais fascinante.
Para se ter uma idØia de sua impor-
tância basta verificarmos, na literatu-
ra especializada, as revolucionÆrias
aplicaçıes, por exemplo, do sistema
luciferase isolado do vagalume e da
GFP (Green Fluorecent Protein) iso-
lada de jelyfish. É preciso, contudo,
estudar muito bem esse potencial,
que Ø muito expressivo.
BC&D - Quem serªo os detento-
res do conhecimento e dos acha-
dos nessa expediçªo e como se
darÆ a distribuiçªo do que foi
encontrado?
CØsar Martins – Assim que come-
çarmos a isolar e a classificar, todo o
material coletado estarÆ disponível
para quem quiser e, naturalmente,
solicitar. Os estudos e as
pesquisas serªo realizadas
nas universidades brasilei-
ras, e assim que começar-
mos a conhecer o que co-
letamos, tudo serÆ disponi-
bilizado pelas medidas le-
gais. É importante enfatizar
que nªo existe nenhum de-
tentor específico dos acha-
dos e tudo serÆ amplamen-
te publicado.
BC&D - A Convençªo da
Diversidade Biológica es-
tabelece que a diversidade bioló-
Ruinas do velho Airªo, cidade
do alto Rio Negro
Extraçªo e transporte de madeira
na Amazônia
8 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
8 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
gica deve trazer benefícios para
a humanidade e reconhece ain-
da a soberania dos Estados no
uso e disponibilidade dos recur-
sos biológicos encontrados em
seus territórios. Como conciliar
entªo os interesses do Brasil com
o dos outros países quanto ao
uso da sua biodiversidade?
CØsar Martins – Esse tema Ø pouco
entendido, haja visto os vÆrios pro-
jetos de lei e medida provisória que
tramitam no Congresso. Eu tenho
uma visªo bastante pragmÆtica a
respeito da autonomia da nossa bi-
odiversidade. Na minha opiniªo,
quem detØm a autonomia da nossa
biodiversidade Ø o Estado Brasileiro;
mas os conhecimentos dela gerados
e de seu uso pertencem à humanida-
de. É só aplicar a Convençªo. Entre-
tanto, isto tem gerado muito mal-
entendido, principalmente com res-
peito à biopirataria. Biopirataria Ø
uma atividade ilícita praticada em
larga escala e, como tal, tem de ser
combatida. Mas como combatŒ-la?
Nªo se combate a biopirataria so-
mente com a criaçªo de Leis, com as
forças armadas, a polícia federal e
outros instrumentos de força. A me-
lhor forma de combatŒ-la Ø com
ciŒncia. A biodiversidade brasileira
tem que ser preservada e estudada
ao mesmo tempo. AtravØs do co-
nhecimento científico Ø que vamos
“Nªo se combate a biopirataria
somente com a criaçªo de Leis,
com as forças armadas, a polícia
federal e outros instrumentos de
força. A melhor forma de
combatŒ-la Ø com ciŒncia”
exercer a nossa verdadeira autono-
mia.
BC&D - Como garantir a partici-
paçªo das comunidades locais e
dos povos indígenas nas deci-
sıes que tenham por objetivo o
acesso e a exploraçªo dos recur-
sos biológicos das Æreas que ocu-
pam?
CØsar Martins – As terras indíge-
nas, em alguns estados brasileiros,
como por exemplo, no AmapÆ, es-
tªo praticamente todas demarcadas.
O processo de demarcaçªo de terras
em outros estados tem evoluído
atravØs de muitas lutas. Mas, o co-
nhecimento existente dos recursos
biológicos , ainda nªo. Em alguns
casos, principalmente o uso fitoterÆ-
pico de algumas plantas, Ø, hÆ mui-
tos anos, de pleno domínio dos
povos da floresta, mas pouco publi-
cado. VocΠencontra alguns relatos
Equipe Humboldtnavegando pelo Rio Tapajós
descritos por grandes viajantes ex-
pedicionÆrios e historiadores. Como
garantir, por exemplo a propriedade
intelectual deste conhecimento? Ago-
ra, com a demarcaçªo de suas terras,
a exploraçªo dos recursos biológi-
cos das Æreas que ocupam fica muito
mais fÆcil. É fazer parcerias e contra-
tos entre as partes. Estou convicto de
que nªo seremos bem sucedidos se
nªo fizermos parceria entre esses
povos e os pesquisadores e/ou Ins-
tituiçıes envolvidas na exploraçªo
dos recursos biológicos.
BC&D - Recentemente, a impren-
sa denunciou um “acordo” fir-
mado entre a Organizaçªo Nªo-
Governamental Bioamazônia e a
multinacional NOVARTIS para a
exploraçªo dos recursos biológi-
cos da Amazônia. Qual a sua opi-
niªo a respeito de eventos dessa
natureza?
CØsar Martins – EstÆ aí; esses mal
entendidos ocorrem. Na minha opi-
niªo, esses acordos tŒm de ser clara-
mente definidos para preservar os
nossos interesses. Por que coletar
recursos biológicos da Amazônia
para pesquisar no exterior? Por que
nªo fazer tudo isso aqui dentro do
nosso próprio país ou com as nossas
universidades e empresas, ou insta-
lando laboratórios, tal como se ins-
talam empresas multinacionais? Des-
sa forma, criaríamos empregos e
principalmente, garantiríamos a for-
maçªo de recursos humanos qualifi-
cados, inclusive, para a própria re-
giªo. Depois, Ø só dividir os lucros.
Para o amplo conhecimento da di-
versidade biológica da Amazônia Ø
preciso fazer parcerias e estimular os
envolvidos a investirem na forma-
çªo de recursos humanos. Que se
instalem indœstrias e laboratórios den-
tro da Amazônia. Desta forma, sim,
pode vir todo mundo.
E-mail do Prof. CØsar:
sasa@unb.br
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 9
PORTAL
WWW.BIOTECNOLOGIA.COM.BR
(Repete fotolito)
Obs.: Saiu na pÆgina 9 da ediçªo anterior (n”16)
10 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
Carta ao Leitor
BIOTECNOLOGIA CiŒncia & Desenvolvimento
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ISSN 1414-4522
Nessa ediçªo entrevistamos o Professor CØsar
Martins de SÆ, da Universidade de Brasília, e um
dos principais coordenadores da Expediçªo
Humboldt 2000.
Gostaria de destacar aqui a brilhante iniciativa
desse projeto que, nos dias de hoje, Ø da mais alta
importância para Brasil, jÆ que o objetivo princi-
pal Ø a busca de novos “achados” que proporci-
onem novos conhecimentos, muito importante
para as mais diversas Æreas. VÆrias expediçıes
como essa jÆ poderiam e deveriam estar sendo
feitas por todo o País, por brasileiros, para asse-
gurar a nossa autonomia sobre o patrimônio
genØtico do Brasil, e com isso combatendo,
inclusive, a biopirataria.
Acreditamos que a partir de agora o governo
federal deverÆ, a exemplo dessa importante expe-
diçªo, promover e incentivar outras expediçıes
dessa envergadura, uma vez que, apoiando pro-
jetos como esse, Ø sem dœvida nenhuma uma das
melhores formas de proteger nosso patrimônio
genØtico.
Dr. Henrique da Silva Castro
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 11
Conselho Científico
Dr. Aluízio BorØm - GenØtica e Melhoramento Vegetal
Dr. Henrique da Silva Castro - Saœde;
Dr. Maçao Tadano - Agricultura;
Dr. Naftale Katz - Saœde;
Dr. Pedro Juberg - CiŒncias;
Dr. SØrgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - GenØtica de Microorganismos;
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi
Dr. Ivan Rud de Moraes - Toxicologia;
Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia
Conselho Federal de Biologia
Dr. Joªo de Deus Medeiros
Fundaçªo Dalmo Catauli Giacometti
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia GenØtica;
Dr. JosØ Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;
Dra. Marisa de Goes - Recursos GenØticos
Instituto de Pesquisas EnergØticas e Nucleares - IPEN
Dr. JosØ Roberto Rogero
Colaboraram nesta ediçªo:
Entrevista
CØsar Martins de SÆ pÆg. 04
Pesquisa
Plantas como Biorreatores pÆg. 12
Flavonóides pÆg. 18
Peptídeos Antimicrobianos pÆg. 30
Emissªo de gases de efeito estufa pÆg. 38
TØcnicas moleculares em sementes pÆg. 44
Desvendando o código genØtico pÆg. 50
Saœde
Vacinas de BCG Recombinante - DTP pÆg. 24
BioNotícias
pÆg. 48
Seçªo de Cartas pÆg. 59
Adilson Leite
Alba Chiesse da Silva
Aloísio da Silva Pinto
AndrØa Almeida Carneiro
Carlos Bloch Jœnior
ClÆudia Teixeira Guimªres
Denise Silvina Piccini Quintas Horton
Édila de Resende Von Pinho
Edilson Paiva
Edson Luis Kemper
Eliane Namie Miyaji
Eneida Abreu Parizotto
Ivan Pereira Nascimento
Letícia Jungmann
Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Magda Aparecida de Lima
Maria das Graças Guimarªes Carvalho Vieira
Maria Laene Moreira de Carvalho
Maura Vianna Prates
Newton Portilho Carneiro
Paulo Cezar De Lucca
Renato MAtos Lopes
RogØrio Pietro Mazzantini
Tânia Toledo de Oliveira
Tanus Jorge Nagem
Waldely Oliveira Dias
12 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
Plantas como
Biorreatores
Utilizaçªo de plantas transgŒnicas como reatores biológicos para produçªo de proteínas
PESQUISA
Fotos cedidas pelos autores
Eneida Abreu Parizotto
Doutoranda em GenØtica e Biologia
Molecular (UNICAMP)
eapariz@unicamp.br
Paulo Cezar De Lucca
Doutorando em GenØtica e Biologia
Molecular (UNICAMP)
pdelucca@unicamp.br
Letícia Jungmann
Mestranda em GenØtica e Biologia
Molecular (UNICAMP)
jungmann@unicamp.br
Edson Luis Kemper
Doutor em GenØtica (UNICAMP)
Alba Chiesse da Silva
Doutora em CiŒncias Biológicas
(UFSCar)
Pós-doc do Centro de Biologia
Molecular e Engenharia GenØtica
(CBMEG, UNICAMP)
chiesse@unicamp.br
Adilson Leite
Doutor em Bioquímica
Pesquisador do Centro de Biologia
Molecular e Engenharia GenØtica
(CBMEG, UNICAMP)
aleite@unicamp.br
 desenvolvimento de plan-
tas transgŒnicas com no-
vas características Ø consi-
derado uma das mais im-
portantes aplicaçıes da
tecnologia do DNA recombinante. Atra-
vØs dessa tØcnica, as plantas podem ser
geneticamente modificadas, basicamen-
te com duas finalidades: a) melhora-
mento de suas características agronô-
micas e qualidades nutricionais; b) uso
das plantas como reatores biológicos
para a produçªo de biomolØculas.
Inicialmente, as plantas transgŒni-
cas visavam apenas ao melhoramento
agronômico por meio da introduçªo
de genes capazes de conferir resistŒn-
cia a herbicidas e a ataques de insetos
e microorganismos. Atualmente, as
plantas transgŒnicas estªo sendo tam-
bØm exploradas para o desenvolvi-
mento de alimentos que apresentem
conteœdo balanceado de aminoÆcidos,
ou ainda que sejam enriquecidos em
óleos insaturados e vitaminas (Gander
& Marcellino, 1997; Binsfeld, 2000;
Carneiro et al., 2000).
As plantas, assim como os animais
transgŒnicos, podem ser empregadas
como biorreatores para a produçªo de
proteínas, carboidratos e lipídios em
larga escala. Adicionalmente, altera-
çıes genØticas que determinam modi-
ficaçıes em vias metabólicas das plan-
tas podem ser empregadas na produ-
çªo de polímeros ou compostos orgâ-
nicos de baixo peso molecular.O
nœmero de compostos produzidos por
meio dessas abordagens tem aumenta-
do consideravelmente, sendo que a
viabilidade do uso das plantas como
biorreatores jÆ foi demonstrada para a
produçªo de carboidratos, Æcidos gra-
xos, polipeptídios utilizados como fÆr-
macos, enzimas de uso industrial e
plÆsticos biodegradÆveis (Goddijn &
Pen, 1995; Hood & Jilka, 1999).
Por que usar plantas
como biorreatores?
As plantas apresentam vantagens
em potencial em relaçªo aos sistemas
baseados em fermentaçªo microbiana,
cØlulas animais e animais transgŒnicos.
Proteínas heterólogas expressas em
bactØrias geralmente retŒm o resíduo
de metionina, derivado do sistema de
traduçªo, na sua extremidade amino-
terminal. Nas proteínas expressas em
eucariotos, entretanto, essa metionina
geralmente faz parte de sinais de ende-
reçamento específicos, que sªo retira-
dos quando essas proteínas sªo intro-
duzidas no compartimento celular para
o qual foram endereçadas.
AlØm disso, a fermentaçªo bacteri-
ana freqüentemente resulta na produ-
çªo de agregados insolœveis, e sªo
necessÆrios gastos significativos para
solubilizar esses agregados e recuperar
a estrutura da proteína nativa. Por
outro lado, o processo de fermentaçªo
em si requer grandes investimentos de
capital.
Ao contrÆrio dos sistemas bacteria-
nos de expressªo de proteínas, os
sistemas eucarióticos permitem o pro-
cessamento e a modificaçªo dos pro-
dutos. O sistema de expressªo eucari-
ótico mais antigo e mais utilizado ba-
seia-se na utilizaçªo de leveduras, sen-
do as espØcies Saccharomyces cerevi-
sae e Pichia pastoris as mais utilizadas
(Torres & Moraes, 2000). Esses siste-
mas sªo tªo econômicos quanto os
bacterianos, mas as proteínas sintetiza-
das sªo freqüentemente hiperglicosila-
das e, quando produzidas em altos
níveis, sªo instÆveis e insolœveis.
Outros sistemas eucarióticos utili-
zados para a produçªo de proteínas
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 13
heterólogas sªo as culturas de cØlulas
de insetos e de mamíferos infectadas
por vírus recombinantes. Esses vírus
apresentam o gene que codifica a
proteína de interesse controlado por
um potente promotor viral (Fraser,
1992). Esses sistemas sªo capazes de
secretar proteínas corretamente eno-
veladas e podem promover modifica-
çıes pós-traducionais. Por outro lado,
tŒm como desvantagens o requerimen-
to de meios de cultura complexos, de
condiçıes especiais para a manuten-
çªo das cØlulas, e de reatores sofistica-
dos, que encarecem bastante o proces-
so.
Animais transgŒnicos tambØm po-
dem ser utilizados para a expressªo de
proteínas heterólogas em larga escala.
Um dos sistemas descritos baseia-se na
secreçªo de proteínas heterólogas no
leite de caprinos, ovinos e bovinos.
Nesse sistema, a expressªo da proteína
de interesse Ø controlada por promoto-
res que atuam nas cØlulas de glândulas
mamÆrias. Devido à limitaçªo da pro-
duçªo em fŒmeas em fase de lactaçªo,
mØtodos alternativos tŒm sido propos-
tos, nos quais a proteína heteróloga Ø
secretada na urina (Kerr et al., 1998) ou
no fluido seminal (Dyck et al., 1999) de
animais transgŒnicos. Os sistemas ba-
seados em animais transgŒnicos sªo,
no entanto, mais caros que os sistemas
baseados em plantas, e a aceitaçªo do
produto por parte do pœblico consumi-
dor Ø menor quando este tem origem
animal.
As plantas apresentam vias de mo-
dificaçªo e processamento pós-tradu-
cionais, e os custos da produçªo de
proteínas heterólogas em plantas ge-
ralmente sªo menores que os dos de-
mais sistemas. Por essas razıes, o uso
de plantas como biorreatores para a
produçªo de proteínas heterólogas estÆ-
se tornando economicamente impor-
tante. A avidina, glicoproteína encon-
trada em ovos de aves, rØpteis e anfíbi-
os, e utilizada na produçªo de reagen-
tes para imunoensaios, constitui a pri-
meira proteína heteróloga produzida
em plantas jÆ comercializada (Sigma)
(Hood et al., 1997).
As diferentes estratØgias utiliza-
das para a produçªo de proteínas
heterólogas em plantas
Basicamente, duas diferentes estra-
tØgias podem ser utilizadas para a
produçªo de proteínas heterólogas em
plantas. Uma delas baseia-se na utiliza-
çªo de vírus contendo RNA simples
fita, que ocorrem naturalmente nas
plantas. O gene que codifica a proteína
de interesse Ø inserido no genoma do
vírus, geralmente fusionado à regiªo
estrutural de um gene que codifica
uma proteína da capa viral. Depois de
infectar a planta, o vírus promove sua
replicaçªo e a expressªo de seus genes
incluindo o gene que codifica a prote-
ína heteróloga. A expressªo desse gene
Ø transitória, pois ele nªo Ø integrado
ao genoma da planta. Esta, por sua vez,
funciona como um veículo para a am-
plificaçªo das partículas virais (Fig. 1).
A proteína recombinante Ø recuperada
atravØs do processamento da proteína
da capa viral, que Ø purificada a partir
de extratos dos tecidos infectados. Op-
cionalmente, as partículas virais qui-
mØricas purificadas podem ser utiliza-
das diretamente na formulaçªo de va
Figura 1: Representaçªo esquemÆtica das diferentes estratØgias
utilizadas na produçªo de proteínas heterólogas em plantas.
Do lado esquerdo, estªo representadas as etapas envolvidas na
produçªo de proteínas heterólogas em plantas pelo emprego de vírus
carreadores. O gene que codifica a proteína de interesse Ø inserido em
um vetor viral que Ø utilizado na infecçªo de plantas. Após o
desenvolvimento das plantas, os tecidos infectados sªo utilizados como
fonte para extraçªo de vírus recombinantes. Os extratos virais podem
ser utilizados para a amplificaçªo da produçªo, atravØs da infecçªo de
novas plantas. Do lado direito, estªo representadas as etapas envolvidas
na produçªo de proteínas heterólogas em plantas transgŒnicas e
transplastômicas. O gene que codifica a proteína de interesse Ø inserido
em um vetor de transformaçªo apropriado. AlØm do gene de interesse,
geralmente Ø inserido tambØm um gene seletivo, codificador de uma
proteína que confere resistŒncia a um antibiótico ou a um herbicida. A
integraçªo simultânea dos dois genes limitarÆ o desenvolvimento de
cØlulas nªo transformadas, durante a etapa de seleçªo. A partir do tecido
selecionado, sªo regeneradas plantas nas quais a integraçªo do gene de
interesse Ø avaliada por meio da tØcnica de PCR e de hibridaçªo com
sondas específicas. A presença do produto de expressªo do gene de
interesse Ø investigada atravØs de testes bioquímicos e imunoensaios
com anticorpos específicos. Essas anÆlises permitem a seleçªo das
linhagens que apresentam maior rendimento, que serªo multiplicadas
e utilizadas no desenvolvimento de mØtodos de extraçªo e purificaçªo,
e subseqüente caracterizaçªo estrutural e funcional da proteína heteró-
loga.
14 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
cinas orais e nasais
(Beachy et al., 1996).
A segunda estratØ-
gia consiste em intro-
duzir o gene que codi-
fica a proteína de inte-
resse no genoma da
planta por meio de tØc-
nicas de transformaçªo,
envolvendo, portanto,
a obtençªo de plantas
transgŒnicas. O desen-
volvimento de uma
sØrie de tØcnicas de
transformaçªo permi-
tiu a obtençªo de plan-
tas transgŒnicas da mai-
oria das plantas culti-
vadas. Descriçıes de-
talhadas das tØcnicas
mais utilizadas podem
ser encontradas em
Brasileiro & Carneiro
(1998). A integraçªo
estÆvel permite a ex-
pressªo permanente do
gene e sua transferŒn-
cia à progŒnie da plan-
ta transformada (Fig.
1). Enquanto a estratØ-
gia mediada por vírus
determina geralmente
a expressªo apenas em
folhas, a integraçªo
permanente apresenta
maior versatilidade,
permitindo que a ex-
pressªo seja direciona-
da para os diversos
órgªos, tecidos e com-
partimentos das plan-
tas.
A orientaçªo da
expressªo para os di-
versos compartimentos
das plantas transgŒni-
cas Ø realizada atravØs
da utilizaçªo de pro-
motores tecido-especí-
ficose de sinais de
direcionamento intracelulares. Essa ca-
pacidade tem sido explorada no de-
senvolvimento de sistemas de produ-
çªo capazes de simplificar o armazena-
mento do material colhido e os proces-
sos de extraçªo e purificaçªo das pro-
teínas recombinantes. Alguns sistemas
baseiam-se na inserçªo do polipeptí-
dio em proteínas carreadoras. O direci-
onamento da proteína sintetizada, nes-
se caso, Ø realizado pelo peptídio sinal
presente na proteína carreadora. Essa
estratØgia foi utilizada na produçªo de
encefalina inserida na albumina 2S de
Arabidopsis thaliana (Vandekerckho-
ve et al., 1989), e do anticoagulante
hirudina inserido em oleosina (Par-
menter et al., 1995). Os sinais presentes
nas proteínas 2S e oleosina endereçam
a expressªo das proteínas recombinan-
tes para corpœsculos protØicos e lipídi-
cos de sementes, respectivamente. A
grande vantagem do sistema baseado
no uso de oleosinas reside no fato de
que os corpœsculos lipídi-
cos e as proteínas associa-
das, devido à sua baixa
densidade, sªo facilmente
purificados por flotaçªo
após centrifugaçªo em
baixa rotaçªo.
A secreçªo de proteí-
nas heterólogas em exsu-
datos de raízes, a rizose-
creçªo, constitui outro sis-
tema especial de endere-
çamento. Borisjuk et al.
(1999) demonstraram a
eficiŒncia desse sistema
atravØs da expressªo de
altos níveis da proteína
verde fluorescente de Ægua
viva (GFP), da fosfatase
alcalina de placenta hu-
mana, e de uma xilanase
bacteriana. Os sistemas de
rizosecreçªo permitem o
desenvolvimento de pro-
cessos de produçªo base-
ados em cultivo hidropô-
nico e cultura in vitro de
raízes de plantas transgŒ-
nicas. Culturas de raízes
sªo especialmente œteis
para a obtençªo de produ-
tos naturais cujas fontes
sªo plantas difíceis de cul-
tivar ou que estªo em pro-
cesso de extinçªo (Shanks
& Morgan, 1999). A fitor-
remediaçªo de solo e Ægua
representa outra importan-
te e promissora aplicaçªo
para os sistemas de rizose-
creçªo.
As proteínas heterólo-
gas podem ainda ser pro-
duzidas em cloroplastos
de plantas, transformadas
atravØs da introduçªo dos
genes codificadores das
proteínas de interesse no
próprio DNA do cloroplas-
to, por meio de tØcnicas
de biobalística e posterior integraçªo
por recombinaçªo homóloga (Fig. 1).
Para diferenciar essas plantas das plan-
tas transgŒnicas com modificaçıes no
DNA nuclear, as plantas assim obtidas
sªo denominadas de transplastômicas.
O grande nœmero de cloroplastos pre-
sentes nas cØlulas das folhas (aproxi-
madamente 100 por cØlula) determina
grande amplificaçªo gŒnica, podendo
resultar em altos rendimentos na pro-
duçªo da proteína recombinante. A
Figura 2: Comparaçªo da tecido-especificidade dos pro-
motores PCaMV e PGKaf.
Para a realizaçªo desse ensaio foram construídos plasmídios
onde os promotores do gene que codifica o transcrito 35S do
vírus do mosaico da couve flor (PCaMV) e do gene que codifica
a γ-kafirina (proteína de reserva de sorgo) controlam a
expressªo do gene repórter codificador da β-glicoronidase
(GUS). Sementes de milho seccionadas longitudinalmente
foram bombardeadas com os plasmídios e, após 48 horas, a
atividade enzimÆtica de GUS foi revelada com a adiçªo do
substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glicoronídio (Xgluc).
Os pontos azuis, indicativos da atividade de GUS, aparecem
nos diversos compartimentos da semente (EB, embriªo; EN,
endosperma; P, pericarpo) bombardeada pelo plasmídio que
apresenta o promotor P35SCaMV (imagem da esquerda),
enquanto que na semente bombardeada com a construçªo
contendo o promotor PGKaf, os pontos azuis sªo observados
apenas na regiªo do endosperma (imagem da direita). O
ensaio demonstra que, ao contrÆrio do promotor P35SCaMV,
o promotor PGKaf apresenta tecido-especificidade, sendo
ativo apenas no endosperma.
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 15
transformaçªo de cloroplastos apresenta
ainda vantagem em relaçªo à contençªo
biológica, posto que o genoma plastidial
raramente Ø transmitido via pólen. Re-
centemente, Staub et al. (2000) descreve-
ram a obtençªo de rendimentos superio-
res a 7% da proteína total solœvel para a
produçªo de hormônio de crescimento
humano (hGH) em cloroplastos de taba-
co. Entretanto, grande parte do hGH
recombinante produzido apresentou um
resíduo do aminoÆcido prolina na regiªo
N-terminal no lugar do resíduo de fenila-
lanina presente na mesma regiªo do
hormônio natural. Esse resultado indica
que a estratØgia utilizada no processa-
mento, catalisado pela protease específi-
ca para ubiquitina, que Ø produzida si-
multaneamente com a proteína de fusªo
ubiquitina-hGH, nªo apresentou a efici-
Œncia desejada em cloroplastos. Portan-
to, apesar do alto rendimento de expres-
sªo descrito, esse sistema requer aperfei-
çoamento adicional na etapa de proces-
samento pós-traducional das proteínas
recombinantes.
Plantas transgŒnicas na produçªo
de peptídios e proteínas de interes-
se farmacŒutico
A expressªo de proteínas usadas como
fÆrmacos em plantas constitui uma alter-
nativa para processos, muitas vezes
caros e que nem sempre sªo capazes
de suprir a demanda desses produtos.
Vandekerckhove et al. (1989) realiza-
ram um dos trabalhos pioneiros nesse
ramo, onde o neuropeptídio leu-ence-
falina (um analgØsico opióide) foi pro-
duzido em Brassica napus (canola),
como parte de uma proteína de reser-
va da semente, a albumina 2S. Outras
proteínas usadas como fÆrmacos jÆ
foram sintetizadas em plantas, como o
fator de crescimento epidØrmico, eri-
tropoietina, interferon, proteína C hu-
mana, glucocerebrosidase, entre ou-
tras (Goddijn & Pen, 1995; Cramer et
al., 1996).
As plantas transgŒnicas tambØm
estªo sendo testadas para a produçªo
de antígenos vacinais. Enquanto os
sistemas baseados na amplificaçªo de
vírus em plantas apresentam capacida-
de de expressar apenas pequenos do-
mínios antigŒnicos fusionados às pro-
teínas da capa viral, plantas transgŒni-
cas podem expressar antígenos de
maior complexidade estrutural, sem
perda de suas propriedades imunogŒ-
nicas originais. Diversas abordagens
tŒm sido usadas para obtençªo de
vacinas a partir de plantas, sendo as
“vacinas comestíveis” as mais promis-
soras, pela reduçªo nos custos e faci-
lidade de administraçªo, uma vez que
dispensariam todos os recursos neces-
sÆrios para a produçªo e distribuiçªo
das vacinas (Langridge, 2000). Buscan-
do demonstrar que proteínas produzi-
das em plantas transgŒnicas sªo capa-
zes de induzir resposta imune nos
animais, Mason et al. (1992) introduzi-
ram, em tabaco, o gene codificador da
proteína de superfície do vírus da he-
patite B (HBV), ligado a um promotor
constitutivo. Imunoensaios revelaram
a presença da proteína viral em extra-
tos das folhas transformadas, indican-
do a viabilidade da expressªo de antí-
genos exógenos em plantas para uso
em vacinas. Posteriormente, Thanava-
la et al. (1995) demonstraram que a
proteína viral obtida nos extratos das
folhas transformadas era capaz de in-
duzir resposta imune in vivo.
A mesma estratØgia foi utilizada
tambØm na produçªo dos antígenos
vacinais bacterianos toxina termolÆbil
(LT) de Escherichia coli enteropatogŒ-
nica (Haq et al., 1995), e toxina colØrica
(CT) de Vibrio cholerae (Arakawa et
al., 1998). Haq et al (1995) demonstra-
ram a formaçªo espontânea de estrutu-
ras pentamØricas LT-B idŒnticas às na-
turais, em batatas transgŒnicas. Os an-
tígenos recombinantes produzidos em
batatas foram capazes de produzir res-
Figura 3: Expressªo de hGH em tabaco transgŒnico.
