Relatório Uchi amarelo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
Instituto de Ciências Exatas - ICE
Departamento de Química - DQ
	
IEQ655 – FITOQUÍMICA EXPERIMENTAL
Manaus, Amazonas
2018
	
	UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM
Instituto de Ciências Exatas - ICE
Departamento de Química - DQ
IEQ655 – FITOQUÍMICA EXPERIMENTAL
OBTENÇÃO DA BERGENINA A PARTIR DE EXTRATO DE UCHI AMARELO
Prof. Dra. Rita de Cassia Saraiva Nunomura 
Guilherme Braule Pinto Lopes – 21453581
Kleber Augusto Costa Brandão – 21203720
Nathália Lamenha Lopes – 21457037
Samuel Ferreira Guedes – 21457310
Yuri Gabriel Gomes Figueiredo – 21453580
Manaus, Amazonas
2018
RESUMO
A Endopleura uchi é uma espécie do gênero Endopleura, pertencente à família Humiriaceae, nativa da Amazônia, presente em todos os estados da região, especialmente no Pará e Amazonas. Seus frutos são ricos em sais minerais, vitaminas C e E, ácidos graxos e fibras. Os frutos, bem como sua casca, possuem grande valor medicinal na região, sendo indicados para o tratamento de inflamações, artrite, colesterol e diabetes, sendo conhecido, também, pelas suas propriedades antioxidantes, antivirais, diuréticas e vermífugas. Um dos principais componentes ativos presentes na planta é a bergenina, um C-glicosídeo do 4-O-metil ácido gálico, que é encontrado tanto na casca, quanto nos frutos. Tendo em vista grande potencial bioativo, este experimento teve como objetivo o isolamento e purificação da bergenina a partir de um extrato de cascas da espécie. A fração de início do experimento (cristais em acetato) foi obtida a partir de um extrato metanólico que foi submetido a partição líquido-líquido com os solventes hexano, clorofórmio e acetato de etila. A fração em acetato apresentou cristais, os quais foram recristalizados e após recristalização observou-se por cromatografia em camada delgada que permaneceram impuros. Os cristais foram, então, submetidos a cromatografia em coluna, sendo obtidas frações ricas em bergenina e outra substância não identificada. A bergenina foi confirmada por comparação com padrão através de análise por CCD. 
Palavras-chave: Uchi amarelo, Endopleura, bergenina, potencial bioativo.
SUMÁRIO
RESUMO	3
SUMÁRIO	4
INTRODUÇÃO	5
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA	6
	ENDOPLEURA UCHI	6
	COMPOSIÇÃO QUÍMICA	6
	MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS	7
•	PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO	7
•	EXTRAÇÃO POR ULTRASSOM	7
•	EXTRAÇÃO COM SOXHLET	8
•	MACERAÇÃO	9
•	FILTRAÇÃO	9
	MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS	10
•	CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO	10
•	CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA	11
OBJETIVO	13
MATERIAIS E MÉTODOS	14
MATERIAIS E REAGENTES	14
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL	14
	OBTENÇÃO DO EXTRATO	14
	OBTENÇÃO DE FRAÇÕES – PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO	14
	RECRISTALIZAÇÃO (SUSPENSÃO)	15
	CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO – COLUNA	15
	CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA	15
RESULTADOS E DISCUSSÃO	16
CONCLUSÃO	19
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS	20
INTRODUÇÃO
A medida em que a sociedade e a tecnologia se desenvolvem, pesquisas com produtos naturais são cada vez mais frequentes na área acadêmica, consequentemente. Ainda mais com o aumento da precaução com o meio ambiente. Grande parte dessas pesquisas são baseadas no conhecimento adquirido da medicina popular. Na qual se utiliza de produtos naturais, como plantas, raízes, extratos e entre outros, como verdadeiros remédios para diferentes tipos de enfermidades, cosméticos, essências e etc (BESSA, 2013).
O maior objetivo dessas pesquisas é poder isolar os princípios ativos dessas plantas e poder determinar fatores como atividade, citotoxidade, composição química, entre outros (Silva & Conceição, 2010). Comprovando esses benefícios, é possível promover a comunidades de baixa renda, maior acesso a medicamentos seguros, de baixo custo, alta disponibilidade, baixa toxicidade, e efeitos colaterais reduzidos (BESSA, 2013; Oliveira, Ferreira, & Toma, 2010).
