DNA Forense

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Programa de Educação 
Continuada a Distância 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Curso de 
DNA Forense 
 
 
 
 
 
Aluno: 
 
 
 
 
 
 
 
 
EAD - Educação a Distância 
 Parceria entre Portal Educação e Sites Associados 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Curso de 
DNA Forense 
 
 
 
MÓDULO I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores 
descritos na bibliografia consultada.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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SUMÁRIO 
 
 
Módulo I 
Introdução 
Breve histórico do DNA forense 
Fundamentos de biologia molecular 
 
 
Módulo II 
DNA genômico x DNA mitocondrial 
Marcadores de variação genética 
Análise do DNA forense: aspectos gerais 
Estudo da metodologia aplicada à identificação humana 
Exame pericial em local de crime 
 
 
Módulo III 
Coleta do material biológico 
Extração de DNA 
Quantificação de DNA 
Reação de amplificação pela polimerase - PCR 
 
 
Módulo IV 
Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA 
Gel de agarose 
Gel de poliacrilamida 
Eletroforese capilar 
 
 
 
 
 
 
 
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Módulo V 
Interpretação dos resultados 
Análise de outros perfis genéticos 
Cromossomo Y 
DNA mitocondrial 
Controle de qualidade dos laboratórios 
Controle de qualidade externo: testes de proficiência em genética forense 
Considerações finais 
Glossário 
Referências bibliográficas 
 
 
 
 
 
 
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MÓDULO I 
 
Introdução 
 
A identificação humana pelo estudo do perfil genético é amplamente utilizada em 
casos de caracterização de vínculo genético familiar, seja em processos cíveis (ex.: 
exclusão ou não da paternidade), como também em processos criminais (ex.: cadáveres e 
materiais biológicos encontrados na cena do crime). 
Atualmente, a mídia tem contribuído de forma 
significativa para a divulgação e popularização dessa 
tecnologia, que vem evoluindo sobremaneira nas 
últimas duas décadas. 
No entanto, algumas considerações sobre 
essa tecnologia não passam de mito, pois não se 
pode concluir que “o DNA resolve tudo”, mas que a 
análise do perfil genético pode auxiliar na 
identificação humana fazendo parte das provas 
periciais de um determinado caso criminal ou civil. 
 
Segundo Butler (2005), os testes de DNA 
para identificação humana podem ser utilizados para: 
 Casos forenses: análise do DNA do 
suspeito com aquele obtido da evidência biológica encontrada na cena do crime ou nas 
vítimas; 
 Teste de paternidade ou caracterização de vínculo genético familiar: 
exclusão ou não de supostos pais, filhos, mães e outros membros da família; 
 Desastres em massa: identificação dos fragmentos humanos e dos corpos 
encontrados em um desastre com inúmeras vítimas; 
 Investigações históricas; 
 Investigações de pessoas desaparecidas; 
 
 
 
 
 
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 Identificação de militares; 
 Banco de DNA de criminosos 
ou de evidências biológicas. 
 
Para isso, é necessário que alguns 
conhecimentos sejam adquiridos para sua 
posterior realização laboratorial. Tais 
conhecimentos teóricos serão ensinados 
nesse curso, que englobará desde os 
fundamentos básicos da biologia molecular 
até a elaboração de protocolos para a 
realização do estudo do DNA forense. 
 
 
 
 
 
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Breve Histórico do DNA Forense 
 
Antes da utilização do DNA para identificação humana, os genes e suas 
estruturas foram estudados para outras finalidades, sendo resumidamente descrito a 
seguir: 
 1856-1863: Gregor Mendel 
 
Figura 1: Gregor Mendel 
 
→ Considerado o “pai da genética moderna” 
→ Estabeleceu as regras da herança genética 
→ Realizou experimentos com 21.000 plantas híbridas para estabelecer o conceito 
de herança genética (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 2: Resumo dos experimentos realizados por Mendel, com diversos tipos de plantas e sua 
herança genética, com a presença de genes dominantes YY e recessivos yy. 
 
 
 1900-1933: Thomas Hunt Morgan (Figura 3) 
 
 Figura 3: Thomas Hunt Morgan contribuiu para a genética moderna ao descobrir a herança 
cromossômica e a recombinação genética. 
 
 
 
 
 
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→ Descobriu a herança cromossômica (Figura 4) e a recombinação genética, na 
qual os ocorre a troca de fragmentos cromossômicos antes da divisão celular 
(Figura 5). 
 
 Figura 4: Representação esquemática dos resultados dos experimentos de Morgan: herança de 
genes ligados ao cromossomo X. 
 
 
Figura 5: Esquema ilustrativo do método de recombinação genética dos cromossomos. 
 
 
 
 
 
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 1944: Avery, MacLeod e McCarty (Figura 6) 
→ Atribuíram ao DNA a herança genética 
 
 Figura 6: Fotografias dos pesquisadores que estudaram a herança genética do DNA. 
 
 
 
 
 
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 Grupos sanguíneos: Antes dos testes utilizando-se ácidos nucléicos, muitos 
tipos de exames sanguíneos eram utilizados para auxiliar na investigação de paternidade. 
Esses testes, baseados em diferentes sistemas de grupos sanguíneos ofereciam 
resultados de até 70 a 90%, se todos fossem analisados e combinados. Os grupos 
sanguíneos recomendados pela Associação Médica Americana eram os sistemas 
eritrocitários: ABO, Rh, MNs, Kell, Duffy, Kidd e o sistema sanguíneo leucocitário HLA 
(PAGE-BRIGHT, 1982). 
 
 1953: James Watson e Francis Crick (Figura 7). 
 
→ Descoberta da estrutura do DNA (Figuras 8 e 9) 
 
 Figura 7: Watson e Crick. 
 
 
 
 
 
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 Figura 8: Fórmula química de uma cadeia simples de ácido nucléico e diagrama da molécula de 
DNA. 
 
 Figura 9: Modelo original da molécula de DNA descrita por Watson e Crick em 1953.13 
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 1985 – Alec Jeffreys (Figura 10): 
 
 
 Figura 10: Alec Jefreys em seu laboratório – a origem da análise do perfil de DNA. 
 
 
→ DNA fingerprint ou impressão digital de DNA (Figura 10 e 11) foi descrito pela 
primeira vez por Alec Jeffreys, em 1985, e revolucionou a análise do DNA visando a 
caracterização de vínculo genético. 
A identificação das regiões polimórficas é realizada empregando-se Polimorfismo 
de Comprimento de Fragmentos de Restrição (Restriction Fragment length polymorphism 
– RFLP), no qual o DNA é submetido à digestão utilizando-se enzimas de restrição 
específicas que cortam a dupla fita de DNA em regiões determinadas. Os fragmentos são 
separados eletroforeticamente, e posteriormente desnaturados, neutralizados e 
transferidos do gel de eletroforese para uma membrana de nylon, em um processo 
denominado Sourthen blotting. Mediante a presença de uma solução de hibridização com 
sondas específicas contendo fósforo radioativo, os fragmentos de DNA fita simples irão 
 
 
 
 
 
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hibridizar e aqueles não correspondentes serão removidos. Após a autorradiografia, os 
VNTRs poderão ser visualizados para análise (Figura 11 e 12) (COMMITTEE ON DNA 
TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1992; JEFFREYS, 1985). 
 
 
 
 Figura 11: Análise da impressão digital de DNA por Alec Jeffreys. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 12: Representação esquemática da análise de Repetições Consecutivas de Número 
Variável ou VNTR. 
 
 
Desde então, algumas tecnologias foram desenvolvidas incluindo a análise de 
Repetições Consecutivas Curtas ou STRs (Edwards et al, 1991) por gel de poliacrilamida 
corados por prata (Nelleman et al, 1994) ou analisados por equipamentos 
semiautomáticos que utilizam gel de poliacrilamida e realizam a leitura por laser dos 
fragmentos amplificados pela PCR com iniciadores marcados com fluoróforos que emitem 
fluorescência (Kimpton et al, 1993; Gill et al, 1995). 
Atualmente, a eletroforese por capilar (Pearce et al, 1993) é amplamente utilizada 
e possui o mesmo princípio que a eletroforese em gel analisados por laser, com a 
 
 
 
 
 
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diferença de que possui capilares para a separação eletroforética dos fragmentos de DNA 
(Butler, 2005). Há também relatos da utilização de microchips de DNA para a análise de 
STRs (Radtkey et al, 2000; Huang et al, 2004; Divine e Allen, 2005; Bienvenue et al, 
2005), podendo também ser um potencial para a análise futura dos STRs (Figura 13). 
 
 Figura 13: Eventos históricos no mundo e no Brasil relacionados à análise de DNA forense. 
 