 (A) Representaçªo esquemÆtica do cassete utilizado na expressªo do
hGH. O esquema mostra a regiªo que codifica o hGH, modificado atravØs
da substituiçªo do peptídio sinal natural por um peptídio equivalente
originÆrio de uma proteína de reserva de planta. A expressªo do gene
modificado Ø regulada pelo promotor PGKaf e pelo sinal e sítio de
poliadenilaçªodo transcrito 35S do vírus do mosaico da couve flor
(3’35S). (B) Western blot de extratos protØicos de diferentes tecidos de
tabaco transgŒnico. Amostras de extratos dos tecidos indicados, contendo
50 µg de proteína solœvel, foram submetidas a eletroforese em gel de
poliacrilamida 14% na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS). Após
a eletroforese, as proteínas foram transferidas para a membrana, onde a
presença de hGH foi revelada pela utilizaçªo de anticorpo específico. Para
indicar a posiçªo da migraçªo do hGH, foram utilizados 50 ng de Saizen,
hGH comercial da Serono. A presença de banda indicadora de hGH
apenas no extrato de semente confirma a tecido-especificidade nesse
sistema de produçªo do hormônio recombinante. (C) Western blot de
extrato protØico obtido a partir de sementes de milho transgŒnico. O
rendimento na produçªo de hGH recombinante (0,6% da proteína
solœvel) foi estimado pela comparaçªo das quantidades do hormônio
presentes em diferentes alíquotas do extrato de semente com diferentes
quantidades do hGH padrªo (Saizen). O extrato foi preparado a partir de
100 mg de farinha de sementes maduras em 1,0 ml de tampªo de extraçªo.
16 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
posta imune e proteçªo parcial em
camundongos (Mason et al., 1998) e no
homem (Tackett et al., 1998).
Anticorpos ou imunoglobulinas sªo
proteínas multimØricas complexas, que
requerem, para a sua produçªo, siste-
mas eucarióticos de expressªo. A pro-
duçªo de anticorpos em plantas pode
ter aplicaçıes in situ ou ex situ (White-
lam & Cockburn, 1996). As aplicaçıes
in situ compreendem aquelas em que o
anticorpo age como um reagente na
própria cØlula, modulando a atividade
de um antígeno, ou ainda, promovendo
imunizaçªo intracelular contra patóge-
nos. Os anticorpos apresentam uma
grande variedade de aplicaçıes ex situ,
tais como controle de poluiçªo ambien-
tal, produçªo de reagentes industriais,
sensores moleculares, reagentes para
diagnósticos, soros contra toxinas e
venenos, imunizaçªo passiva contra
agentes infecciosos, contraceptivos, te-
rapias contra câncer, entre outras. A
maioria dessas aplicaçıes requer gran-
des quantidades de anticorpos, sendo
sua utilizaçªo limitada pelo rendimento
dos sistemas de produçªo. As plantas
transgŒnicas, alØm de apresentarem al-
tos rendimentos de produçªo, constitu-
em atØ o momento, o œnico sistema de
expressªo capaz de produzir anticorpos
completos funcionais. Esse fato foi efe-
tivamente comprovado atravØs da pro-
duçªo de um anticorpo do tipo IgA em
tabaco (Ma et al., 1995). Com esse
objetivo, esses pesquisadores produzi-
ram quatro diferentes plantas de tabaco
transgŒnicas, cada uma expressando
uma das quatro cadeias polipeptídicas
que compıem um anticorpo monoclo-
nal do tipo IgA. AtravØs de cruzamentos
sucessivos entre essas plantas, obtive-
ram plantas capazes de expressar, si-
multaneamente, as quatro cadeias poli-
peptídicas e de produzir uma imuno-
globulina funcional. Devido à capacida-
de de ligaçªo do anticorpo original com
uma adesina da bactØria Streptococcus
mutans, o anticorpo recombinante, pro-
duzido em larga escala em plantas,
deverÆ ser utilizado na imunizaçªo pas-
siva contra cÆrie, pela sua adiçªo em
dentifrícios.
Produçªo de hormônio do
crescimento humano em
sementes de plantas transgŒnicas
As proteínas recombinantes, de ma-
neira geral, devem ser processadas ime-
diatamente após a colheita, devido à
alta atividade proteolítica da maioria
dos tecidos vegetais. As sementes, por
sua vez, apresentam tecidos especiali-
zados que permitem o armazenamen-
to de proteínas por longos períodos,
sem a ocorrŒncia de degradaçªo. AlØm
disso, o emprego de promotores se-
mente-específicos impede que haja ex-
pressªo generalizada da proteína na
planta, de modo que seus processos
metabólicos bÆsicos nªo sªo significa-
tivamente afetados.
Com o objetivo de explorar as
vantagens da produçªo em sementes,
foi desenvolvido, em nosso laborató-
rio um, cassete de expressªo onde a
expressªo do gene codificador da pro-
teína de interesse Ø controlada pelo
promotor de γ-kafirina. A γ-kafirina,
uma proteína de reserva de sorgo,
acumula-se em grande quantidade na
semente, onde constitui fonte de nitro-
gŒnio e enxofre durante a germinaçªo
(Leite et al., 1999). Conforme demons-
tram os experimentos de expressªo
transiente mostrados na Figura 2, en-
quanto o promotor constitutivo deriva-
do do transcrito 35S do vírus do mosai-
co da couve flor (P35ScaMV) dirige a
expressªo do gene repórter gus para os
diversos compartimentos da semente
de milho, o promotor de γ-kafirina
estimula essa expressªo especificamen-
te no tecido de reserva, o endosperma.
O cassete de expressªo baseado no
promotor de γ-kafirina foi inicialmente
testado na produçªo de hormônio do
crescimento humano (hGH) em se-
mentes de tabaco transgŒnico (Leite et
al., 2000). Com essa finalidade, a se-
qüŒncia de cDNA codificadora do hGH
foi inserida na extremidade 3’ da se-
qüŒncia promotora (Fig. 3A). Na hipó-
fise, o hGH Ø produzido na forma de
um prØ-hormônio que apresenta um
peptídio sinal em sua extremidade
amídica. O peptídio sinal Ø responsÆ-
vel pelo endereçamento da proteína
para o retículo endoplasmÆtico (RE)
determinando, dessa forma a secreçªo
do hormônio. Apesar da existŒncia de
evidŒncias de que sinais de endereça-
mento de animais sªo funcionais em
plantas, no intuito de maximizar seu
processamento na semente o peptídio
sinal original do hGH foi substituído
por um peptídio sinal equivalente ori-
ginÆrio de uma proteína de reserva de
Coix lacryma-jobi, um cereal filogene-
ticamente relacionado ao milho (Leite
et al., 1999).
A anÆlise de extratos protØicos dos
diversos órgªos do tabaco transforma-
do com o cassete de expressªo de-
monstrou a produçªo do hormônio
recombinante especificamente nas se-
mentes (Fig. 3B). O seqüenciamento da
regiªo amídica do hGH purificado a
partir das sementes indicou a presença
de resíduos idŒnticos aos encontrados
no hormônio natural. Esse resultado
demonstra que o peptídio sinal adicio-
nado, de maneira similar ao peptídio
sinal original, pôde ser reconhecido
como um sinal de endereçamento, ten-
do sido adequadamente processado.
Posteriormente, ensaios de ligaçªo a
receptores específicos mostraram que
o hormônio produzido em sementes
de tabaco apresenta propriedades simi-
lares às da proteína nativa, dando uma
clara indicaçªo de sua funcionalidade
(Leite et al., 2000).
O nível de expressªo do hGH re-
combinante obtido em sementes de
tabaco resultou um rendimento de pro-
duçªo de, aproximadamente, 0,16%
das proteínas solœveis da semente. O
baixo rendimento deve-se possivelmen-
te ao fato de um promotor originÆrio de
uma planta monocotiledônea ter sido
usado no controle da expressªo de
genes em tabaco, uma planta dicotile-
dônea. Corroborando com essa hipóte-
se, resultados obtidos recentemente
por nosso grupo demonstram rendi-
mentos superiores (cerca de quatro
vezes) em sementes de milho transgŒ-
nico. Estimativas baseadas nesse rendi-
mento indicam a possibilidade de se
produzir, aproximadamente, 250 g de
hGH a partir de uma tonelada de se-
mente de milho transgŒnico (Fig. 3C).
A baixa complexidade protØica que
caracteriza o endosperma, aliada à re-
duzida solubilidade em Ægua da maio-
ria de suas proteínas, deve facilitar o
desenvolvimento de processos indus-
triais de extraçªo e purificaçªo do hGH
produzido em sementes de milho trans-
gŒnico. Com o objetivo de comparar o
rendimento da produçªo de hGH re-
combinante em sementes de diferentes
espØcies de plantas, a mesma constru-
çªo utilizada na transformaçªo de taba-
co e de milho estÆ sendo testada em
soja. Os experimentos com soja trans-
gŒnica estªo sendo realizados em cola-
boraçªo com os pesquisadores Dr. Elí-
bio L. Rech e Dr. Francisco J. L. Aragªo,
da EMBRAPA-Recursos GenØticos e Bi-
otecnologia(Brasília, DF).
Esse trabalho abriu perspectivas para
a expressªo de outros fÆrmacos de
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 17
interesse econômico em sementes e,
utilizando o mesmo sistema de expres-
sªo, nosso grupo estÆ trabalhando atu-
almente em projetos que visam à ex-
pressªo de insulina humana e de um
anticorpo em sementes de tabaco trans-
gŒnicas.
Agradecimentos
Os autores agradecem o suporte
tØcnico dado por Camilla Abbehausen,
Daniela Stancato e Eduardo Kiyota, e o
trabalho dos alunos de iniciaçªo cien-
tífica FlÆvia Enara Furquin, MÆrio del
Giœdice Paniago e Sylvia Morais de
Sousa. Adilson Leite recebe bolsa de
Produtividade em Pesquisa do CNPq.
Eneida A. Parizotto recebe bolsa do
CNPq, Paulo C. De Lucca, Letícia Jung-
mann e Alba C. da Silva recebem bolsa
da FAPESP. Este trabalho recebe apoio
financeiro da FAPESP atravØs do Proje-
to TemÆtico PTE: 99/02198-3.
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18 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
PESQUISA
Farmacologia de flavonóides no controle hiperlipidŒmico em animais experimentais
FLAVONÓIDES
Fotos/ilustraçıes cedidas pelos autores
Renato Matos Lopes
Mestrando do curso de Agroquímica
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular
Universidade Federal de Viçosa
renato@tdnet.com.br
Tânia Toledo de Oliveira
Doutora, Professora Adjunta do
Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal de
Viçosa
ttoledo@mail.ufv.br
Tanus Jorge Nagem
PhD, Professor Adjunto do Departamento
de Química da Universidade Federal de
Ouro Preto
tjnagen.bh@zaz.com.br
Aloísio da Silva Pinto
Mestre, Professor Assistente do Departa-
mento de VeterinÆria da Universidade
Federal de Viçosa
aloisio@mail.ufv.br
INTRODU˙ˆO
Desordens coronarianas sªo uns dos problemas causados pelo acœmulo de
colesterol, e tŒm sido causa de alta taxa de mortalidade no Brasil, Japªo, Inglaterra,
Estados Unidos e outros países (Truswell, 1984).
A aterosclerose e, em particular, a cardiopatia coronÆria, relaciona vÆrios
fatores de risco, tais como: idade, sexo, obesidade, estresse emocional, baixos
níveis de colesterol -HDL, fumo, dietas ricas em gordura saturada e ainda
problemas genØticos. A importância de todos esses fatores derisco Ø correlacio-
nada com o aumento dos níveis de colesterol no sangue, assim como as atividades
pró-oxidantes de radicais livres sobre as lipoproteínas de baixa densidade (LDL)
no nível endotØlio. O consumo de gorduras saturadas aumentam os valores do
colesterol na corrente sangüínea, impedindo a atividade dos receptores de LDL e,
conseqüentemente, dificultando a sua eliminaçªo (Leite, 1994).
Níveis elevados de colesterol-HDL estªo associados com a diminuiçªo de risco
da cardiopatia coronariana; seu efeito Ø oposto ao colesterol-LDL, uma vez que
este transporta o colesterol para os tecidos, enquanto o HDL atua no transporte
do colesterol em excesso para o fígado. O quociente colesterol LDL/colesterol-
HDL Ø um indicativo confiÆvel de risco aterogŒnico. Nas populaçıes onde sªo altas
as concentraçıes tanto do LDL como do HDL, os indivíduos com menores níveis
de HDL estªo mais susceptíveis a padecer de cardiopatia coronariana. Ainda que
os níveis de HDL possam estar condicionados geneticamente, a alimentaçªo Ø um
fator determinante (Feinleb, 1984).
As partículas de HDL facilitam o transporte de colesterol dos tecidos perifØricos
ao fígado, para sua excreçªo. Os Æcidos saturados nªo reduzem os níveis de
colesterol-HDL, mas aumentam a concentraçªo de colesterol-LDL. A maioria das
investigaçıes epidemiológicas mostram uma correlaçªo positiva entre as concen-
traçıes sØricas de triacialgliceróis e a cardiopatia coronariana (Feinleb, 1984).
A reduçªo nas concentraçıes plasmÆticas de lipoproteínas LDL, VLDL podem
diminuir o risco do infarto do miocÆrdio (Lipid Research, 1984).
O esquema 1 apresenta a formaçªo de uma placa aterosclerótica. Partículas de
LDL e plaquetas penetram no endotØlio e causam lesıes (1). Fatores de
crescimento liberados pelas plaquetas estimulam as cØlulas musculares abaixo do
endotØlio, causando proliferaçªo no sítio da lesªo. Todo processo Ø acompanhado
pela migraçªo de monócitos e outras partículas de LDL (2), conseqüentemente,
ocorre a formaçªo de cØlulas espumosas (3). Desenvolve-se, entªo uma aglome-
raçªo na regiªo de fosfolipídios, colesterol e cÆlcio e, gradualmente, ocorre o
endurecimento deste, formando saliŒncias fibrosas e resistentes que sªo as placas
de ateroma.
Como prevençªo da doença arterial coronariana, Ø comum o uso de fÆrmacos
hipolipemiantes como adjuvantes da dietoterapia para pacientes com dislipopro-
teinemia. A busca de novos fÆrmacos que possam atuar em uma reduçªo dos níveis
de colesterol tem sido motivo de novas pesquisas.
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 19
FLAVONÓIDES
Os flavonóides compıem uma
ampla classe de substâncias de ori-
gem natural, cuja síntese nªo ocor-
re na espØcie humana. Entretanto,
tais compostos possuem uma sØrie
de propriedades farmacológicas que
os fazem atuar sobre sistemas bio-
lógicos. Conseqüentemente, mui-
tas dessas propriedades atuam de
forma benØfica para a saœde huma-
na. Atualmente, jÆ foram
identificadas mais de quatro mil
substâncias pertencentes ao grupo
dos flavonóides (Peterson & Dwyer,
1998)
.
Estruturalmente, os flavonóides
constituem substâncias aromÆticas
com 15 Ætomos de carbono (C
15
) no
seu esqueleto bÆsico, sendo com-
postos fenólicos, que possuem nes-
sa estrutura anØis aromÆticos C
6
-C
3
-
C
6
. O esqueleto C
15
 dos flavonóides
Ø biogeneticamente derivado do
fenilpropano (C
6
-C
3
) e trŒs unida-
des de acetato (C
6
). Portanto,
flavonóides sªo derivados de ben-
zo-gama-pirona de origem vegetal
(Yokozawa et al, 1997), podendo
haver facilmente interconversªo
entre eles (vide figura 1).
A explicaçªo para a existŒncia
de uma grande diversidade estrutu-
ral dos flavonóides Ø explicada pelas
modificaçıes que tais compostos
podem sofrer, tais como:
hidroxilaçªo, metilaçªo, acilaçªo,
glicosilaçªo, entre outras (Koes et
al, 1994).
Consumidos em grandes pro-
porçıes dentro de uma dieta huma-
na regular, os flavonóides sªo en-
contrados em vegetais, legumes,
frutas, chÆs de ervas, mel, entre
outros produtos de consumo coti-
diano.
Apesar do termo “flavonóide”
derivar do latim flavus, que signifi-
ca amarelo, observa-se que os gru-
pos flavonóis e flavonas sªo incolo-
res e que a classe das antocianinas
possuem substâncias que variam
no seu espectro de coloraçªo do
verde ao azul. A tabela 1 apresenta
algumas das principais classes de
flavonóides, assim como alguns dos
seus principais representantes e
características.
Propriedades farmacológicas
dos flavonóides
Diversos ensaios “in vivo” e “in
vitro” vŒm comprovando e determi-
nando a ampla variedade das ativida-
des biológicas dos compostos flavo-
noídicos. Segundo Ratty & Das (1998),
algumas dessas propriedades farma-
cológicas jÆ foram observadas por
Szent-Gyorgi em 1936. Destacam-se,
dentre outros, os seguintes efeitos
dos flavonóides sobre os sistemas
biológicos: capacidade antioxidativa
(esta constitui a atividade mais eluci-
dada pelos estudos atØ agora desen-
volvidos); atividades antiinflamatória
e de efeito vasodilatador; açªo antia-
lØrgica; atividade contra o desenvol-
vimento de tumores, anti - hepatotó-
xica, antiulcerogŒnica; atuaçªo anti-
plaquetÆria, bem como açıes antimi-
crobianas e antivirais. Pesquisas re-
centes demonstraram que alguns fla-
vonóides atuam na inibiçªo da repli-
caçªo viral do agente causador da
Síndrome da ImunodeficiŒncia Hu-
mana – HIV (Lin et al. 1997).
Sabe-se que os flavonóides po-
dem inibir vÆrios estÆgios dos proces-
sos que estªo diretamente relaciona-
dos com o início da aterosclerose,
como ativaçªo de leucócitos, adesªo,
agregaçªo e secreçªo de plaquetas
(Hladovec, 1986b), alØm de ativida-
des hipolipidŒmicas (Lin et al, 1986)
e aumento de atividades de recepto-
res de LDL (Kirk et al, 1998).
Segundo Anton & Beretz (1990),
as propriedades farmacológicas dos
flavonóides ainda nªo haviam sido
totalmente avaliadas. Após uma dØ-
cada de avanços nessa linha de pes-
quisa, pode-se afirmar que novos
estudos toxicológicos e farmacológi-
cos devem ser realizados, uma vez
que a ampla diversidade estrutural
desses compostos - bem como a
capacidade de interaçªo com outras
substâncias - nos reporta a imaginar
que novas descobertas ainda podem
e devem ser realizadas.
Com o objetivo de se avaliar a
açªo hipolipidŒmica de flavonóides e
de corantes naturais em animais ex-
perimentais com hiperlipidemia in-
duzida, o laboratório de BiofÆrmacos
da Universidade Federal de Viçosa
vem desenvolvendo uma sØrie de
estudos para conhecer o potencial
farmacológico desses compostos.
A seguir, sªo descritas algumas
metodologias empregadas pelo labo-
ratório de BiofÆrmacos da Universi-
dade Federal de Viçosa, utilizando-se
coelhos com hiperlipidemia induzi-
da a partir de uma dieta rica em Æcido
cólico e colesterol ou aplicaçªo de
Triton:
METODOLOGIA GERAL.
Considerando-se um nœmero de-
terminado de coelhos machos, albi-
nos, adultos, da Raça Nova Zelândia
(com peso mØdio de 2500 ± 200g),
dispostos em gaiolas individuais com
temperatura local que varia entre 22
± 3 0 C, e taxa de umidade relativa do
ar situada na faixa de 70%. Esses
animais sªo submetidos a uma dieta
com raçªo comercial SOCIL, na pro-
porçªo de 130 g ao dia e Ægua potÆvel
ad libitum ( figura 2).
Após o período de adaptaçªo às
condiçıes locais, os animais sªo or-
Esquema 1: Formaçªo da
placa aterosclerótica
20 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
denados em grupos, de acordo com
o tratamento a ser aplicado: a) Grupo
controle; b) Controle + substâncias
indutoras de hipercolesterolemia; c)
Controle + substâncias indutoras de
hipercolesterolemia + substâncias –
teste (flavonóides ou medicamen-
tos). Os tratamentos sªo efetuados
durante períodos predeterminados
de tempo e, normalmente o trata-
mento dos animais Ø realizado por
via oral atravØs de cÆpsulas (figura 3).
Amostrasde sangue sªo retiradas
antes, durante e após o tratamento
desses animais para verificaçªo e
acompanhamento dos efeitos dos tra-
tamentos sobre os constituintes lipí-
dicos, o sangue retirado Ø centrifuga-
do a 7100 G por 15’, para obtençªo do
soro. As dosagens sorológicas sªo
realizadas e os resultados do coleste-
rol, do colesterol-HDL e dos triacilgli-
ceróis sªo obtidos por meio de Kits
Biolab no equipamento multipara-
mØtrico AlizŒ (figura 4).
As substâncias utilizadas como
indutores das hiperlipidemias sªo:
colesterol a 1% e Æcido cólico 0,1%
misturados à raçªo, assim como a
aplicaçªo intraperitonial de Triton
WR 1339 na dose de 300mg/kg de
peso corporal do animal, utilizando
como veículo NaCl 0,9%.
Triton Ø tambØm conhecido como
tyloxapol, um detergente nªo aniôni-
co de estrutura polimØrica da Sigma,
cuja utilizaçªo vem sendo ampla-
mente empregada para promover hi-
perlipidemia em cobaias (Mathur et
al., 1964; Sharma, 1979; Choi et al.,
1991).
RESULTADOS OBTIDOS
Nossos trabalhos demonstram que
naringenina e chitosan tŒm efeitos
sobre lipídios no soro de coelhos
com hiperlipidemia induzida por Tri-
ton. Certificou-se, inclusive, que a
associaçªo entre naringenina e chis-
tosan foram mais eficazes no controle
do metabolismo lipídico. Os resulta-
dos obtidos demonstram que, em um
efeito sinØrgico das duas substâncias-
teste, promovem uma reduçªo de
71,42% de triacilgliceróis, em compa-
raçªo com o grupo de animais que
apresentaram hiperlipidemia induzi-
da pelo Triton ( Lopes, 2000).
O flavonóide Naringina associado
à antocianina e ao carmim (corantes
naturais utilizados na indœstria de
alimentos) reduziram em atØ 70,21%
os triacilgliceróis e em 63,01% os
níveis de colesterol em ratos hiperli-
pidŒmicos, atravØs de Triton. Narin-
gina e antocianinas foram tambØm as
responsÆveis pelo acrØscimo de
15,27% de colesterol – HDL, quando
comparado aos animais tratados ape-
nas com a raçªo e o indutor ( Nagem
et al., 1999). Dessa forma, a associa-
çıes entre naringina/antocianina e
naringina/carmim demonstraram alta
eficiŒncia na reduçªo dos níveis de
colesterol e triacilglicerol.
Os flavonóides quercetina, mori-
na e o medicamento Æcido nicotínico,
empregados de forma isolada e asso-
ciada, apresentaram açªo no metabo-
lismo lipídico em ratos machos hiper-
lipidŒmicos (Santos et al. 1999a). Os
resultados mostraram uma reduçªo
de 83,77% de triacilgliceróis e 76,89%
de colesterol, quando se empregou
um tratamento conjunto de morina e
Æcido nicotínico. Quercetina e Æcido
nicotínico promoveram uma varia-
çªo positiva em 21,96% para o coles-
terol-HDL.
O Æcido nicotínico Ø um medica-
mento empregado de forma usual no
controle de níveis de lipídios no
organismo. Açıes hipolipidŒmicas
desse medicamento decorrem da ini-
biçªo da lipólise do tecido adiposo,
mobilizaçªo dos Æcidos graxos, redu-
çªo da esterificaçªo dos triacilglice-
róis no fígado e aumento da lipase
Figura 1: Interconversªo dos principais grupos de flavonóides.
Adaptado de Domingues (1973)
FIGURA 2: Coelho da Raça Nova
Zelândia confinado em gaiola
individual durante o tratamento
com a substância-teste
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 21
lipoprotØica ( Goodman & Gilman’s,
1996).
Diversos compostos flavonoídi-
cos de diferentes plantas, que foram
extraídos, isolados, identificados e
quantificados, foram transformados
quimicamente e empregados em en-
saios biológicos para avaliaçıes dos
seus potenciais farmacológicos sobre
lipídios em ratos (Santos et al, 1999b;
CLASSES
Antocianinas
Flavanas (mono,
bi e triflavans)
Flavanonas
Flavonas
Flavonóis
Isoflavonóides
COLORA˙ˆO
Azul, vermelha e
violeta
Incolor
Incolor para um
amarelo pÆlido.
Amarelo pÆlido
Amarelo pÆlido
Incolor
EXEMPLOS
Cianidina;
Delfinidina;
Peonidina.
Catequina;
Epicatequina
Luteoforol;
Procianidina.
Theaflavina
Hesperidina;
Naringenina.
Apigenina;
Luteolina;
Diosmetina;
Tangeretina;
Nobiletina
Quercetina;
Rutina;
Mircetina;
Kaempherol
Daidzeína;
Genisteína.
COMENT`RIOS
Antocianinas estªo predominantemente em frutas e flores
e provavelmente foram os primeiros flavonóides a serem
isolados – provenientes de pigmentos florais, conforme
indicam seus próprios nomes. Sªo usadas como corantes.
Flavanas sªo encontradas em frutas e chÆs (verdes ou
pretos). Biflavanas sªo encontradas em frutas, lœpulo,
nozes e bebidas como chÆs e Ægua de coco. O sabor
peculiar de algumas bebidas, frutas, chÆs e vinhos Ø
devido, principalmente, à presença das biflavanas.
Flavanonas sªo encontradas quase que exclusivamente em
frutas cítricas.
Flavonas sªo encontradas quase que exclusivamente em
frutas cítricas. Mas tambØm em cereais, frutas, ervas e
vegetais. Conferem o pigmento amarelo em flores. Os
compostos mais comuns sªo a apigenina e a luteolina.
Os flavonóis estªo presentes em diversas fontes, sendo
predominantes em vegetais e frutas. A quercetina Ø o
principal representante da classe.
Isoflavonóides sªo encontrados quase que exclusivamente
em legumes, particularmente na soja.
Fonte: Adaptado de Peterson & Dwyer, 1998
Tabela 1: Principais classes de flavonóides e descriçªo de suas características bÆsicas
Nagem et al, 1995; Santos et al,
1999c).
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos demons-
tram reduçıes estatisticamente sig-
nificativas para os níveis de coles-
terol e de triacilgliceróis, assim
como aumento dos valores de co-
lesterol-HDL, destacando-se, inclu-
sive, efeitos sinØrgicos dos com-
postos flavonoídicos testados.
Dessa forma, Ø fundamental o de-
senvolvimento de novas pesqui-
sas sobre o potencial dos flavonói-
des no tratamento e na prevençªo
das hiperlipidemias, uma vez que
a obtençªo de novos resultados
servirªo de instrumentos para a
utilizaçªo desses produtos na pre-
vençªo de doenças cardiovascula-
res.
As interaçıes com outros nœ-
cleos de pesquisas para o desen-
volvimento de novas metodologi-
as de anÆlises permitirªo aprofun-
dar os conhecimentos sobre os
FIGURA 4: Equipamento
AlizŒ (Analisador AutomÆtico
de Bioquímica), capaz de
realizar anÆlises de concentra-
çıes de constituintes
sangüíneos, aproximadamen-
te 180 testes/hora
FIGURA 3: Recipiente lacrado
e identificado contendo as
cÆpsulas com a substância-teste
a ser utilizada durante o ensaio
biológico
mecanismos de açıes desses com-
postos naturais, assim como obter
novas avaliaçıes de suas proprieda-
des farmacológicas.
Evidencia-se tambØm a importân-
cia e a aplicabilidade de avaliaçıes
de toxicidade de flavonóides sobre
sistemas biológicos. Essa afirmaçªo
reside no fato de que ensaios toxico-
lógicos permitirªo o emprego de doses
22 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
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seguras dos flavonóides como fÆr-
macos.
O laboratório de biofÆrmacos da
Universidade Federal de Viçosa pos-
sui interesse em interagir com ou-
tros nœcleos de pesquisa, que, por-
ventura, tenha como objetivo estu-
dos farmacológicos e toxicológicos
de flavonóides, corantes naturais ou
outros produtos de origem natural.
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 23
Anúncio COBRAFI
Conselho Brasileiro de
Fitossanidade
(REPETE FOTOLITO)
Obs.: Saiu na página 37 da edição anterior nº 16
24 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
SAÚDE
Resposta imune e proteçªo induzida por vacinas de BCG recombinante-DTP
Vacinas de BCG Recombinante-DTP
Fotos cedidas pelos autores
Waldely Oliveira Dias
PhD pela Escola Paulista de Medicina –
Pesquisadora do Instituto Butantan –
Centro de Biotecnologia.
RogØrio Pietro Mazzantini
Centro de Biotecnologia - Instituto
Butantan
Mestrando do Curso Interunidades em
Biotecnologia.
Eliane Namie Miyaji
PhD pela Universidade de Sªo Paulo, Pós-
Doutoranda no Instituto Butantan –
Centro de Biotecnologia.
Ivan Pereira Nascimento
Doutorando do Departamento de
Bioquímica - Instituto de Química – USP.
Centro de Biotecnologia, Instituto
Butantan.