As plantas do gênero botânico Endopleura uchi, conhecido popularmente como uxizeiro, pertencente à família Humiriaceae, ocorre em toda a área da floresta amazônica brasileira, sendo muito comum, principalmente, no estado do Pará e Amazonas. O Uxi é chamado também de uxi-ordinário, uxi-verdadeiro, uxiliso, axuá, cumatê, pururu, uxiamarelo e uxi-pucu (Taverny et al., n.d.).
Sua casca é bastante comercializada em mercados e feiras, para o combate a artrite, colesterol alto, diabetes, inflamações e infecções intestinais (Politi, Moreira, Salgado, & Pietro, 2010). Sua polpa é de característica carnosa, farinácea e oleosa, com sabor e cheiro peculiar e agradável, sendo consumida de diversas maneiras pela comunidade da região e pela indústria para a produção de sorvetes, cremes, refrescos, doces, licores, entre outros (Taverny et al., n.d.).
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
ENDOPLEURA UCHI
A Endopleura uchi é uma espécie do gênero Endopleura, pertencente à família Humiriaceae, nativa da Amazônia, presente em todos os estados da região, especialmente no Pará e Amazonas1. A família Menispermaceae abrange cerca de 8 gêneros e 65 espécies distribuídas desde a Costa Rica até o Brasil, também ocorrendo na costa ocidental da África2. É conhecida popularmente por Axuá, Pururu ou Uxi Amarelo.
A árvore pode atingir até 30 metros, com troncos retos e lisos que podem atingir até 1 metro de diâmetro. Suas cascas são acinzentadas, possuem folhas denteadas, flores brancas esverdeadas e sementes oleaginosas3. Seus frutos são ricos em sais minerais, vitaminas C e E, ácidos graxos e fibras4.
Os frutos, bem como sua casca, possuem grande valor medicinal na região, sendo indicados para o tratamento de inflamações, artrite, colesterol e diabetes5, sendo conhecido, também, pelas suas propriedades antioxidantes, antivirais, diuréticas e vermífugas. Um dos principais componentes ativos presentes na planta é a bergenina, um C-glicosídeo do 4-O-metil ácido gálico, que é encontrado tanto na casca, quanto nos frutos6.s
COMPOSIÇÃO QUÍMICA
Na espécie Endopleura uchi já foram observadas a ocorrência das isocumarinas bergenina e 8,10-dimetoxibergenina e dos triterpenóides pentacíclicos ácido masílinico e seu éster masilinato de metila no caule7. Seus frutos apresentaram principalmente ácido oléico e ácido palmítico, além de cerca de outros 42 componentes responsáveis pelo odor característico da fruta, com predominância de 3,3-dimetil-2-butanol e eugenol8.
A bergenina, principal componente presente na planta, é um sólido cristalino com ponto de fusão de 149,8 ºC9. Esta substância tem demonstrado diversas atividades biológicas, atuando com propriedades antifúngicas10, antioxidantes11, hepatoprotetora12 e até anti-inflamatória13. Foram relatados, também, atividade neuroprotetiva14 e antiviral, atuando contra o vírus HIV15. Abaixo, a figura 1 mostra a estrutura química da bergenina.
Figura 1: Estrutura química da bergenina.
MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS
Diferentes substâncias presentes em misturas homogêneas e heterogêneas podem ser separadas e/ou isoladas por meio de diferentes técnicas, auxiliando na caracterização de compostos orgânicos e inorgânicos.
PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
A extração líquido-líquido, também chamada de partição, é uma das técnicas de separação mais comumente utilizadas, que consiste em extrair componentes específicos de uma mistura em diferentes fases. Em sua configuração mais simples, a extração líquido-líquido pode ser realizada com o auxílio de um funil de separação ou tubos de centrífuga.
A partição de um soluto entre duas fases líquidas imiscíveis se baseia na solubilidade de cada um de seus compostos em ambos os solventes. Usualmente, se utiliza água e um solvente orgânico, imiscível com a água, adequado para o isolamento da substância em questão. No contato entre as duas fases, o soluto é transferido de uma fase para a outra, permitindo seu isolamento.
EXTRAÇÃO POR ULTRASSOM
A extração por ultrassom, também chamada de sonicação, é uma técnica que utilizaa energia de ondas sonoras e que cria uma vibração no fluido, causando uma variação de pressão neste e gerando cavitação – processo no qual ocorre a formação de cavidades (bolhas de vapor ou gás) em um líquido, em função da redução de pressão total. Esta redução de pressão é suficiente para que a distância entre as moléculas ultrapasse a distância molecular crítica que mantém a matéria intacta16. As oscilações sofridas pelas moléculas com a passagem do som através do meio, juntamente com os processos de cavitação gerados e o aumento de temperatura, contribuem para a degradação de estruturas e compostos, permitindo sua extração.