 
O Projeto Genoma concluído agora pode identificar pelo sequenciamento do DNA 
humano a localização de genes, revelando que há provavelmente cerca de 20.500 genes 
humanos. Tal fato revelou ao mundo informações detalhadas sobre a estrutura, 
organização e funcionamento do conjunto completo de genes humanos. O Consórcio 
 
 
 
 
 
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Internacional para Sequenciamento do Genoma Humano publicou o primeiro rascunho do 
genoma humano na revista Nature, em fevereiro de 2001, com a sequência de todo o 
genoma de três milhões de pares de bases, cerca de 90% completo. A surpreendente 
conclusão desta primeira versão era de que o número de genes humanos pareceu ser 
significativamente menor do que estimativas anteriores, a qual variou de 50.000 genes a 
140.000 (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
A sequência completa foi concluída e publicada em abril de 2003. Após a 
publicação da maioria do genoma, em fevereiro de 2001, Francis Collins, diretor do 
Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Human Genome Research 
Institute – NHGRI), observou que o genoma poderia ser pensado em termos de um livro 
com várias utilizações: “Trata-se de um livro de história, uma narrativa da viagem da 
nossa espécie através do tempo. É um trabalho manual, com um projeto para construção 
incrivelmente detalhado de cada célula humana. E é um livro-texto transformador da 
medicina, com informações que darão aos profissionais da saúde novos poderes para 
tratar, prevenir e curar as doenças” (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH 
INSTITUTE, 2008). 
As ferramentas criadas através do Projeto Genoma também estão sendo 
utilizadas para caracterizar o genoma de outros organismos usados extensivamente em 
pesquisa biológica como ratos, moscas e frutas. Tal pesquisa é importante porque a 
maioria dos organismos tem genes muito semelhantes ou “homólogos”, possuindo 
funções similares. Estes objetivos são necessários e continuarão a exigir uma variedade 
de novas tecnologias que tornarão possível e relativamente rápido construir um primeiro 
esboço do genoma humano, assim como aperfeiçoar este projeto (NATIONAL HUMAN 
GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
 
 
 
 
 
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As técnicas utilizadas no projeto genoma incluem: 
→ Sequenciamento de DNA; 
→ O emprego da técnica de análise de Fragmentos de 
Restrição dos Polimorfismos de Comprimento (RFLP); 
→ Cromossomos artificiais em levedura (YAC); 
→ Cromossomos artificiais em bactéria (TAS); 
→ A reação em cadeia da polimerase (PCR); 
→ Eletroforese. 
Fonte: An Overview of the Human Genome Project. 
 Disponível em http://www.genome.gov/12011238 
 
 
 
 
 
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Fundamentos de Biologia Molecular 
 
O DNA (ácido desoxirribonucléico) armazena toda a informação genética, sendo 
encontrado nos cromossomos do núcleo e nas mitocôndrias, a maior parte localizada no 
primeiro (Figuras 14 e 15). 
 
 
 
 Figura 14: A célula é a unidade básica de todos os indivíduos vivos. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 15: DNA a molécula da vida: do cromossomo a cadeia dupla de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
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O DNA pode ser extraído de amostras de sangue, de esfregaços bucais, de 
saliva, de osso, de dente, de tecidos e órgãos, de fios de cabelos, de sêmen, entre outros 
materiais biológicos (Brettell et al, 2005) (Figura 16). 
 
 Figura 16: Amostras biológicas para análise do DNA forense. 
 
 
 
 
 
 
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As moléculas de DNA caracterizam-sepor polímeros de alto peso molecular, 
compostos de unidades básicas de nucleotídeos contendo 2-desoxirribose ligados entre 
as posições 3’ e 5’ de carbonos por ligações fosfodiéster. A estrutura do DNA é uma dupla 
hélice de cadeias complementares opostas, na qual as duas moléculas são mantidas 
juntas por fracas pontes de hidrogênio (Figuras 17 e 18) (Watson & Crick, 1953). 
A) 
 
 
 
 
 
 
 
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B) 
 
 Figura 17: A) Representação esquemática da dupla hélice da molécula de DNA segundo Watson 
& Crick, 1953; B). Estrutura química da molécula de DNA, com sua natureza antiparalela com o carbono 3’ 
com o carbono 5’. As bases C e G são ligadas por três pontes de hidrogênio e as A e T, por duas. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 18: Representação esquemática da molécula de DNA. 
 
 
A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina através de duas ou 
três uniões de hidrogênio respectivamente. Essas bases nitrogenadas (adenina - A, timina 
- T, citosina - C e guanina – G ou g) (Figura 19), ao se ligarem com o açúcar, constituem o 
nucleosídeo; sendo que o último ligado com um grupamento fosfato, constitui o 
nucleotídeo, que é a unidade básica de repetição na fita de DNA (Watson & Crick, 1953) 
(Figura 20). 
 
 
 
 
 
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 Figura 19: Estrutura química das bases nitrogenadas e suas respectivas pontes de hidrogênio. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 20: O nucleotídeo e par de bases (“base pair” - bp) 
 
 
Determinados fragmentos de DNA especificam a síntese de RNA em um 
processo denominado transcrição. O ácido ribonucléico (RNA) é um polímero linear 
composto de cadeia de unidades de ribose ligadas pelas posições 3’ e 5’ por intermédio 
de grupamentos fosfodiéster, tendo como função a síntese protéica e também pode 
constituir o genoma de alguns vírus. O gene é uma unidade de transcrição que consiste 
de um segmento de DNA específico que se estende do início do sítio de transcrição ao 
sítio de término de transcrição. O RNA especifica a síntese de polinucleotídeos que 
formarão as proteínas, sendo tal processo denominado tradução, ocorrendo nos 
ribossomos, nas mitocôndrias e cloroplastos (Figuras 21, 22 e 23) (Beard & Armentrout, 
1967; Srinivasan & Yathindra, 1977). 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 21: Fluxograma da transcrição e translação. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 22: Mecanismo de produção de aminoácidos pelas células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 23: Ilustração da transcrição e translação. 
 
 
As regiões de um gene que codificam proteínas são denominadas éxons e 
aquelas que não a realizam, íntrons. Cada éxon codifica uma porção específica da 
proteína completa. Em algumas espécies, incluindo a humana, os éxons são separados 
por longas regiões de DNA denominadas íntrons ou DNA “lixo”, que aparentemente não 
estão associadas à codificação de DNA (National Human Genome Research Institute, 
2008) (Figura 24 e 25). 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 24: Diferenças entre os éxons e íntrons. Observe a remoção da parte amarela, 
correspondente ao íntron. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 25: Diferenças entre os éxons e íntrons. 
 
 
 
 
 
 
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Os alelos constituem as variantes de um gene em uma região particular, ou lócus, 
em um cromossomo. Diferentes alelos produzem variações nas características individuais 
como, por exemplo, cor do cabelo ou tipo sanguíneo (National Human Genome Research 
Institute, 2008) (Figura 26). 
 
 
 
 Figura 26: Alelos correspondentes à cor dos olhos, ligados ao cromossomo X. 
 
 
 
 
 
 
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A duplicação celular ocorre através da mitose (Figura 27) e a formação de 
gametas masculinos e femininos ocorre através da meiose (Figura 28). 
 
 Figura 27: A mitose é responsável pelo crescimento e desenvolvimento dos indivíduos, bem como 
a reposição de células injuriadas ou destruídas do corpo. 
 
 
 
 
 
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 Figura 28: A meiose é um processo de divisão celular pelo qual uma célula diplóide (pares de 
cromossomos, sendo um materno e outro paterno) origina quatro células haplóides (um cromossomo), 
reduzindo à metade o número de cromossomos constante de uma espécie. 
 
 
 
 
 
 
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A transferência das informações genéticas de uma geração a outra ocorre através 
da replicação do DNA, catalisada por enzimas denominadas DNA polimerases. Essas 
enzimas mediam a síntese da nova fita de DNA in vivo, utilizando como molde (template) 
a fita complementar da molécula existente. Inicialmente, a molécula de DNA tem as suas 
fitas separadas pelo rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm a dupla hélice, 
em um processo denominado desnaturação, que ocorre in vivo em pH alcalino. Além da 
fita molde, é necessária a presença de um oligonucleotídeo iniciador ou primer, ou seja, 
um pequeno fragmento de DNA simples, complementar a fita molde, desoxinucleotídeos 
trifosfatados (dATP, dCTP, dGTC, dTTP), que serão incorporados à fita duplicada. A 
replicação do DNA ocorre em regiões específicas denominadas origem de replicação 
(Marmur & Doty, 1959). 
Sucintamente, a replicação ocorre com a adição de um nucleotídeo à fita de DNA 
pela ligação de seu grupo fosfórico, presente no carbono 5' da desoxirribose, com a 
hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do último nucleotídeo presente na cadeia 
replicada. Por esse motivo, descreve-se que a síntese de DNA ocorre no sentido 5´-> 3´ 
(Figura 29) (Marmur & Doty, 1959;). Todo o processo descrito acima será a base do 
princípio da amplificação do DNA in vitro denominada reação em cadeia pela polimerase 
(PolymeraseChain Reaction – PCR), que será estudado nos tópicos adiante. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 29: Posição 5´- 3´das fitas de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
----------------FIM DO MÓDULO I--------------- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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MÓDULO II 
 
 
DNA Genômico X DNA Mitocondrial 
 
O conjunto completo de sequências no material genético de um organismo é 
denominado genoma, incluindo todos os cromossomos mais qualquer DNA presente nas 
organelas. O genoma nuclear humano possui cerca de 3300 Mb, distribuídos em 22 
cromossomos autossômicos e 2 sexuais (Figura 30 e 31), compostos de 30 a 35 mil 
genes, caracterizando por 1,5% a 2% de DNA codificante de proteínas, sendo que 46% 
do total constitui-se de sequências de DNA repetitivas (Wiemann, 2001; Szymasky, 2005). 
 