Denise Silvina Piccini Quintas
Horton
PhD pela Escola Paulista de Medicina –
Pesquisadora do Instituto Butantan
Luciana Cezar de Cerqueira Leite
PhD pela Universidade de Sªo Paulo –
Pesquisadora do Instituto Butantan
lccleite@quim.iq.usp.br
A imunoprofilaxia, ou vacinaçªo, Ø
a medida mais eficiente e menos one-
rosa na prevençªo de doenças infecci-
osas. A erradicaçªo da varíola e o
sucesso com a tríplice (DTP - difteria,
tØtano e pertussis, ou tosse comprida)
e com a Sabin sªo provas contunden-
tes da importância desses programas
de vacinaçªo. No entanto, fatores cul-
turais, sociais e econômicos dificul-
tam a realizaçªo de diversas campa-
nhas de vacinaçªo, especialmente em
países em desenvolvimento, onde os
sistemas de saœde sªo por vezes defi-
citÆrios. Essa conjuntura levou a co-
munidade científica a um esforço para
desenvolver vacinas multivalentes. Em
especial, procuram-se veículos vivos
de apresentaçªo de antígenos, uma
vez que a expressªo contínua do imu-
nógeno poderia eliminar a necessida-
de de vÆrias doses de reforço para se
alcançar uma proteçªo mÆxima, o que
Ø o caso de vÆrias vacinas atualmente
em uso. Veículos que tŒm sido parti-
cularmente investigados sªo: Vaccí-
nia, Salmonella atenuada, ou BCG
(Bacilo Calmette-Guerin, vacina con-
tra a tuberculose), com resultados em-
polgantes (1).
O Bacilo de
Calmette-Guerin, BCG
Albert Calmette e Camille Guerin,
trabalhando no Instituto Pasteur, de
Lille, no início do sØculo, atenuaram
uma cepa virulenta de Mycobacterium
bovis ao longo de 13 anos com 215
passagens sucessivas. A imunizaçªo
com essa cepa foi entªo testada em
diversas espØcies de animais experi-
mentais para demonstrar que, alØm de
nªo ocorrer reversªo para a virulŒn-
cia, tambØm conferia resistŒncia a um
desafio subseqüente com M.bovis vi-
rulento ou M.tuberculosis. Essa cepa,
hoje conhecida como Bacilo de Cal-
mette-Guerin, ou BCG, foi utilizada
oralmente, pela primeira vez, em 1921,
e sua aplicaçªo generalizada foi reco-
mendada pela Liga das Naçıes, em
1927.
Hoje o BCG Ø a vacina mais utiliza-
da no mundo, tendo jÆ sido adminis-
trada a 3 bilhıes de indivíduos, com
uma freqüŒncia baixíssima de efeitos
adversos sØrios. Isso torna o BCG um
bom candidato a veículo para apre-
sentaçªo de antígenos heterólogos,
tendo em vista a possível validaçªo de
uma vacina recombinante baseada em
BCG. Uma vacina multivalente, que
utilize BCG como veículo vivo, apre-
sentaria vÆrios outros fatores vantajo-
sos, como: I) o BCG Ø a œnica vacina
recomendada pela WHO (Organiza-
çªo Mundial da Saœde) para ser admi-
nistrada ao nascimento; II) requer ape-
nas uma imunizaçªo para conferir
imunidade celular duradoura, pois o
BCG pode permanecer no organismo
por anos (dependendo do indivíduo)
- a apresentaçªo contínua dos antíge-
nos eliminaria a necessidade de pro-
gramas de vacinaçªo seqüenciais, que
Ø o caso de diversas vacinas em uso
atualmente; III) seu processo de pro-
duçªo Ø de baixo custo, sendo vendi-
da atualmente a apenas 55 centavos
de dólar; IV) o BCG Ø um dos mais
efetivos adjuvantes conhecidos para
induçªo de imunidade celular em ani-
mais e humanos; e V) estudos recen-
tes tŒm reanalisado a possibilidade de
uma vacinaçªo oral com BCG, de-
monstrando a induçªo de respostas
humorais e celulares, inclusive em
tecidos mucosos. Todas essas vanta-
gens favorecem o uso da cepa viva
atenuada de BCG como veículo mul-
tivacinal para a induçªo de imunidade
humoral e celular contra diversos pa-
tógenos (2, 3).
BCG recombinante
MicobactØrias como M.tuberculosis
ou BCG infectam macrófagos e po-
dem sobreviver por longos períodos
no seu interior, estimulando continu-
amente o sistema imune. VÆriosestu-
dos tŒm demonstrado que BCG re-
combinante expressando proteínas
heterólogas pode induzir os 3 tipos de
resposta imune necessÆrios para pro-
teçªo contra vÆrios patógenos: I) pro-
duçªo de anticorpos IgG por cØlulas
B; II) proliferaçªo de linfócitos T e
produçªo de linfocinas, inclusive in-
terferon-gama (IFN-γ); III) e produçªo
de linfócitos T-citotóxicos, com restri-
çªo por classe I do complexo princi-
pal de histocompatibilidade (Figura
1). Antígenos de diversos patógenos
virais, bacterianos e de parasitas, como
HIV, Streptococcus pneumoniae, Clos-
tridium tetani, Borrelia burgdorferi,
Plasmodium falciparum, Schistosoma
mansoni, etc, foram expressos em
BCG recombinante, induzindo res-
postas humorais e/ou celulares e, em
alguns casos, levando à proteçªo con-
tra um desafio com o patógeno (2,3).
A Vacina Tríplice - DTP
A vacina tríplice - DTP convencio-
nal mostrou-se extremamente eficien-
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 25
te no controle de infecçıes por difte-
ria, tØtano e pertussis (tosse compri-
da), quando a vacinaçªo completa Ø
alcançada. Essa vacina Ø constituída
de anatoxina diftØrica e anatoxina te-
tânica (as respectivas toxinas detoxifi-
cadas por tratamento químico) e por
cØlulas inteiras de Bordetella pertussis,
quimicamente inativadas. Um incon-
veniente na tecnologia utilizada na
produçªo da vacina tríplice Ø a neces-
sidade de manipulaçªo de grandes
quantidades de material tóxico na pre-
paraçªo de cada um dos componen-
tes. Embora essa vacina seja muito
eficiente, algumas vezes tem sido rela-
cionada a efeitos colaterais indesejÆ-
veis. AlØm disso, Ø necessÆria a aplica-
çªo de diversas doses para se alcançar
a proteçªo mÆxima, o que pode levar
a uma cobertura reduzida, especial-
mente em países em desenvolvimen-
to. Assim, a cobertura mundial para
vacinaçªo com DTP, que estava esta-
cionada hÆ anos em 80%, em 1998
caiu para 74%, sendo a baixa cobertu-
ra concentrada nos países em desen-
volvimento. Isso significa que 1 em
cada 4 crianças no mundo nªo estÆ
coberta contra esses patógenos, resul-
tando em uma mortalidade anual de
quase 1 milhªo de crianças (4). Por-
tanto, existe um esforço para a aplica-
çªo de novas tecnologias para o de-
senvolvimento de vacinas contra tØta-
no, difteria e pertussis, buscando-se
alternativas para reduçªo do nœmero
de doses necessÆrias. A utilizaçªo de
vetores vivos de apresentaçªo de an-
tígenos poderia ser, neste caso, extre-
mamente vantajoso.
BCG recombinante - DTP
O objetivo deste trabalho consiste
em desenvolver uma vacina multiva-
lente, utilizando BCG como veículo
vivo para apresentaçªo de antígenos
de difteria, tØtano e pertussis. Utiliza-
mos os seguintes antígenos: I) para a
fraçªo diftØrica, o CRM 197, toxina
diftØrica, com uma mutaçªo que elimi-
na sua atividade tóxica, mas mantØm
a sua imunogenicidade (gentilmente
cedido pelo Dr. Rino Rappuoli, Bioci-
ne, ItÆlia); II) para a fraçªo tetânica, o
fragmento C da toxina tetânica (FC),
que se tem mostrado atóxico e imuno-
gŒnico (clonado pela Dra. Ana Lucia
T.O. Nascimento, Instituto Butantan);
e III) para a fraçªo pertussis, o gene da
Subunidade 1 da toxina pertussis
(S1PT), com 2 mutaçıes que a tornam
atóxica, porØm mantendo sua imuno-
genicidade (PT-9K/129G) (fornecido
pelo Dr. Rino Rappuoli).
No desenvolvimento de uma vaci-
na de BCG recombinante, a expressªo
da proteína heteróloga pode ser
conseguida atravØs de um vetor de
expressªo extracromossomal ou a par-
tir de um vetor integrativo, sendo que
o primeiro, em geral, leva a maiores
níveis de expressªo e o segundo, a
expressªo mais estÆvel. Os vetores de
expressªo extracromossomais tŒm sido
mais utilizados, sendo vetores-ponte
com origem para replicaçªo em mico-
bactØria e em Escherichia coli, onde Ø
realizada toda a manipulaçªo genØtica
dos vetores. Os vetores de expressªo
devem ter um marcador de seleçªo
para isolar os transformantes, onde se
usa em geral um gene de resistŒncia a
antibiótico. O gene que tem sido mais
usado Ø o gene Tn903, que confere
resistŒncia a kanamicina, uma vez que
as micobactØrias sªo naturalmente re-
sistentes a antibióticos β-lactâmicos
(3).
O nível de expressªo e localizaçªo
dos antígenos sªo fatores importantes
para o nível de resposta imune indu-
zida. Sªo os promotores que regem o
nível de expressªo. Os promotores
micobacterianos que tŒm sido mais
utilizados sªo os promotores das pro-
teínas de choque tØrmico, hsp60 e
hsp70. Mais recentemente, outros pro-
motores tŒm sido utilizados para a
expressªo de proteínas heterólogas,
como o promotor pAN, isolado de
M.paratuberculosis; os promotores dos
antígenos de 18kDa, 19kDa e 85A, de
M.tuberculosis, e o promotor mutado
da β-lactamase de M.fortuitum, pBlaF*.
Outro fator importante na resposta
imune induzida Ø a localizaçªo do
antígeno heterólogo. A fusªo com
seqüŒncias sinais de exportaçªo de
diferentes proteínas de micobactØria
pode levar à exportaçªo dos antíge-
nos e, conseqüentemente, à alteraçªo
na resposta imune induzida (2,3).
Nós utilizamos vetores de expres-
sªo que contŒm o promotor pBlaF*,
que levou a elevada expressªo de
antígenos de outros patógenos, com
ou sem a seqüŒncia sinal de exporta-
çªo da β-lactamase (ssBlam) (gentil-
mente cedidos pela Dra. Brigitte Gic-
quel, Instituto Pasteur, Paris), que os
direcionaria à exportaçªo. Assim, o
vetor pJEM17 leva à expressªo do
gene nativo e o vetor pLA71 coloca o
gene em fusªo com ssBlam (Figura 2).
Abordagem Experimental
A Figura 3 ilustra a abordagem
experimental utilizada. Os genes dos
antígenos heterólogos de tØtano, dif-
teria e pertussis, respectivamente, FC,
CRM197 e S1PT, foram amplificados
por PCR a partir de plasmídeos con-
tendo os genes e clonados nos vetores
de expressªo em micobactØria con-
tendo o promotor pBlaF*, pJEM17 e
pLA71, sem fusªo e com fusªo com a
seqüŒncia sinal da β-lactamase, res-
pectivamente. BCG eletrocompeten-
tes foram transformados por eletropo-
raçªo e plaqueados em meio sólido
para crescimento de micobactØria con-
tendo kanamicina (o plasmídeo con-
tØm o gene de resistŒncia a este anti-
biótico) para seleçªo dos transfor-
mantes.
Colônias de BCG recombinante
resistentes à kanamicina, portanto con-
tendo os vetores, foram cultivadas em
meio líquido, tambØm contendo ka-
namicina. Uma parte foi utilizada para
preparaçªo de extratos protØicos por
sonicaçªo e extraçªo com detergente
SDS e outra parte foi utilizada para
Tabela 1: SobrevivŒncia de
camundongos imunizados com
rBCG-S1PT contra desafio com B.
pertussis virulentaa
Grupo SobrevivŒncia
Salina 1/10
rBCG-S1PT 8/10
DTP 9/10
a Grupos de 10 camundongos
imunizados 2 semanas antes com
106 CFU/0,5 ml of rBCG-S1PT, ou
o controle negativo recebendo 0,5
ml de salina e o controle positivo
recebendo 0,4 ml de DPT, foram
submetidos a desafio intracerebral
com uma dose letal de cepa
virulenta de B. pertussis. A
sobrevivŒncia foi monitorada por
17 dias.
26 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
preparaçıes vacinais congeladas em
glicerol a -80º C. Os extratos protØicos
foram analisados por eletroforese em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e
por Western blot (reaçªo com anticor-
pos específicos), para verificaçªo da
expressªo dos antígenos heterólogos.
Na revelaçªo dos Western blots, foram
utilizados anticorpos específicos: I)
soro policlonal anti-anatoxina tetâni-
ca e II) anti-anatoxina diftØrica produ-
zido em cavalos no Instituto Butantan,
e III) anticorpos monoclonais anti-
toxina pertussis (cedidos pelo Dr. Yuji
Sato, NIH, do Japªo). A localizaçªo
dos antígenos foi verificada por extra-
çªo diferencial com detergente Triton
X-114, em que se separam as fraçıes
de citosol (aquosa), membrana celular
(detergente) e parede celular (insolœ-
vel) (5).
Preparaçıes vacinais de clones de
BCG recombinante que expressaram
os antígenos heterólogosforam, en-
tªo, administrados intraperitonealmen-
te em grupos de 5 a 10 camundongos
Balb/c, NIH, ou Swiss, a uma dose de
106 unidades formadoras de colônia
(CFUs) em 0,5 mL de salina apirogŒn-
cia (Figura 3). Foram tambØm admi-
nistrados: salina, BCG e BCG conten-
do os vetores vazios, como grupos
controles negativos e DTP, como con-
trole positivo. Os camundongos fo-
ram sangrados por via retro-orbital a
cada 30 dias por atØ 6 meses. A indu-
çªo de resposta imune humoral foi
avaliada por ELISA, onde se verificou
a presença de anticorpos homólogos
específicos contra os antígenos nos
soros dos camundongos imuniza-
dos. Para as preparaçıes de BCG-
S1PT, avaliou-se tambØm a induçªo
de resposta imune celular específica
contra toxina pertussis (PT), dosan-
do-se a liberaçªo de IL-4 e IFN-γ por
linfócitos esplŒnicos isolados dos ca-
mundongos imunizados, após estí-
mulo com toxina pertussis detoxifi-
cada (dPT).
Camundongos imunizados com
as diferentes vacinas de BCG recom-
binante expressando os antígenos
de difteria, tØtano e pertussis, foram
entªo submetidos a ensaios para ve-
rificaçªo do nível de proteçªo indu-
zida. A proteçªo contra tØtano Ø
verificada pela capacidade do soro
de camundongos vacinados em neu-
tralizar a toxina tetânica ativa. O
ensaio pode ser in vivo, onde a
toxina tetânica Ø administrada aos
camundongos vacinados, ou in vitro
onde a toxina Ø misturada com o
antissoro e o complexo administra-
do em camundongos nªo vacinados.
Verifica-se a sobrevivŒncia dos ani-
mais por 4 dias. A proteçªo contra
difteria Ø avaliada pela capacidade
de soroneutralizaçªo da toxina diftØ-
rica in vitro, verificando a toxicidade
da mistura toxina-antissoro aplicada
sobre culturas de cØlulas de mamífe-
ro (CØlulas Vero). A sobrevivŒncia
das cØlulas Ø avaliada após 3 dias. A
proteçªo contra pertussis Ø avaliada
pela sobrevivŒncia dos camundon-
gos imunizados após desafio intrace-
rebral com cepa virulenta de Borde-
tella pertussis, seguida por 14 dias.
Resultados:
Expressªo dos Antígenos
Heterólogos em rBCG
Os vetores de expressªo de mico-
bactØria contendo os antígenos de
tØtano, difteria e pertussis foram ele-
troporados em BCG e as colônias
resistentes à kanamicina, seleciona-
das e cultivadas para a preparaçªo de
extratos protØicos e lotes de vacinas.
Os extratos protØicos foram analisa-
dos por Western blot.
Os extratos protØicos de clones de
BCG recombinante (rBCG) transfor-
mados com os vetores contendo o
gene FC, sem ou com fusªo com
ssBlam, respectivamente, rBCG-JFC e
rBCG-LAFC, mostraram expressªo da
proteína heteróloga por Western blot
revelado com antissoro anti-anatoxi-
na tetânica, com os respectivos pesos
moleculares esperados: rBCG-JFC
apresentou uma banda de ~ 51 kDa e
rBCG-LAFC de ~ 55 kDa (incluindo
4kDa da ssBlam). No entanto, os ex-
perimentos de localizaçªo do antíge-
no heterólogo no BCG mostraram
que, em ambas as construçıes, o FC se
encontrava no citosol, indicando que,
nesse caso, a fusªo com ssBlam nªo
resultou em exportaçªo do antígeno.
Clones de rBCG transformados com
os vetores de expressªo contendo o
antígeno de difteria CRM197 mostra-
ram expressªo da proteína em Wes-
tern blot quando revelado com antis-
soro anti-anatoxina diftØrica (6). O
clone de rBCG-JCRM197 apresentou a
banda de peso molecular esperado a
~50 kDa. JÆ o clone de rBCG-LA-
CRM197 apresentou uma banda de
mesmo peso molecular, indicando que
a fusªo com ssBlam nªo foi estÆvel. O
interessante Ø que, em ambas as cons-
truçıes, o antígeno se localizou na
fraçªo de membrana, mesmo sem a
seqüŒncia sinal de exportaçªo, suge-
rindo uma afinidade própria da prote-
ína pela membrana celular.
No caso de rBCG-S1PT (contendo
a subunidade S1 da toxina pertussis
mutada), realizamos apenas a cons-
truçªo em fusªo com ssBlam, pois
relatos da literatura haviam indicado
uma dificuldade de expressÆ-la sem
fusªo em outros sistemas. O Western
blot revelado com anticorpo anti-PT
mostrou uma banda de ~30kDa, pou-
co acima da banda de S1 da toxina
Figura 1. Resposta imune induzida por BCG recombinante
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 27
pertussis (de 26,2 kDa). O S1PT re-
combinante localizou-se na fraçªo de
parede celular (Figura 4, 2 e 3), indi-
cando ter havido uma tentativa de
exportaçªo do antígeno que nªo che-
gou a se completar (7).
Resposta Imune e Proteçªo
induzida pelas vacinas de rBCG
em camundongos
Camundongos Balb/c ou NIH fo-
ram imunizados com as preparaçıes
vacinais de rBCG-JFC, rBCG-LAFC,
rBCG-JCRM197 ou rBCG-LACRM197,
ou diferentes combinaçıes desses. Um
reforço foi realizado nas mesmas con-
diçıes após 2 meses e meio. A forma-
çªo de anticorpos anti-anatoxina tetâ-
nica ou diftØrica foi avaliada mensal-
mente nos soros dos camundongos
vacinados, durante 6 meses, por ELI-
SA. Imunizaçªo com rBCG expressan-
do FC em ambas as construçıes indu-
ziu a formaçªo de anticorpos anti-
anatoxina tetânica, mostrando, entªo,
uma elevaçªo dos títulos sØricos após
o reforço. A expressªo de FC, com e
sem fusªo, com ssBlam mostrou-se
equivalente, porØm a resposta humo-
ral foi mais elevada sem a fusªo,
indicando ser a expressªo do gene
nativo mais adequada. A imunizaçªo
de camundongos com rBCG expres-
sando CRM197 tambØm induziu à for-
maçªo de anticorpos anti-anatoxina
diftØrica, que foi aumentada após o
reforço (6). TambØm, nesse caso, a
construçªo sem fusªo com ssBlam
induziu a um nível maior de anticor-
pos anti-anatoxina diftØrica. Quando
os camundongos foram imunizados
com uma mistura de rBCG expressan-
do FC e rBCG expressando CRM197,
ambos sem fusªo, a resposta imune
induzida contra cada um foi aumenta-
da, evidenciando um efeito adjuvante
de rBCG-FC sobre a resposta contra
difteria e a recíproca, de rBCG-CRM197
contra o tØtano. O soro obtido dos
camundongos imunizados com a mis-
tura de rBCG-FC e rBCG-CRM197 apre-
sentou um padrªo de isótipos de imu-
noglobulina preponderantemente
IgG1, semelhante ao obtido com as
vacinas convencionais compostas pe-
las respectivas anatoxinas. Esse mes-
mo soro foi capaz de neutralizar a
atividade da toxina tetânica in vitro e
in vivo. O mesmo soro foi tambØm
capaz de neutralizar a atividade da
toxina diftØrica in vitro sobre cØlulas
Vero.
Camundongos Swiss foram imuni-
zados com as preparaçıes vacinais de
rBCG-S1PT, e a induçªo de resposta
humoral específica contra PT seguida
por ELISA do soro dos camundongos
imunizados por atØ 6 meses. A induçªo
de anticorpos anti-PT foi baixa. A res-
posta celular foi avaliada por liberaçªo
de IL-4 e IFN-γ de linfócitos esplŒnicos
de animais imunizados. Uma elevada
liberaçªo de INF-γ pelos linfócitos, após
estímulo com dPT, caracterizou uma
resposta celular tipo Th1 (7). Esses
camundongos foram submetidos a de-
safio intracerebral com dose letal de
cepa virulenta de B.pertussis, apresen-
tando uma elevada sobrevivŒncia, com-
parÆvel à obtida com a vacina tríplice
(Tabela I).
Discussªo
A expressªo dos antígenos de difte-
ria, tØtano e pertussis em BCG atravØs
dos vetores de expressªo em micobac-
tØria contendo o promotor pBlaF* mos-
trou-se adequada, levando à induçªo
de elevados níveis de anticorpos anti-
anatoxina tetânica e diftØrica, e de uma
resposta celular contra a toxina pertus-
sis. A resposta humoral obtida contra
tØtano e difteria pela mistura de rBCG-
FC e rBCG-CRM197 foi capaz de neu-
tralizar a atividade das respectivas toxi-
nas tetânica e diftØrica. Nossos resulta-
dos evidenciaram um efeito adjuvante
recíproco de rBCG-FC e rBCG-
CRM197. A expressªo de FC em rBCG
jÆ havia sido descrita utilizando outros
vetores, mas a proteçªo induzida foi
parcial. A expressªo de CRM197 em
veículos vivos de apresentaçªo de
antígenos tem se mostrado difícil. Esta
Ø a primeira vez que se obtØm a
expressªo de CRM197 em BCG. A
imunizaçªo de camundongos com
rBCG-S1PT induziu a umaelevada
resposta celular específica contra PT,
que foi capaz de proteger os animais
contra um desafio intracerebral com
dose altamente virulenta B. pertussis.
A expressªo em BCG de S1PT em
fusªo com FC havia sido recentemen-
te descrita, porØm a resposta celular
induzida foi baixa. Estamos investi-
gando, atualmente, a resposta imune
induzida pela administraçªo conjunta
de rBCG-FC, rBCG-CRM197 e rBCG-
S1PT, com a expectativa de que pro-
priedades adjuvantes dos antígenos
combinados possam ainda aumentar
a resposta imune induzida contra cada
um dos patógenos.
Nossos estudos demonstraram
que rBCG expressando os antígenos
de DTP induzem resposta imune efici-
ente e protetora contra tØtano, difteria
e pertussis. No entanto, uma vez que
essas sªo vacinas vivas, podendo per-
manecer no organismo por longos
períodos, nªo seria aceitÆvel sua ad-
ministraçªo em humanos, pela possi-
bilidade de disseminaçªo do gene de
Figura 2. Vetores de expressªo de antígenos heterólogos em
micobactØria. Os vetores pJ-Ag e pLA-Ag contŒm origem de replicaçªo
em E.coli (ori-E.coli) e origem de replicaçªo em micobactØria (ori-
mico), o gene de resistŒncia à kanamicina (Km), e o promotor mutado
da β-lactamase de M.fortuitum, pBlaF*. pJ-Ag expressa o gene do
antígeno nativo e pLA-Ag expressa os gene em fusªo, com a seqüŒncia
sinal da β–lactamase (ssBlam) (ss). Ag pode ser FC, CRM197 ou S1PT
28 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
resistŒncia a antibiótico para outras
bactØrias. Recentemente foi descrito
um sistema de expressªo em BCG,
utilizando cepas auxotróficas, desen-
volvidas para posterior complementa-
çªo com um vetor que expresse o gene
eliminado, conjuntamente com o antí-
geno recombinante. Dessa forma, evi-
ta-se a seleçªo com antibiótico e, con-
seqüentemente, o uso do gene de resis-
tŒncia, produzindo-se uma cepa de
rBCG adequada para administraçªo em
humanos. Estamos atualmente desen-
volvendo esse sistema no laboratório,
para posterior verificaçªo da resposta
imune induzida pelos antígenos de
DTP expressos dessa forma.
Em conjunto, este trabalho repre-
senta um fato inØdito na expressªo dos
3 antígenos de DTP em um mesmo
sistema, com induçªo de resposta imu-
ne protetora contra cada um dos pató-
genos, condiçªo necessÆria à imple-
mentaçªo de qualquer uma das vaci-
nas. Nossos resultados indicam que
rBCG-DTP poderia constituir uma vaci-
na de dose œnica, eficiente e de baixo
custo, contra tuberculose, tØtano, dif-
teria e pertussis, com claras vantagens
para países em desenvolvimento.
ReferŒncias:
1) Levine, M.M., Lagos, R. 1997
Vaccines and vaccination in a histori-
cal perspective, 1-12. . In M.M. Levine,
G.C. Woodrow, J.B. Kaper, G.S. Co-
bon (ed.), New generation vaccines,
2nd ed. Marcel Dekker, Inc. NY.
2) Gicquel, B. 1995 BCG as a
vector for the construction of multiva-
lent recombinant vaccines. Biologi-
cals 23, 113-8.
3) Fennelly, G.J., W.R. Jacobs Jr.,
and B.R. Bloom. 1997. The BCG as a
recombinant vaccine vector, p. 363-
385. In M.M. Levine, G.C. Woodrow,
J.B. Kaper, G.S. Cobon (ed.), New
generation vaccines, 2nd ed. Marcel
Dekker, Inc. NY.
4) WHO/V&B/99.17 WHO Vacci-
ne Preventable Diseases Monitoring
Figura 4. Localizaçªo da
subunidade S1 da toxina
pertussis em BCG
recombinante analisada por
Western blot. Lisado de
BCG recombinante foi
fracionado por
centrifugaçªo e
particionado em detergente.
As amostras corresponden-
tes a cada fraçªo ou locali-
zaçªo foram aplicadas em
gel de SDS-PAGE,
transferidas para uma
membrana de nitrocelulose
e submetidas a um
imunoensaio utilizando um
soro policlonal contra a
toxina pertussis
Figura 3. Construçªo e
teste de vacinas de BCG
recombinante
System, 1999 Global Summary.
5) Parish, T., P.R. Wheeler. 1998.
Preparation of cell-free extracts from
mycobacteria, p. 77-89. In, T. Parish and
N.G Stoker (ed.), Methods in Molecular
Biology, Vol. 101: Mycobacteria Proto-
cols, Humana Press, Totowa, NJ.
6) Miyaji, E.N., Mazzantini, R.P., Dias,
W.O., Nascimento, A.L.T.O, Marcovistz,
R., Matos, D.S., Raw, I., Winter, N.,
Gicquel, B., Rappuoli, R. and Leite,
L.C.C. “Induction of Neutralizing Anti-
bodies Against Diphtheria Toxin by Pri-
ming with Recombinant Mycobacterium
bovis BCG Expressing CRM
197
, a Mutant
Diphtheria Toxin”, submetido (2000).
7) Nascimento, I.P., Dias, W.O., Ma-
zzantini, R.P., Miyaji, E.N., Gamberini,
M., Quintillo, W., Gebara, V.C., Cardo-
so, D.F., Ho, P.L., Raw, I. Winter, N.,
Gicquel, B., Rappuoli, R., Leite, L.C.C.
“Recombinant BCG Expressing S1-Per-
tussis Toxin induces Protection against
an Intracerebral Challenge with Live
Bordetella pertussis in Mice”, Infection
Immunity, 68 (9), 4877-4883 (2000).
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 29
Anúncio ANBIO
Associação Nacional de
Biossegurança
(FOTOLITO NOVO)
Obs.: Fotolito fornecido em anexo
30 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
PEPT˝DEOS ANTIMICROBIANOS
Uma alternativa no combate a microrganismos resistentes
Maura Vianna Prates
Aluna de doutorado do curso de Pós-graduaçªo do Departamento de
Biologia Celular da Universidade de Brasília/UnB.
mprates@unb.br
Carlos Bloch Jœnior
Professor adjunto do Instituto de Química da Universidade
de Brasília/UnB, Pesquisador do Cenargen/Embrapa.
cbloch@cenargen.embrapa.br
s ameaças à saœde de
seres vivos causadas por
infecçıes de microrganis-
mos resistentes a antibió-
ticos e a vÆrios agentes
germicidas vŒm atingindo índices ja-
mais registrados. Muitos microrganis-
mos tŒm desenvolvido resistŒncia tan-
to contra os jÆ bem estabelecidos
antibióticos de uso convencional
quanto contra os antibióticos de œlti-
ma geraçªo (Austin D. J., et al., 1999),
causando graves problemas de saœde
pœblica e vultosos prejuízos econô-
micos. O impacto da crescente resis-
tŒncia de microrganismos a medica-
mentos e a substâncias específicas
tem movimentado vÆrios grupos de
pesquisa, assim como a indœstria far-
macŒutica para desenvolvimento de
novas drogas que sejam capazes de
lidar efetivamente com as estratØgias
de adaptaçªo que esses organismos
elaboram, em face de todo o tipo de
situaçªo adversa.