Em um banho ultrassônico, o transdutor – dispositivo que gera a vibração – é preso ao fundo da cuba do aparelho e a energia vibracional das ondas ultrassônicas é transmitida através de um líquido – geralmente água – ao frasco reacional16. O ultrassom pode ser utilizado como técnica de extração alternativa ao Soxhlet, na extração de compostos orgânicos, apresentando eficiência de extração igual ou superior17. A extração utilizando o ultrassom ainda apresenta como vantagens de utilização o baixo custo, a rapidez no processo de extração, bem como a alta reprodutibilidade.
EXTRAÇÃO COM SOXHLET
O método de extração com consiste na transferência do analito de um sistema sólido para uma fase líquida, através do tratamento de uma amostra imersa em um solvente puro, geralmente éter de petróleo, éter dietílico ou n-hexano18.
O processo consiste no aquecimento de um solvente puro no balão até sua ebulição. O vapor resultante é conduzido por um tubo lateral até o condensador, onde é condensado e goteja no extrator. No extrator, o solvente condensado se acumula e termina por cobrir o cartucho contendo a amostra sólida. Ao atingir o nível do sifão, o excedente é evacuado até o balão, carregando as substâncias solúveis. Ao retornar ao balão, o solvente sofre aquecimento novamente, repetindo o ciclo. Um esquema do sistema pode ser visto abaixo.
Figura 2: Esquema de um sistema de extração utilizando Soxhlet.
Uma das vantagems do Soxhlet é sua grande eficiência na extração de compostos orgânicos. Entretanto, oferece como desvantagens um alto fator de degradação de alguns compostos, inviabilizando seu uso19, além de uma grande quantidade de solvente e um longo período de tempo necessários para a extração20.
MACERAÇÃO
A maceração é uma técnica simples, utilizada para extrair de um material substâncias químicas de interesse e que consiste na moagem do material, seguido de sua imersão em um solvente adequado para a extração do composto. Geralmente é feita em um recipiente fechado, com agitação esporádica, por um período de 6 a 10 horas e à temperatura ambiente. Existem variações da técnica que visam a melhoria da eficiência, utilizando agitação constante (maceração dinâmica) ou feita de forma repetida, renovando o solvente extrator (remaceração).
FILTRAÇÃO
A filtração é uma técnica utilizada para separar substâncias presentes em misturas heterogêneas, envolvendo sólidos e líquidos. A fase sólida é retida em papel de filtro ou algodão e a fase líquida é recolhida em outro frasco. Uma das técnicas mais comuns de filtração consiste no uso de papel de filtro ou algodão e um funil simples. É possível, também, utilizar sucção, com o auxílio de um funil de Buchner – que consiste de um funil cilíndrico de porcelana contendo um prato perfurado. O uso de sucção fornece uma rápida filtração, com maior aproveitamento da solução filtrada, quando comparada à filtração sob pressão atmosférica21. As figuras 3 e 4, abaixo, mostram, respectivamente, esquemas de filtração à pressão atmosférica e de filtração à pressão reduzida.
				
Figura 3. Esquema de filtração simples.		 Figura 4. Esquema de filtração à vácuo.
MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
A cromatografia é um método de análise que permite a separação, identificação e quantificação de substâncias químicas. Consiste na distribuição destas substâncias entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma fase permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem, os componentes presentes na fase móvel são distribuídos, de forma que cada um dos componentes da mistura é seletivamente retido pela fase estacionária22.
CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO
A cromatografia por adsorção, também chamada de cromatografia líquido-sólido ou cromatografia em coluna é um método cromatográfico que utiliza, em geral, uma coluna de vidro em posição vertical, com extremidade superior aberta e extremidade inferior possuindo uma válvula para o controle da fase móvel22. A fase presente no interior da coluna é chamada de adsorvente, sendo utilizados, geralmente, alumina, sílica gel, silicato de magnésio ou carvão ativo, onde as substâncias eluirão segundo suas polaridades. A atividade cromatográfica da fase estacionária, tendo grupos polares, aumenta sobre substâncias polares, observando-se a ordem a seguir22.
-CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
Os eluentes utilizados na fase móvel são diversos, a depender na necessidade. Entretanto, para que sejam adequados, devem não somente realizar sua função de solvente, propriamente dito, solubilizando os componentes da mistura, mas também possuir baixo ponto de ebulição para que sejam evaporados com facilidade, além de permitir o desenvolvimento dos componentes da mistura na coluna e remover ou dessorver estes componentes do adsorvente22.