 
 Figura 30: Cromossomos humanos. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 31: Cariótipo de um humano do sexo masculino. 
 
 
A finalização do sequenciamento do DNA humano (Tabela 1) trouxe alguns dados 
que alteraram os valores esperados pela comunidade científica, como por exemplo, a 
quantidade de genes. Estimava-se que o genoma humano possuía mais de 80.000 genes, 
mas após o Projeto Genoma, estima-se que existam de 20.000 a 25.000 genes (Figura 
32). 
 
 
 
 
 
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 Tabela 1: Quantidade de nucleotídeos em cada cromossomo humano. 
 
 
 
 
 
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 Figura 32: Resumo das características básicas do genoma humano. 
 
 
 
 
 
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O genoma mitocondrial possui particularidades que o diferenciam do genoma 
cromossômico, sendo sua herança materna. Sua estrutura circular de 16,5Kb lhe fornece 
maior resistência à digestão enzimática de uma única célula há a presença de milhares de 
mitocôndrias, cada qual com uma cópia de DNA mitocondrial, sendo que 93% do seu 
genoma é codificante, não possuindo íntrons e com poucas regiões repetitivas (Anderson 
et al, 1981). Dentro de uma única célula há inúmeras cópias do genoma mitocondrial, ao 
contrário do genoma nuclear, que possui uma cópia por célula (Budowle et al, 2003) 
(Figura 33, 34 e 35). 
 
 
Adaptado de http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/july1999/dnaf1.htm. Acessado em 28/09/2008 
Figura 33: Diferenças básicas entre o DNA genômico ou nuclear e mitocondrial. 
 
 
 
 
 
 
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Figura 34: Representação esquemática do DNA genômico ou nuclear e do DNA mitocondrial 
(mtDNA). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 35: Representação esquemática do DNA mitocondrial (mtDNA), de acordo com as suas 
regiões hipervariáveis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Marcadores de Variação Genética 
 
A variabilidade do DNA humano confere a diferença entre cada ser vivo, sendo 
que pode ser denominada por polimorfismo se a variação genética possuir frequência 
acima de 1% em determinada população e mutação abaixo desse valor (Beiguelman, 
2006). Jeffreys et al. (1985) foi um dos primeiros a analisar as regiões de minissatélites do 
DNA humano, possibilitando a investigação de paternidade e a identificação em casos 
criminais. O polimorfismo dos minissatélites permite que ocorra a diferenciação dos 
indivíduos, aumentando a possibilidade de termos uma quantidade maior de alelos na 
população, desde que não sejam gêmeos idênticos, posto que terão o mesmo perfil 
genético. Para a análise do minissatélite, Jeffrey et al. desenvolveram o DNA fingerprint 
(impressão digital de DNA). Ao utilizar a tecnologia de Southern blot, obtiveram um 
padrão de bandas específico para cada indivíduo, como se fosse uma impressão digital. 
Os Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo de 
comprimento de sequência única englobam os VNTR (Variable Number of Tandem 
Repeats) ou repetições consecutivas de número variável (Wyman e White, 1980; Jeffreys 
et al,1985; Wolff et al,1989) ou minissatélites descritos no parágrafo anterior, e também os 
STR (Short Tandem Repeats) ou repetições consecutivas curtas ou microssatélites 
(Edward et al, 1991; Edward et al, 1992) (Figuras 36, 37 e 38). 
A diferença entre eles é o tamanho da sequência que se repete, sendo que nos 
microssatélites essa estrutura é menor, pois possuem repetições constituídas de 2 a 9 
pares de bases, e o minissatélite, de 10 a 64 pares de bases. Esse DNA satélite na 
maioria das vezes não é transcrito, consequentemente não está associado com a 
expressão da informação genética (Nelleman et al, 1994; Hamond et al, 1994; Gill et al, 
1994; Urquart et al, 1994; Chakraborty et al, 1999). 
 
 
 
 
 
 
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Figura 36: Representação esquemática comparando as VNTRs das STRs, segundo sua unidade de 
repetição. 
 
 
Figura 37: Representação esquemática das repetições consecutivas do STR TPOX e seus 
respectivos alelos. 
 
 
 
 
 
 
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Os Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de nucleotídeo único 
é uma variação na sequência de DNA que ocorre quando um nucleotídeo é alterado por 
outro em sequências de DNA que podem ou não codificar genes (Delahunty, 1996; 
Sobrino et al, 2005; Butler, 2005) (Figuras 38 e 39). 
 
 
Figura 38: Representação esquemática comparando os polimorfismos de sequência com os de 
comprimento. 
 
 
 
 
 
 
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Figura 39: Representação esquemática de sequências de DNAde três indivíduos distintos com a 
presença de um SNP (polimorfismo de sequência) e um STR (polimorfismo de comprimento), mostrando 
suas diferenças. 
 
 
Atualmente, os STRs e SNPs são empregados amplamente para a identificação 
humana e possuem diferenças relevantes (Gill et al, 2004; Butler, 2005) (Quadro 1). 
 
 
 
 
 
 
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Quadro 1: Comparação entre os STRs e SNPs (adaptado de Butler, 2005). 
STR SNP 
Variam de 2 a 9 nucleotídeos que se 
repetem consecutivamente 
Troca de bases A/T, A/G, A/C, C/T, 
C/G, T/G. 
Apresentam-se em diversos alelos, 
normalmente mais de 5 
Normalmente 2 
Detectado por separação 
eletroforética em gel ou capilar 
Análise por sequenciamento ou 
hibridização em microchip. 
O FBI preconiza 13 STRs Estima-se que mais de 50 SNPs 
seriam necessários para a análise (Gill 
et al, 2004) 
Vantagens: 
• Banco de dados populacionais 
realizado no mundo todo 
• A presença de vários alelos 
facilita a identificação de 
mutações e misturas de DNA. 
Vantagens: 
• Os produtos de PCR podem ser 
menores, resultado em maior 
chance de amplificação, 
principalmente em amostras 
biológicas degradadas. 
• Após devidamente otimizados e 
estudados, pode-se analisar mais 
de 1000 SNPs em um mesmo 
microchip, mas essa tecnologia 
ainda não é amplamente 
empregada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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A análise dos SNPs também pode estar associada aos fenótipos individuais, 
havendo uma possibilidade futura de identificação de traços físicos como, por exemplo, a 
cor da íris (Frudakis et al, 2003). Sua grande aplicação na atualidade se dá nas pesquisas 
de farmacogenética e na indústria farmacêutica, na caracterização de doenças de origem 
genética e bioquímica (Wang et al, 1998). 
Jobim et al. (2006) relata que os melhores STRs utilizados na identificação 
humana são aqueles com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho 
(100 a 200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose, e baixa 
frequência de mutações. Para isso, há a necessidade dos laboratórios realizarem a 
frequência genética em pelo menos 100 indivíduos não relacionados. 
 
Análise do DNA Forense: Aspectos Gerais 
 
Para analisar uma amostra de material biológico visando caracterização de 
vínculo genético, seja familiar ou em casos criminais, qualquer contaminação de DNA 
estranho, ou mesmo a inadequação das metodologias aplicadas, pode resultar tanto na 
impossibilidade de estabelecer os perfis genéticos como na inutilização da amostra, posto 
que principalmente em casos forenses a amostra pode ser única. A primeira preocupação 
no estudo do perfil genético, visando à identificação humana, é avaliar o quanto as 
metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, assim como seus 
princípios moleculares e genéticos. 
Tendo em vista assegurar uma geração de dados corretos e tecnologias 
adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade é essencial para os 
laboratórios de análises clínicas que realizam identificação humana pelo DNA. Todas as 
metodologias de análise de DNA forense devem ser submetidas a um programa de 
validação visando assegurar a segurança, a reprodutibilidade e robustez da técnica 
(Klosterman, 2001). Resumidamente, a análise de DNA forense ocorre da seguinte 
maneira (Figura 40): 
 
 
 
 
 
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Figura 40: Esquema da sequência dos métodos a serem utilizados para o estudo do DNA forense, 
englobando os estudos da Biologia, da Tecnologia envolvida e da Genética aplicada. 
 