O surgimento da resistŒncia a an-
timicrobianos Ø um exemplo clÆssico
de evoluçªo em resposta a uma forte
pressªo de seleçªo. Hospitais e ou-
tros estabelecimentos constituem uma
comunidade ecológica particular, na
qual diversos tipos de micróbios cir-
culam e interagem entre si direta-
mente, por meio da reproduçªo e da
troca de plasmídeos, e/ou indireta-
mente, por meio de interaçıes entre
pacientes e funcionÆrios.
O corpo humano Ø um conhecido
habitat de uma microflora muito di-
versificada, composta de populaçıes
benØficas, populaçıes prejudiciais à
saœde e populaçıes que vivem co-
mensalmente, as quais exercem pou-
ca influŒncia sobre seu hospedeiro
em condiçıes normais. A respeito
dos microrganismos patogŒnicos, a
maior preocupaçªo Ø o surgimento
de cepas resistentes aos antimicrobi-
anos disponíveis. Entretanto, os mi-
crorganismos comensais estabelecem
um tipo de problema diferente da-
quele imposto pelos microrganismos
patogŒnicos. Sob condiçıes normais,
eles vivem em locais como a pele ou
Fotografias gentilmente cedidas pelo Prof. Antônio Sebben
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 31
o trato respiratório, causando pouco
ou nenhum problema. PorØm, quan-
do transferidos para regiıes estØreis,
como a corrente sangüínea e os pul-
mıes, eles podem ser malØficos e
provocar sØrios distœrbios na saœde
do hospedeiro (Stewart F. M., et al.,
1998).
Uma vez que os antimicrobianos
sªo introduzidos para tratar os verda-
deiros patógenos e nªo os comen-
sais, vÆrios fatores de transferŒncia
de resistŒncia sªo assim dissemina-
dos e podem ser transmitidos a linha-
gens sensíveis, por meio do contato
entre as cØlulas. Muitos fatores de
virulŒncia,como, por exemplo, os de
Staphylococcus aureus, sªo carrega-
dos por plasmídeos e podem ser
consignados entre diferentes linha-
gens. Sem dœvida, esse Ø o principal
mecanismo para o rÆpido espalha-
mento de linhagens com resistŒncia
mœltipla (Brock, T. D., et al.,1994).
AlØm disso, o problema da resistŒn-
cia introduz questıes relacionadas
com a duraçªo e com a intensidade
do tratamento, com as estratØgias que
envolvem o uso de vÆrias drogas
concomitantemente e com o rigor
que deve ser obedecido por parte
dos pacientes.
PROBLEM`TICA DA
RESIST˚NCIA A DROGAS
A infecçªo hospitalar vem desper-
tando interesse nªo somente para a
Ærea sanitÆria como tambØm para a
econômica, devido, sobretudo, à ver-
satilidade com que os microrganis-
mos causadores tŒm driblado a açªo
de drogas. A infecçªo hospitalar atin-
ge dois milhıes de norte-americanos
a cada ano e cerca de setenta mil
acabam morrendo. O S. aureus Ø um
dos microrganismos mais comumen-
te encontrados em hospitais e um dos
principais agentes causadores da in-
fecçªo hospitalar. A resistŒncia da
bactØria S. aureus a antibióticos vem
crescendo assustadoramente, mesmo
em se tratando de drogas poderosas
e de amplo espectro como a metici-
lina. Em 1981, 5% da populaçªo de S.
aureus eram resistentes a este antibi-
ótico. Dez anos depois a porcenta-
gem aumentou para 38% e as estima-
tivas atuais sªo de cerca de 50% de
resistŒncia à meticilina (http://
www.bhj.org/journal/1997/3901_jan/
special_064.htm).
Infecçıes causadas por microrga-
nismos resistentes nªo atingem so-
mente a saœde humana. Na pecuÆria,
grandes sªo os problemas enfrenta-
dos pelos criadores de gado leiteiro
susceptível à mastite, uma condiçªo
inflamatória da glândula mamÆria cau-
sada por bactØrias, (S.aureus, E. coli
e P. aeruginosa, principalmente) que
acarreta mudança das características
físicas do œbere e do leite, em vacas.
As perdas na indœstria leiteira dos
Estados Unidos somam mais de dois
bilhıes de dólares por ano. Os custos
incluem a diminuiçªo da produçªo e
a perda da qualidade do leite, seja
provocada pela inflamaçªo propria-
mente dita, seja causada pelo uso de
antibióticos para o tratamento e as
despesas com veterinÆrios, com labo-
ratórios e com a perda dos animais
(http://classes.aces.uiuc.edu/AnS-
ci308/mastitisintro.html).
O mesmo quadro pode ser verifi-
cado no que diz respeito aos fitopa-
tógenos. O surgimento de resistŒncia
de fungos fitopatogŒnicos de impor-
tância agronômica Ø considerado um
fator limitante na eficÆcia e na vida
œtil das mais variadas estratØgias de
controle de doenças (Heaney S., et
al., 1994). Muitos gŒneros tais como
Aspergillus, Botrytis, Venturia, Ustila-
go, Marnaporte, Colletotrichum, Al-
ternaria, Cercospora, Cladosporium
e Penicillium, tŒm desenvolvido es-
tratØgias elegantes de resistŒncia con-
tra os fungicidas mais amplamente
empregados como os da classe dos
benzimidazóis, das estrobilurinas, das
fenoxiquinolinas e das anilinopirimi-
dinas (Steffens, J. J., et al., 1996).
Nos œltimos anos, tem-se consta-
tado que mesmo fungicidas de amplo
espectro de açªo como o Benomyl,
tornaram-se alvo de resistŒncia. O
emprego deste fungicida tem-se mos-
trado cada vez mais ineficiente para
combater a antracnose, doença pro-
vocada pelo gŒnero Colletotrichum
sp., em culturas de diversas fruteiras
susceptíveis e, sobretudo, contra a
doença da “flor preta” em morango
(Tanaka, M. A. S., et al., 1997).
Conforme comentado anterior-
mente, o uso indiscriminado de dro-
gas Ø o principal fator de induçªo à
resistŒncia; contudo, a prevençªo
desse abuso nªo Ø garantia de que a
susceptibilidade seja um fator rever-
sível, uma vez que os efeitos provo-
cados pelos antimicrobianos na fisio-
logia e ecologia dos microrganismos
impossibilitam, cada vez mais, o re-
torno ao estado de susceptibilidade
anterior. Dessa forma, o uso de novas
tecnologias para o desenvolvimento
de drogas mais eficazes constitui uma
estratØgia promissora no campo da
biotecnologia, uma vez que possibi-
litarÆ a iniciativa de prospeçªo de
novas classes de molØculas naturais
e/ou sintØticas, capazes de neutrali-
zar ou de danificar o patógeno-alvo
ao invØs de inviabilizÆ-lo genetica-
mente, inibindo assim o desenvolvi-
mento da resistŒncia (Heinemann, J.
A., et al, 2000). Atualmente, peptíde-
os antimicrobianos de origem animal
Figura 1a:
Phyllomedusa tarsius:
"Perereca da Floresta"
- espØcie amazônica
32 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
estªo sendo utilizados como mode-
los para o desenho de novas drogas
com aplicaçªo nas Æreas agrícola e de
saœde. Para tanto, seqüŒncias anfifíli-
cas de peptídeos vŒm sendo dese-
nhadas, sintetizadas e testadas in vi-
tro, a fim de permitirem a obtençªo
de genes com potencial de resistŒn-
cia a fitopatógenos, bem como com-
postos ativos para a fabricaçªo de
drogas de amplo espectro e de mœl-
tipla aplicabilidade.
Um exemplo dessa abordagem
sªo os anÆlogos sintØticos da magai-
nina II, peptídeo proveniente da se-
creçªo da pele do anfíbio africano
Xenopus laevis (Zasloff, M., 1987)
que foram testados com sucesso na
inibiçªo da germina-
çªo de conídios de
Cryphonectria parasi-
tica, Fusarium oxys-
porum f. sp. lycopersi-
ci, e Septoria musiva,
e que nªo provoca-
ram nenhuma interfe-
rŒncia detectÆvel na
germinaçªo de pólen
dos organismos hos-
pedeiros, alØm de se-
rem eficazes tambØm
contra as bactØrias
Agrobacterium tume-
faciens, Erwinia
amylovora e Pseudo-
monas syringae. As
diferenças significativas encontradas
na sensibilidade entre os microrga-
nismos e as cØlulas vegetais tŒm
mostrado que tais peptídeos podem
ser œteis como modelos para o dese-
nho de genes de resistŒncia (Powell,
W. A., et al., 1995).
O uso das magaininas na agricul-
tura nªo se restringe a cultivares
frutíferos ou alimentícios de um modo
geral, mas abrange tambØm o ramo
de plantas ornamentais geneticamente
modificadas, as quais expressam ge-
nes de magaininas resistentes a fun-
gos e outros patógenos causadores
de lesıes. Da mesma forma, a magai-
nina II jÆ vem sendo utilizada como
princípio ativo na fabricaçªo de dro-
gas como o LOCILEX™, que Ø um
creme de uso tópico com açªo micro-
bicida e empregado no tratamento da
infecçªo de œlceras diabØticas. AlØm
disso, derivados da magainina II tŒm
sido amplamente aplicados nas tera-
pias contra o câncer, no tratamento
de conjuntivites, de acne, de doenças
sexualmente transmissíveis, de mico-
ses, alØm de serem drogas promisso-
ras no tratamento da gripe (http://
www.magainin.com).
SUBST´NCIAS BIOATIVAS
DE ORIGEM NATURAL
Venenos e toxinas de origem na-
tural hÆ muito representam uma fon-
te de fascínio para o homem, graças
aos seus extraordinÆrios efeitos far-
macológicos. Sua utilizaçªo científica
tem contribuído com sucesso para a
elucidaçªo de vÆrios mecanismos fi-
siológicos, como demonstrado por
Claude Bernard em seus experimen-
tos clÆssicos da dØcada de 1850, com
o “curare” (Erspamer, V., 1994), as-
sim como sua exploraçªo industrial
para o uso terapŒutico, a exemplo de
vÆrias comunidades indígenas e na
medicina popular (Daly et al. 1992).
Os vertebrados, mais precisamen-
te os anfíbios da ordem Anura, repre-
sentam um verdadeiro laboratório de
bioquímica, tendo em vista o arsenal
de toxinas que fabricam. Nas cØlulas
que revestem as paredes de glându-
las granulares presentes na pele des-
ses animais Ø produzida uma varieda-
de de princípios ativos que compre-
endem molØculas alifÆticas, aromÆti-
cas e heterocíclicas, alØm
de uma diversificada gama
de esteróides, de alcalói-
des, de aminas biogŒni-
cas, de derivados guani-
dínicos, de proteínas e de
peptídeos, incluindo-se
na produçªo desses dois
œltimos, seus precursores
e todo o sistema enzimÆ-
tico envolvido na sua bi-
ossíntese. Essas molØcu-
las acumulam-se em grâ-
nulos, os quais compıem
a luzde glândulas dØrmi-
cas e sªo liberadas medi-
ante estímulos apropria-
dos. Seu papel Ø muito
Figura 1b: Leptodactylus ocellatus: "Rª-Manteiga" -
amplamente distribuída no Brasil
Figura 1c:
Dendrobates galactonotus:
EspØcie amazônica
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 33
diversificado sobre as funçıes fi-
siológicas da pele ou na defesa
contra predadores e microrganis-
mos. Grande nœmero desses com-
postos jÆ se encontra caracteriza-
do estrutural e funcionalmente
(Sebben, A. et al., 1993).
Entre todos os tipos de molØ-
culas mencionados acima, os pep-
tídeos tŒm despertado bastante
interesse devido às suas ativida-
des como mediadores farmacoló-
gicos e à descoberta de molØculas
homólogas ou anÆlogas em teci-
dos do trato gastrointestinal e
sistema nervoso de mamíferos. O
exemplo mais freqüente de molØcu-
las encontradas em ambos os grupos
sªo as taquicininas, as ceruleínas, o
hormônio liberador de tirotropina, as
bobesinas e os peptídeos opióides
(Erspamer, V. e Melchiorri, P., 1980).
O primeiro relato da ocorrŒncia
de peptídeos com atividade antibac-
teriana e hemolítica na pele de anfí-
bio data de 1969, quando foi identi-
ficada a bombinina, um peptídeo de
24 resíduos de aminoÆcidos, prove-
niente da secreçªo cutânea do anuro
europeu Bombina variegata (Csor-
das, A. e Michl, H., 1970). No final da
dØcada de 1980, foram isoladas as
magaininas de Xenopus laevis (Zaslo-
ff, M., 1987) e, somente a partir daí,
outros peptídeos com atividade mi-
crobicida de origens diferentes co-
meçaram a ser estudados mais deta-
lhadamente. Atualmente, as magaini-
nas representam uma das mais bem
estudadas classes de peptídeos anti-
bióticos, os quais sªo considerados
efetores da imunidade inata, agindo
em uma primeira linha de defesa
contra infecçıes bacterianas e fœngi-
cas nos organismos superiores (Zas-
loff, M., 1992; Boman, H. G., 1995;
Nicolas, P., 1995; Barra, D., et al.,
1998).
GL´NDULAS DE VENENO
Especificamente nos anfíbios hÆ
pelo menos dois tipos de glândulas
dØrmicas denominadas mucosas e
granulares, alØm das glândulas paro-
tóides posteriores aos olhos da mai-
oria dos anuros. As mucosas encon-
tram-se distribuídas no tegumento e
sua secreçªo umectante promove a
hidrataçªo da pele por onde ocorrem
cerca de 90% das trocas gasosas (Orr,
R. T., 1986).
 As glândulas granulares, tambØm
chamadas glândulas serosas ou de
veneno, podem estar distribuídas ao
longo de todo o corpo ou concentra-
das em algumas Æreas, formando pro-
tuberâncias, especialmente na regiªo
dorsal do animal (Duellman, E. W. e
Trueb, L., 1986). Em muitas espØcies,
essas glândulas, juntamente com as
glândulas parotóides secretam subs-
tâncias bioativas que constituem um
“novo” sistema de defesa coordena-
do pelo sistema nervoso, diferente
daquele constituído pelas cØlu-
las T e B do sistema imune, e
detŒm a capacidade de promo-
ver a síntese de peptídeos de
baixa massa molecular com ati-
vidade antimicrobiana de am-
plo espectro, efetivos contra bac-
tØrias e fungos. Tal ocorrŒncia
poderia explicar a acentuada
resistŒncia desses grupos de an-
fíbios a doenças (Nicolas, P e
Delfour, A., 1994).
O lume das glândulas sero-
sas e das parotóides Ø rico em
grânulos que armazenam secre-
çıes tóxicas. Em situaçıes de perigo,
um estímulo nervoso Ø recebido pe-
las paredes glandulares provocando
a contraçªo da musculatura local e
causando uma descarga sincronizada
do seu conteœdo. Após a liberaçªo da
secreçªo, o sistema glandular inicia
seu processo de regeneraçªo, que
pode variar de poucas horas a alguns
dias, dependendo da espØcie de an-
fíbio, atØ que o conteœdo do lume
glandular seja reconstituído (Delfino,
G., et al., 1990).
PEPT˝DEOS ANTIMICROBIANOS
Mais de cinqüenta peptídeos anti-
microbianos de anfíbios jÆ foram iso-
lados, tendo como principal caracte-
rística a natureza catiônica e a capa-
cidade de permeabilizar membranas
de microrganismos. Podem ser agru-
pados segundo sua estrutura primÆ-
ria e muitos sªo encontrados em
indivíduos do mesmo gŒnero e atØ
mesmo em indivíduos de gŒneros
distintos, pertencentes à mesma subfa-
mília ou nªo. Em 1970, a bombinina
foi descrita como um peptídeo anti-
bacteriano e hemolítico isolado da
secreçªo da pele do anfíbio B. varie-
gata (Csordas, A. e Michl, H., 1970).
Pouco tempo depois, outras bombi-
ninas foram detectadas na secreçªo
do mesmo anfíbio, as quais diferiram
entre si por poucos resíduos de ami-
noÆcidos (Simmaco, M., et al., 1991).
Peptídeos do tipo bombinina tam-
bØm foram isolados da espØcie B.
orientalis e mostraram pouquíssima
variaçªo em relaçªo aos encontrados
em B. variegata. As bombininas pos-
suem amplo espectro de açªo contra
microrganismos em geral, porØm apre-
Figura 2:
Exemplar adulto de Physalaemus
fuscomaculatus. Notar o aspecto
granuloso da pele dorsal. Marca-
do pelo acœmulo de glândulas
granulosas
Figura 3:
Corte histológico da pele de anfí-
bio mostrando a epiderme (E) e as
glândulas granulosas (G) e muco-
sas (M) localizadas na derme.
Aumento: 100 X
Coloraçªo: Azul de toluidina
34 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
sentam toxicidade se-
letiva contra cØlulas
sangüíneas, provocan-
do a lise das mesmas
(Gibson, B. W., et al.,
1991).
A secreçªo da pele
de Xenopus laevis tam-
bØm tem sido objeto
de intensa investigaçªo.
Nessa secreçªo, foram
detectados o TRH (hor-
mônio liberador de ti-
rotropina), a xenopsi-
na e a ceruleína, com
potente atividade hipo-
tensora. AlØm desses
peptídeos bioativos,
foram encontrados ain-
da peptídeos homólo-
gos às bombininas, de-
nominados magaini-
nas, que tambØm sªo
encontradas no estômago do anfíbio,
porØm sem funçªo definida nesse
órgªo.
Os peptídeos de defesa isolados
da pele de Xenopus sp. estªo agrupa-
dos em subfamílias de acordo com
sua origem biossintØtica. A xenopsi-
na e a ceruleína sªo molØculas de
estrutura e atividades farmacológicas
anÆlogas às da neurotensina e da
gastrina/CCK (colecistocinina) dos
mamíferos, respectivamente. Esses
peptídeos adotam a estrutura de hØ-
lice anfifílica quando em ambiente
hidrofóbico, sendo ativos em doses
micromolares contra uma variedade
de bactØrias gram-positivas, gram-
negativas, fungos e leveduras (Be-
vins, C. L. e Zasloff, M., 1990). As
magaininas I e II sªo peptídeos ho-
mólogos que possuem um amplo
espectro de açªo antimicrobiana. Em
doses micromolares, interrompem o
crescimento e/ou induzem a lise os-
mótica de diversos tipos de bactØrias
gram-positivas e gram-negativas e de
protozoÆrios. Elas sªo capazes de
induzir uma lise irreversível das cØlu-
las tumorais hematopoiØticas e de
tumores sólidos de diversas origens,
mas nªo provocam efeito sobre cØlu-
las diferenciadas de eucariotos (Zas-
loff, M., 1987).
As espØcies do gŒnero Rana de
diferentes Æreas geogrÆficas tŒm-se
mostrado igualmente interessantes,
no que se refere ao conteœdo de
peptídeos antimicrobianos da pele.
Foram detectados peptídeos com ati-
vidade antimicrobiana nas espØcies
R. esculenta (Simmaco, M., et al.,
1993, 1994), R. brevipoda (Morikawa,
N., et al., 1992), R. catesbeiana (Cla-
rk, D. P., et al., 1994) R. rugosa (Park,
J. M., et al., 1994; Suzuki, S., et al.,
1995) e R. temporaria (Simmaco, M.,
et al., 1996) denominados esculenti-
nas, brevininas, ranalexinas, rugosi-
nas e temporinas, respectivamente. A
particularidade encontrada nos pep-
tídeos desse gŒnero Ø a sua estrutura-
çªo secundÆria, a qual Ø decisiva no
modo de interaçªo toxina/microrga-
nismo, distinta de todas as outras atØ
entªo descritas (Simmaco M., et al.,
1998).
Na AmØrica do Sul, os hilídeos da
subfamília Phyllomedusinae consti-
tuem uma fonte muito rica de peptí-
deos antimicrobianos. Atualmente
quatro espØcies do gŒnero Phyllome-
dusa vŒm sendo estudadas: P. bicolor
(Daly, J. W., et al., 1992; Mor, A., et al.,
1994; Charpentier,S., et al., 1998), P.
sauvagei (Mor, A., et al., 1991; Mor, A.
e Nicolas, P., 1994a), P. distincta
(Batista, C., et al., 1999) e P. tarsius
(Prates, M. V., 1999). Nesse gŒnero
foram detectados potentes agentes
antimicrobianos denominados der-
maseptinas, com amplo espectro de
atividade antimicrobiana e cicatri-
zante. As dermaseptinas
sªo molØculas catiôni-
cas de 24 a 34 resíduos
de aminoÆcidos que for-
mam uma cadeia linear
com estrutura secundÆ-
ria aleatória em solven-
te aquoso, porØm orde-
nada (α-hØlice) quan-
do em meio apolar (Mor,
A., et al., 1991; Mor, A.
e Nicolas, P., 1994a; Mor,
A., et al., 1994; Mor, A.
e Nicolas, P., 1994b).
Outras espØcies, tais
como P. rhodei e P.
burmeisteri, tambØm
tŒm sido investigadas
como provÆveis produ-
toras de peptídeos anti-
microbianos, da família
das dermaseptinas.
AlØm disso, peptídeos
relacionados com as dermaseptinas
foram detectados em outros hilídeos
dessa subfamília, nas espØcies Pa-
chymedusa dacnicolor e Agalychnis
annae, ambas provenientes da AmØ-
rica Central (Wechselberger, C., 1998)
.
As dermaseptinas exercem ativi-
dade lítica sobre bactØrias gram-posi-
tivas e gram-negativas, protozoÆrios
ciliados, leveduras e fungos filamen-
tosos em concentraçıes micromola-
res (Fleury, Y., et al., 1998). Contudo,
tais efeitos citolíticos nªo foram ob-
servados em cØlulas de mamíferos,
devido, possivelmente, à estrutura e
à composiçªo da membrana celular
desses animais. De fato, estudos de
citólise usando lipossomas de dife-
rentes composiçıes fosfolipídicas e
crescente concentraçªo de colesterol
(característica de animais superiores)
mostraram maior resistŒncia dessas
membranas artificiais à ruptura (Ba-
tista, C. V. F., 1999). A adenoregulina
de P. bicolor Ø um peptídeo de estru-
tura similar às dermaseptinas, mas foi
isolada primeiramente por sua fun-
çªo farmacológica neurotransmisso-
ra, que consiste na sua capacidade de
induzir a ligaçªo de agonistas aos
receptores A1 de adenosina, prova-
velmente devido à presença de D-
aminoÆcidos em sua composiçªo
(Daly, J. W., et al., 1982). Posterior-
mente, foi relatada sua atividade an-
Peptídeos
Magaininas
Bombininas
Dermaseptinas
Brevininas
Caerinas
Gaegurinas
Rugosinas
Buforina
Ranalexinas
Xenoxinas
Temporinas
Maculatinas
Esculentinas
Pipininas
PGLa
Xenopsina (fragmento precursor)
Levitídeo (fragmento precursor)
Ceruleína (fragmento precursor)
Ceruleína
Frenatina
Anfíbios
Xenopus sp.
Bombina sp.
Phyllomedusa sp.
Rana brevipoda
Litoria sp.
Rana rugosa
Rana rugosa
Bufo bufo
Rana catesbeiana
Xenopus sp.
Rana temporaria
Litoria genimaculata
Rana esculenta
Rana pipiens
Xenopus laevis
Xenopus laevis
Xenopus laevis
Xenopus laevis
Litoria cerulea
Litoria infrafrenata
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 35
timicrobiana, semelhante a das ou-
tras dermaseptinas.
Da mesma forma, muitas espØcies
australianas de anfíbios do gŒnero
Litoria tŒm sido estudadas por apre-
sentarem peptídeos antimicrobianos.
As espØcies L. xanthomera e L. chloris
revelaram a presença de peptídeos
antimicrobianos denominados caeri-
nas (Stone, D. J. M., et al., 1992;
Steinborner, S. T., et al., 1997; Stein-
borner, S. T., et al., 1998), e as espØ-
cies L. splendida e L. cerulea, o pep-
tídeo ceruleína, todos ativos contra
bactØrias gram-positivas (Stone, D. J.
M., et al., 1992; Waugh, R. J., et al.,
1993). JÆ as espØcies L. infrafrenata e
L. genimaculata apresentaram peptí-
deos denominados frenatinas e ma-
culatinas (Raftery, M. J., et al., 1996;
Rosek, T., et al., 1998), sendo o
primeiro de amplo espectro e o se-
gundo, com atividade semelhante à
das caerinas.
Na tabela, estªo listados os princi-
pais peptídeos com atividade antimi-
crobiana encontrados nas secreçıes
da pele ou em outros órgªos de
anfíbios anuros.
CONCLUSˆO
O recente progresso da indœstria
farmacŒutica relacionado com a des-
coberta e a produçªo de novos agen-
tes antimicrobianos nªo vem alcan-
çando o sucesso desejado na conten-
çªo da mutagŒnese de resistŒncia a
drogas desenvolvida pelos microrga-
nismos. Enquanto os mecanismos de
resistŒncia criados por muitos micró-
bios vŒm-se tornando cada dia mais
eficazes, as drogas conhecidas mos-
tram-se cada vez menos eficientes no
combate às patologias. A resistŒncia
microbiana a drogas Ø um problema
complexo, uma vez que consiste no
produto de um processo natural e,
muito mais que isso, essencial, nªo
somente para a origem, como tam-
bØm para a evoluçªo de todos os
seres vivos, o qual fundamenta-se na
mutaçªo espontânea, na transferŒn-
cia e recombinaçªo de genes, crian-
do assim variabilidade genØtica atu-
ante na seleçªo natural.
A bactØria Pseudomonas aerugi-
nosa possuí em seu genoma alguns
genes codificadores de proteínas for-
madoras de bombas, as quais podem
ser a chave para a elucidaçªo do
mecanismo de resistŒncia contra di-
versas classes de antibióticos (Stover,
C. K., 2000). A hipótese aceita atual-
mente sugere que bactØrias gram-
negativas, grupo do qual a P. aerugi-
nosa faz parte, podem resistir ao
efeito letal de muitos antimicrobia-
nos, utilizando uma estratØgia de
bombeamento dos agentes químicos
para fora das cØlulas bacterianas mais
rapidamente do que seu acœmulo no
interior destas. Dessa forma, tais pro-
teínas formadoras de bombas teriam
a capacidade de conferir a essas
bactØrias a propriedade de resistŒn-
cia (Nikaido, H., 1998). Ainda nªo foi
esclarecido o procedimento da evo-
luçªo das bombas. Especula-se que
elas teriam surgido da necessidade
dos microrganismos em eliminar to-
xinas naturalmente presentes no seu
ambiente (Greenberg, E. P., 2000).
Sabendo disso, torna-se cada vez
mais importante a investigaçªo e a
descoberta de drogas capazes de atu-
arem diretamente sobre a parede e a
membrana plasmÆtica, provocando
lise e morte celular, ao primeiro con-
tato. AtØ onde se tem registro, sabe-
se que mesmo os mais sofisticados
mecanismos de defesa desenvolvi-
dos pelos microrganismos ainda nªo
sªo suficientes para neutralizar uma
açªo do tipo detergente produzida
por peptídeos de carÆter catiônico.
O modo de defesa mediado pela
resposta humoral e celular confere
aos vertebrados uma proteçªo espe-
cífica e de longa duraçªo contra os
microrganismos patogŒnicos, porØm
nªo Ø de forma alguma adaptado
para responder rapidamente e de
maneira eficaz a uma invasªo micro-
biana local, por ocasiªo de uma le-
sªo. Uma das descobertas mais inte-
ressantes a esse respeito revelou que,
alØm da resposta imune celular alta-
mente específica, os vertebrados pos-
suem um mecanismo químico de
defesa, composto por peptídeos an-
timicrobianos, anÆlogo ao encontra-
do em invertebrados (Boman, H. G.
e Haltmark, D., 1987; Lehrer, R. I., et
al., 1991).
A maioria dos peptídeos antimi-
crobianos descritos atØ o momento
tem correspondentes de estrutura
idŒntica ou similar nos mamíferos e
invertebrados. Sua presença nos ver-
tebrados, considerada como efetora
ancestral da imunidade, possui muito
mais que um significado vestigial.
No que diz respeito às vantagens,
nªo Ø surpreendente o que esse
sistema de defesa química pode
conferir ao hospedeiro. De fato, um
repertório fixo, porØm extenso, de
pequenos peptídeos antimicrobia-
nos oferece aos animais superiores
um modo de controle particular-
mente rÆpido e eficaz contra a pro-
liferaçªo microbiana (Nicolas, P. e
Delfour, A., 1994).
As possibilidades de aplicaçªo
dos peptídeos antimicrobianos pela
agroindœstria, assim como pela in-
dœstria farmacŒutica, sªo inœmeras.
Um trabalho sistemÆtico de prospe-
çªo dessas molØculas, com identifi-
caçªo e síntese química em larga
escala, possibilitarÆ, nªo somente
um grande avanço na produçªo de
novas drogas, melhor conhecimen-
to biológico das espØcies doadoras,
reconhecimento do valor de cada
uma delas, como novas categorias
de recursos genØticose, por fim, a
necessidade de preservaçªo desses
animais.
