Aula 9. Controle crescimento microbiano 2

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Controle do crescimento 
microbiano
DEFINIÇÕES
Esterilização: Destruição ou remoção de todas as formas de vida de um objeto ou 
habitat.
Desinfecção: Destruição maioria dos m.o. patogênicos mas não de todos os m.o. 
(em superfícies ou objetos). 
Sanitização: Processo que leva à redução dos microrganismos, a níveis seguros, 
de acordo com os padrões de saúde pública (aplicado a utensílios e objetos).
Ex: lavar louças e utensílios com água fervente ou com desinfetante 
Anti-sepsia: destruição de patógenos em tecidos vivos. Como são aplicados em 
tecidos vivos, os anti-sépticos são, geralmente, menos tóxicos que os desinfetantes
Germicida: mata microrganismos, mas em geral não endosporos.
“Cida”: agente que promove a morte (ex: bactericida, fungicida, algicida)
“Stático”: agente que promove a inibição do crescimento (bacteriostático, 
fungistático)
Padrão de morte microbiana
Da mesma forma que no crescimento, a morte microbiana ocorre de forma 
exponencial. Assim, após uma rápida redução do número, a taxa de morte pode 
tornar-se mais lenta, devido à sobrevivência de células mais resistentes.
Condições que afetam a atividade de um agente de controle microbiano, 
especialmente se tal agente é de natureza química:
1. Tamanho da população: Quanto maior a população, maior o tempo 
necessário à sua eliminação.
2. Natureza da população: Se nesta população de microrganismos existirem 
endosporos, os quais são muito mais resistente que formas vegetativas, sua 
eliminação não ocorrerá tão facilmente. No caso de células em diferentes 
estágios de crescimento - células mais jovens tendem a ser mais suscetíveis que 
células em fase estacionária. 
3. Concentração do agente: Geralmente, quanto mais concentrado, melhor (exceto 
álcool). A relação entre a concentração e a eficiência via de regra não é linear.
4. Tempo de exposição: agentes químicos requerem tempo mais prolongado, já 
tratamentos térmicos exposição mais longa compensa temperatura mais baixa. 
5. Temperatura: Dentro de limites, o aumento da temperatura torna o processo mais 
eficiente. Para agentes químicos, geralmente o aumento de 1°C da temperatura 
aumenta em 10 vezes a eficiência do processo, o que também permite a diluição do 
agente.
6. Condições "ambientais": pH do meio - quando é ácido, favorece a eliminação 
térmica; presença de matéria orgânica - dificulta a ação do produto (necessidade de 
lavagens dos materiais antes do controle por agentes químicos), seja por proteger o 
microrganismo ou competir pelo produto em uso. Altas concentrações de açúcar, 
proteínas ou lipídeos diminuem a penetrabilidade do calor. A consistência do material 
ou solução também interfere.
Susceptibilidade relativa de microrganismos 
Os principais agentes físicos que promovem o controle microbiano são: 
Calor, Filtração e Radiações. Eventualmente, outros agentes, tais como 
as baixas temperaturas, dessecação, podem ser utilizados.
CALOR - um dos agentes físicos mais práticos e eficientes para a esterilização 
e/ou desinfecção. O calor pode ser empregado sob duas formas: seco e úmido, 
tendo a vantagem de apresentar, apenas 2 parâmetros a serem controlados: tempo 
e temperatura.
Para todos os organismos são definidas as temperaturas cardeais, ou seja, as 
temperaturas mínima, máxima e ótima de crescimento. Assim, quando estes são 
submetidos a temperaturas superiores à temperatura máxima de crescimento, os 
efeitos letais tornam-se aparentes. 
PRINCIPAIS MÉTODOS DE CONTROLE MICROBIANO: 
- Controle por agentes Físicos 
- Controle por agentes Químicos
Processos empregando calor:
1. Calor seco: a morte ocorre pela oxidação de constituintes celulares 
Incineração: processo drástico de eliminação de microrganismos; destrói o produto.