 
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense (ISFG), que 
atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), 
publica recomendações envolvendo polimorfismos de DNA, demonstrando o interesse em 
avaliar a reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. O FBI acrescenta 
alguns itens para o controle de qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências 
de DNA forense, que inclui, além desses cuidados, a realização de periódicos testes de 
proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de 
qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e identificar 
 
 
 
 
 
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tópicos que devem ser aperfeiçoados e a auditoria para averiguar a qualidade das 
atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 2000). 
Os exercícios propostos para laboratórios que realizam caracterização de vínculo 
genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos mãe, filho e 
suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, seus protocolos 
metodológicos, assim como os resultados obtidos entre os participantes (Bjerre et al, 
1997; Hallengerb e Morling; 2001). 
No Brasil, tais testes de proficiência em identificação humana pelo DNA são 
realizados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética 
Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic Genetics), não 
havendo um grupo específico que realize testes de proficiência no país. Esses testes 
consistem na análise de amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam um 
caso forense para a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 
2000). 
As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório 
podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o 
desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos 
para o exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (Neumayer, 1998; INTERPOL, 2001). 
Nos EUA o FBI implantou o CODIS - Combined DNA Index System, que tornou-se 
operacional em 1998, e combina a ciência forense com a tecnologia eletrônica, formando 
um banco de dados de perfis genéticos de DNA extraído de evidências biológicas 
coletadas na cena do crime e DNA de criminosos condenados por agressão sexual e 
outros tipos de violência física (Figura 41). Todos os estados americanos podem ter 
acesso a esse banco de DNA e, dessa maneira, há a possibilidade de comparar os perfis 
genéticos de um suspeito em um crime com os perfis contidos no CODIS, averiguando se 
o mesmo cometeu anteriormente outra infração (FBI, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 41: Inspeção visual de evidência forense. 
 
 
O CODIS selecionou 13 STRs para a análise do perfil genético: CSF1PO, FGA, 
TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, 
e D21S11 (Budowle & Moretti, 1999) (Figura 42 e Tabela 2). Esse conjunto de loci 
transformou-se uma referência para outros países do mundo, no que se refere à ciência 
forense (Sun et al, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 42: STRs recomendados pelo Banco de DNA, vinculadoao FBI (CODIS), segundo a sua 
distribuição nos cromossomos humanos. Fonte: http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/fbicore.htm. 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 2 – Informação dos 13 STRs recomendados pelo CODIS. 
 
Nome do 
Lócus 
Localização do 
cromossomo 
Unidade 
de 
repetição 
Acesso 
GenBank 
http://www.n
cbi.nih.gov/
Genbank/in
dex.html
Variação 
dos alelos 
Número de alelos 
observados 
CSF1PO 5q33.1 
c-fms pronto-
oncogene, 
6° intron 
TAGA X14720 6-16 15 
FGA 4q31.3 
α-fibrinogênio 
3° intron 
CTTT M64982 15-51,2 69 
TH01 11p15.5 
Tirosina hidroxilase 
1° intron 
TC|AT D00269 3-14 20 
TPOX 2p25.3 
Tiroide peroxidade 
10° intron
GAAT M68651 6-13 10 
VWA 12p13.31 
von Willebrand 
factor 
40° intron
[TCTG]
[TCTA] 
M25858 10-24 28 
D3S1358 3q21.31 [TCTG]
[TCTA]
NT_005997 9-20 20 
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10 
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22 
D8S1179 8q24.13 [TCTA]
[TCTG]
G08710 8-19 13 
D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14 
D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10 
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43 
D21S11 21q21.1 [TCTA]
[TCTG] 
complexo
AP000433 24-38 70 
Adaptado de Butler et al, 2005 
 
 
O DNA working group of the European Network of Forensic Science Institutes 
(ENFSI) e Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) (Gill et al, 
2004) levantam a possibilidade futura da substituição do banco de dados de DNA 
atualmente contendo os 13 STRs indicados pelo CODIS do FBI por um banco de dados 
 
 
 
 
 
56 
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de DNA contendo informações de SNPs. Entretanto, os autores citam que a curto e médio 
prazo não haverá a substituição dos bancos de dados, inclusive das tecnologias 
utilizadas, e sim a incorporação dos mesmos em estudos forenses visando à 
padronização do seu uso assim como de sua análise. 
Essa normatização possibilita maior facilidade em comparar tanto as frequências 
alélicas populacionais como os resultados dos perfis genéticos, mesmo que seja realizada 
em outros países. Visando futuramente implantar um banco de perfis genéticos de 
criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou os STRs sugeridos pelo 
CODIS como referência em perícias criminais em seu Manual de Padronização de 
Exames de DNA em Perícias Criminais (Secretaria Nacional de Segurança Pública - 
SENASP, 2006), que está sendo utilizado como referência para os laboratórios que 
trabalham com identificação humana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Estudo da Metodologia Aplicada à Identificação Humana 
 
A análise do DNA em caracterização do vínculo genético engloba desde o 
domínio da metodologia de coleta do material biológico até a interpretação dos resultados 
obtidos (Butler, 2004) (Figura 43). Cada qual possui sua particularidade e cuidados 
inerentes à técnica que podem oferecer vantagens e desvantagens, de acordo com o 
objetivo almejado. 
 
 
 Figura 43: Esquema de todos os procedimentos envolvidos em caracterização do vínculo 
genético. 
 
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59 
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Exame Pericial no Local do Crime 
 
Em 2000, a Agência Federal de Investigação dos Estados Unidos (EUA), mais 
conhecida como FBI (Federal Bureau of Investigation), elaborou um guia para a 
investigação da cena do crime (TWGCSI – Grupo de trabalho técnico da investigação da 
cena do crime, 2000). Esse manual visa à padronização das práticas adotadas para a 
investigação da cena do crime dos policiais e peritos americanos, tornando-se referência 
em investigação da cena do crime, seja para o exame de DNA forense ou não. Eles 
elaboraram esse manual dividindo em cinco sessões distintas: chegada à cena do crime, 
documentação preliminar, avaliação da cena, processando a cena, finalizando a 
investigação da cena do crime. 
 
1) Chegada à cena do crime: Um dos cuidados mais importantes da perícia 
criminal é a manutenção das evidências físicas e a preservação da cena do crime, que 
deve ser realizada imediatamente após sua constatação, e é realizado normalmente pela 
polícia local (Figura 44). 
 
a) Anotar o local, a data, o tipo de ocorrência, casas, veículos, eventos 
ocorridos e elementos envolvidos; 
b) Não permitir que pessoas, veículos ou objetos saiam da cena do crime, 
identificando possíveis vítimas e suspeitos; 
c) Aproximar-se da cena cuidadosamente e verificar a possibilidade de outros 
crimes ao redor; 
d) Realizar observações iniciais (olhar, ouvir e cheirar) o ambiente e anotá-los; 
e) Observar a possibilidade de perigo de explosão e contaminação por 
materiais perigosos ou tóxicos e, se necessário, chamar policiais especializados para 
analisar a cena do crime; 
 
 
 
 
 
 
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Figura 44: Esquema de isolamento da cena do crime. 
 
 
f) Não permitir que pessoas, veículos ou animais se aproximem da cena do 
crime, evitando contaminações e perigos como explosões; 
g) Após controlar as situações de perigo e isolar a área, a próxima atenção é 
chamar socorro médico para dar assistência médica necessária aos feridos, minimizando 
ao máximo a contaminação da cena do crime; 
h) Anotar todas as etapas dos cuidados médicos, desde sua hora de chegada 
até os cuidados prestados; 
i) Assegurar que evidências como roupas, objetos e manchas encontradas no 
corpo sejam preservadas pela equipe médica; 
j) Documentar todos os comentários e testemunhos de pessoas envolvidas ou 
presentes no local do crime ou ao seu redor; 
 
 
 
 
 
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k) Um oficial da polícia deve sempre que possível acompanhar a vítima para o 
hospital para garantir a preservação das evidências ou mesmo documentar comentários 
feitos pelo paciente; 
l) Lacrar a cena do crime com faixas e adesivos; 
m) Controlar o fluxo de pessoas, inclusive peritos e outros policiais; 
n) Se possível, efetuar mensurações e tirar fotografias com escalas, para 
preservar as evidências – como pegadas, marcas de pneu no chão, etc –, presentes na 
cena do crime, caso chova, neve ou derreta (se for gelo); 
o) Não permitir que qualquer pessoa fume, masque chiclete, use o telefone ou 
banheiro, coma ou beba qualquer coisa, mexa nos vidros e janelas, mude os móveis de 
lugar, etc. Ou seja, não permitir que mexam em qualquer objeto presente na cena do 
crime ou ao seu redor; 
p) Toda a documentação e anotações feitas pelo policial devem ser entregues 
ao investigador de polícia para posterior estudo e análise. 
 