Agradecimentos: Os autores de-
sejam agradecer ao Professor Antô-
nio Sebben pelas fotos deste artigo,
à EMBRAPA-CENARGEN e à Funda-
çªo Universidade de Brasília.
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Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 37
Anœncio Novo
(O fotolito estÆ sendo
enviado pelos Correios)
38 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
Emissªo de Gases de
Efeito Estufa
PESQUISA
Emissªo de gases de efeito estufa provenientes de sistemas agrícolas no Brasil
Magda Aparecida de Lima
Embrapa Meio Ambiente
Jaguariœna, SP
magda@cnpma.embrapa.br
umentos recentes na
concentraçªo de gases
traço na atmosfera, de-
vido à atividade antró-
pica, tŒm levado a um
impacto no balanço de
entrada e saída de radiaçªo solar do
planeta, tendendo ao aquecimento da
superfície da terra. A mudança na
radiaçªo líquida mØdia no topo da
troposfera, decorrente de uma altera-
çªo na radiaçªo solar ou infraverme-
lha, Ø designada forçante radiativa.
Os principais gases responsÆveis pelo
efeito estufa adicional sªo: o dióxido
de carbono (CO
2
), o metano (CH
4
), o
óxido nitroso (N
2
O), clorofluorcarbo-
nos (CFCs) e ozônio (O
3
). Estima-se
que, se a taxa atual de aumento desses
gases no planeta continuar pelo próxi-
mo sØculo, as temperaturas mØdias
globais subirªo 0,3oC por dØcada, com
uma incerteza de 0,2 oC a 0,5 oC por
dØcada (Cotton & Pielke, 1995), de
modo que, no ano 2100, o aquecimen-
to global estaria compreendido na
faixa de 1,0 a 3,5 oC (European Comis-
sion, 1997). A Figura 1 mostra a con-
tribuiçªo relativa de gases para o au-
mento da forçante radiativa global, e a
Tabela 1 mostra as atividades princi-
pais responsÆveis pelas emissıes, tem-
po de permanŒncia e taxa atual de
acrØscimo desses gases na atmosfera.
A agricultura Ø uma atividade alta-
mente dependente de fatores climÆti-
cos, como temperatura, pluviosidade,
umidade do solo e radiaçªo solar. Os
principais efeitos das alteraçıes des-
ses fatores na agricultura certamente
incidiriam na produtividade e no ma-
nejo das culturas, assim como nossistemas sociais, econômicos e de
políticas pœblicas. A mudança climÆti-
ca pode afetar a produçªo agrícola de
vÆrias formas: pela mudança nos fato-
res climÆticos, incluídos a freqüŒncia
e a severidade de eventos extremos;
pelo aumento da produçªo, devido ao
efeito fertilizador do carbono por cau-
sa da maior concentraçªo de CO
2
atmosfØrico; pela alteraçªo da intensi-
dade da colheita, devido a uma mu-
dança no nœmero de graus-dia de
crescimento, ou devido a modificaçªo
da ocorrŒncia e a severidade de pra-
gas e doenças (Shaw, 1997), entre
outros efeitos. Estudos baseados em
modelos de circulaçªo geral (GCM)
tŒm mostrado que a produtividade de
vÆrias culturas tende a diminuir em
algumas regiıes do globo e a aumen-
tar em outras, de tal modo que a
produçªo em Æreas tropicais e subtro-
picais, principalmente na `frica sub-
Saara, devido às grandes Æreas de
clima Ærido e semi-Ærido e sua depen-
dŒncia de agricultura, tende a ser mais
afetada em relaçªo às regiıes tempe-
radas (Jones et al., 1997, CGIAR, 1998).
Ao mesmo tempo em que constitui
uma atividade potencialmente influ-
enciÆvel pela mudança do clima, a
agricultura tambØm contribui para o
efeito estufa, com emissıes de gases
como o metano (CH
4
), dióxido de
carbono (CO
2
), monóxido de carbono
(CO), óxido nitroso (N
2
O) e óxidos de
nitrogŒnio (NO
x
). Estimam-se que 20%
do incremento anual da forçante radi-
ativa global sªo devidos ao setor agrí-
cola considerando-se o efeito dos ga-
ses metano, óxido nitroso e gÆs carbô-
nico (baseado em IPCC, 1996a), ex-
cluída a fraçªo correspondente às
mudanças do uso da terra relaciona-
das com as atividades agrícolas (15%).
O metano e o óxido nitroso sªo os
principais gases emitidos pelo setor
agropecuÆrio, e contribuem com 15%
e 6%, respectivamente, para a forçante
radiativa global (Cotton & Pielke, 1995).
As fontes agrícolas de gases de efeito
estufa sªo o cultivo de arroz irrigado
por inundaçªo, a pecuÆria, dejetos
animais, o uso agrícola dos solos e a
queima de resíduos agrícolas. O culti-
vo de arroz irrigado por inundaçªo, a
pecuÆria domØstica e seus dejetos,
assim como a queima de resíduos
agrícolas promovem a liberaçªo de
metano (CH
4
) na atmosfera. Estima-se
que cerca de 55% das emissıes antró-
picas de metano provŒm da agricultu-
Figura 1: Contribuiçªo relativa
de gases provenientes de
atividades antrópicas ao efeito
estufa (baseado em Krupa,
1997)
1
 Tg = 1012 gramas
Fotos cedidas pela autora
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 39
ra e da pecuÆria juntas (IPCC,1995).
Os solos agrícolas, pelo uso de fertili-
zantes nitrogenados, fixaçªo biológi-
ca de nitrogŒnio, adiçªo de dejetos
animais, incorporaçªo de resíduos cul-
turais, entre outros fatores, sªo res-
ponsÆveis por significantes emissıes
de óxido nitroso (N
2
O). A queima de
resíduos agrícolas nos campos libe-
ram, alØm do metano (CH
4
), tambØm
óxido nitroso (N
2
O), óxidos de nitro-
gŒnio (NO
x
) e monóxido de carbono
(CO).
Criada em 1992, durante a Confe-
rŒncia das Naçıes Unidas sobre Meio
Ambiente e Desenvolvimento, com a
finalidade de proteger o sistema cli-
mÆtico global para as presentes e
futuras geraçıes, a Convençªo Qua-
dro de Mudança do Clima estabeleceu
compromissos para os países signatÆ-
rios, a fim de que estes se responsabi-
lizassem pela elaboraçªo de inventÆri-
os periódicos das emissıes antrópicas
de gases e pela formulaçªo e imple-
mentaçªo de programas nacionais vol-
tados para a mitigaçªo da mudança do
clima, bem como pela promoçªo e
cooperaçªo para o desenvolvimento,
aplicaçªo e difusªo de tecnologias,
prÆticas e processos de reduçªo ou
prevençªo das emissıes de gases de
efeito estufa. A seguir, sªo identifica-
das algumas opçıes de reduçªo de
gases traço potencialmente aplicÆveis
ao setor agropecuÆrio brasileiro. Dado
que o metano constitui o principal gÆs
produzido por atividades agrícolas no
país, uma atençªo especial Ø dada
neste artigo às opçıes para a sua
reduçªo.
Opçıes e medidas para a
reduçªo das emissıes de
gases de efeito estufa
Campos inundados de arroz
O cultivo de arroz irrigado por
inundaçªo (Foto 1) Ø uma importante
fonte de emissªo de metano (CH
4
),
contribuindo com 16% das emissıes
antrópicas de metano (Figura 2). Es-
tima-se em 20 a 100 teragramas1 (mØ-
dia de 60 Tg) por ano a taxa de
emissªo desse gÆs nos campos de
arroz irrigado (IPCC, 1995). O metano
Ø produzido nos solos inundados,
durante a decomposiçªo anaeróbia de
substâncias orgânicas, mediante a açªo
de bactØrias (metanogŒnicas). A con-
diçªo mais importante para a sua
formaçªo Ø de anaerobiose (ausŒncia
de oxigŒnio), que ocorre no solos sob
inundaçªo. A matØria orgânica rica em
carbono presente nesses solos consti-
tui o fator mais importante para a
produçªo de metano, tendo como
origem as raízes mortas de plantas de
arroz, as algas e plantas aquÆticas na
Ægua de inundaçªo, exudatos de raí-
zes (secreçıes) de plantas de arroz,
fertilizantes orgânicos adicionados e a
matØria orgânica existente no solo. Os
materiais mais facilmente degradÆveis
(como exudatos de raízes de plantas
de arroz, adubo verde) contribuem
para taxas mais elevadas de produçªo
de metano. AlØm do tipo de substrato
orgânico, a composiçªo, a textura e,
principalmente, a temperatura dos so-
los sªo fatores que influenciam a pro-
duçªo de metano nos campos de
arroz inundado. O metano produzido
nos campos de arroz Ø liberado para a
atmosfera por vÆrias rotas, sendo a
principal delas por transporte difusivo
pelo aerŒnquima (tecido vascular de
aeraçªo). Segundo demonstrado por
Bont et al. (1978), a presença de
plantas de arroz facilita o escape de
metano para a atmosfera na ordem de
7 a 10 vezes mais que solos inundados
sem cultivo de arroz. A formaçªo de
bolhas de gÆs na superfície da Ægua e
sua difusªo na Ægua do solo constitu-
em outras vias de escape de metano a
partir desses sistemas agrícolas.
Do total de metano gerado por
essa fonte, cerca de 90% sªo atribuí-
dos ao continente asiÆtico. No Brasil,
Principal
fonte
antrópica
Tempo de
vida na
atmosfera
Taxa anual
atual de
aumento
Contribuiçªo
relativa ao
efeito estufa
antrópico
GÆs Carbônico
(CO
2
)
Combustíveis
fósseis,
desflorestam-
ento
50-200 anos
0,5%
60%
Metano
(CH
4
)
Cultivo de
arroz
inundado,
pecuÆria,
combustíveis
fósseis,
queima de
biomassa
10 anos
0,9%
15%
Óxido
Nitroso
(N
2
O)
Fertilizantes,
conversªo
do uso da
terra
150 anos
0,3%
5%
Clorofluor-
carbonetos
(CFCs)
Refrigeradores,
aerossóis,
processos
industriais
60-100 anos
4%
12%
Ozônio
(O
3
)
Hidrocarbonetos
(com NOx),
queima de
biomassa
Semanas a
meses
0,5-2,0%
8%
Monóxido
de Carbono
(CO)
Combustíveis
fósseis,
queima de
biomassa
meses
0,7-1,05
-
Vapor d·Ægua
(H
2
O)
Conversªo de
uso da terra,
irrigaçªo
dias
desconhecido
desconhecido
Tabela 1- Gases traço atmosfØricos significantes para o aumento do efeito estufa (krupa, 1997)
40 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
estima-se uma con-
tribuiçªo de 0,3 Tg
(Tg = 1012 gramas) de
metano proveniente
do cultivo de arroz
irrigado (Embrapa,
1998). Essa cultura re-
presenta cerca de
55% do total de arroz
produzido no país,
embora este seja ain-
da um grande impor-
tador de arroz (mais de 1/4 da
produçªo nacional).
Desde que a produçªo de me-
tano ocorre em solos sob condi-
çıes de anaerobiose, regimes de
inundaçªo intermitentes, condici-
onados às precipitaçıes pluvio-
mØtricas, ou de mœltipla aeraçªo
devem promover reduçªo das
emissıes de metano. Outras op-
çıes de reduçªo incluem:
a) melhoramento vegetal – de-
senvolvimento de novas cultiva-
res, seleçªo e geraçªo de plantas
de arroz com baixas taxas de emis-
sıes de metano.De acordo com
estudos de Minami & Neue (1994),
as variaçıes no coeficiente de di-
fusªo na transiçªo da raiz para o
aerŒnquima parecem desempenhar
um importante papel na emissªo
de metano entre as variedades de
arroz.
b) aceleraçªo da decomposi-
çªo de metano atravØs da oxida-
çªo por breves interrupçıes da
inundaçªo. O aumento da drena-
gem de Ægua (troca da lâmina
d’Ægua) e a secagem intermitente
do solo ou no fim da esta-
çªo de crescimento resul-
ta na oxidaçªo do metano
retido no solo. Sabe-se,
contudo, que ciclos alter-
nativos de anaerobiose e
aerobiose, que favorecem
a reduçªo das emissıes de
metano, aumentam a emis-
sªo de N
2
O, quando com-
parado às condiçıes de
anaerobiose ou aerobiose
permanentes.
c) modificaçªo do ma-
nejo de fertilizaçªo, de for-
ma que se opte pela adiçªo de
material orgânico compostado,
onde a matØria orgânica facilmen-
te mineralizÆvel encontra-se jÆ de-
composta e humificada, fornecendo
menos substrato para as bactØrias me-
tanogŒnicas.
Queima de biomassa na
agricultura
A combustªo da biomassa de resí-
duos de colheita e de culturas agríco-
las na prØ-colheita (Foto 2), como
prÆtica agrícola, leva à produçªo de
metano, óxido nitroso (N
2
O), óxidos
de nitrogŒnio (NO
x
) e monóxido de
carbono (CO), alØm do dióxido de
carbono (CO
2
). O fogo libera carbono
da biomassa durante a combustªo e
acentua diretamente a liberaçªo de
carbono do solo do qual a vegetaçªo
foi queimada. No Brasil Ø freqüente a
queima de cana-de-açœcar na prØ-
colheita (para auxiliar a colheita ma-
nual), e, em menor escala, a queima
dos resíduos da cultura
do algodªo, para contro-
le fitossanitÆrio. Embora
ocorra liberaçªo de CO
2
durante a queima da
cana-de-açœcar, as emis-
sıes desse gÆs nªo sªo
consideradas como uma
emissªo líquida ao longo
do tempo por esses siste-
mas, pois, no ciclo se-
guinte da cultura, o CO
2
emitido Ø reabsorvido (IPCC, 1996b).
No Brasil estima-se que a queima
de cana-de-açœcar e de resíduos de
algodªo herbÆceo, juntos, gerem emis-
sıes de 2,8 Tg de CO, 0,1 Tg de CH
4
,
0,006 Tg de N
2
O e 0,2 Tg de NO
x
(Embrapa, 1999a). As emissıes de
gases provenientes da queima de cana-
de-açœcar correspondem a 97% des-
ses totais. A cultura do algodªo herbÆ-
ceo, alØm de apresentar produçıes
bem menores (cerca de 1,3 milhıes de
toneladas, em 1994, segundo IBGE
(1997)), proporcionalmente à cana-
de-açœcar (292 milhıes de toneladas),
tem empregado cada vez menos a
prÆtica de queima dos resíduos após a
colheita. Entre as medidas possíveis
para reduzir as emissıes de gases
provenientes da queima de resíduos
agrícolas no Brasil destacam-se: a)
corte mecânico da cana-de-açœcar e
aproveitamento energØtico da biomas-
sa, com consequente diminuiçªo de
desperdícios de matØria vegetal e ener-
gia; b) a reduçªo de queimadas de
culturas e de seus resíduos; c) uso de
prÆticas agrícolas de conservaçªo dos
solos; d) aplicaçªo e implantaçªo de
legislaçªo relacionada com
o controle de queimadas nas
unidades de federaçªo.
PecuÆria
Herbívoros ruminantes,
como bovinos, ovinos, bu-
balinos e caprinos produ-
zem metano atravØs da fer-
mentaçªo entØrica, um pro-
cesso digestivo que ocorre
no rœmen. As emissıes glo-
bais desse gÆs geradas a
partir dos processos entØri-
cos sªo estimadas em 80 milhıes de
toneladas anuais, correspondendo a
cerca de 22% das emissıes totais de
metano geradas por fontes antrópicas
Figura 3: Principais fontes
antrópicas de emissıes de óxido
nitroso (N
2
O) para a atmosfera
(baseado em IPCC, 1995)
Figura 2: Fontes globais de
emissªo de metano proveni-
ente de atividades antrópicas
(baseado em IPCC, 1995)
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 41
(U.S.EPA, 2000) (Figura 2).
A produçªo de metano dÆ-se tam-
bØm a partir dos dejetos animais, prin-
cipalmente quando manipulados na
forma líquida, em condiçıes de anae-
robiose. As emissıes globais de meta-
no provenientes dessa fonte sªo esti-
madas em cerca de 25 milhıes de
toneladas por ano (IPCC, 1995), cor-
respondendo a 7% das emissıes totais
de metano.
No Brasil, 68% da pecuÆria Ø repre-
sentada por bovinos (87% de corte e
13% de leite, aproximadamente), com
pouco mais de 163 milhıes de animais
em 1998 (IBGE, 2000), sendo conside-
rado o maior rebanho bovino do
mundo com fins comerciais. Grande
parte desses animais Ø do tipo zebuí-
no, criados em sistemas predominan-
temente extensivos, de baixo investi-
mento de capital (Foto 3). O aumento
da produçªo animal tem sido devido,
em grande parte, ao elevado nœmero
de animais e nªo tanto da produtivida-
de. A produtividade mØdia anual de
leite no país, como exemplo, Ø de
pouco mais de 1.000 kg/vaca/ano,
para um total de 17 milhıes de vacas
ordenhadas, segundo dados do Insti-
tuto Brasileiro de Geografia e Estatís-
tica - IBGE), e, mesmo assim, a produ-
çªo nacional, em 1998, totalizou cerca
de 20 bilhıes de litros.
Do total das emissıes de metano
no Brasil, a pecuÆria, atravØs da fer-
mentaçªo entØrica e dos dejetos, con-
tribui com cerca de 96% do total, com
emissıes estimadas em 9,7 Tg de CH
4
,
em 1994 (Embrapa, 1999b). Desse
total, a pecuÆria bovina contribui com
96% das emissıes, sendo que as ou-
tras categorias de animais (bubalinos,
muares, caprinos, asininos, eqüinos,
suínos), juntas, sªo responsÆveis pe-
los 4% restantes das emissıes de me-
tano. As emissıes provenientes de
suínos sªo consideradas negligenciÆ-
veis (1kg CH
4
/animal/ano).
Os fatores de emissªo de metano,
que sªo obtidos a partir do consumo
de alimento e da taxa de sua conver-
sªo em metano, variam em funçªo do
sistema de produçªo e das caracterís-
ticas dos animais. Para bovinos de
leite, por exemplo, os valores mØdios
de fatores de emissªo podem variar de
81 a 118 kg de metano/animal/ano na
AmØrica do Norte e em países do leste
europeu, respectivamente, enquanto,
em países africanos e asiÆticos, esti-
mam-se emissıes entre 36 a 56 kg de
metano/animal/ano (IPCC, 1995).
A intensidade da emissªo de meta-
no depende do tipo de animal, da
quantidade e grau de digestibilidade
da massa digerida e do esforço ao qual
o animal Ø submetido. Em bovinos, a
taxa de conversªo em metano Ø esti-
mada, em mØdia, em 6% da energia
bruta do alimento ingerido. Desde
que a produçªo de metano varia de
acordo com a quantidade e qualidade
do alimento digerido (U.S.EPA,
1990a,b), as vÆrias modalidades e con-
diçıes de sistemas de criaçªo de ani-
mais domØsticos implicam fatores di-
ferentes de emissªo de metano.
As opçıes de reduçªo das emis-
sıes de metano na atividade pecuÆria
estªo associadas ao aumento da pro-
dutividade animal, com o objetivo de
se obterem maiores valores de produ-
çªo animal por quantidade de metano
emitido.
Ruminantes manejados extensiva-
mente podem ter suas emissıes redu-
zidas por meio da melhoria da diges-
tªo fermentativa no rœmen, adminis-
trando-se dietas a base de urØia e de
proteínas e fornecendo nutrientes vi-
tais. No Brasil, onde a maior parte das
emissıes de metano provŒm de Æreas
extensivas de pastagem, a suplemen-
taçªo alimentar de gado em pasto com
proteínas constitui um fator limitante
para significante parte das proprieda-
des rurais. Devem ser, pois, investiga-
das alternativas alimentares, em fun-
çªo dos recursos naturais, condiçıes
climÆticas e estrutura sócio-econômi-
ca específicas de cada regiªo. O au-
mento da produtividade animal por
meio de suplementaçªo alimentar,
controle de zoonoses, melhoramento
genØtico e de taxas de reproduçªo, e
outras melhorias, pode contribuir para
a estratØgia de reduçªo das emissıes
de metano por unidade de produto
(Embrapa, 1999d). Com esse intuito,
programas governamentais de apoio
à produçªo animal, muitos deles atu-
almente em fase de implementaçªo,
sªo fundamentais para o alcance deste
objetivo. Abioengenharia de alimen-
tos Ø uma oportunidade a ser explora-
da no melhoramento da eficiŒncia dos
processos microbianos com vistas à
otimizaçªo da digestªo de fibras no
rœmen e síntese microbiana. Outras
possibilidades incluem o desenvolvi-
mento de organismos que oxidam
metano ou outros sumidouros de hi-
drogŒnio no rœmen, usando engenha-
ria genØtica (Embrapa, 1999b).
O desenvolvimento de modernas
tØcnicas de mediçªo e de monitora-
mento das emissıes de gases traço
tŒm propiciado a avaliaçªo das emis-
sıes de metano em pequenos e gran-
des ruminantes, sob diferentes siste-
mas de produçªo. Para animais man-
tidos em regime de pastagens, desta-
ca-se a tØcnica do traçador (interno)
hexafluoreto de enxofre (SF
6
) (John-
son & Johnson (1995)). Nessa tØcnica,
um dispositivo de permeaçªo, que
libera o SF
6
 a uma taxa conhecida, Ø
colocado no rœmen do animal, de
modo que amostras de metano sªo
coletadas nas proximidades da boca e
do nariz do animal (Foto 4- Foto do
Tom Wirth, USEPA). Assume-se nes-
se mØtodo que o padrªo de emissªo
de SF
6
 simule o padrªo de emissªo de
CH
4
. As concentraçıes do metano e
do traçador sªo entªo determinadas
pela cromatografia gasosa ou outro
mØtodo de quantificaçªo. A partir da
taxa conhecida de liberaçªo do traça-
dor no rœmen e das concentraçıes de
metano e do traçador nas amostras de
gÆs, calcula-se o metano produzido
pelo animal (U.S.EPA, 2000). Outros
mØtodos de mediçªo empregados sªo:
mØtodo de câmara fechada, (para ani-
mais confinados), mØtodo de traçador
externo e mØtodo micrometeorológi-
co.
Por meio de estimativas acuradas
das taxas de emissªo de metano deri-
vada de ruminantes, bem como do
seu monitoramento, com base no uso
Foto 1: Cultivo de arroz irrigado
por inundaçªo – fonte antrópica
de emissªo de metano para a
atmosfera
42 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
de tØcnicas como as acima descritas, Ø
possível se estabelecerem diferentes
estratØgias de manejo animal voltadas
para a reduçªo das emissıes de meta-
no por unidade de produto (leite,
carne, etc.).
Solos Agrícolas
Os solos sªo um importante reser-
vatório de carbono ativo, orgânico e
inorgânico, e desempenham um im-
portante papel no ciclo do carbono
global. A agricultura tem sido respon-
sÆvel por significativas perdas de car-
bono pelo solo, atravØs de prÆticas
agrícolas de baixa sustentabilidade
ambiental. Entre essas prÆticas, citam-
se a araçªo excessiva, gradeaçªo e
desmatamentos, que expıem os solos
a processos de erosªo e compactaçªo
e, por conseguinte, à reduçªo dos
níveis de matØria orgânica no solo.
AlØm disso, fatores como a fertilizaçªo
inadequada, a queima de restos cultu-
rais e o cultivo intensivo das terras,
contribuem para o aumento dessas
perdas. Em contraste, prÆticas agríco-
las que restauram a capacidade dos
solos como reservatório de carbono
incluem: reflorestamento, cultivo de
culturas perenes (culturas extrativis-
tas, como seringueira, cacau, casta-
nhas, fruticultura, etc.), uso adequado
de fertilizantes químicos e adubos
orgânicos, pastagens bem manejadas,
agrofloresta e prÆticas de conservaçªo
do solo (Embrapa, 1999d).
Os reflorestamentos estocam car-
bono e, se mantidos intactos ou se
seus produtos florestais forem usados
em aplicaçıes durÆveis, essa estoca-
gem adicional pode ser significativa. A
produtividade de florestas de folho-
sas, como o eucalipto, no Brasil, Ø
uma das mais elevadas do mundo
(30m3/ha/ano), contribuindo para a
fixaçªo de carbono em cerca de 9 ton
C/ha/ano (Sociedade Brasileira de Sil-
vicultura, 1999), o que evidencia o
potencial do setor para fixar carbono
atmosfØrico. Sistemas agroflorestais,
mediante a utilizaçªo de prÆticas sus-
tentÆveis de manejo de florestas, po-
dem tambØm ser uma importante con-
tribuiçªo à mitigaçªo do efeito estufa,
à medida que sªo evitadas emissıes
por atividades mais predatórias (des-
matamento e queima de florestas),
ficando grande parte do carbono esto-
cado no sistema solo-vegetaçªo.
A implantaçªo de florestas (reflo-
restamentos) ou culturas permanen-
tes em Æreas degradadas por ativida-
des agrícolas, alØm da recomposiçªo
vegetal de Æreas ribeirinhas e de pro-
teçªo ambiental (como as de risco de
erosªo, montantes de bacias de abas-
tecimento, etc.), sªo oportunidades
para capturar (ou sequestrar) carbono
atmosfØrico, ao mesmo tempo que
restauram outras propriedades ambi-
entais e influi em indicadores econô-
micos. Programas de reflorestamento
e recuperaçªo de Æreas de proteçªo
ambiental vŒm sendo implementadas
mais recentemente, em decorrŒncia
do estabelecimento de consórcios de
bacias hidrogrÆficas e de outras inici-
ativas governamentais e nªo governa-
mentais para a restauraçªo de Æreas
florestais, em diversos estados brasi-
leiros.
Os solos agrícolas constituem tam-
bØm uma das mais importantes fontes
de óxido nitroso (N
2
O) para a atmos-
fera, o que se dÆ por meio de adiçıes
de fertilizantes nitrogenados sintØti-
cos, da deposiçªo de dejetos animais
ricos em nitrogŒnio, da fixaçªo bioló-
gica de nitrogŒnio aumentada, e do
cultivo de solos orgânicos e minerais
atravØs da mineralizaçªo da matØria
orgânica. As emissıes de N
2
O dos
solos ocorrem como conseqüŒncia
dos processos microbiológicos de
desnitrificaçªo e nitrificaçªo, a partir
de nitrogŒnio mineral. A desnitrifica-
çªo2 , que Ø o processo mais importan-
te nesse caso, consiste na reduçªo
microbiana do nitrato (NO
3
-) a formas
intermediÆrias de N, e entªo a formas
gasosas (NO, N
2
O e N
2
) liberadas na
atmosfera (Embrapa, 1999c). As esti-
mativas globais de emissªo de N
2
O
indicam uma mØdia de 5,7 Tg N/ano
(IPCC, 1995), sendo que os solos cul-
tivados e os dejetos da pecuÆria con-
tribuem com quase 70% do total das
fontes (Figura 3). No Brasil, os dejetos
animais depositados nos solos consti-
tuem uma das principais fontes de
emissªo de óxido nitroso (0,1 Tg N/
ano). Algumas das medidas de redu-
çªo das emissıes de óxido nitroso
sªo: o uso eficiente de fertilizantes
sintØticos, o tratamento de dejetos
animais, manejo de nutrientes do solo,
uso de inibidores de nitrificaçªo, inte-
graçªo da agricultura e pecuÆria.
O setor agropecuÆrio pode contri-
buir para a mitigaçªo da mudança do
clima pela aplicaçªo de diferentes
prÆticas de reduçªo das emissıes de
gases de efeito e pela proteçªo e
expansªo de sumidouros e reservató-
rios de carbono. Os principais desafi-
os para o alcance desse objetivo resi-
dem: a) na identificaçªo de sinergias
entre os objetivos de aumento de
produtividade e o equilíbrio climÆtico
global; b) na produçªo de alimentos
limpos e seguros para o consumo
humano, com menor impacto ambi-
ental; c) na adoçªo de “boas prÆticas”
em sistemas agrícolas; d) no fomento
ao desenvolvimento de pesquisa bÆsi-
ca para compreender os processos,
prÆticas e tØcnicas que influenciam as
emissıes de gases nos diferentes agros-
sistemas, desde que uma produtivida-
de agrícola maior possa ser obtida
com o conhecimento e uso de melho-
res tØcnicas.
 Entre as açıes e estratØgias possí-
veis de ser empregadas como contri-
buiçªo à reduçªo de gases de efeito
estufa, destacam-se: a) recuperar Ære-
as degradadas, com o objetivo adicio-
nal de fixar carbono atmosfØrico; b)
adotar política agrícola orientada para
a conversªo de terras degradadas ou
Foto 2: Queima de cana-de-
açucar – prÆtica geradora de gases
de efeito estufa, como monóxido
de carbono (CO), metano (CH4),
óxido nitroso (N2O) e óxidos de
nitrogŒnio (NOx).