Chama direta: os materiais são levados à incadescência, promovendo a destruição 
de todos os microrganismos.
Esterilização alça inoculação
Flambagem : processo onde o material é submetido diretamente ao fogo, seja seco 
ou embebido em álcool. Bastante utilizado na desinfecção de alças de vidro.
Estufa esterilizante : 160°C/2 hs ou 180°C/1 h. Amplamente utilizado para vidrarias 
e material metálico.
2. Calor úmido - é mais eficiente devido ao maior poder de penetração do vapor 
d’água. A morte é decorrente da desnaturação de ácidos nucléicos e proteínas, 
podendo também romper membranas. Além disso, o vapor tem maior capacidade 
de romper as pontes de hidrogênio.
Autoclave (121°C/15 min/1 atm) – vapor sob 
pressão. Muito utilizado em microbiologia destrói 
células vegetativas e endosporos, em um pequeno 
volume, em 10 a 12 minutos. Com volumes maiores, 
o tempo é maior (6 litros � 70 minutos). 
Frequentemente são utilizados indicadores da 
eficiência de esterilização, por exemplo, ampolas 
contendo endosporos de Bacillus stearotermophilus
ou outros, os quais são incubados após o processo 
de esterilização. Se há crescimento o processo não 
foi realizado adequadamente.
Esquema de funcionamento de uma autoclave
Curva de morte microbiana
D = tempo redução decimal define o tempo necessário 
para a morte de 90% dos microrganismos
Fervura (100°C/30 min.)
� comparação: a eliminação de endosporos de C. botulinum pela fervura, requer 
cerca de 5,5 horas. Por outro lado, a 120°C, estes esporos são eliminados após 4 
a 5 minutos. Elimina a maioria dos m.o. patógenos, mas não garante esterilização.
Pasteurização 
63°C/30 min - pasteurização lenta
72°C/15 seg - pasteurização rápida - HTST
O tratamento térmico é breve para evitar alterações significativas no sabor e teor 
nutricional de alimentos porém alguns microrganismos podem persistir e causar 
deterioração. 
- Pasteurização não elimina todos os microrganismos (não é esterilização)
- Tem como alvo microrganismos patogênicos tipicamente presentes em alimentos
- Processo muito utilizado para conservação de leite e bebidas
UHTP - pasteurização
UHTS - esterilização
FILTRAÇÃO - útil na esterilização de materiais termolábeis, sendo 
empregado para líquidos e gases. Os filtros são compostos por celulose, 
acetato, policarbonato, teflon, ou outro material sintético. Embora o 
diâmetro dos poros possa variar, os mais utilizados são aqueles de 0,2 
µm, que removem os microrganismos (exceto vírus) das soluções e do ar.
Membranas Filtrantes: Correspondem ao tipo mais comum de filtro 
esterilizante, em microbiologia. São membranas porosas de acetato de 
celulose, nitrocelulose ou policarbonato, tendo espessura de ≈ 0,2 mm, 
contendo poros variando de ≈ 0,1 a 0,5 µm de diâmetro, que ocupam 
cerca de 80 a 85% da membrana.
O ar também pode ser filtrado, em fluxos laminares contendo filtros HEPA 
(High Efficiency Particulate Air filters) muito usados em cabines de 
segurança biológica e hospitais, que removem 99,97% de partículas de 
0,3 µm. 
RADIAÇÕES - Ionizante e não ionizante
Radiação Não-Ionizante: a radiação ultravioleta (de 4 a 400 nm - sendo 260 nm o 
comprimento mais eficiente) é bastante letal, mas exibe baixa penetrabilidade, não 
atravessando vidros, filmes sujos e outro materiais. Assim, a radiação UV é 
extremamente eficiente na eliminação de microrganismos presentes em superfícies. 