2) Documentação preliminar e avaliação da cena: 
 
a) O investigador de polícia deverá documentar todas as informações 
recolhidas pelo policial, organizá-las e identificá-las com os dados da região do crime 
(delegacia, responsável, cidade, estado, etc); 
b) Continuar a manutenção da cena do crime descrita anteriormente, 
documentando todas as pessoas que estiverem participando da investigação; 
c) Definir estratégias para a análise fotográfica e recuperação dos vestígios 
encontrados na cena do crime. 
 
3) Processando a cena: 
 
a) O investigador deverá avaliar e posteriormente solicitar a presença de 
peritos criminais, de acordo com a especialidade envolvida; 
b) O controle da contaminação deve ser extremamente rígido, evitando-se o 
contágio dos profissionais, das vítimas, da cena do crime, dos objetos, etc.; 
 
 
 
 
 
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c) Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI), como luvas (obrigatório), 
gorros e protetores de sapato (se necessário); 
d) Todo material utilizado para coleta das evidências deve estar devidamente 
limpo ou até esterilizado, caso seja para coleta de material biológico, e deve ser 
corretamente acondicionado (Figura 45); 
 
 
 
 
 Figura 45: Envelopes e sacos de papel para coleta de evidências e objetos encontrados na cena do 
crime como roupas, celulares, documentos, etc. 
 
 
 
e) Toda evidência deve ser corretamente documentada, citando-se a 
localização, identificação e condições que se encontravam, fotografada com escalas de 
referência e/ou filmadas antes de ser removida da cena do crime; 
 
f) Analisar e verificar a metodologia utilizada para a coleta da evidência. Por 
exemplo, cada método requer equipamentos e materiais diferenciados para a sua 
realização. Sendo assim, para fazer a análise de impressões digitais não se utiliza o 
mesmo equipamento para exame de marcas de mordidas, e assim por diante; 
 
 
 
 
 
 
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g) Documentar qualquer intercorrência ou dificuldade havida durante a coleta 
do material; 
h) Preservar adequadamente o material coletado com a finalidade de minimizar 
sua degradação: refrigerado, congelado, local seco, local úmido, etc.; 
i) Encaminhar para os respectivos laboratórios periciais. 
 
4) Finalizando a investigação da cena do crime: 
 
a) Determinar quais evidências foram coletadas; 
b) Discutir com toda a equipe envolvida na cena do crime as intercorrências e 
evidências. 
 
 
 
 
 
 
 
 
------------------FIM DO MÓDULO II----------------- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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65 
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MÓDULO III 
 
 
Estudo da Metodologia Aplicada à Identificação Humana (Cont.) 
 
Coleta do Material Biológico 
 
As amostras de material biológico devem ser minuciosamente colhidas, seja 
quando dispostas na cena do crime ou quando forem de indivíduos devidamente 
identificados. É importante que todas as pessoas que manipulam as amostras tenham 
conhecimentos específicos baseados na literatura especializada, e ainda possuam 
treinamento em boas práticas de manipulação em laboratórios forenses, com rígida 
formação em controle de qualidade (INTERPOL, 2001). Amostras que não estiverem 
adequadamente identificadas e documentadas podem ser questionadas; aquelas que não 
forem corretamente coletadas são passíveis de não serem analisadas; outras, se não 
forem devidamente acondicionadas podem sofrer contaminação e se não forem 
criteriosamente preservadas pode ocorrer decomposição e deterioração (FBI, 2003). 
O FBI (1999, 2001) e a INTERPOL (2001) elaboraram normas para os 
laboratórios forenses que participam da formação dos bancos de DNA internacional, 
englobando principalmente a metodologia de coleta de evidências biológicas para análise 
do DNA, assim como aspectos importantes para o treinamento de pessoal que serão 
descritas adiante. O material biológico presente na cena do crime pode aparentar invisível 
a olho nu, dessa maneira, utiliza-se reagente como o luminol que não interfere na análise 
do DNA para detecção de amostras com vestígios de sangue, sendo que reage com o 
ferro presente na hemoglobina, exibindo uma quimioluminescência (GROSS et al, 1999). 
Outros kits de reagentes são empregados: aqueles que contém antígeno próstata-
específico para sêmen (HOCHMEISTER et al, 1999) e para saliva, o teste de detecção de 
amilase por Phadebas® (WILLOTT & GRIFFITHIS, 1980) etc. Diversos cuidados devem 
ser tomados para a documentação das amostras coletadas na cena do crime: fotografar o 
local de remoção das evidências, realizar anotações da sua disposição e de 
características pertinentes (SÃO PAULO, 1999; INTERPOL, 2001 ; FBI, 2003; 
 
 
 
 
 
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BONACORSO, 2005). Amostras de sangue podem ser coletadas dos indivíduos, 
encontradas em corpos, objetos e superfícies (Figura 46). Qualquer que seja o material 
biológico a ser coletado, o manipulador deverá utilizar luvas ou pinças estéreis (Figura 46 
e 47). A coleta de sangue em indivíduos hígidos deverá ser realizada em dois tubos de 
5mL contendo EDTA como anticoagulante, devidamente identificado e a seguir 
refrigerado. 
Recomenda-se que os objetos, superfícies ou corpos que possuem as amostras 
de sangue sejam recolhidos se possível, além de realizar esfregaços nas formas líquidas 
ou, se secas, umidificar a região com água estéril, seguida de esfregaço. Em ambos os 
casos aconselha-se esperar secar os esfregaços (Figuras 48 e 49) para depois serem 
embalados em envelope de papel limpo (Figura 47), evitando que a umidade facilite o 
crescimento de bactérias e fungos. Amostras desêmen, de saliva e urina, ou de objetos 
que os contém, podem ser utilizadas e seguem a mesma metodologia descrita 
anteriormente. Tecidos, dentes, ossos e fios de cabelos também podem servir de fonte de 
células para análise de DNA (FBI, 2003). A estocagem do material deve ser em 
refrigerador a 4°C ou em freezer a -20°C, no entanto, para longos períodos, estocar a -70 
a -80°C (BUTLER, 2005). 
 
 
 
 
 
67 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 46: Amostras de sangue sendo coletadas de um objeto perfuro-cortante – faca – 
frequentemente utilizado em agressões físicas e homicídios. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 47: manipulação de material contendo amostras biológicas com luvas. 
 
 
 
 
 Figura 48: esfregaço bucal utilizado para a coleta de saliva e células descamadas da mucosa oral, 
para a extração de DNA. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 49: Coletor estéril apropriado para coleta de materiais biológicos presentes na cena do 
crime. 
 
 
O armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no 
máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. 
Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua 
coleta e disposição individualmente descrito (Secretaria de Segurança Pública de São 
Paulo – SSP-SP, 1999; INTERPOL, 2001). A degradação do DNA de amostras biológicas, 
utilizadas em investigação criminal, pode ocorrer decorrente de um processo natural de 
exposição ao meio-ambiente. Luz, umidade, temperaturas elevadas, bem como 
contaminações bacterianas ou fúngicas levam à degradação química do DNA humano 
(SCHNEIDER et al, 2004). 
A comissão de DNA da Internacional Society For Forensic Haemogenetics – ISFH 
sugeriu algumas recomendações para a análise de DNA pela PCR, incluindo que essa 
contaminação pode ser evitada, atendendo a certos cuidados durante todo o processo de 
análise de DNA, que vão desde a coleta e armazenamento do material biológico do qual 
 
 
 
 
 
70 
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será extraído o DNA, até o próprio local de preparação da PCR. As contaminações das 
amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta 
interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de 
normas de procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se 
imprescindíveis (INTERPOL, 2001). 
Visando o estabelecimento de normas para coleta e exame de materiais 
biológicos para identificação humana, a Secretaria de Segurança Pública do Estado de 
São Paulo (SSP-SP) baixou a Resolução SSP-194, em 2 de junho de 1999 (São Paulo, 
1999): 
 
“Considerando: 
a) a necessidade de normatizar os serviços periciais relativos à 
coleta de materiais biológicos para exames de identificação humana, 
tanto nos locais de crime quanto na pessoa humana, viva ou morta; 
b) que os procedimentos a serem seguidos pelos órgãos policiais e 
periciais oficiais devem estar em consonância com os ditames da 
legislação em vigor, e 
c) que é imprescindível a correta preservação das amostras para 
não haver contaminações ou outros prejuízos (p. 104)”. 
 