Foto: Humberto Rocha
2
 Desnitrificaçªo : NO
3
-
 => NO
2
 => 2NO => N
2
O => N2
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 43
abandonadas para uso florestal e re-
generaçªo de florestas, assim como
para propiciar meios e recursos para a
adoçªo de boas prÆticas agropecuÆri-
as e tecnologias; c)incentivar ativida-
des agroflorestais sustentÆveis, como
alternativa de exploraçªo de floresta
de forma nªo predatória e que, ao
mesmo tempo, favoreçam o estoque
de carbono nos solos e na vegetaçªo;
d) desenvolver tecnologias que inte-
grem objetivos de produtividade e
reduçªo das emissıes de gases; e)
fomentar o desenvolvimento de pes-
quisa para a compreensªo dos proces-
sos que influenciam o fluxo de gases
entre sistemas agropecuÆrios e a at-
mosfera; f) promover a melhoria de
informaçªo tØcnica, social e econômi-
ca, que subsidiem o delineamento das
características dos sistemas de produ-
çªo agrícola e animal geradores de
gases traço, permitindo açıes de mo-
nitoramento.
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apresentado ao MinistØrio da CiŒncia
e Tecnologia. Jaguariœna: Embrapa
Meio Ambiente.
Embrapa. 1999b. InventÆrio de
Emissıes de Gases de Efeito Estufa
provenientes de atividades agrícolas
no Brasil: emissıes de metano prove-
nientes da pecuÆria. Relatório tØcnico
apresentado ao MinistØrio da CiŒncia
e Tecnologia. Jaguariœna: Embrapa
Meio Ambiente.
Embrapa. 1999c. InventÆrio de
Emissıes de Gases de Efeito Estufa
provenientes de atividades agrícolas
no Brasil: emissıes de óxido nitroso
provenientes de solos agrícolas. Rela-
tório tØcnico apresentado ao MinistØ-
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Foto 3: Gado de corte em
sistema de produçªo extensivo
44 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
TØcnicas Moleculares em
SEMENTES
PESQUISA
Aplicaçªo de tØcnicas moleculares no controle de qualidade das sementes
Fotos cedidas pelas autoras
Maria Laene Moreira de Carvalho
PhD, Prof. Adjunta IV do Depto. de Agricultura-UFLA
Maria das Graças Guimarªes Carvalho Vieira
Prof. Titular do Depto. de Agricultura-UFLA
Édila de Resende Von Pinho
 Prof. Adjunto do Depto de Agricultura-UFLA
Universidade Federal de Lavras /UFLA/DAG
email: sementes@ufla.br
 termo “qualidade das se-
mentes” envolve aspec-
tos genØticos, físicos, fisi-
ológicos e sanitÆrios que,
avaliados de maneira in-
tegrada, propiciam o conheci-
mento do valor real e do poten-
cial de utilizaçªo de um lote de
sementes.
A pesquisa na Ærea de
biologia molecular associada ao
controle de qualidade de se-
mentes tem evoluído rapidamen-
te e novas tØcnicas tŒm-se mos-
trado œteis na obtençªo de clas-
ses distintas de marcadores mo-
leculares que auxiliam na eluci-
daçªo dos fatores que afetam a
qualidade, na manipulaçªo e
identificaçªo do material genØti-
co, assim como na preservaçªo
desses materiais. Tais tØcnicas permi-
tem o monitoramento durante todo o
processo produtivo, eliminando custos
e garantindo a qualidade.
Marcadores moleculares na
determinaçªo da qualidade
genØtica de sementes
O registro de diferentes cultivares e
os problemas que envolvem a comer-
cializaçªo nacional e internacional de
sementes fazem com que a habilidade
de distinguir e de identificar cultivares
se torne um ponto crucial para o mo-
nitoramento e controle desse comØr-
cio.
No Brasil, pela lei de no 9.456, de
1997, foi instituída a proteçªo de culti-
vares, que reconhece a propriedade
intelectual e os direitos ao titular de
materiais genØticos protegidos. Nessa
lei, a caracterizaçªo de forma precisa
da cultivar Ø um dos pontos essenciais
para garantir o direito de propriedade
intelectual. Para ser submetida à prote-
çªo, a nova cultivar, ou a cultivar
essencialmente derivada, deve se apre-
sentar distinta de outra, utilizando-se
para isto descritores homogŒneos quan-
to às suas características em cada estÆ-
dio de desenvolvimento e estÆveis
quanto à repetiçªo dessas característi-
cas ao longo de geraçıes sucessivas.
Atualmente, para submeter uma culti-
var à proteçªo, sªo usados marcadores
morfológicos, que apresentam uma
sØrie de inconvenientes, como a neces-
sidade de um grande nœmero desses
descritores, que, na sua maioria, serªo
identificados em nível de planta inteira
ou adulta; comoa necessidade de
amplo espaço físico para a avaliaçªo
do material; alØm de possíveis influŒn-
cias do ambiente no qual estªo inseri-
dos. Comparados aos morfoló-
gicos, os marcadores molecula-
res se mostram mais versÆteis,
rÆpidos e seguros. Os princi-
pais marcadores moleculares
utilizados para a identificaçªo
de cultivares e da pureza genØ-
tica envolvem a anÆlise de pro-
teínas e de DNA.
A utilizaçªo da eletroforese
de proteínas em identificaçªo
de cultivares se baseia no fato
de estas serem produtos dos
genes e, portanto, poderem ser
consideradas como marcado-
res para os genes que as codi-
ficam. Na maioria das espØcies, prote-
ínas de armazenamento de sementes
exibem considerÆvel polimorfismo com
relaçªo à carga, tamanho, ou ambos os
parâmetros. AlØm do mais, elas sªo
codificadas em vÆrios lócus, estªo pre-
sentes comparativamente em grandes
quantidades e sªo prontamente extraí-
veis. No caso de espØcies autógamas,
pode ocorrer uma base genØtica estrei-
ta, dificultando a certificaçªo da pureza
genØtica pelo uso dessa tØcnica. Nas
espØcies alógamas, as populaçıes de
indivíduos expressam uma ampla vari-
edade de caracteres fenotípicos. Estes
indivíduos podem ser geneticamente
distintos, contendo diferentes combi-
naçıes de lócus em homozigose e
heterozigose, incluídos aqueles que
codificam para proteínas de armazena-
mento e isoenzimas. Neste caso, Ø
indicada a anÆlise em “bulk”, para que
se tenha todo o genoma da populaçªo
representado.
FIGURA 1. Diferenciaçªo de
cultivares de cafeeiro por
RAPD, utilizando o primer OP-
I20. UFLA- Lavras, MG. 2000.
Acima de cada linha encontra-
se a denominaçªo das cultiva-
res. (Gentilmente cedido por
Padilha, L., aluna do curso de
Doutorado em Fitotecnia/
Sementes da UFLA)
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 45
As isoenzimas, por sua vez, devem
ser usadas com muito critØrio para este
fim, pois determinados sistemas enzi-
mÆticos podem apresentar variaçıes
em funçªo do estÆdio de deterioraçªo
em que as sementes se encontram ou
quando estªo presentes microrganis-
mos em associaçªo com as sementes.
Existem diversas tecnologias base-
adas no polimorfismo do DNA utiliza-
das para identificaçªo de cultivares e
determinaçªo da pureza genØtica em
lotes de sementes. A principal vanta-
gem do uso de DNA Ø que eles nªo sªo
afetados pelo ambiente, permitindo
uma anÆlise mais objetiva e precisa.
Entre as tØcnicas utilizadas, destacam-
se: RFLP (fragmentos de restriçªo de
segmentos polimórficos) RAPD (poli-
morfismo do DNA amplificado ao aca-
so); os microsatØlites ou SSRs (sequŒn-
cia simples repetida) e o AFLP (frag-
mentos de comprimento polimórfico
amplificado).
A tØcnica de RFLP propicia alto
nível de discriminaçªo entre indivídu-
os, alta reprodutibilidade e tem apre-
sentado resultados positivos quando
utilizado na identificaçªo de cultivares
de milho e soja. No entanto, para
espØcies como tomate e trigo, alguns
autores tŒm revelado que essa tØcnica
nªo detecta muita variaçªo, o que pode
inviabilizar sua utilizaçªo na identifica-
çªo e certificaçªo da pureza genØtica
dessas espØcies. A des-
peito dessas vantagens, a
anÆlise de RFLP Ø lenta,
requer grande quantida-
de de material da planta,
exige trabalho intensivo,
muito espaço em labora-
tório e apresenta custo
elevado, o que restringe
seu uso em programas de
controle de qualidade para
certificaçªo da pureza
genØtica.
MØtodos baseados em PCR (reaçªo
em cadeia da polimerase) tais como
RAPD, AFLP e SSR ou microsatØlites
tŒm sido preferencialmente utilizados
para anÆlise da pureza genØtica e uma
vez que pequenas quantidades de DNA
sªo requeridas, os perfis podem ser
obtidos mais rapidamente do que com
RFLPs. Desses mØtodos, o RAPD Ø o
menos aceito, devido ao baixo grau
relativo de complementaridade entre o
primer e a seqüŒncia de DNA alvo, o
que torna o teste de difícil padroniza-
çªo. O baixo anelamento relativo do
primer tambØm resulta em falhas na
amplificaçªo de algumas bandas pa-
rentais do híbrido em F1. Sobretudo
falhas na reprodutibilidade de resulta-
dos comprometem grandemente a pre-
cisªo e a praticidade do uso de RAPDs
para anÆlise de pureza genØtica, fazen-
do com que este mØtodo seja utilizado
com grande cuidado. No entanto, o
RAPD tem sido bastante usado em
etapas iniciais de diferenciaçªo (Fig1);
após a detecçªo de polimorfismo, os
produtos RAPD sªo clonados e se-
qüenciados, redesenhando primers
PCR, mais longos e entªo convertendo
esses marcadores “ao acaso” para regi-
ıes amplificadas caracterizadas por se-
qüŒncia (marcadores SCARs). Nesse
caso, a amplificaçªo da seqüŒncia es-
pecífica do DNA ocorre em temperatu-
ras de pareamento mais elevadas, o
que torna o processo mais reproduzí-
vel.
A tecnologia AFLP combina, em
parte, as tØcnicas RFLP e RAPD. Nesta
tØcnica, o DNA Ø clivado com enzimas
de restriçªo, e os fragmentos obtidos
sªo amplificados por PCR a partir de
primers complementares aos adapta-
dores que foram previamente ligados
às extremidades dos fragmentos. Des-
sa forma, a maioria das dificuldades
apresentadas em RAPD Ø resolvida,
pelo uso de condiçıes de alta adstrin-
gŒncia para o anelamento do primer
PCR. Ressalta-se no entanto, que tanto
RAPD quanto AFLP sªo marcadores
dominantes, o que torna sua utilizaçªo
um problema prÆtico para anÆlise de
pureza genØtica, uma vez que os hete-
rozigotos podem nªo ser detectÆveis.
Um exemplo de utilizaçªo da tØcnica
de AFLP para diferenciaçªo de cultiva-
res de algodoeiro pode ser visualizado
na Fig. 2.
Simples SeqüŒncias Repetidas (SSRs)
ou microsatØlites consis-
tem de pequenas seqüŒn-
cias , com 1 a 4 nucleo-
tídeos de comprimento,
repetidas ao longo do
genoma, podendo ocor-
rer tanto em regiıes co-
dificadoras quanto em re-
giıes nªo codificadoras.
Devido a erros (inser-
çıes/deleçıes) durante
o processo de replicaçªo
do DNA, que normalmente ocorrem
com mais freqüencia nessas regiıes
repetidas do genoma, os microsatØlites
sªo normalmente polimorfos. As regi-
ıes com seqüŒncias simples repetidas
sªo amplificadas individualmente atra-
vØs de PCR, pela utilizaçªo de um par
de “primers” específicos que sªo com-
plementares às sequŒncias œnicas que
flanqueiam os microsatØlites. Essas re-
giıes do genoma que contŒm a se-
qüŒncia repetida devem ser inicial-
mente identificadas, isoladas e seqüen-
ciadas, o que demanda tempo e eleva
FIGURA 2. Diferenciaçªo de
cultivares de algodoeiro por
AFLP. UFLA – Lavras/MG, 2000.
As setas indicam distinçªo das
cultivares colorida e precoce,
das demais.(Gentilmente cedida
por Mann,R.S., aluna do curso
de Doutorado Fitotecnia /
Sementes / UFLA)
FIGURA 3. Padrıes de
microssatØlites de linhagens e
híbrido de milho pelo primer
bnlg2291 em folhas e sementes
(5 repetiçıes). UFLA, Lavras,
MG. 2000. (Gentilmente cedida
por Salgado, K.C.C., aluna do
curso de mestrado em
Fitotecnia/Sementes/UFLA.)
46 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
o custo operacional. Ao contrÆrio do
RAPD e AFLP, lócus SSR sªo codomi-
nantes, multialØlicos, ou seja, todos os
alelos de um determinado lócus po-
dem ser detectados e discrimina-
dos, alØm de serem somaticamen-
te estÆveis. Apesar da tecnologia
SSR ser onerosa em sua implemen-
taçªo, hÆ de se ressaltar que, no
caso de plantas, estªo à disposi-
çªo, no mercado, pares de “pri-
mers” para diversas espØcies de
interesse econômico, o que viabi-
liza o seu uso na identificaçªo e
anÆlise de pureza genØtica. Marca-
dores SSRs tambØm tŒm sido utili-
zados para detectar a contamina-
çªo genØtica em campos de produçªo
de sementes (Fig 3).
Apesar da recomendaçªo do uso de
marcadores bioquímicos pela Interna-
tional Seed Testing Association (ISTA)
e pela Assocation of Official Seed
Analysts (AOSA) e da gama de tØcnicas
disponíveis, a escolha do mØtodo mo-
lecular a ser utilizado vai depender da
estrutura genØticade cada espØcie, do
seu modo de reproduçªo, do tamanho
do seu genoma e, sem dœvida, da
relaçªo custo/benefício. HÆ de se res-
saltar ainda a necessidade de investi-
mentos nestas tecnologias, de forma
que sejam adaptadas e postas à dispo-
siçªo para uso em anÆlises rotineiras de
laboratório.
Marcadores moleculares na
determinaçªo da qualidade
fisiológica de sementes
TŒm sido desenvolvidas pesqui-
sas para detectar as diversas reaçıes
metabólicas que envolvem síntese
e degradaçªo de molØculas durante
o desenvolvimento, a germinaçªo e
a deterioraçªo de sementes. No
processo de morfogŒnese tem sido
utilizado marcadores moleculares,
como a β-tubulina, com a finalidade de
acompanhar as seqüŒncias de proces-
sos que ocorrem durante a divisªo
celular. A atividade da β-tubulina pode
ser detectada pelas tØcnicas de imuno-
detecçªo ( Fig 4). Esse tipo de anÆlise
tem grande aplicaçªo em pesquisas
relacionadas com envigoramento de
sementes e em estudos de tolerância a
dessecaçªo.
Durante a fase de maturaçªo das
sementes, a anÆlise do acœmulo de
materiais de reserva por meio de mar-
cadores moleculares pode fornecer in-
dícios da qualidade das sementes. Pro-
teínas termoestÆveis como as LEA pro-
teinas (Late Embriogenise Abundant)
tŒm sido utilizadas como um dos indi-
cativos de tolerância à dessecaçªo, e a
atividade da enzima α-amilase, como
marcador relacionado com a tolerância
à secagem de sementes de milho.
Isoenzimas tambØm podem ser utili-
zadas como marcadores de dormŒncia,
germinaçªo e deterioraçªo. A enzima
α-amilase tem se apresentado eficiente
para monitorar a intensidade de dor-
mŒncia de sementes de arroz ao longo
do armazenamento (Fig 5), e a endo-β-
mananase, como marcador no proces-
so de germinaçªo.
A perda da viabilidade das sementes
no processo de deterioraçªo Ø precedi-
da por reduçªo na capacidade de sinte-
tizar proteínas, devido ao declínio
de componentes como ribossomos,
RNA mensageiro e alteraçıes em
nível de transcriçªo e traduçªo, com
o envelhecimento das sementes.
A integridade e o metabolismo celu-
lar dependem da grande variedade
de enzimas e proteínas estruturais de
cada espØcie. Desta forma, os testes
mais sensíveis para determinar o
estÆdio de deterioraçªo sªo aqueles
que medem a atividade de certas
enzimas associadas com a quebra
das reservas ou com a biossíntese de
tecidos novos. As proteínas de armaze-
namento tambØm podem sofrer mudan-
ças resultantes de quebras parciais ou de
degradaçªo para subunidades.
A atividade específica de enzimas e
a integridade das proteínas de armaze-
namento tŒm sido determinada por meio
de tØcnicas de eletroforese e usadas
como marcadores do processo de dete-
rioraçªo das sementes. As enzimas mais
pesquisadas nesse sentido sªo aquelas
que atuam no processo de respiraçªo, a
exemplo da malato desidrogenase, ou
aquelas envolvidas no metabolismo de
ligaçªo nitrogŒnio-carbono, (fundamen-
tal no processo de germinaçªo de se-
mentes), como a glutamato desidro-
genase ou ainda aquelas que possu-
em funçıes específicas no metabolis-
mo dos lipídeos, como Ø o caso das
esterases. Ainda tem sido considera-
do o estudo da atividade de enzimas
removedoras de peróxidos como as
peroxidases, catalases, peroxido dis-
mutase, entre outras, e enzimas liga-
das à destruturaçªo do sistema de
membranas, a exemplo da esterase,
fosfatase Æcida e alcalina (Fig 6). JÆ as
proteínas de armazenamento tŒm sido
utilizadas para detecçªo de estÆgios mais
avançados de deterioraçªo.
No intuito de melhorar o desempe-
nho de sementes com determinados
níveis de deterioraçªo, tem-se trabalha-
do por meio da restriçªo hídrica (pri-
ming). Para o monitoramento desta tØc-
nica, a eletroforese de isoenzimas espe-
cíficas (Fig 7) vem sendo recomendada.
Muitas vezes podem ocorrer manifesta-
çıes bioquímicas indesejÆveis em fun-
çªo do mØtodo de condicionamento
empregado, o que pode ser detectado
pelos perfis eletroforØticos de enzimas
envolvidas na rota anaeróbica, a exem-
FIGURA 4. Acumulaçªo de β
tubulina em embriıes de
sementes de tomate durante a
germinaçªo. (Gentilmente
cedido por Delmondez, R.,
bolsista recØm-Doutor em
Fitotecnia/ Sementes da UFLA)
Figura 5. Perfis eletroforØticos de
atividade enzimÆtica da α-amilase,
em sementes de arroz recØm-
germinadas, antes e após o
armazenamento. UFLA, Lavras-
MG, 2000. (Gentilmente cedido
por Vieira, A.R. Doutor em
Fitotecnia/ Sementes da UFLA)
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 47
plo da Ælcool desidrogena-
se.
Em œltima anÆlise, fica
evidenciado que o uso de
marcadores moleculares
para avaliaçªo da qualida-
de fisiológica das semen-
tes, apesar de jÆ ter tido um
avanço expressivo, ainda
requer muitas pesquisas,
antes de que seja estabelecido como
ferramenta decisiva em programas de
controle de qualidade.
Marcadores moleculares
na determinaçªo da
qualidade sanitÆria
Os mØtodos tradicionais para iden-
tificaçªo de fungos envolvem estudos
de sua morfologia na planta infectada
e nos meios de cultura. Esses mØtodos
sªo geralmente demorados e podem
ser pouco conclusivos ou levar a erros
de interpretaçªo.
TØcnicas moleculares, baseadas na
imunologia e anÆlises de Æcidos nuclØi-
cos tŒm sido aplicadas em diversas
Æreas da micologia, o que tem gerado
grandes perspectivas para o desenvol-
vimento de mØtodos rÆpidos, sensíveis
e específicos no diagnóstico de pató-
genos de plantas, comumente transmi-
tidos por sementes. Por um grande
período de tempo, as isoenzimas e
proteínas foram os marcadores mole-
culares mais escolhidos. Recentemen-
te, com o advento cada vez mais rÆpido
do conhecimento em ciŒncias, outras
tØcnicas baseadas em molØculas de
DNA e RNA foram disponibilizadas.
RFLP foi a principal tØcnica mole-
cular utilizada para identificaçªo de
isolados fœngicos antes da reaçªo de
polimerase em cadeia, no entanto,
apresenta algumas desvantagens, como
requerer grande quantidade de DNA
para visualizaçªo em autoradiografia,
DNA de alta qualidade, intacto e sem
inibidores de enzimas de restriçªo.
Marcadores moleculares baseados
em microssatØlites podem ser obtidos
para a discriminaçªo de tÆxons. Este
mØtodo jÆ foi testado em fungos, de-
tectando polimorfismo inter e intraes-
pecíficos nos patógenos. Apesar da
utilizaçªo desta tØcnica ter auxiliado na
identificaçªo e caracterizaçªo de fun-
gos, ela apresenta a desvantagem de
necessitar do conhecimento prØvio das
seqüŒncias do organismo a ser estuda-
do, para a construçªo dos primers.
O RAPD tem-se apresentado
como um mØtodo viÆvel, e tem detec-
tado variaçıes em muitos organismos
(Fig 8). Apesar de seu problema de
repetiçªo, existe a possibilidade de,
aliado a este, usar-se SCARs, onde
fragmentos sªo seqüenciados e pri-
mers maiores construídos. Esses pri-
mers sªo mais longos e específicos
para um lócus, o que possibilita a sua
utilizaçªo por diferentes laboratórios.
Outro mØtodo que pode ser utiliza-
do e que tem algumas vantagens sobre
o RAPD, Ø o AFLP. Uma vantagem
significante do AFLP sobre o RAPD Ø
que muitos fragmentos sªo gerados e,
conseqüentemente, mais ban-
das podem ser detectadas com
uma simples amplificaçªo.
Para algumas espØcies de
fungos, tem-se ainda utilizado
outros recursos, como a anÆlise
de DNA mitocondrial o que
tem permitido a identificaçªo
entre isolados, apesar de em
alguns casos apenas possibili-
tar diferenciaçªo entre espØcies.
A anÆlise da regiªo ITS (Internal
Transcribed Spacers) Ø indicada para a
identificaçªo de espØcies de microrga-
nismos, inclusive nos casos em que a
taxonomia Ø controvertida, pois esta
regiªo Ø pouco variÆvel em estudos
intra-específicos, e apresenta variabili-
dade em torno de 0-2%.
A escolha das melhores tØcnicas
para avaliaçªo da qualidade genØtica,
fisiológica ou sanitÆria de lotes de se-
mentes, depende de vÆrios fatores, in-
cluídasa finalidade da anÆlise, as carac-
terísticas das espØcies e a relaçªo custo/
benefício. O desenvolvimento de tØcni-
cas moleculares tem evoluído de modo
extremamente rÆpido, possibilitando
maior segurança e confiabilidade dos
resultados na avaliaçªo e no controle da
qualidade de sementes.
FIGURA 6. Padrıes enzimÆticos
da fosfatase Æcida de Aspergillus
glaucus, Aspergillus flavus e de
sementes de algodoeiro inocula-
das e nªo inoculadas com
ambos os fungos separadamente
e submetidos a envelhecimento
artificial. UFLA – Lavras – MG,
1995
FIGURA 7. Padrıes isoenzimÆti-
cos de sementes de cafeeiro
submetidas a diferentes potenci-
ais hídricos nos tempos de 3 e 6
dias, reveladas para Ælcool
desidrogenase (ADH). UFLA,
Lavras - MG, 1998. (Gentilmente
cedido por Camargo, R., aluno de
doutorado em Fitotecnia/ Semen-
tes da UFLA)
FIGURA 8. Padrıes de ampli-
ficaçıes obtidos com DNA
extraído de 3 isolados de C.
gossypii e 1 isolado de C.
gossypii var. cephalosporioides.
Nas linhas, a seqüŒncia dos
isolados 1, 2 e 3 (C. gossypii) e
do isolado 4 (C. gossypii var.
cephalosporioides), 1o grupo
de 4 foram amplificados pelo
primer A
4
 e o 2o grupo, pelo
primer A
7
. UFLA – MG 1998
48 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
to, fatores relacionados com a disse-
minaçªo da doença, freqüentemen-
te associados à pobreza, mudaram o
quadro de euforia para um cenÆrio
de recrudescimento do flagelo. Tal
situaçªo agrava-se com o apareci-
mento de bacilos resistentes às dro-
gas habituais, fruto, na maioria das
vezes, de tratamentos irregulares,
com grandes percentuais de aban-
dono. O problema pode ser reversí-
vel desde que sejam tomadas medi-
das urgentes e inovadoras em vÆrias
frentes. O CPT, dando sua parcela
de contribuiçªo para a soluçªo des-
ses problemas, desenvolveu tecno-
logias avançadas para testes prØ-
clínicos de novos medicamentos an-
timicobacterianos e coloca à dispo-
siçªo das Universidades, Institutos
de Pesquisas e Empresas FarmacŒu-
ticas a possibilidade de testar produ-
tos obtidos por cada uma dessas
Instituiçıes.
A TB – um problema secular às
portas do terceiro milŒnio
Na sua marcha desafiadora a TB
atingiu em âmbito mundial, e nos
tempos atuais, 10 milhıes de casos
novos, com 3 milhıes de mortes por
ano, representando 18,5% de todas
as mortes em adultos entre 15-59
anos - a fase mais produtiva da
populaçªo mundial. Cerca de meta-
de dos doentes nunca tiveram trata-
mento. Segundo a OMS, 32% da
populaçªo mundial estÆ infectada
com o bacilo da TB e, portanto, com
maior risco de adoecer por reativa-
çªo e, tambØm, por infecçªo exóge-
na. Entre 1850 e 1950, um bilhªo de
pessoas morreram de TB. Na dØcada
passada, 300 milhıes de pessoas
foram infectadas, 90 milhıes de no-
vos casos da doença apareceram e
30 milhıes de pessoas morreram.
Morreram mais pessoas de TB em
1996 do que em qualquer ano da
história. As perspectivas para elimi-
nar o bacilo da tuberculose do gran-
de nœmero de indivíduos infectados
– um terço da populaçªo mundial,
sªo baixas. O bacilo se aloja com
maior freqüŒncia no pulmªo, por
tempo indefinido, mas pode infectar
outros órgªos, permanecendo con-
tido pelas cØlulas de defesa do orga-
nismo. Em decorrŒncia da diminui-
çªo da resistŒncia orgânica (desnu-
triçªo, subnutriçªo, estresse ou asso-
ciaçªo de outras doenças), o bacilo
tende a se reproduzir intensamente
e pode levar o indivíduo à morte,
caso nªo seja tratado devidamente.
A primeira droga contra a TB, a
estreptomicina, foi descoberta em
1946. Na dØcada de 50, outras dro-
gas foram pesquisadas e surgiram as
primeiras associaçıes medicamen-
tosas. Naquela Øpoca, acreditava-se
que a erradicaçªo da doença estaria
próxima. Contudo, uma sØrie de
fatores estÆ contribuindo para a dis-
seminaçªo da TB, entre os quais
podemos destacar: a pobreza, o uso
incorreto da terapŒutica; o abando-
no do tratamento; a alta capacidade
infectante desses agentes; as via-
gens migratórias constantes; a ocor-
rŒncia de grandes aglomerados po-
pulacionais e a co-infecçªo pelo
HIV. Como o tratamento da doença
Ø feito exclusivamente por medica-
mentos, e os que estªo atualmente
em uso, alØm de causarem graves
efeitos colaterais, estªo sendo inefi-
48 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
O Centro de Pesquisas em Tu-
berculose (CPT) da Faculdade de
Medicina de Ribeirªo Preto – USP
anuncia a sua disponibilidade de
realizar ensaios prØ-clínicos de no-
vos medicamentos contra o bacilo
da tuberculose (TB). Todos os con-
tatos devem ser feitos com a Dra.
Ana Olívia de Souza (e-mail:
olivia@rpm.fmrp.usp.br) ou com o
Dr. CØlio Lopes Silva (e-mail
clsilva@fmrp.usp.br)
Desde que o alemªo Robert Koch
anunciou a descoberta do bacilo da
TB, em 1882, a prevençªo e o trata-
mento da doença desafiam cientis-
tas em todo o mundo. E pela dimen-
sªo que essa doença infecto-conta-
giosa tem alcançado na atualidade -
2 bilhıes de pessoas infectadas e 3
milhıes de mortes anuais - tornou
particularmente importante o de-
senvolvimento de um novo medica-
mento para o tratamento dessa en-
fermidade, por uma equipe de pes-
quisadores do CPT - USP, coordena-
da pelo professor CØlio Lopes Silva
e pela Dra. Ana Olívia de Souza.
Segundo a Organizaçªo Mundial de
Saœde, a TB Ø um flagelo milenar. No
passado, a doença foi disseminada
pelos fluxos migratórios e em decor-
rŒncia das guerras e da colonizaçªo
das novas terras descobertas a partir
do sØculo XV. Antes dos antibióti-
cos, o tratamento da TB era precÆrio,
com elevada taxa de mortes dos
indivíduos afetados. O advento da
quimioterapia, baseada nos antibió-
ticos, com índice esperado de cura
de atØ 95% dos casos, deu origem à
euforia pela possível erradicaçªo de-
finitiva da “peste branca”. No entan-
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 49
cientes contra cepas resis-
tentes, Ø indispensÆvel que
se desenvolvam novos me-
dicamentos, novos fÆrma-
cos ou novas formulaçıes
farmacŒuticas para o
combate à TB.