Sua maior eficiência se dá a 260 nm, que corresponde ao comprimento de onda de 
maior absorção pelo DNA. A radiação UV afeta primariamente este tipo de molécula. 
Sua ação é decorrente da formação de dímeros de pirimidinas (timina). 
Cabine de fluxo laminar com luz UV utilizada na
descontaminação das superfícies internas 
Cuidado com exposição!!!!
� queimaduras, alergias 
� MUTAGÊNICO!!!!!!
Radiação Ionizante: Radiações de pequeno comprimento de onda, e de altíssima 
energia e penetrabilidade. Os dois principais tipos são a radiação Gama e os Raios 
X. São bastante eficientes, pois promovem a ionização de átomos, fazendo-os 
perderem elétrons. Comoconsequência são gerados radicais livres extremamente 
reativos, que podem destruir pontes de hidrogênio, duplas ligações, estruturas em 
anel. Quando na presença de oxigênio, geram radicais hidroxila livres, 
absolutamente tóxicos para as células.
A radiação gama é originada geralmente a partir de fontes de 60Co ou 137Ce. 
Estas radiações vêm sendo amplamente utilizadas em produtos termolábeis, tais 
como plásticos e alguns tipos de alimentos (frutas, vegetais, alimentos marinhos). 
Nos alimentos seu uso é interessante, uma vez que inativam enzimas autocatalíticas 
que participam do processo de degradação natural aumentando a vida útil dos 
produtos.
Outros métodos físicos de controle
Baixas temperaturas: refrigeração ou congelamento são muito utilizados no controle 
microbiano de alimentos e produtos biológicos, pois levam a uma diminuição ou 
interrupção do metabolismo. Na maioria os microrganismos patogênicos humanos são 
mesofílicos, estas baixas temperaturas são eficientes no controle. Porém, células de 
Clostridium botulinum, quando incubadas a 5°C, são ainda capazes de produzir e 
secretar a toxina, e patógenos como Listeria e Yersinia podem crescer em baixas 
temperaturas. Ciclo de congelamento/descongelamento são bastante prejudiciais. 
Dessecação: baixa atividade água evita crescimento mas células podem ficar viáveis. 
Liofilização: dessecamento a baixa temperatura. Utilizada para preservação de 
microrganismos. 
Pressão osmótica: conservas com altos teores de sal ou açúcar. Em geral fungos 
são mais resistentes que bactérias. 
Alta Pressão: utilizada na conservação de alimentos e produtos farmacêuticos. 
Promove alteração na estrutura molecular de proteínas e carbohidratos. 
Controle de Microrganismos por Agentes Químicos
Agentes químicos de controle microbiano:
Correspondem a agentes químicos naturais ou sintéticos que matam ou inibem o 
crescimento microbiano. 
Características de um agente químico ideal: 
boa atividade antimicrobiana, toxicidade seletiva, solubilidade, estabilidade, 
inocuidade, não interação com a matéria orgânica, temperatura de ação 
adequada, alto poder de penetração, sem poder corrosivo ou tintorial, desprovido 
de ação danosa ao meio ambiente.
Principais Tipos de Agentes Químicos:
1) Compostos orgânicos:
Fenóis e derivados (cresóis (metil-fenol), xilenóis): o fenol não é mais usado como 
desinfetante ou anti-séptico devido à sua toxicidade para os tecidos. Os derivados fenólicos 
(hexaclorofeno, triclosano) são empregados principalmente como anti-sépticos ou 
desinfetantes hospitalares. Atuam lesando membranas e promovendo desnaturação 
proteínas. São efetivos na presença de matéria orgânica, permanecem ativos por muito 
tempo. Entretanto tem odor desagradável e são irritantes para pele. 