Continuando na mesma Resolução, em seu anexo cita os cuidados que devemos 
ter para a coleta, armazenamento e análise do material biológico para a extração de DNA. 
Os cuidados incluem utilização de luvas descartáveis; instrumentos de coleta, 
armazenamento e análise devem ser estéreis; a documentação completa do vestígio 
eleito para a coleta, incluindo-se fotografias da região, tipo de armazenamento, entre 
outros; o armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no 
máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. 
Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua 
coleta e acondicionamento individualmente descrito. 
 
 
 
 
 
 
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EXTRAÇÃO DE DNA 
 
 
 
 
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores, 
podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para a sua extração. Após a 
coleta do material biológico, o DNA da amostra deverá ser separado de outras 
substâncias celulares antes de ser examinado. Proteínas celulares, contaminações 
químicas e microbiológicas diminuem o poder discriminatório das análises utilizando o 
DNA (BUTLER, 2005; HOFF-OLSEN et al, 1999; JUNG et al, 1991). 
A escolha do uso de diferentes métodos de extração de DNA está relacionada ao 
tipo de material envolvido e influencia diretamente o sucesso da análise dos STRs. A 
maioria dos procedimentos de extração de DNA compreende a lise celular, seguida da 
remoção das proteínas celulares precipitadas e por fim a precipitação do DNA com sua 
final eluição. Existem diversos métodos para obtenção de DNA: a extração orgânica, que 
é a mais tradicional, empregando-se a proteinase K para lise celular e fenol clorofórmio 
 
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73 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SALIVA PELO MÉTODO 
ORGÂNICO (Anzai et al.; 2001). 
 
A amostra de saliva coletada e colocada em tubo estéril é submetida à 
centrifugação para a separação das células de sua parte aquosa, removendo-
a. As pontas contendo o algodão dos swabs – que contém a saliva coletada 
sobre a pele – foram colocadas em um tubo estéril, sendo imediatamente 
iniciado o processo de extração, sem nenhum preparo prévio. Em seguida, 
adiciona-se 700μL do tampão de lise para saliva (10mM TRIS pH8,0; 10mM 
EDTA; 0,1 M NaCl; 2% SDS) e posteriormente 35μl de Proteinase K 20mg/mL. 
Após agitação, a tampa do tubo deve ser vedada com Parafilm® e incubada 
por uma noite a 56oC. 
A seguir, a Proteinase K é inativada a 95oC por 10 minutos, 
adicionando-se 700μL de fenol tamponado com pH 8,0 e homogeneizando-se 
com movimentos manuais leves por 5 minutos. Centrifuga-se e o 
sobrenadante é transferido para outro tubo, utilizando uma micropipeta com 
ponteira estéril. Acrescenta-se fenol/ clorofôrmio/ álcool isoamílico (25:24:1) 
na mesma quantidadedo sobrenadante removido, homogeneiza-se, 
centrifuga-se e remove-se o sobrenadante novamente para outro tubo. 
Adiciona-se ao sobrenadante cerca de 2 ou 3 vezes o volume recuperado, 
álcool 100% e 10% do volume em acetato de sódio 5M. Incuba-se durante 
uma noite a -20oC. 
No terceiro dia de extração, centrifuga-se a mistura. Dispensa-se o 
etanol, e ao precipitado adiciona-se 1mL de etanol 70%, homogeneizando-se 
cuidadosamente. Centrifuga-se e novamente é removido o álcool. Seca-se 
totalmente o "pellet". Ressuspende-se o "pellet" com 100μL de T.E. (Tris-base 
100mM, pH 7,6; EDTA 10mM, pH 8,0). 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
A técnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira fase, a lise 
celular, seguida de desnaturação ou inativação de proteínas. Com solventes orgânicos o 
DNA é posteriormente separado de macromoléculas, como as proteínas através de 
solubilização em água, e em seguida precipitado com etanol. Outras metodologias com o 
mesmo princípio, inclusive kits comerciais, podem ser utilizadas para cada tipo de 
amostra biológica. Há diferentes metodologias para a extração de DNA de sangue total 
(Salazar et al., 1998; Schneider, 1998), de esfregaços vaginais e de amostras de sêmen 
(Schneider, 1998), de saliva total e de materiais contendo saliva (Walsh D et al., 1992; 
Sweet et al., 1996; Hochmeister et al., 1998; Anzai et al., 2001, Anzai-Kanto, 2005); de 
dente humano (Oliveira, 2000), de osso (Hagelberg et al., 1991; Alves, 2000) (Figura 53); 
de material parafinado (Mesquita et al., 2001), tecidos removidos de cadáveres 
(Hochmeister, 1998) (Figura 51), entre outros. 
 
 
 Figura 53: Cadáver em avançado estado de putrefação, submergido em mar por 
aproximadamente 1 mês. O material biológico coletado para a extração de DNA foi a cabeça do fêmur e 
tecido da parte interna do tórax, utilizando a porção interna da amostra para evitar a contaminação do DNA 
externo. 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 
 
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores como 
condições da amostra e da conservação, sendo necessário utilizar critérios para escolha 
da metodologia de extração para cada tipo de amostra (HAGELBERG et al., 1991; 
HOCHMEISTER, 1998; SALAZAR et al., 1998; SCHNEIDER, 1998; ALVES, 2000; ANZAI 
et al., 2001; MESQUITA et al, 2001; OLIVEIRA et al, 2002). 
O DNA pode ser obtido inclusive de células únicas, como as bucais. O isolamento 
de DNA micromanipulado de cada uma das 226 células utilizadas, a alteração da 
concentração de iniciadores, a utilização de AmpliTaqGold® e reação de PCR com 34 
ciclos, possibilitou que Findlay et al. (1997) obtivessem sucesso ao amplificar o DNA de 
cada uma dessas células. AmpliTaqGold tem uma estabilidade à temperatura maior do 
que outras taqs, como a taq polimerase comum. Ao amplificarem individualmente o DNA 
de cada célula, obtiveram amplificação em 91% (206), sendo que em 50% (114) o perfil 
genético (7 loci) foi completo, em 64% (144) amplificou-se 4 a 6 loci. Os autores insistem 
no rigoroso controle da contaminação, posto que mesmo tomando esse cuidado em sua 
Extração de DNA Do Sangue (Salazar et al, 1998) 
 
 As amostras de sangue foram submetidas à lise celular com 1000µL 
do tampão Tris-1 (Tris HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl2 10mM EDTA 2mM 
pH 8,0) contendo Triton X-100 a 2.5%. Após a centrifugação, os núcleos 
celulares foram lisados com 220µL do tampão Tris-2 (Tris-HCl 10mM pH8,0, 
KCl 10 mM, Mg Cl2 10mM, EDTA 2mM pH 8,0, NaCl 0,4 M) contendo SDS a 
1%. As proteínas foram removidas por precipitação salina com 100% seguindo 
de lavagem etanol 70%, por 3 vezes. Posteriormente o DNA foi ressuspendido 
em 100µL do tampão TE (Tris-HCl 10 mM e 1mM EDTA, pH 8,0) e mantidos a 
–20oC.
 
 
 
 
 
78 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
pesquisa obtiveram 28% com alelos adicionais aos verdadeiros alelos, e 11% somente 
com alelos adicionais. 
 
Quantificação de DNA 
 
A quantificação do DNA após a sua extração é importante para o aperfeiçoamento 
da qualidade do produto de DNA resultante da PCR (Internacional Society for Forensic 
Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poderá saturar a 
reação, fazendo com que apareça artefatos de técnica e amplificações inespecíficas que 
podem dificultar a sua análise. Já a sua falta poderá acarretar a perda de um dos alelos, 
quando o indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos mesmos (Butler, 
2005). 
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas após a extração, além 
de verificar a possibilidade de degradação (JUNG et al, 1991; HOFF-OLSEN et al, 1999). 
O DNA pode ser quantificado por espectrofotometria em espectrofotômetro (Figura 54 e 
55) a 260 nm, sua pureza pela relação 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada 
em géis de agarose. No entanto, esses métodos avaliam a quantidade geral de DNA, seja 
ele humano ou de outro tipo. Quando se refere às amostras utilizadas em investigação 
criminal ou passíveis de degradação e contaminação, recomenda-se a utilização da 
quantificação de DNA de humano (INTERNACIONAL SOCIETY FOR FORENSIC 
HAEMOGENETICS - ISFH, 1992). 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 54: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de ácidos nucléicos. 
 