Informaçıes sobre as
atividades do CPT
AlØm do desenvolvimen-
to da terapia gŒnica, que Ø
usada, tanto para a pre-
vençªo como para o trata-
mento da TB jÆ instalada,
o CPT estÆ envolvido com
a realizaçªo de ensaios de
susceptibilidade de mico-
bactØrias a produtos sintØ-
ticos e a extratos e/ou
fraçıes purificadas de
plantas, fungos, bactØrias
do solo etc., abrangendo todas as
etapas na fase prØ-clínica da tria-
gem de uma droga candidata a
medicamento anti-TB. As tØcnicas
aplicadas nos ensaios seguem os
padrıes adotados internacional-
mente assim como os padrıes do
Centro de Controle e Prevençªo de
Doenças (CDC/EUA). A triagem
prØ-clínica Ø constituída de 4 eta-
pas. Na primeira etapa determina-
se a concentraçªo inibitória míni-
ma contra o bacilo utilizando o
sistema automatizado MB/Bact ou
a microdiluiçªo em placa. Nesses
testes, cepas de Mycobacterium sp
sªo submetidas diretamente em
contato com a açªo da droga em
teste. As drogas que atingem 90%
de inibiçªo do crescimento mico-
bacteriano passam para a segunda
etapa dos testes. Na segunda eta-
pa, os ensaios sªo repetidos para
confirmar a concentraçªo que ini-
be 99% do crescimento micobacte-
riano. Outro fator de extrema im-
portância e tambØm considerado
em nossos ensaios Ø a determina-
çªo da toxicidade de um compos-
to. Para essa finalidade, vÆrias li-
nhagens de cØlulas sªo utilizadas
nos ensaios para determinaçªo con-
centraçªo da droga que inibe 50% da
proliferaçªo celular e verificadas tam-
bØm a açªo das drogas sobre orga-
nelas celulares como lisossomas e
mitocôndrias. Com os resultados ob-
tidos nessa etapa, calcula-se o índice
de seletividade da droga utilizando-
se os parâmetros acima avaliados.
Como requisito para a droga ser
submetida aos testes da terceira eta-
pa, esse índice deve ser igual ou
superior a 10. As drogas seleciona-
das para a terceira etapa sªoavalia-
das sobre as micobactØrias localiza-
das dentro dos macrófagos – as
cØlulas que albergam o bacilo da TB
na infecçªo e na doença. Essa etapa
Ø crítica e de grande importância,
uma vez que, para a droga ser
efetiva, ela deve permear a membra-
na celular e atingir o interior do
macrófago onde a micobactØria estÆ
presente. A droga ainda deve resistir
às condiçıes do meio intracelular
para combater os bacilos. Muitas
drogas sªo inefetivas porque nªo
atingem o interior do macrófago ou
porque, de alguma forma, sªo de-
gradadas no citoplasma celular. Após
15 dias do início dos testes, determi-
na-se o nœmero de bactØrias que
sobreviveram, a concentraçªo bac-
tericida mínima, a capacidade da
droga em retardar o início do cresci-
mento micobacteriano após a remo-
çªo da droga, e a dose efetiva para
a reduçªo de 50% do crescimento
micobacteriano intracelular. As dro-
gas com atividade dentro dos pa-
drıes estabelecidos pelo CPT, avali-
adas frente a vÆrias cepas isoladas de
pacientes portadores de TB, e resis-
tentes a uma das drogas utilizadas na
quimioterapia da TB, passarªo para
a quarta etapa. Na quarta etapa, os
testes sªo realizados em animais de
experimentaçªo como camundon-
gos, cobaias e macacos. Eles sªo
experimentalmente infectados com
bacilos da TB e tratados com as
drogas em teste. Durante o trata-
mento, monitora-se o nœmero de
bacilos presentes em órgªos como o
baço e o pulmªo. Os dados obtidos
na quarta etapa indicam se uma
droga apresenta potencial terapŒuti-
co para a quimioterapia da TB e a
viabilidade de continuidade dos
ensaios na fase clínica.
Dr. CØlio Lopes Silva
clsilva@fmrp.usp.br
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 49
50 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
Desvendando o
Código GenØtico
PESQUISA
Um quebra-cabeça que começa a ser montado
Newton Portilho Carneiro
Ph.D. Biologia Molecular
newtonc@cnpms.embrapa.br
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG
AndrØa Almeida Carneiro
Ph.D. Biologia Molecular
andreac@cnpms.embrapa.br
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG
ClÆudia Teixeira Guimarªes
D.S. Biologia Molecular
claudia@cnpms.embrapa.br
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG
Edilson Paiva
Ph.D. Biologia Molecular
edilson@cnpms.embrapa.br
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG
Os genes sªo as unidades biológicas responsÆveis em determi-
nar as características de um organismo. Apesar de atualmente conhecer-
mos como as informaçıes contidas nos genes sªo codificadas em
proteínas, muitas dessas proteínas / genes nªo possuem uma funçªo
conhecida. Como descobrir a(s) funçªo(ıes) de uma proteína codificada
por um determinado gene? Proteínas podem ter funçıes enzimÆticas,
estruturais ou de reserva, a que iremos nos referir nesta discussªo, como
funçıes bioquímicas. Contudo, funçıes bioquímicas estªo encaixadas
em um contexto mais amplo, como por exemplo: proteínas participam
de processos de regulaçªo celular, de defesa, de tolerância a estresses,
etc, os quais serªo referidos neste texto como funçªo biológica de uma
proteína. Este artigo tem por objetivo descrever alguns dos mecanismos
utilizados para o estudo da funçªo bioquímica e biológica de proteínas
codificadas por um gene ou em grande escala, por grupos de genes.
Seqüenciamento de Genes –
Projetos Genomas
Existem basicamente dois tipos de
projetos genoma. Um chamado estru-
tural que Ø o seqüenciamento total do
genoma, e outro funcional, que se
baseia no seqüencimento apenas dos
genes expressos. A estratØgia mais
utilizada para genomas estruturais Ø a
chamada “shotgun”, que Ø uma se-
qüŒncia em grande escala de subclo-
nes de fragmentos de DNA jÆ mapea-
dos. Estudos estruturais de genomas
estruturais tŒm a principal vantagem
de combinarem o seqüenciamento e o
mapeamento físico dos genes, mas a
desvantagem de um elevado custo.
Considerando esse aspecto, estÆ sen-
do feito o seqüenciamento total do
genoma, apenas de organismos com
genomas pequenos ou daqueles que
jÆ tŒm grande financiamento. Por ou-
tro lado, o genoma funcional Ø base-
ado apenas no seqüenciamento dos
genes expressos e tem a vantagem de
poder caracterizar a expressªo tem-
poral e local dos genes. O seqüencia-
mento no genoma funcional Ø feito
em cerca de 800 pares de bases (bp)
de apenas uma das fitas de cDNA.
Considerando que as bibliotecas de
cDNA sªo montadas direcionalmente,
a maior parte do seqüenciamento Ø
feito a partir da extremidade 5’ do
cDNA, devido ser a mais informativa e
conservada. Embora possa haver er-
ros de leitura nas seqüŒncias geradas,
estes nªo comprometem, na maio-
ria dos casos, a identificaçªo dos
correspondentes genes. Desta for-
ma, milhares de seqüŒncias podem
ser determinadas com um limitado
investimento. A terminologia do in-
glŒs para etiqueta dos genes Ø cha-
mada de “Express Sequence Tags”
(ESTs).
O banco de dados de ESTs tem
mostrado ser uma grande fonte de
identificaçªo, principalmente da fun-
çªo bioquímica de muitos genes e
de funçıes biológicas que podem
ser inferidas com base na freqüŒn-
cia de certos genes, que sªo identi-
ficados em bibliotecas de cDNAs
construídas sob diferentes condi-
çıes. Exemplificando: uma proteí-
na X pode ser identificada como
uma quinase (funçªo bioquímica) atra-
vØs do seqüenciamento do gene que
a codifica e da comparaçªo com o
banco de dados. Se essa mesma pro-
teína for identificada apenas em teci-
dos ou orgªos que sofreram o ataque
de um patógeno Y , esse fato pode
levantar a suspeita de que a proteína
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 51
X esteja relacionada com os
processos de defesa contra o
organismo Y (funçªo biológi-
ca).
Atualmente (Outubro/
2000), mais de 5 milhıes de
seqüŒncias, correspondendo
a genes de vÆrios organismos
estªo disponíveis em bancos
de dados pœblicos. Os proje-
tos genomas, no início dos
anos 90, começaram seqüen-
ciando principalmente genes
abundantes e indicavam que
cerca de 60% das seqüŒncias
eram desconhecidos. Como
jÆ era de se esperar, pesquisa-
dores das mais diversas Æreas foram
depositando informaçıes de seqüŒn-
cias e suas funçıes no banco de da-
dos. Para muitos desses genes, as
funçıes foram determinadas pela uti-
lizaçªo da combinaçªo de uma sØrie
de estudos que envolveu caracteriza-
çªo de mutantes, níveis e localizaçıes
da expressªo gŒnica, modificaçıes de
substratos específicos, hibridaçªo in
situ, mapeamento, interaçªo proteína-
proteína in vitro e in vivo entre outros.
Essas seqüŒncias gŒnicas, cujas fun-
çıes jÆ estªo determinadas, servem de
suporte para a identificaçªo da funçªo
gŒnica de novas seqüŒncias deposita-
das em bancos de dados. Quantos
genes sªo desconhecidos hoje, com-
parando-se com o início dos
anos 90? A comparaçªo de
seqüŒncias pode ser feita a
nível de nucleotídeos, amino-
Æcidos ou de domínios funci-
onais. As anÆlises de compa-
raçªo sªo feitas enviando-se a
seqüŒncia editada para o ban-
co de dados e os resultados
sªo devolvidos em uma forma
chamada de “e value”. Quanto
menor esse valor, maior a si-
milaridade da seqüŒncia com
aquela presente no banco de
dados. Cabe ao pesquisador
responsÆvel determinar qual Ø
o limite mínimo para conside-
rar que uma seqüŒncia estÆ qualitativa
ou quantitativamente representada no
banco de dados pœblicos. Apesar do
sistema de bioinformÆtica estar bas-
tante sofisticado nesses projetos, Ø
difícil para um computador indicar o
que pode ser considerado um novo
gene, um membro de uma família
gŒnica ou variaçıes de um alelo. Hoje,
projetos genomas descrevem que para
um “e value” de 10-25 existem cerca de
35% de genes desconhecidos.
Existe um grande nœmero de pro-
jetos genomas sendo desenvolvidos
no mundo. Um resumo dos ESTs
depositados em banco de dados pœ-
blicos pode ser acessado no
endereço internet http://
www.ncb i .n lm.n ih .gov/
dbEST/dbEST_summary.html.
No Brasil, projetos genoma tŒmsido principalmente realizados
no Estado de Sªo Paulo, com o
auxílio da Fapesp (Fundaçªo
de Apoio à Pesquisa, do Estado
de Sªo Paulo).
Como um seqüenciamento
per si pode ser œtil na determi-
naçªo da biologia de um gene?
Dependendo do nœmero de
clones seqüenciados e das va-
riedades das bibliotecas de
cDNAs construídas, Ø possível
tirar conclusıes relacionadas à abun-
dância, expressªo temporal e espacial
de muitos genes. Apesar de muitos
desses seqüenciamentos serem feitos
a partir do final 5’ do gene, Ø possível
ter toda a regiªo codante do gene
devido à presença de clones de cD-
NAs derivados de mRNA de diferentes
tamanhos. A bioinformÆtica pode re-
conhecer um bom seqüenciamento,
retirar regiıes dos vetores, submeter
automaticamente a anÆlise do “Blast”
e montar “contigs” ou grupos de se-
qüŒncias que tenham “overlaps” e,
com isso, caracterizar membros de
uma família, alelos, “single nucleoti-
deo polymorphism” (SNPs) etc.
Nem sempre os projetos genomas
pœblicos descrevem as seqüŒn-
cias desconhecidas. A vanta-
gem de um banco de dados
disponibilizar as seqüŒncias
desconhecidas Ø a oportuni-
dade que um pesquisador
poder comparar as expres-
sıes de um gene em outros
organismos e de sugerir pro-
vÆveis funçıes. As seçıes a
seguir descrevem processos
usados para auxiliar a melhor
descriçªo da(s) funçªo(ıes)
gŒnica(s).
GenØtica Direta e Reversa
GenØtica direta Ø um processo que
envolve, inicialmente, a anÆlise do
fenótipo e depois o isolamento e a
identificaçªo do gene responsÆvel pela
característica. Genes tŒm sido isolados
por clonagem posicional, mutagŒnese
com inserçªo de transposons ou de T-
DNA, por escrutínio de bibliotecas de
Figura 1 - Mutaçªo por
antisenso. A – CØlula nªo
mutante contendo o gene “X”;
B – Construçªo contendo o
gene “X” na orientaçªo
antisenso; C - CØlula “A” trans-
formada com construçªo “B”.
CØlula da Planta Mutante na
Proteina X
Figura 2 - Co-supressªo de
promotor. O experimento de
SDS-PAGE demonstra
que a proteína “X” nªo existe
mais na planta transgŒnica
contendo a construçªo gŒnica
52 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
DNA expresso e por tØcnicas
de expressªo diferencial (diffe-
rental display).
Com o aumento da capaci-
dade de clonar, modificar e
examinar as atividades biológi-
cas de segmentos de DNA, a
caracterizaçªo de um gene pode
tambØm ser realizada pela uti-
lizaçªo de uma rota inversa,
denominada de genØtica rever-
sa. Esse novo processo parte
de um gene cuja estrutura mo-
lecular Ø conhecida e procede
por explorar a contribuiçªo do
gene para um determinado fe-
nótipo. Assim sendo, um cami-
nho experimental parte do gene
como uma seqüŒncia de nucle-
otídeos para a sua funçªo cor-
respondente. Sendo a seqüŒncia do
gene conhecida, sua funçªo pode ser
desvendada pela sua inativaçªo por
meio da recombinaçªo homóloga com
uma seqüŒncia defeituosa, ou pela
diminuiçªo da sua expressªo por tØc-
nicas de antisenso ou de co-supres-
sªo.
 TØcnicas de GenØtica Reversa
Usadas para Manipular Genes e
para Produzir Organismos
Mutantes
Mutaçªo por Perda da
Funçªo GŒnica
Nesse próximo seguimento de-
monstraremos como tØcnicas de re-
combinaçªo homóloga, antisenso e
co-supressªo podem ser empregadas
para mutar um gene conhecido, fa-
zendo com que ele se torne nªo fun-
cional e a importância das plantas
transgŒncias como importantes ferra-
mentas cientifícas para auxiliar na iden-
tificaçªo da funçªo gŒnica.
Recombinaçªo Homóloga
A recombinaçªo homóloga Ø a
alteraçªo de uma pequena parte da
seqüŒncia de um gene de interesse
que geralmente Ø feita com a incorpo-
raçªo de um gene marcador e a rein-
troduçªo desse gene mutado no orga-
nismo de origem. Uma vez dentro do
organismo de interesse, o gene muta-
do tem a capacidade de substituir o
gene nativo pela recombinaçªo ho-
móloga, criando um organismo mu-
tante. Um gene marcador pode ser o
gene bar de seleçªo para o herbicida
fosfinotricine (PPT). As plantas con-
tendo o gene modificado com o mar-
cador sªo selecionadas na presença
do herbicida e, após ficar demonstra-
do a incorporaçªo do gene modifica-
do no genoma da planta transforma-
da, essa Ø autofecundada e, por estu-
dos moleculares, Ø possível identificar
a planta que tenha apenas o alelo
modificado (homozigose). A
planta homozigota para o gene
modificado de interesse pode
apresentar ou nªo um fenótipo
aparente, mas as plantas com
os fenótipos mutantes eviden-
tes podem proporcionar uma
forma rÆpida de correlacionar
o fenótipo com o gene modifi-
cado. MØtodos de distœrbio da
funçªo gŒnica, via recombina-
çªo homóloga tŒm sido descri-
tos para leveduras e ratos, sen-
do poucos os casos descritos
em plantas. Uma aplicaçªo com
sucesso da recombinaçªo ho-
móloga, em plantas foi a de-
monstrada para o gene AGL
MADS-box, em Arabidopsis.
Antisenso
A metodologia do antisenso envol-
ve a introduçªo, na cØlula, de molØcu-
las de RNA ou de DNA, construídas
artificialmente, que sejam complemen-
tares (antisenso) ao RNA mensageiro
(mRNA) do gene de interesse. Uma
das hipóteses para explicar o motivo
pelo qual o RNA antisenso pode cau-
sar mutaçıes no organismo transfor-
mado Ø o fato de que estas molØculas
de RNA ou de DNA artificiais se ligam
ao mRNA celular, inativando-o (Fig.
1). Usando essa tecnologia, o antisen-
so do gene da chalcone sintase (chs),
responsÆvel pela pigmentaçªo das flo-
res, foi introduzido em plantas de
petœnia e de tabaco, resultando em
plantas com alteraçªo na pigmenta-
çªo das suas flores (fenótipo mutan-
te). Sheehy et al. (1988) tambØm usa-
ram a tecnologia do antisenso para
inibir a produçªo de enzimas respon-
sÆveis pelo desenvolvimento do fruto
do tomate, produzindo, assim, um
tomate mutante com o amadureci-
mento retardado.
 Co-supressªo
Na tØcnica de co-supressªo, um
gene de interesse Ø engenheirado por
meio de tØcnicas de biologia molecu-
lar, para superexpressar uma proteína
de interesse. Uma vez que a cØlula
possui uma maquinaria minuciosa-
mente ajustada, qualquer alteraçªo
nos níveis de expressªo de uma pro-
teína produz uma grande confusªo
Figura 3 - Identificaçªo de um
gene utilizando transposon por
meio de genØtica direta. A
grande maioria dos indivíduos
F1 do cruzamento entre um
indivíduo “A” contendo um
transposon ativo com o indiví-
duo mutante de interesse “B”
serªo normais devido à comple-
mentaçªo do alelo normal da
linhagem “A”, contudo, em uma
freqüŒncia baixa na populaçªo
F1, o transposon estarÆ inserido
no locus do indivíduo “A”
corresponde ao gene mutado do
indivíduo “B”. Nesse caso, o
indivíduo F1 serÆ semelhante ao
indivíduo “B”. Dessa forma o
alelo mutado do indivíduo “B”
pode ser substituído pelo
transposon, um marcador
conhecido, atravØs de cruzamen-
tos, e o gene de interesse
identificado atravØs da constru-
çªo de uma biblioteca genômica
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 53
nos mecanismos de regulaçªo celular.
Como conseqüŒncia, na maioria das
vezes, a superexpressªo de uma pro-
teína na cØlula faz com que a produ-
çªo dessa proteína seja desligada e, ao
contrÆrio do que seria espera-
do, forma-se, entªo, um orga-
nismo mutante, que nªo pro-
duz a proteína de interesse.
Isso pode acontecer a nível de
gene ou a nível de promotor.
Um exemplo de co-supressªo
a nível de promotor Ø demons-
trado na Figura 2 onde um
mutante foi produzido nªo na
proteína que estava sendo su-
perexpressa, mas na proteína
de onde foi retirado o promo-
tor. Embora seja difícil compre-
ender como a superexpressªo
de um gene possa ocasionar a
diminuiçªo da síntese de sua
proteína, vÆrios experimentos
tŒm sido realizados demons-
trando a ocorrŒncia desse fato.
O primeiro resultado de co-
supressªo foi obtido por meio de um
estudo envolvendo a variaçªo da co-
loraçªo de flores de petœnia pela
introduçªo do gene da chs sob o
controledo promotor 35S.
Mutaçªo por Inserçªo de
Transposon ou T-DNA
Transposons
Transposons sªo elementos de
DNA que tŒm a capacidade de sair de
uma regiªo do genoma e se incorpo-
rar em outra. Sendo o movimento do
transposon um processo aleatório,
quando estes elementos “pulam” em
um genoma, podem se inserir no
meio de um gene, tornando-o inativo.
Em plantas, uma sØrie de transposons
tŒm sido usados como ferramenta,
tanto na genØtica direta quanto na
reversa, para isolamento e caracteri-
zaçªo de vÆrios genes ou fenótipos. O
princípio da tØcnica estÆ descrito na
Figura 3. O primeiro gene de planta
clonado por transposon, via genØtica
direta, foi o gene “bronze”, de milho,
que codifica UDP-glucose:flavonóide
3-O-glucosiltransferase, uma enzima
da via metabólica das antocianinas
(Fedoroff et al., 1984).
A genØtica reversa usando mutan-
tes por inserçªo de transposons foi
descrita, inicialmente, em Drosophila
melanogaster. Essa metodologia Ø ba-
seada em uma reaçªo em cadeia da
polimerase (PCR – Polymerase Chain
Reaction), que utiliza um primer com-
plementar ao final do transposon e
outro complementar ao final do gene.
Dessa forma, os produtos de Polime-
rase Chain Reaction (PCR) só serªo
obtidos se um transposon estiver inse-
rido no gene de interesse. Genes que
tiveram sua expressªo alterada pela
inserçªo do transposon sªo recupera-
dos por meio da amplificaçªo por PCR
do DNA extraído do indivíduo com
fenótipo mutante. Esse processo tem
sido utilizado na identificaçªo de ge-
nes em Caenorhabditis elegans e mi-
lho.
A família dos transposons Mutator
(Mu) em plantas apresenta altas taxas
de mutaçıes e tem alto grau de con-
servaçªo nas extremidades das se-
qüŒncias invertidas. Essas duas carac-
terísticas sªo bastante interessantes,
pois ajudam a selecionar alelos que
contenham os elementos Mu cuja se-
qüŒncia Ø previamente conhecida. In-
serçıes dos elementos Mu podem ser
identificadas pela amplificaçªo por
PCR. O gene mutado pode, entªo, ser
recuperado e propagado em semen-
tes F
2
. Outros aspectos importantes
desse processo, e essenciais para a
anÆlise de um menor nœmero de plan-
tas, sªo o nœmero de transposiçªo e o
nœmero de cópias do transposon Mu
na planta. A tecnologia de caracteriza-
çªo de funçıes gŒnicas atravØs do Mu
foi utilizada pela primeira vez em
milho pela Pioneer Hi-Bred Co., sen-
do denominada Trait Utility System
(TUSC) (Fig. 4). Bensen et al. (1995)
utilizaram a tØcnica do TUSC para
caracterizar o mutante Anther ear1
(An1), cujo produto gŒnico estÆ en-
volvido na síntese do primeiro inter-
mediÆrio tetracíclico na via da biossín-
tese de giberelina (GA). A mutaçªo
An1 resultou em um fenótipo respon-
sivo à GA, que inclui uma altura redu-
zida de planta, atraso na maturidade e
desenvolvimento de flores perfeitas
em espigas normalmente pestiladas.
Um projeto financiado pela Natio-
nal Science Foundation (NSF) coor-
denado pela Dra. Virginia Walbot (Uni-
versidade de Stanford, EUA) tem por
objetivo demonstrar a funcionalidade
de genes de milho usando dois mØto-
dos complementares: o seqüencia-
mento de DNA genômico flanquean-
do as inserçıes do transposon Mu e a
identificaçªo e caracterizaçªo dos in-
divíduos mutantes contendo esses
Figura 4 – TUSC (Trait Utility
System in Corn). Plantas conten-
do transposons ativos sªo multi-
plicadas para a montagem de
uma biblioteca de mutantes.
Conhecendo a freqüŒncia com
que o transposon se multiplica e
se insere em regiıes codantes,
pode-se calcular teoricamente o
nœmero de plantas necessÆrias
para se ter um transposon em
cada gene. Cada planta mutante
Ø autofecundada e as sementes
estocadas. Uma reaçªo de PCR Ø
feita com DNA extraído de folhas
de grupos de plantas dessa
biblioteca de mutantes, usando-
se um primer do transposon e
um primer do gene (a seqüŒncia
de ambos Ø conhecida). A
hibridaçªo Ø feita para auxiliar
no escrutínio de um grande
nœmero de plantas. Os grupos de
plantas cujo sinal foram positivos
sªo subdivididos atØ que seja
encontrada a planta que conte-
nha o transposon inserido no
gene. Para aumentar a chance de
encontrar a planta mutante, testa-
se uma sØrie de primers de um
œnico gene simultaneamente
54 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
transposons. Um banco de mu-
tantes estÆ sendo criado usando
plantas transformadas com os
elementos Mu contendo o plas-
mídeo Bluescript (Fig. 5). A nova
inserçªo contendo o transposon
poderÆ ser seletivamente clona-
da direto em E. coli, gerando
uma biblioteca de mutaçªo in-
sercional para anÆlise de DNA.
Cada planta F
2
 serÆ autofecunda-
da e as sementes serªo estocadas
no “Maize Genetics Cooperative
Stock Center”, um órgªo especi-
almente criado para armazenar
os estoques de sementes muta-
das. Os usuÆrios poderªo utilizar
a tØcnica de PCR para seleçªo de uma
coleçªo de plasmídeos que foram in-
seridos em genes de interesse. Cerca
de 50.000 ESTs, flanqueadas pelo trans-
poson Mu, jÆ foram completamente
seqüenciados durante o primeiro ano
do projeto. O objetivo final Ø seqüen-
ciar cerca de 150.000 segmentos de
DNA genômico contendo inserçıes
do transposon Mu.
T-DNA
O T-DNA Ø um segmento de DNA
presente no plasmídeo Ti (DNA nªo
cromossômico) de Agrobacterium tu-
mefaciens, uma bactØria de solo que
causa tumores quando infecta plan-
tas. O tumor Ø causado pela capacida-
de da bactØria de transferir seu T-DNA
para as cØlulas vegetais. O T-DNA
contØm genes que codificam hormô-
nios e aminoÆcidos necessÆrios à so-
brevivŒncia da AgrobactØria dentro da
planta. Cientistas descobriram que
podiam alterar este fragmento de DNA
substituindo os genes nativos por
qualquer gene de interesse e, que
esses novos genes continuariam sen-
do transferidos para as plantas pelo
sistema mediado pela bactØria. A par-
tir dessa descoberta, o T-DNA passou
a ser usado como uma ferramenta na
genØtica direta e reversa de maneira
semelhante aos transposons. O T-
DNA se insere aleatoriamente no meio
de genes tornando-os nªo funcionais
e produzindo um organismo mutante.
A funçªo do gene Agamous de Arabi-
dopsis foi caracterizada como sendo
um regulador transcricional necessÆ-
rio para o desenvolvimento floral uti-
lizando essa metodologia (Yanofsky
et al., 1990).
GenØtica reversa em Arabidopsis
usando grandes populaçıes de plan-
tas mutadas, com um elemento de
inserçªo, taes como o T-DNA de A.
tumenfaciens. Grandes populaçıes
de plantas mutantes foram geradas
para constituir uma biblioteca de in-
serçªo. Em Arabidopsis, uma unidade
de transcriçªo tem em mØdia 2.5 kb
(intron e exon), o que significa que
um genoma de 100 Mb pode ser
dividido em cerca de 40.000 genes.
Para ter 95% de chance de acertar um
dos genes, sªo necessÆrias 120.000
inserçıes aleatórias independentes. O
DNA Ø extraído de plantas mutageni-
zadas e agrupadas em grupos maio-
res. Inserçıes simples podem ser de-
tectadas por PCR em grupos de cerca
de milhares de indivíduos. Depen-
dendo da natureza da populaçªo usa-
da, grupos ou supergrupos po-
dem ser organizados em matri-
zes de duas ou trŒs dimensıes
para facilitar a determinaçªo fi-
nal do indivíduo carregando a
inserçªo desejada. As reaçıes
de PCR sªo realizadas em su-
pergrupos de DNA usando-se
combinaçıes de oligonucleotí-
deos do gene e do elemento de
inserçªo. Os produtos de PCR
sªo carregados em um gel de
agarose, transferidos para mem-
brana e hibridizados com son-
das produzidas a partir do gene
de interesse e do elemento de
inserçªo. Apesar do PCR ape-
nas permitir a amplificaçªo do gene
mutado pelo elemento de inserçªo,
“backgrounds” podem ocorrer. Desta
forma, apenas as bandas que hibridi-
zarem com ambas sondas serªo leva-
das adiante. Uma vez que o produto
de PCR tenha sido confirmado e se-
qüenciado, o supergrupo pode ser
subdividido em grupos cada vez me-
nores. A determinaçªo final da linha
mutantepode ser obtida em menor
tempo, dependendo do esquema de
agrupamento dos DNAs.
Uso de Microarrays de DNA
para Estudar a Expressªo de
Genes em Todo o Genoma
de Um Organismo
O microarray Ø uma metodologia
utilizada para comparar a expressªo
de um grande nœmero de genes, si-
multaneamente. Essa tØcnica empre-
ga arranjos (arrays), que contŒm um
grande nœmero de genes robotica-
mente distribuídos de forma ordenada
sobre placas de vidro. A quantificaçªo
dos níveis de expressªo na tecnologia
de microarray Ø baseada em experi-
mentos onde os milhares de clones de
cDNA sªo hibridizados com duas son-
das marcadas com diferentes fluores-
cŒncias (geralmente uma que emite
cor vermelha e outra, verde). As son-
das podem ser conjuntos de cDNAs
gerados a partir de cØlulas ou de
tecidos em duas situaçıes diferentes
que se deseje comparar (por exem-
plo: resistŒncia e suscetibilidade ao
alumínio). Os resultados sªo produzi-
dos sob forma de diferentes intensida-
des de fluorescŒncia, que sªo capta-
das por microscopia de fluorescŒncia
Figura 5 – Projeto NSF coorde-
nado pela Dr“. Virginia Walbot
(University of Stanford). O
transposon contendo uma marca
de seleçªo para resistŒncia à
ampicilina em bactØria Ø transfe-
rido para o milho por transfor-
maçªo. As plantas sªo multiplica-
das e sªo feitas bibliotecas
genômicas a partir de colunas e
fileiras de plantas contendo esses
transposons engenheirados,
inseridos aleatoriamente no
genoma. Os plasmídeos origina-
dos da biblioteca genômica
contendo esse cassetes sªo
seqüenciados e as plantas que
contŒm os transposons inseridos
nos genes de interesse sªo
identificadas
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 55
a laser, em funçªo dos diferentes
níveis de expressªo de cada gene.