A fase móvel, ao passar através do adsorvente na coluna, arrasta consigo os componentes da amostra que está sendo cromatografada. A velocidade do movimento descendente de um determinado componente da amostra depende de sua adsorção pela fase estacionaria, isto é, quanto mais fracamente o componente for adsorvido, mais rápida é a passagem pela coluna22. Esta adsorção está relacionada às forças de Van der Waals entre os compostos presentes da amostra e o adsorvente. A figura 5, abaixo, mostra o esquema de uma cromatografia em coluna.
Figura 5. Esquema de Cromatografia em Coluna.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste em separar os componentes de uma mistura por meio da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana. O processo de separação ocorre, principalmente, por meio da adsorção, entretanto, podem ocorrer, também, por partição ou troca iônica, ao se utilizar fases estacionárias tratadas, o que permite a separação tanto de substâncias hidrofóbicas quanto hidrofílicas22.
Os adsorventes mais utilizados na CCD são a sílica, alumina, celulose e a poliamida. De modo geral, os adsorventes utilizados na cromatografia em coluna podem, também, serem utilizados na CCD. Adsorventes com aplicações mais restritas também são utilizados, como a uréia e o polietileno na separação de ácidos graxos; silicatos de cálcio ou de magnésio na separação de açúcares; gel de dextrana na separação de aminoácidos e proteínas, além de carvão ativado para a separação de fenóis, além de vários outros adsorventes com a incorporação de reagentes diversos, de acordo com a necessidade22. As placas cromatográficas podem ser preparadas manualmente, com o auxílio de placas de vidro ou adquiridas comercialmente – estas, geralmente confeccionadas por uma camada de adsorvente depositada sobre uma lâmina de material plástico ou alumínio. A fase móvel pode ser composta por um solvente específico ou por uma mistura, de acordo com a necessidade. A figura 6, a seguir, mostra o esquema de uma placa cromatográfica com a aplicação da amostra, bem como a equação utilizada para o cálculo do fator de retenção (Rf), que é a razão entre a distância percorrida pela substância (ds) e a distância percorrida pela fase móvel (dm).
Figura 6. Esquema de placa cromatográfica e equação de fator de retenção.
Após o desenvolvimento do cromatograma, as placas passam por um processo de revelação, no qual tornam-se visíveis as substâncias incolores presentes na amostra. O processo pode ser de natureza química, como uso de diversas substâncias químicas, de acordo com a necessidade; de natureza física, com o uso de lâmpadas ultravioletas ou aquecimento, bem como natureza biológica, fazendo uso de reações enzimáticas ou bacterianas22. 
OBJETIVO
Esta prática teve como objetivo realizar o isolamento da bergenina a partir do extrato de Endopleura uchi, confirmando sua composição a partir de análise cromatográfica por comparação com padrão. 
MATERIAIS E MÉTODOS
MATERIAIS E REAGENTES
Erlenmeyers;
Bastão de vidro; 
Coluna cromatográfica; 
Suporte; 
Garras; 
Sílica; 
Béquer; 
Funil de separação; 
Evaporador rotatório; 
Placas cromatográficas; 
Balão de fundo redondo; 
Ultrassom; 
Funil;
Cuba de vidro; 
Capilar;
Metanol;
Hexano; 
Acetato; 
Clorofórmio; 
Vanilina Sulfúrica; 
Balança analítica; 
Espátulas; 
Frascos pequenos de vidro; 
Etiquetas;
Pipeta de Pasteur;
Padrão da bergenina.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
OBTENÇÃO DO EXTRATO
As cascas de Endopleura uchi foram submetidas a um processo de extração em metanol (o método não foi especificado) realizado pela professora Dra. Rita Nunomura. Tal extrato foi concentrado em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, até eliminação do solvente.
OBTENÇÃO DE FRAÇÕES – PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
	Foram realizadas partições líquido-líquido para obtenção de frações de diferentes polaridades. O extrato metanólico foi extraído em hexano, clorofórmio e acetato.
RECRISTALIZAÇÃO (SUSPENSÃO)
	Os cristais obtidos da fração em acetato foram solubilizados em acetona e posteriormente filtrados. A amostra utilizada foi obtida através de 200 mg dos cristais e que foram solubilizados em metanol.
CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO – COLUNA 
	A cromatografia em coluna foi utilizada para realizar a separação e o isolamento da bergenina a partir da amostra preparada com os cristais da partição de acetato. Nela foi utilizada 20g de sílica de fase normal. Os solventes utilizados para a extração foram clorofórmio e metanol, variando os eluentes, respectivamente, de 10 a 100% metanol.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
	Tanto as amostras para a realização da coluna, quanto as amostras obtidas da coluna cromatográfica foram analisadas por CCD em placas com sílica em fase normal, a fotodocumentação foi realizada em celulares smartphones. O volume de aplicação e o sistema de eluentes foi proposto de acordo com as características da amostras. As placas foram reveladas por luz ultravioleta 254 nm e vanilina. Após a obtenção das frações da coluna, foi feita uma placa comparando-se as frações com o padrão da bergenina.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
	O material cedido para estudo foram as 200 mg de cristais obtidos após a recristalização da fração em acetato obtida de uma partição realizada do extrato de Uchi amarelo. Para análise da pureza dos cristais obtidos foi feita uma análise por cromatografia em camada delgada (figura 7) onde é possível observar na revelação em luz ultravioleta no comprimento de onda 254 nm e vanilina sulfúrica a presença de mais substâncias. A substância destacada em vermelho é a de interesse – bergenina – e em cima da placa há mais uma substância não identificada. É importante citar que, como pode ser visto na figura, a bergenina revela em luz ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm, mas não é aparente ao ser revelada em vanilina sulfúrica.
Figura 7: Análise cromatográfica dos cristais da fração em acetato de E. uchi.
	Como pode ser visto na figura acima, devido a substância majoritária estar localizada em um fator de retenção muito bom, considera-se esse sistema de eluente um bom sistema para retirar essa substância na coluna. Visando o isolamento e purificação da bergenina, foi proposto o seguinte gradiente de eluentes para a coluna (tabela 1).
Tabela 1 – Sistemas de solvente utilizados na coluna.
	Número da fração
	Gradiente de eluentes
	Sistema de solventes
	Volume total
	1
	9:1
	Clorofórmio/Metanol
	100 mL
	2
	8:2
	
	
	3
	7:3
	
	
	4
	6:4
	
	
	5
	0:10
	
	
	Seguinte a proposta de sistema de eluentes, os 200 miligramas de cristais foram submetidos ao isolamento por cromatografia em coluna. A coluna realizada pode ser observada na figura abaixo (figura 8), onde após o recolhimento das 5 frações, as amostras foram concentradas em evaporador rotatório para retirada dos solventes. Vale ressaltar que o eluente 3 (7:3 CHCl3:MeOH) foi passado duas vezes para maior certeza de que a bergenina sairia nessa fração.
Figura 8: Coluna cromatográfica de Uchi. 
	Após concentração das amostras, as amostras foram pesadas. A fração 2 rendeu 127,8 mg de amostra, e a fração 3 proporcionou 4,4 mg. Subsequente à coluna, as frações obtidas foram analisadas por CCD utilizando como parâmetro um padrão de bergenina para constatar se houve o isolamento da bergenina. O sistema de eluição da placa foi o mesmo utilizado para análise dos cristais. O resultado pode ser analisado na figura abaixo (figura 9).
Figura 9: Análise cromatográfica das frações obtidas da coluna junto com o padrão da bergenina e fração que originou a coluna.
	A partir da análise cromatográfica na figura acima comprova-se que a fração 3 (7:3 clorofórmio/metanol) extraiu apenas a bergenina, ao olhar para a placa é possível constatar a substância ao analisar a olho nu a similaridade entre a primeira amostra aplicada (o padrão), a segunda amostra aplicada um pouco mais diluida mas presente (fração 3) e a quarta fração aplicada (cristais da fração em acetato ainda impuros). Já na terceira amostra aplicada, a fração 2 (8:2) extraiu e isolou uma substância com rf diferenciado à bergenina, sendo assim, outra substância química.
	A bergenina possui como fórmula molecular C14H16O9 e peso molecular 328 g/mol. Seu espectro de massas se apresenta da seguinte forma na fonte LC-MS, modo negativo (figura 10).
Figura 10: Espectro LC-MS da Bergenina. Fonte: <https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/bergenin#section=General-MS> 
CONCLUSÃO
A partir dos procedimentos realizados pôde-se concluir que a bergenina é uma substância que pode vir a ser facilmente isolada através de técnicas cromatográficas simples, podendo ser confirmada de maneiras simples também, como por exemplo comparação do fator de retenção com padrão por cromatografia em camada delgada, assim como por espectrometria de massas. O experimento foi realizado de forma unânime, obtendo a bergenina que corroborou com o padrão pertencente ao laboratório. 
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