Álcoois: Muito usados, efetivos, confiáveis e baratos, atuando como bactericidas, 
fungicidas e contra vírus envelopados. Os mais usados são etanol e isopropanol, 
nas concentrações entre 70 e 80%. Atuam desnaturando proteínas e dissolvendo 
lipídeos de membrana. Agem e evaporam sem deixar resíduos 
Compostos Quaternários de Amônio: são detergentes catiônicos. Bactericidas 
fortes especialmente contra Gram positivas. Fungicidas, amebicidas. Bactérias 
Gram negativas são menos afetadas (Pseudomonas crescem ativamente na sua 
presença!!). Ex: cloreto de benzalcônio e cloreto de cetilpiridíneo (Cepacol). 
Atuam sobre a membrana (fosfolipídeos). Inativados por detergentes aniônicos.
Biguanidas: 
� clorexidina muito usados como antissépticos tem ação bactericida 
principalmente se combianda com álcool ou detergentes. Causam ruptura da 
membrana citoplasmática bacteriana. Não atua sobre endosporos. 
2) Halogênios:
Iodo: anti-séptico para a pele a 2%, ou em solução com iodeto de potássio. Eficaz 
contra bactérias, fungos, vírus e protozoários parasitas. Combina-se com amino-
ácidos (tirosina) iodinando proteínas. Em concentrações elevadas elimina esporos. 
Tem como desvantagens: danos à pele, manchar e causar alergias
Iodóforos (combinação com moléculas orgânicas): liberação lenta é menos irritante
Ex: iodo-povidona (iodo + polivinilpirrolidona) 
Cloro: Muito utilizado no tratamento de águas e nas indústrias de laticínios e 
alimentos. Pode ser aplicado na forma de gás, hipoclorito de sódio ou de cálcio, 
que gera ácido hipocloroso (HOCl), a forma mais eficaz. 
Promove a oxidação de componentes celulares causando a morte em cerca de 
30 minutos. Eficaz contra fungos, bactérias e vírus, com a desvantagem de 
descorar alguns materiais. É eficiente, barato, de fácil uso, mas altamente reativo 
com a matéria orgânica. 
3) Metais Pesados:
Foram muito usados no passado como germicidas (prata, mercúrio, zinco e cobre), 
sendo atualmente substituídos por compostos menos tóxicos. Os mais usados são 
compostos orgânicos de mercúrio, prata, cobre e zinco. Ação oligodinâmica
- Mercurocromo e mertiolate, usados como como preservantes de soros e vacinas. 
O sulfato de cobre é usado na desinfecção de águas, contra algas.
Combinam-se com proteínas, geralmente grupos SH, desnaturando-as
4) Agentes oxidantes
Peróxidos: 
- peróxido de hidrogênio: ação oxidante. Usado como antisséptico mas tem atuação 
excelente em superfícies.
- ácido peracético: endosporocida considerado esterilizante, 
mata bactérias, fungos, vírus. Muito usado na desinfecção de equipamentos médicos 
e plantas de processamento de alimentos. Não deixa resíduos, baixa interação com 
matéria orgânica. 
Ozônio: empregado na desinfecção de água. Tratamento mais caro, tem a vantagem 
de não produzir compostos organoclorados. Devido à sua instabilidade, a água 
submetida a este tratamento está mais sujeita à contaminação que quando clorada.
5) Aldeídos:
Formaldeído e Glutaraldeído, moléculas muito reativas, combinam-se com proteínas 
formando ligações covalentes com grupos funcionais (NH2, OH, SH e COOH), 
inativando-as.
Formaldeído 8% dissolvido em água ou álcool (irritante e deixa resíduos)
Glutaraldeído 2% (menos irritante e mais efetivo). Bactericida, viricida e fungicida 
(10 minutos). De 3 -10 horas, destrói endosporos . Considerado agente químico 
esterilizante.
Gases esterilizantes: Óxido de etileno, possui alta capacidade de penetração. 
Como é explosivo, é dissolvido em misturas de 10 a 20% com CO2 , freon. Interage 
com proteínas e promove alquilação substituindo grupos OH, SH e COOH. Fatores a 
serem considerados: concentração, temperatura, umidade e tempo exposição. 