A imagem dos pontos fluores-
centes Ø processada por compu-
tadores e programas específicos,
sendo gerada simultaneamente
uma grande quantidade de in-
formaçªo (Fig. 6).
A tecnologia de microarrays
nªo fornece apenas informaçıes
sobre a funçªo de genes anôni-
mos, o que favorecerÆ bastante
os processos de genØtica rever-
sa, mas tambØm constitui uma
ferramenta indispensÆvel para
estudos globais de expressªo
gŒnica, com grandes aplicaçıes
nos estudos de biologia molecu-
lar e fisiologia vegetal. Apesar do
microarray ser um dot blot de
RNA, grande nœmero de conclusıes
podem ser tiradas com o uso desse
processo.
Uma importante aplicaçªo da tec-
nologia de microarray Ø o fato que
muitos arrays podem ser produzidos
para servir como uma plataforma co-
mum entre vÆrios pesquisadores. Se
aclopado para o desenvolvimento de
um banco de dados centralizado, os
pesquisadores serªo capazes de pes-
quisar em multiplos grupos de dados
diferentes padrıes de expressªo de
interesse. Com essa tecnologia, serÆ
possível acessar o impacto de específi-
co tratamento, fatores ambientais, estÆ-
gios de desenvolvimento e efeitos na
expressªo global de todos os genes em
um transgŒnico, estudos envolvendo
heterosis e produtividade, anÆlise com-
parativa de organismos de genomas
menores, como vírus, melhoramento
assistido por marcadores, fingerprin-
ting e escrutínio de germoplasma para
identificar genes envolvidos em pro-
cessos específicos, entre outros. Devi-
do a informaçªo gerada por estudos de
microarrays ser quantitativa, mudan-
ças sœbitas na expressªo de um gene
podem ser detectadas e podem substi-
tuir metodologias de subtraçªo e “diffe-
rential display”.
Apesar da obtençªo de “cDNAs” de
organismos procariotas ser difïcil devi-
do principalmente à falta do poli A+ e
à alta instabilidade dos mRNAs, esses
organismos ainda sªo um excelente
sistema para anÆlise de microarray
devido principalmente ao seu genoma
pequeno (em torno de 3 Mb) e a grande
variabilidade de mutantes disponíveis.
Estudos de microarrays podem ser
usados para comparar o organismo
selvagem com mutantes, em uma sØ-
rie de fatores específicos.
A anÆlise de expressªo gŒni-
ca em grande escala oferece
grandes vantagens, porØm esse
processo possui limitaçıes. Uma
clara limitaçªo na aplicaçªo des-
sa tecnologia Ø a grande quan-
tidade de RNA necessÆria du-
rante a etapa de hibridaçªo. A
quantidade de RNA total para
uma hibridaçªo Ø de 50 a 200 µg
(2 a 5 µg para mRNAs). Certa-
mente, os resultados gerados
por esse processo nªo determi-
nam a funçªo de um gene, mas
fornecem uma forte ferramenta
para a sua compreensªo. Os
resultados fornecidos por esse
processo servem para indicar
genes candidatos interessantes
para estudos mais detalhados. Estu-
dos adicionais terªo de ser feitos para
verificar se os níveis de transcriçªo
alterados refletem mudanças na sínte-
se ou “turnover”. AlØm disso, uma
resposta diferente pode estar relacio-
nada com processos pós-transcricio-
nais como fosforilaçªo, metilaçªo, gli-
colisaçªo, etc.
Devido a essa grande capacidade
de anÆlise de transcritos ao mesmo
tempo, a tecnologia de microarray
pode, muitas vezes, antecipar os pro-
jetos genomas de seqüenciamento es-
trutural e funcional. Os microarrays
hoje sªo construídos a partir de clones
conhecidos. Essa etapa envolve se-
qüenciamento de genes, identificaçªo
de clones em placas de estoque, ma-
nipulaçıes desses clones para novas
placas de estoque, reaçıes de PCR e
eletroforese em gel de agarose para
confirmar a eficiŒncia do processo,
etc. Uma nova idØia que tem surgido
Ø o uso de microarrays sem o seqüen-
ciamento prØvio. Clones de bibliote-
cas normalizadas sªo submetidos a
amplificaçªo do inserto por PCR e
automaticamente transferidos para o
microarray. Assumindo que a quanti-
dade de clones raros tenha aumenta-
do em relaçªo aos abundantes na
normalizaçªo da biblioteca, e que, em
cada lâmina de vidro, podem ser orga-
nizados pelo menos 10.000 clones, o
processo pode tornar-se bem mais
simples e interessante. Clones relacio-
nados com o estresse poderiam ser
isolados com base na confecçªo de
uma biblioteca de cDNA de raiz de
Figura 6 - AnÆlise de expressªo
gŒnica usando microarray. O
mRNA total de cada situaçªo Ø
usado para preparar sondas de
cDNA usando a transcriptase
reversa na presença de um
nucleotídeo marcado com fluo-
rescŒncia. Um dos grupos de
mRNA Ø marcado com um
nucleotídeo com fluorescŒncia
verde e o outro, com fluorescŒn-
cia vermelha. As duas sondas sªo
misturadas e hibridizadas com o
DNA no microarray. Assim, a
relativa abundância de cada
mRNA Ø comparada por um
analisador de imagem atravØs do
sinal gerado pelas duas sondas. O
objetivo do processo Ø identificar
genes cujos sinais gerados foram
mais voltados para o verde ou
para o vermelho. Aqueles clones,
cujo mRNA nªo sªo diferencial-
mente expressos entre as duas
populaçıes de mRNA, terªo uma
cor intermediaria entre verde e
vermelho, aqui representada pela
cor amarela. Os clones represen-
tados pela cor cinza representam
aqueles que estªo representados
em pequenas quantidades nas
sondas. Toda a anÆlise de ima-
gem Ø feita em um computador
que calcula intensidade de sinal
gerado na hibridaçªo
56 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
uma planta tolerante ao es-
tresse, e sondas de cDNAs
da planta tolerante e da
planta susceptível ao mes-
mo estresse marcados com
duas fluorescŒncias dife-
rentes. Um robô de micro-
array Ø capaz de colocar
16 amostras em 48 placas
de vidro, lavar e secar a
sonda para o próximo gru-
po de cDNA em 70 segun-
dos. Assim, cerca de 10.000
amostras podem ser im-
pressas em, aproximada-
mente, 12 horas. VÆrios sis-
temas robotizados mais rÆpidos e efi-
cientes para a impressªo e processa-
mento dos cDNA nas placas de vidro,
alØm de metodologias cada vez mais
sensíveis e precisas para detecçªo e
anÆlise dos resultados tŒm sido desen-
volvidos e disponibilizados. No exem-
plo anterior, apenas clones expressos
diferencialmente seriam seqüenciados.
Portanto, mesmo que tenhamos clo-
nes repetidos, estaremoscom um nœ-
mero de clones para seqüenciamento
bastante reduzido em relaçªo a um
seqüenciamento aleatório. Se na prÆ-
tica de microarrays pode, ou poderÆ
em um futuro próximo, ser usado sem
auxílio de “classificaçªo” prØvia dos
clones, grupos que tenham, ou este-
jam desenvolvendo, organismos con-
trastantes para diversas caraterísticas
de interesse, estarªo com excelentes
ferramentas para ajudar a identificar
os genes envolvidos em vÆrios pro-
cessos fisiológicos. Linhas recombi-
nantes provinientes de cruzamentos
de indivíduos contrastantes e mutan-
tes sªo as melhores opçıes, atualmen-
te, para as anÆlises de microarrays.
Vantagens e desvantagens do
microarray baseado em
fragmentos de DNA
Existem basicamente dois proces-
sos em que os microarrays podem ser
confeccinados. Um Ø a impressªo de
oligos e o outro, os de framentos de
DNA previamente isolados na lâmina
de vidro. O microarray baseado em
oligos, em particular aqueles produzi-
dos por mØtodo de fotolitografia, tem
alta densidade (250.000 olinucleotide-
os/cm2) e sªo mais consistentes nos
arrays comparados com os microar-
rays baseados em fragmentos de DNA.
O potencial de colocar clones em
locais errados pode ser evitado no
mØtodo do oligo porque sªo sintetiza-
dos in situ, baseado na seqüŒncia do
gene obtido diretamente do banco de
dados. AlØm disso, devido à seqüŒn-
cia que os hibridiza no microarray
baseado em oligo ser muito curta (20
a 25 nucleotídeos), as reaçıes de
hibridaçªo sªo muito sensíveis na tro-
ca de um simples nucleotídeo, ao
contrÆrio do mØtodo baseado no frag-
mento de DNA. Isso faz
microarrays baseado em
oligonucleotideos parti-
cularmente apropriados
para genotipagem e apli-
caçıes de seqüencia-
mento. A maior desvan-
tagem do microarray
baseado em oligos Ø que
sua construçªo depende
da disponibilidade de um
banco de dados seguro.
Ao contrÆrio de micro-
arrays baseados em frag-
mentos de DNA, infor-
maçıes de seqüŒncias
nªo sªo necessÆrias para a constru-
çªo. Em comparaçªo à dot blots de
clones arranjados em membranas de
filtro, microarrays sªo mais sensíveis,
exibindo uma dinâmica mais ampla e
permitindo uma anÆlise simultânea de
duas sondas complexas. Assim, ape-
sar dos dot blots poderem ser apropri-
ados para pequena escala, apenas
microarrays baseados em fragemen-
tos de DNA podem fornecer anÆlises
em escala genômica. Uma desvanta-
gem do processo, similar em qualquer
outro mØtodo de hibridaçªo, Ø o fato
de que hibridaçªo cruzada entre mem-
bros de uma família gŒnica pode ocor-
rer, ocasionando uma anÆlise confusa
de expressªo gŒnica de membros de
uma mesma família.
SAGE (Serial Analysis
of Gene Expression)
SAGE Ø a extensªo lógica do se-
qüenciamento de EST. Um inventÆrio
de mRNAs Ø feito com base no se-
qüenciamento de cDNAs curtos, clo-
nados em tandem. O tamanho desses
cDNAs Ø o suficiente para identificar
genes correspondentes no banco de
dados. O padrªo de restriçªo desses
genes diferentes estÆ relacionado com
a abundância relativa de cada cDNA.
Os padrıes gerados pelo SAGE
tŒm sido estudados em humanos e em
levedura, contudo tŒm sido pouco
utilizados em plantas. Um prØ-requisi-
to para a identificaçªo dos ESTs Ø a
disponibilidade de um banco de da-
dos grande para a espØcie estudada.
Essa tØcnica Ø poderosa, mas nªo Ø
conveniente para a comparaçªo de
muitas amostras diferentes e para o
estudo de transcritos raros.
Figura 7 - Identificaçªo de
interaçªo proteína-proteína (in
vitro).
A) A proteína de interesse Ø
clonada em um vetor de expres-
sªo em bactØria que permite a
sua purificaçªo em uma coluna
de afinidade. Um extrato de
proteínas produzido nas cØlulas
vegetais Ø tambØm submetido à
coluna que jÆ contØm fixada a
proteína de interesse. A coluna Ø
lavada e as proteínas que intera-
girem com a proteína de interes-
se podem ser seqüenciadas ou
usadas para produzir anticorpos
que serªo utilizados em uma
biblioteca de expressªo de
cDNA.
B) Proteínas “X” e “Y” produzi-
das em E. coli sªo misturadas e
passadas atravØs de uma coluna
de níquel. Se a proteína “Y”
interagir com a “X”, ambas
ficarªo retidas na coluna. O
processo pode ser visualizado
por anticorpos ou raio-X, caso a
proteina “Y” esteja marcada com
radioatividade
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 57
Proteomics – Estudo do Perfil
ProtØico de Um Organismo
Cientistas tŒm utilizado o ter-
mo “proteomics” para descrever
as anÆlises do perfil protØico de
um organismo. O comportamen-
to de muitas proteínas em um
proteoma pode ser monitorado
por meio de gØis de eletroforese
em duas dimensıes. Nesse pro-
cesso, proteínas provenientes de
cØlulas ou de tecidos em duas condi-
çıes fisiológicas diferentes (por exem-
plo, plantas resistentes e sensíveis a
uma determinada doença ou condi-
çªo de estresse) sªo extraídas, aplica-
das em gØis e comparadas qualitativa
e quantitativamente. As proteínas pre-
sentes em apenas um dos gØis ou que
tenham a sua quantidade alterada sªo
fortes candidatadas para atuarem no
controle do processo em estudo. A
partir da identificaçªo das proteínas
de interesse, pode-se, utilizando-se as
tØcnicas de biologia molecular, isolar
sua seqüŒncia gŒnica e caracterizÆ-la.
Localizaçªo Celular de um
mRNA ou Proteína para
Inferir sobre sua Funçªo
Os genes sªo transcritos em molØ-
culas de RNAs mensageiros (mRNA),
que sªo traduzidos em proteínas. Es-
sas sªo transportadas para locais espe-
cíficos dentro da cØlula de um deter-
minado tecido ou organismo. Enquan-
to alguns genes codificam para prote-
ínas que sªo expressas em todas as
cØlulas de um indivíduo durante toda
a sua vida (genes constitutivos), ou-
tros codificam para proteínas que sªo
expressas apenas em algumas cØlulas,
ou em um determinado período de
desenvolvimento, ou em resposta a
algum estímulo externo (genes teci-
do-específicos). A localizaçªo de uma
proteína ou de seu mRNA nas cØlulas
ou tecidos onde sªo produzidos Ø
uma importante fonte de informaçªo,
que pode auxiliar na determinaçªo da
funçªo de um gene ou proteína. Um
dos princípios dessa metodologia Ø a
identificaçªo do mRNA ou da proteína
de interesse por meio de sondas espe-
cíficas. As sondas após se ligarem à
proteína ou ao mRNA em estudo sªo
detectadas com o auxílio de tØcnicas
de microscopia. Uma vez conhecida a
localizaçªo da molØcula dentro de um
organismo podem ser programados
experimentos mais refinados para a
definiçªo de sua funçªo. TØcnicas de
hibridizaçıes in situ tŒm sido ampla-
mente utilizadas para localizar genes e
os seus produtos em cromossomos,
tecidos e cØlulas de diversos organis-
mos.
Interaçªo Proteína-Proteína
A caracterizaçªo da funçªo gŒnica
pode ser auxiliada por meio de estu-
dos de interaçªo proteína-proteína in
vitro e in vivo. A observaçªo de que
uma proteína, cuja funçªo Ø desco-
nhecida, interage com uma que Ø
conhecida pode sugerir que as duas
proteínas fazem parte do mesmo pro-
cesso ou que podem estar localizadas
no mesmo compartimento celular. Os
dois tipos de testes (in vitro e in vivo)
podem ser usados para verificar a
existŒncia de interaçªo entre duas
proteínas conhecidas, identificar no-
vas proteínas que interagem com uma
proteína em estudo e identificar
regiıes dentro de uma proteína
que sªo importantes no processo
de reconhecimento e da interaçªo.
Existe um grande nœmero de alter-
nativas e variaçıes para estudar as
interaçıes entre proteínas (Fig. 7).
Apesar de bastante informativas,
as reaçıes in vitro podem masca-
rar os resultados reais devido à
impossibilidade de se reproduzir
in vitro todas as condiçıes exis-
tentes nas cØlulas in vivo. Por esse
motivo, foram desenvolvidos proto-
colos que estudam a interaçªo entre
proteínas in vivo.
Uma maneira eficiente para detec-
çªo de interaçªo in vivo Ø utilizar o
sistema híbrido duplo de levedura.
Esse processo constitui a construçªo
de duasproteínas de fusªo, por enge-
nharia genØtica. Uma delas gera um
híbrido entre seqüŒncias para um do-
mínio que se liga ao DNA do fator de
transcriçªo Gal4 (aminoÆcidos 1-147)
e a proteína de interesse. Um segundo
plasmídeo de expressªo contØm uma
seqüŒncia que ativa o fator de transcri-
çªo Gal4 (aminoÆcidos 768-881) fun-
dida com cDNAs (Fig. 8). Os cDNAs
sªo provenientes de bibliotecas de
onde existem genes candidatos. Des-
sa forma, se as duas proteínas expres-
sas na levedura sªo capazes de intera-
gir, o complexo resultante ativarÆ a
transcriçªo dos promotores contendo
sítios de ligaçªo para o Gal4, gerando
uma colônia azul em meio contendo
um substrato apropriado (X-GAL). O
sucesso dessa metodologia foi primei-
ramente demonstrado pela interaçªo
Gal4-Gal80 (Fig. 8).
Conclusªo
Desde a redescoberta das leis de
Gregor Mendel, cientistas começaram
a questionar a natureza do gene. Que
tipo de molØcula seria o gene? Como
a informaçªo contida em uma molØ-
cula poderia ser transmitida para as
próximas geraçıes? Por que e como
apareceriam indivíduos mutantes?
Apenas em meados do sØculo XX,
com a descoberta da estrutura do
DNA por Watson e Crick, essas e
muitas outras questıes começaram a
ser respondidas. Nas primeiras trŒs
dØcadas após a compreensªo da es-
trutura do DNA, o conhecimento a
Figura 8 - Interaçªo proteína-
proteína in vivo. A- O ativador de
transcriçªo GAL4 possui dois
domínios: um que se liga ao DNA
e outro que ativa a transcriçªo; B
e C - Os dois domínios foram
separados: o primeiro pode ser
fundido à proteína de interesse
(B) e o segundo, à proteína
desconhecida (C); D - As colônias
de levedura contendo os dois
plasmídeos cujas proteínas intera-
gem serªo azuis em meio conten-
do X-GAL (substrato para a
enzima), devido à resconstituiçªo
do fator de transcriçªo GAL4 e à
ativaçªo do gene da beta-galacto-
sidase (lac Z)
58 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
respeito de sua biologia cresceu fan-
tasticamente. Dentro desse período,
ficou conhecida a natureza química
dos genes, como a informaçªo genØ-
tica era armazenada, como as cØlulas
respondiam a essa informaçªo e como
ela era transmitida de uma geraçªo
para outra.
A partir dos anos 70, cientistas
aprenderam a manipular a molØcula
de DNA utilizando as tØcnicas de bio-
logia molecular. Inaugurou-se a era da
tecnologia do DNA recombinante, tam-
bØm denominada engenharia genØti-
ca. Desde entªo, a biologia molecular
tem experimentado grandes avanços
tecnológicos que tŒm culminado em
importantes fontes de conhecimento
sobre a funçªo, expressªo e regulaçªo
de genes em diferentes organismos.
Trabalhos de isolamento, seqüencia-
mento e caracterizaçªo de um ou
poucos genes eram comumente pu-
blicados atØ a dØcada de 90. Atual-
mente, um œnico laborató-
rio pode seqüenciar 1000
(ou mais) genes por dia.
Um pesquisador pode utili-
zar os dados gerados e che-
gar a conclusıes muito mais
precisas sobre a funçªo de
um gene em poucas sema-
nas de trabalho, do que
outro, em muitos meses de
trabalho, hÆ alguns anos
atrÆs. Hipóteses podem ser
testadas muito mais rÆpida
e precisamente. EstÆ haven-
do um redirecionamento na
maneira como os grupos
conduzem seus projetos de
pesquisas na Ærea da biolo-
gia molecular. A primeira
fase dos chamados projetos
genoma, seqüenciamento
de genes, estÆ gerando uma
grande quantidade de informaçıes, as
quais serªo provavelmente, multipli-
cadas com a implementaçªo da se-
gunda fase, ou seja, com a anÆlise
funcional do material seqüenciado.
Neste texto foram mencionadas meto-
dologias que tŒm por objetivo auxiliar
na identificaçªo da funçªo gŒnica tan-
to em âmbito bioquímico como bioló-
gico. Entre elas, os microarrays tŒm
revolucionado a anÆlise funcional de
seqüŒncias gŒnicas em grande escala,
uma vez que diferenças nos níveis de
expressªo de milhares de genes po-
dem ser detectados simultaneamente.
Desta forma, vÆrios genes ainda des-
conhecidos poderªo ter suas funçıes
biológicas desvendadas utilizando esse
processo. Em um futuro nªo muito
distante, ao invØs de se comprarem
“kits” para construçªo de bibliotecas,
serªo compradas bibliotecas jÆ arran-
jadas em matrizes, e o pesquisador
testarÆ sondas diferentes. Os resulta-
dos serªo organizados nªo mais em
ESTs, mas em níveis de expressªo
desses genes sob diferentes condi-
çıes. As metodologias de anÆlise gŒ-
nica, tanto individuais quanto em lar-
ga escala, fornecerªo um acesso a
informaçıes sem precedentes para
todas as Æreas da biologia. Entre elas,
a agropecuÆria serÆ amplamente be-
neficiada, uma vez que existe grande
necessidade de identificar e de estu-
dar genes que sejam responsÆveis por
conferir resistŒncia a doenças, tole-
rância a estresses bióticos e abióticos,
Figura 10 - Processo de seleçªo
de leveduras contendo os
plasmídios pAS2 e pACT2 e
seleçªo das leveduras contendo
interaçªo entre as proteínas “X”
e “Y”
Figura 9 - Esquema dos plasmí-
dios usados no sistema de
levedura de híbrido duplo. Os
plasmidios pAS2 e pACT2
contŒm as proteínas de fusªo de
ligaçªo no DNA (DBD) e ativa-
çªo de transcriçªo (DAD),
respectivamente. Os genes Trp e
Leu permitem que a levedura
cresça em meio sem triptofano e
leucina. O gene Ap seleciona os
plasmídios em Escherichia coli.
HA Ø a proteína hemoaglutinina
e pode ser usada como proteína
repórter de leveduras transfor-
madas
aumento da qualidade nutricional,
entre outras características de interes-
se econômico.
ReferŒncias
BENSEN, R.J.; JOHAL, G.S.; CRA-
NE, V.C.; TOSSBERG, J.T.; SCHNA-
BLE, P.S.; MEELEY, R.B.; BRIGGS, S.P.
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of the maize An1 gene. Plant Cell 7:
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bronze locus in maize by a simple and
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ATT, W.R. (1988). Reduction of poly-
galacturonase activity in tomato fruit
by antisense RNA. Proc. Natl. Acad.
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YANOFSKY, M.F.; MA, H.; BOW-
MAN, J.L.; DREWS, G.N.; FELDMANN,
K.A.; MEYEROWITZ, E.M. (1990). The
protein encoded by the Arabidopsis ho-
meotic gene agamous resembles trans-
cription factors. Nature 346: 35-39.
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 59
CARTAS
SE˙ˆO DE CARTAS
Para entrar em contato com Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento vocŒ pode enviar sua
correspondŒncia via Internet, fax ou carta para esta seçªo. A critØrio do editor, as mensagens pode-
rªo ser publicadas resumidamente. Nossos endereços sªo:
Redaçªo de Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento: SRTV/Sul – Quadra 701 – Ed. PalÆcio do
RÆdio II, sala 215 – Cep 70340-902 – Brasília –DF Tel: (061) 225-1512 Fax: (061)224-2830
Home-page: www.biotecnologia.com.br Email: kl3@biotecnologia.com.br
Prezados Senhores,
O motivo dessa mensagem Ø solicitar
informaçıes. Fui escalado para uma
discussªo sobre a MP2052 durante o
próximo EVINCI (Curitiba/PR - UFPR),
em uma mesa-redonda, na qual esta-
rªo presentes representantes do IBA-
MA. Tenho acompanhado algumas
listas de discussªo e percebo que o
desconhecimento sobre o assunto Ø
geral, indo desde os alunos da gradu-
açªo atØ o MCT e CNPq, que suspen-
deram os processos de projetos com
cooperaçªo internacional atØ que os
advogados do IBAMA possam enten-
der a lei. Preciso de sugestıes sobre
temas que podem ser discutidos. JÆ
estou preparando uma pequena pau-
ta para meu discurso mas queria mais
sugestıes. Aproveito o ensejo para
informar que produzo um boletim
enviado por e-mail para cerca de uma
centena de estudiosos da Ærea de
Ornitologia em todo o Brasil e vÆrios
países da AmØrica do Sul.
FERNANDO COSTA STRAUBE
Mülleriana: Sociedade Fritz Müller de
CiŒncias Naturais
E-mail: juruva@milenio.com.br
Prezado Sr.Fernando, Estamos dispo-
nibilizandoum espaço no nosso site,
denominado BIOCORREIO, para tro-
ca de informaçıes entre pesquisado-
res, portanto poderÆ deixar essa sua
mensagem para que algum eventual
pesquisador entre em contato com
vocŒ. Basta enviar novamente sua
mensagem A/C de Biocorreio do por-
tal www.biotecnologia.com.br.
•••
Prezado Senhores,
Sou fruticultor de Mamªo, MaracujÆ,
Banana, e algumas CucurbitÆceas
como Abóbora e Melancia. HÆ algum
tempo jÆ utilizo produtos como Meta-
rhizium anisopliae e Beauveria bassi-
ana, e tenho obtido excelentes resul-
tados. Vejo no processo de controle
biológico uma saída saudÆvel para a
produçªo de alimentos e outros pro-
blemas sanitÆrios. Sou assinante da
revista biotecnologia e gostaria de dar
a minha participaçªo, parabenizando
primeiramente, por este excelente tra-
balho. Como produtor, sinto que a
maioria dos colegas produtores nªo
conhecem nenhuma tecnologia de
controle fitossanitÆrio biológico, e estªo
extremamente bitolados com o uso de
controles convencionais químicos.
Vejo a necessidade de mudar isso
mediante disponibilidade de informa-
çıes, o que procuro fazer um pouco
aqui em minha regiªo. Sinto que hÆ
poucos produtos no mercado para
que possamos utilizar e nªo sªo bem
divulgados, sendo difícil para o pro-
dutor encontrar tais informaçıes. Os
produtos que, eventualmente, neces-
site manipular na própria propriedade
para aplicaçªo sªo muito rejeitados
pelo produtor por entenderem que
nªo hÆ tempo e pessoal treinado para
isso. Assim, a minha opiniªo seria no
sentido de criarem uma coluna dentro
da revista onde disponibilizassem in-
formaçıes dos produtos existentes,
suas finalidades e formas de utiliza-
çªo.
Sem mais, subscrevo-me.
Atenciosamente
Hugo Yamada
Prezado Sr.Hugo,
Acusamos e agradecemos seu e mail,
assim como informamos que sua su-
gestªo foi encaminhada.
•••
Meu nome Ø Ricardo Alexandre Gue-
des da Silva e sou universitÆrio. Curso
biologia, estou no 6” período, na UPE
e tenho conhecimento de informÆti-
ca/internet. Estou procurando vagas
de pesquisador (laboratório) e quero
informaçıes sobre a Ærea.
Ricardo A.G da Silva
e-mail: fouly@uol.com.br
Prezado Ricardo,
No momento estamos disponibili-
zando um espaço em nosso site na
Internet, por meio do Portal Biotec-
nologia chamado Biocurriculum,
espaço no qual o senhor poderÆ
disponibilizar o seu curriculum.
Caso tenha interesse, envie o seu
curriculum A/C da sessªo Biocurri-
culum.
•••
Prezado Sr.
VocΠpoderia me enviar o intervalo
de pÆginas do artigo “Extraction of
DNA from Plants SOLUTIONS FOR
COMMONLY FOUND PROBLEMS”
publicado na revista Biotecnologia
(volume 9, ano 1999)? Desde jÆ, lhe
agradeço muito pela atençªo!
Flavio Ayres
Prezado Sr. FlÆvio,
O artigo “Extraçªo de DNA de plan-
tas - soluçıes para problemas comu-
mente encontrados” estªo na ediçªo
n” 9 da Revista Biotecnologia. PÆgs.
40, 41, 42, 43.
•••
VocŒs poderiam me informar sobre
o Dermanyssus, pois estou desen-
volvendo um trabalho universitÆrio
e nªo estou encontrando nada so-
bre esse assunto.
Desde jÆ agradeço,
Fleury
fleuri@osite.com.br
Caro Sr. Fleury, todo o material que
dispomos encontra-se em nosso site.
Pedimos por gentileza que faça uma
pesquisa no nosso sistema de busca,
a fim de encontrar o assunto deseja-
do.
60 Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento
FUNDA˙ˆO GIACOMETTI
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na PÆg. 31 da ediçªo anterior (n”16)
Biotecnologia CiŒncia & Desenvolvimento 61
MONSANTO
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na pÆgina 49 da ediçªo anterior (n”16)
EMBRAPA
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na 3“ Capa da ediçªo anterior (n”16)