 
 Figura 55: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de DNA que utiliza apenas 1μL de 
produto de extração de DNA. 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Essa quantificação pode ser realizada por hibridização de uma sonda utilizando-
se um determinado lócus (D17Z1) em uma amostra de DNA imobilizada de uma 
membrana de náilon – dot blot (WALSH et al., 1992; ANDERSEN, 1998), e por kits 
comerciais como, por exemplo, o AluQuant™ human DNA quantitation system (WAYE et 
al, 1989; HOFF-OLSEN et al, 1999; MANDREKAR et al., 2001; SCHNEIDER et al, 2004; 
BUTLER, 2005). Apesar dessas técnicas serem mais complexas e caras que a 
espectrofotometria, elas quantificam somente o DNA humano, pois possuem sondas 
específicas para o mesmo. Tal característica pode ser imprescindível em casos forenses 
que haja a possibilidade de contaminação de DNA externo. No entanto, muitas vezes não 
é utilizada, pois há a necessidade de 5 a 10μL de produto de DNA, o que muitas vezes 
não é obtido. 
Uma metodologia que está substituindo as outras técnicas de quantificação por 
utilizar pouca quantidade de DNA, serespecífico para DNA e inclusive possibilitando 
verificar a presença de inibidores da enzima polimerase é a quantificação de DNA por 
PCR em tempo real. Principalmente em casos forenses que existe ínfima quantidade de 
DNA, está sendo altamente recomendada. Consiste no emprego de marcadores 
específicos marcados com fluorescência que são utilizados para a amplificação de 
regiões do genoma humano. No entanto, para fins didáticos, será explicado após a 
explicação da reação em cadeia pela polimerase (PCR), pois envolve a amplificação do 
DNA. A amostra biológica sendo preservada adequadamente e realizada em ótimas 
condições de extração e quantificação obtém-se quantidades maiores ou menores de 
DNA (Tabela 3). 
 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Tabela 3: Quantidade de DNA extraído de diversos tipos de material biológico (Butler, 
2005). 
 
Tipo de amostra Quantidade de DNA 
Sangue total 20000 ~ 40000 ng/mL 
Mancha de sangue 250 ~500 ng/cm3 
Líquido seminal 150000 ~ 300000 ng/mL 
Esfregaço de material vaginal pós-coito 10 ~3000 ng/esfregaço 
Fio de cabelo com bulbo 1 ~750 ng/fio 
Pêlo com bulbo 1 ~10 ng/pêlo 
Saliva total 1000 ~10000 ng/mL 
Esfregaço bucal 100 ~1500 ng/esfregaço 
Urina 1 ~20 ng/mL 
Osso 3 ~10 ng/mg 
Tecido 50 ~500 ng/mg 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Reação de Amplificação pela Polimerase - PCR 
 
Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi a PCR, tendo 
como seu inventor Kary Mullis (Figura 56), recebendo o Prêmio Nobel por essa 
descoberta (INTERPOL, 2001). A PCR consiste na amplificação seletiva de uma 
sequência-alvo de DNA específica a partir de uma coleção heterogênea de DNA, 
empregando-se um par de oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma 
certa extensão em ambas as fitas do DNA a ser amplificado (Saiki et al, 1985). Várias 
sequências de iniciadores de diversas regiões do DNA humano já foram estabelecidas 
possibilitando a amplificação de seus respectivos STRs nas reações de PCR 
(Polymeropoulos et al., 1991; Polymeropoulos et al., 1992; Nishimura & Murray, 1992; Li 
et al., 1993; Moller et al., 1994; Urquhart et al., 1994; Urquhart et al., 1995; Jin et al., 
1997). A sequência-alvo de DNA, cuja continuação é originalmente conhecida, é 
denominada DNA molde. 
 
 
 Figura 56: Kary Mullis inventou a PCR, permitindo que sejam amplificados in vitro fragmentos 
de moléculas de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
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A PCR envolve três etapas: desnaturação, hibridização e extensão. A 
desnaturação ocorre quando a molécula de DNA é aquecida acima da temperatura de 
90°C, na qual as pontes de hidrogênio da dupla hélice se rompem, ocorrendo a separação 
das cadeias complementares. Os iniciadores se ligam especificamente às sequências de 
DNA complementares no processo de hibridização, mediante uma temperatura que pode 
variar de 45 a 72°C e deve ser previamente otimizada, estando relacionada à temperatura 
de melting (Tm), que é medida através de uma fórmula específica que envolve a 
quantidade de C e G em sua sequência. 
A prevalência de ligação dos iniciadores ocorre pela sua alta concentração no 
meio da reação. A enzima termoestável denominada DNA polimerase direciona o 
posicionamento dos precursores do DNA – dNTP – iniciando a síntese de novas fitas de 
DNA. Com um novo aumento de temperatura, a enzima DNA polimerase catalisa a 
reação, incorporando o nucleotídeo na posição terminal do iniciador, complementando as 
bases do DNA molde, promovendo a extensão da fita (Saiki, 1985, Sambrook et al, 2001) 
(Figura 57, 58 e 59). 
 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 Figura 57: Esquema da reação de PCR, com visualização dos fragmentos. 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 Figura 58: Representação esquemática da PCR com detalhamentos dos reagentes que a 
envolvem. 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 59: Esquema representativo de exemplo de ciclagem para uma PCR convencional. 
 
 
A PCR é realizada em equipamentos denominados termocicladores que 
controlam e variam a temperatura automaticamente para cada programa pré-estabelecido 
pelo pesquisador (Figura 60). 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 60: Exemplo de termociclador utilizado para a PCR. 
 
 
A reação de PCR é preparada utilizando-se diversos reagentes que devem 
possuir concentrações específicas para cada tipo de análise. Atualmente, existem 
diversos kits de PCR contendo todos os reagentes pré-padronizados que facilitam a 
utilização da PCR em laboratórios forenses. No entanto, é de grande importância que o 
pesquisador entenda todo o processo de amplificação e seus reagentes. O reagente que 
vai direcionar a otimização de cada reação será o primer ou iniciador, que flanqueará a 
região do DNA a ser copiada, sendo um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente e é 
adicionado à reação em altas concentrações (Butler, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 4: reagentes utilizados em uma PCR com a respectiva concentração ótima. 
Reagente Concentração ótima 
Tris-HCl, pH 8,3 (25°C) 10 a 50 mM 
Cloreto de Magnésio 1,2 a 2,5 mM 
Cloreto de Potássio 50 mM 
Desoxirribonucleotídeos trifosfatados 
(dNTPs) 
200 μM de cada 
nucleotídeo(dATP, dTTP, dCTP, 
dGTP) 
DNA polimerase termoestável 0,5 a 5 U 
Soro de Albumina Bovina (BSA)* 100 μg/mL 
Primers ou Iniciadores 0,1 a 1,0 μM 
DNA 1 a 10 ng de DNA 
* Não é utilizado em todas as reações 
 
 
As ciclagens da PCR variam de acordo com os reagentes empregados, 
principalmente com a enzima polimerase, que altera a temperatura de extensão, os 
primers, que muda a temperatura de hibridização; e com a amostra de DNA, pois 
apresenta-se em pouca quantidade, podendo aumentar o número de ciclos. Só para ter 
uma idéia da variação das condições de ciclagem para kits diferentes utilizados em DNA 
forense foram colocados na tabela 5 exemplos de parâmetros de duas empresas 
distintas. 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 5: Parâmetros utilizados para a ciclagem da PCR em kits de PCR multiplex 
comercialmente disponíveis no mercado, e que são os mais utilizados mundialmente. 
Passo do protocolo AmpFlSTR® kits 
(Applied 
Biosystems) 
GenePrint® STR Kits 
(Promega 
Corporation) 
Desnaturação inicial 95°C / 11 
minutos 
95°C / 11 minutos 
Quantidade de ciclos 28 ciclos 30 ciclos 
Desnaturação 94°C / 1 minuto94°C / 30 segundos 
(ciclo 1 a 10) 
90°C / 30 segundos 
(ciclo 11 a 30) 
Hibridização 59°C / 1 minuto 60°C / 1 minuto 
Extensão 72°C / 1 minuto 70°C / 1 minuto 
Extensão final 60°C / 60 
minutos 
60°C / 30 minutos 
Final 10°C até sua 
remoção do 
equipamento 
4°C até sua remoção 
do equipamento 
 
 
As vantagens da utilização da PCR na ciência forense são a sua sensibilidade, 
pois é capaz de amplificar sequências a partir de quantidades ínfimas da sequência-alvo 
de DNA e até mesmo do DNA de uma única célula; e sua robustez, permitindo a 
amplificação de sequências específicas a partir de material biológico degradado (ISFH, 
1992, INTERPOL, 2001; Sambrook, 2001). No entanto, tal eficiência e sensibilidade 
implicam também na atenção aos cuidados para evitar-se a contaminação de DNA 
externo, que pode ocorrer durante todo o processo de análise do DNA (Internacional 
Society For Forensic Haemogenetics – ISFH, 1992). 
Kwok & Higuchi (1989) elucidaram vários cuidados pertinentes à preparação do 
material para a PCR, objetivando evitar a contaminação das amostras: 
 