Condições: 38°C/5-8 hs ou 54°C/3-4 hs, com 50% de umidade e EtO de 400 a 800 
mg/litro. Muito utilizado para esterilização de material descartável.
Custo elevado, tóxico, mutagênico 
Esterilização óxido etileno
Outros agentes para esterilização gasosa: óxido de propileno e beta-propiolactona 
Agentes antimicrobianos
Agente Antimicrobiano: qualquer composto utilizado para tratar doenças produzidas 
por patógenos. Pode eliminar ou inibir o crescimento de microrganismos, podendo 
ser de origem natural ou sintética.
Antibióticos: Alexander Fleming foi o primeiro a utilizar o termo antibiótico para 
designar moléculas produzidas por um determinado organismo capazes de inibir o 
crescimento de outros. Constituem-se em produtos microbianos ou derivados, sendo 
produtos do metabolismo secundário. São geralmente compostos complexos, cuja 
síntese envolve várias etapas enzimáticas.
Características gerais das drogas antimicrobianas
• Toxicidade Seletiva: característica que todo antimicrobiano deve apresentar, pois 
reflete-se na capacidade de atuar seletivamente sobre o microrganismo, sem 
provocar danos ao hospedeiro.
Drogas que atuam sobre funções microbianas inexistentes em eucariotos 
geralmente tem maior toxicidade seletiva (Penicilina).
• Espectro de ação: Refere-se à diversidade de organismos afetados pelo agente. 
Geralmenteos antimicrobianos são de pequeno ou de amplo espectro. Atualmente, 
os laboratórios vem trabalhando em busca de isolar e purificar antimicrobianos de 
espectro restrito, que atuam especificamente sobre um ou um pequeno número de 
microrganismos. 
• Quanto à síntese: Microbiana, química ou semi-sintética
Microbiana - geralmente por uma ou poucas bactérias (actinomicetos) e vários tipos 
de fungos filamentosos. 
Química - sulfonamidas, Trimetoprim, Cloranfenicol, Isoniazida além de outros 
antivirais e antiprotozoários. 
Semi-sintéticos - são antibióticos naturais, modificados pela adição de grupamentos 
químicos, tornando-os menos suscetíveis à inativação pelos microrganismos 
(ampicilina, carbencilina, meticilina).
• Quanto à ação: "státicos" ou "cidas"
Os "cidas" podem ser "státicos" dependendo da concentração, ou do tipo de 
organismo.
Os "staticos" tem sua ação vinculada à resistência do hospedeiro.
Mecanismos de ação dos antimicrobianos
Vários são os possíveis alvos para os agentes antimicrobianos. O 
conhecimento dos mecanismos de ação destes agentes permite entender 
sua natureza e o grau de toxicidade seletiva de cada droga.
1) Inibição da síntese da Parede Celular:
Penicilinas e cefalosporinas: contém em sua estrutura um anel β-lactâmico, que 
interage com proteínas denominadas PBPs (Penicillin Binding Protein), inibindo 
também a enzima envolvida na transpeptidação, responsável pela ligação entre 
as cadeias de tetrapeptídeos do peptideoglicano. Com isso, há o impedimento 
da formação das ligações cruzadas entre os tetrapeptídeos de cadeias 
adjacentes de peptideoglicano, ocasionando uma perda na rigidez da parede 
celular. 
Bacitracina: Interfere com a ação do carreador lipídico que transporta os 
precursores da parede pela membrana. 
Vancomicina: liga-se diretamente à porção peptídica do PG. 
Estes agentes antimicrobianos são muito seletivos, pois atuam sobre estrutura 
encontrada somente em bactérias (peptideoglicano).
Atuam somente em bactérias em crescimento ativo
Modo de ação e estrutura das penicilinas
Proteínas de ligação a penicilina ( PBP)
http://asmscience.org/content/education/imagegallery/image.3662
Efeito dos antibióticos β-lactâmicos
[A] morfologia normal 
[B] morfologia em cultivo contendo 2 μg/mL de andinocilina 
Enterobacter aerogenes
2) Ligação à Membrana Citoplasmática: são agentes antimicrobianos 
que muitas vezes exibem menor grau de toxicidade seletiva.
polimixinas: Ligam-se à membrana, entre os fosfolipídeos, alterando sua 
permeabilidade (detergentes). São extremamente eficientes contra Gram 
negativos, pois afetam tanto a membrana citoplasmática como a membrana 
externa.
Ionóforos: Moléculas hidrofóbicas que penetram na membrana 
citoplasmática, permitindo a difusão passiva de compostos ionizados para 
dentro ou fora da célula.
3) Inibição da síntese de ácidos nucléicos:
Novobiocina: se liga a DNA girase, afetando o desenovelamento do DNA, 
impedindo sua replicação.
quinolonas: Inibem a DNA girase, afetando a replicação, transcrição e 
reparo.
Rifampicina: Ligação à RNA polimerase , bloqueando a transcrição.
4) Inibição da tradução ou da síntese protêica : um dos principais 
grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a síntese protéica 
corresponde a processo altamente complexo, envolvendo várias etapas e 
diversas moléculas e estruturas. 
estreptomicina e gentamicina: Liga-se à subunidade ribossomal 30S, bloqueando-
a e promovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formação do 
complexo de iniciação.
tetraciclina: Liga-se à subunidade ribossomal 30S (sítio A), impedindo a ligação 
do aminoacil-tRNA.
cloranfenicol: Liga-se à subunidade ribossomal 50S e inibe a formação ligações 
peptídicas entre os amino-ácidos.
eritromicina: Bloqueia a ação da subunidade ribossomal 50S e inibe a elongação. 
5) Antagonismo metabólico: geralmente ocorre inibição competitiva.
Sulfas e derivados: são análogos estruturais do ácido p-aminobenzóico (PABA), 
molécula crucial para a síntese de ácidos nuclêicos em bactérias. Ocorre inibição da 
síntese do ácido fólico, pela competição com o PABA.
Em seres humanos o ácido fólico não é sintetizado a partir do PABA.
Trimetoprim: bloqueio da síntese do tetrahidrofolato, inibindo a dihidrofolato redutase. 
Resistência microbiana
A resistência microbiana aos antimicrobianos pode ser de dois tipos: 
• Natural: ausência da estrutura, ou via metabólica alvo.
• Adquirida: Através de mutações espontâneas ou recombinação. 
Principais mecanismos de resistência:
Alteração da permeabilidade: modificação de porinas membrana impedindo 
entrada do agente. Muitas bactérias Gram negativas são resistentes a penicilina 
por impermeabilidade. 
Inativação : muitos antimicrobianos são inativadas por enzimas codificadas pelos 
microrganismos. A β-lactamase é uma enzima microbiana que cliva o anel β-
lactâmico das penicilinas inativando-as. Outras drogas podem ser inativadas por 
modificações resultantes da adição de grupamentos químicos, como a 
fosforilação ou acetilação.
Os genes que codificam a enzima β -lactamase estão geralmente presentes em 
plasmídeos que são facilmente transmitidos de uma bactéria para outra tornando a 
receptora resistente aos antibióticos β-lactâmicos. Desta forma a resistência é 
disseminada.
Novos tipos de penicilinas modificadas são resistentes a ação da β -lactamase porém 
também surgem novas bactérias resistentes!!!!! 
Modificação da estrutura alvo (ou sítio de ação): alterações (mutações) na molécula do 
RNAr (no caso de resistência à eritromicina e cloranfenicol), alteração da enzima, no 
caso de drogas que atuam no metabolismo, ou uso de vias metabólicas alternativas.
Bomba de efluxo: bombeamento ativo do agente antimicrobiano para fora da célula
Teste de sensibilidade
Produção antibiótico