 
 
 
 
 
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A preservação do DNA forense para a amplificação pela PCR também envolve o 
controle da temperatura, da umidade, o valor do pH, a presença de ácido húmico e fúlvico 
e microorganismos. A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado de 
milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem 
preservado em ambientes secos e com o mínimo crescimento de microorganismos 
(Figura 61). A presença de ácido fúlvico e húmico pode comprometer a amplificação pela 
PCR pelo fato de inibir os efeitos da enzima polimerase utilizada na reação. O pH neutro 
ou levemente alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os 
 
9 o isolamento físico da área de preparação da PCR e de seus produtos 
utilizados; 
9 não levar para a sala de PCR qualquer tipo de material biológico ou produto 
de DNA. 
9 autoclavar a água deionizada e outras soluções, com exceção dos iniciadores, 
dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), tampão comercial e Taq DNA 
polimerase; 
9 aliquotar reagentes; 
9 utilização de luvas descartáveis que devem ser constantemente trocadas; 
9 ter cuidado ao abrir os tubos pois parte do produto da PCR pode estar na sua 
tampa, possibilitando o seu desperdício; 
9 misturar os reagentes da PCR em um único tubo, aliquotá-los em tubos 
individuais e por último adicionar o DNA individualmente em cada tubo; 
9 e finalmente a escolha correta de controles negativos e positivos, que podem 
auxiliar na detecção de contaminantes. 
Kwok & Higuchi (1989) 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
microorganismos podem metabolizar o DNA por completo, se em grande quantidade 
(Burger et al., 1999). 
 
 
 
 Figura 61: Esqueletos encontrados em uma vala e que foram utilizados na Herzegovina para a 
identificação humana de indivíduos mortos durante a 2° Guerra Mundial. 
 
 
Regiões específicas de amplificação são escolhidas de acordo com o objetivo da 
análise. Atualmente, as regiões mais utilizadas são as STRs para a identificação humana. 
Edwards et al (1991) relata que as melhores STRs empregadas na identificação humana 
são aquelas com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho (100 a 
200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose e baixa frequência 
de mutações. Esses dados são levantados por estudos populacionais de regiões distintas, 
que serão descritos posteriormente. 
A PCR permite que mais de uma região possa ser copiada simultaneamente se 
adicionado mais de um iniciador sense e antissense em uma única reação. A amplificação 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
simultânea de duas ou mais regiões de DNA é conhecida por PCR multiplex (Figura 62). 
Para essa reação a temperatura de hibridização dos iniciadores deve ser compatível e a 
complementaridade excessiva das regiões deve ser criteriosamente analisada, para 
prevenir a formação de dímeros de iniciadores que não hibridização com o DNA 
(EDWARDS & GIBBS, 1994). 
 
 
 
Figura 62: Kit Multiplex de duas empresas distintas comercialmente disponíveis para a realização de 
PCR em uma única reação. 
 
 
Há diversas vantagens da PCR multiplex para DNA forense: 1) diminui o tempo 
de preparo e a quantidade de reagentes utilizados; 2) diversos loci podem ser 
amplificados em uma única reação, empregando-se pouca quantidade de DNA, 
 
 
 
 
 
93 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
aumentando a chance de sua amplificação. Atualmente há diversos conjuntos multiplex 
disponíveis no comércio, facilitando a padronização e comparação dos resultados entre 
os laboratórios forenses (LEVEDAKOU et al., 2002; WALLIN et al., 2002; KRENKE et al, 
2002; COLLINS et al, 2004) (Quadro 1). 
 
Quadro 1 - Os loci mais utilizados no FBI e INTERPOL distribuídos segundo os kits 
comerciais multiplex: 
Fornecedor 
Applied Biosystems 
http://home.appliedbiosystems.com 
Promega 
http://www.promega.com
 PRODUTO 
 
AmpFLSTR® Power-
Plex® 
Power-Plex® 
16 SGM Plus Profiler Profiler 
Plus 
Cofiler Identifier
D21S11 (1)(2) X X X X 
FGA (1)(2) X X X X X 
VWA (1)(2) X X X X X X 
THO1 (1)(2) X X X X X X 
D3S1358 (1)(2) X X X X X X 
D8S1179 (1)(2) X X X X 
D18S51 (1)(2) X X X X 
D16S539 (2) X X X X X 
TPOX (2) X X X X X 
CSF1P0 (2) X X X X X 
D13S317 (2) X X X X X 
D7S820 (2) X X X X X X 
D5S818 (2) X X X X X 
D19S433 (3) X X 
D2S1338 (3) X X 
Penta D (3) X 
Penta E (3) X 
Amelogenina (1) X X X X X X X 
(1) ISSOL – Conjunto Padrão de Loci da INTERPOL, idêntico Conjunto Padrão Europeu - ESS, com uma exceção: 
para o ISSOL a amelogenina é opcional 
(2) Os 13 lócus do Sintema de índice de Combinação de DNA - CODIS do FBI 
(3) Lócus que fazem parte do grupo dos mais utilizados mundialmente segundo a INTERPOL 
 Fonte: <http://www.interpol.int/public/Forensic/DNA/loci.asp>. Acesso em: 22 Maio 2006. 
 
 
 
 
 
 
 
94 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Outra técnica que deve ser comentada seria a utilização da PCR em tempo real, 
que, no momento, está sendo aproveitada em ciência forense para determinar a 
quantidade de DNA humano viável para a amplificação. A PCR em tempo real amplia 
regiões específicas de DNA. Diferencia-se da PCR tradicional, pois possui sondas 
marcadas com fluoróforos proporcionando detecção em tempo real dos fragmentos 
amplificados, sendo simultaneamente quantificados (Figura 63). Dessa maneira, não há 
necessidade da utilização de géis e análise por Southern Blot como nas outras técnicas 
quantitativas descritas anteriormente (ANDREASON, 2003). 
Entretanto, para a realização da PCR em tempo real é necessário equipamento 
específico e sondas adequadas. O DNA humano pode ser especificamente quantificado 
para posterior análise do perfil genético pelas STRs, assim como verificar a presença ou 
não de inibidores da enzima polimerase(APPLIED BIOSYSTEMS, 2006). 
 
 
 
 Figura 63: Esquema representativo da PCR em tempo real, na qual sondas com fluorescências 
são utilizadas para a amplificação de uma região específica de DNA. Após a hibridização da sonda com a 
molécula de DNA, a enzima taq polimerase atua amplificando a região alvo, liberando um fluoróforo que 
será analisado em tempo real pelo equipamento termociclador, sendo conectado a um computador que 
através de programas específicos realiza a interpretação dos dados. 
 
 
 
 
 
-------------FIM DO MÓDULO III------------- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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MÓDULO IV 
 
Estudo da metodologia aplicada à identificação humana (cont.) 
 
Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA 
 
Os fragmentos de DNA amplificados por PCR são identificados após a 
eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da coloracão com prata, ou pela detecção 
de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no PCR são marcados com 
fluorocromos, possibilitando a análise por sequenciador automático (Gill, 1992; Sullivan et 
al, 1992; Frégeau e Fourney, 1993). 
A eletroforese é uma metodologia amplamente empregada para a separação, 
isolamento, análise e manipulação dos ácidos nucléicos. Os ácidos nucléicos possuem 
uma carga geral total negativa, devido aos seus grupamentos fosfato do arcabouço, 
consequentemente, quando aplicados em um gel de agarose ou poliacrilamida, eles 
migrarão em direção ao ânodo em um campo elétrico (Aaji e Borst, 1972; Southern, 
1979). Em condições apropriadas de tampão, voltagem e miliamperagem, os fragmentos 
pequenos migrarão mais facilmente do que os maiores (Figura 64 e 65). 
 
 
 
 
 
97 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 64: Fragmentos de DNA carregados negativamente migram ao pólo positivo mediante a 
presença de um campo elétrico específico. 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 65: Esquema da corrida de eletroforese com visualização dos fragmentos de DNA e das 
partículas de gel e dos poros, seguida de imagem dos fragmentos de DNA corados com brometo de etídeo 
exposto a luz ultravioleta. 
 
 
 A variação do tipo e concentração do gel propicia diferentes características de 
separação, permitindo distintas resoluções e análises. Em caracterização de vínculo 
genético utiliza-se eletroforese em gel de poliacrilamida ou eletroforese capilar para a 
análise das imagens. Em inclusão ou exclusão de paternidade, compara-se os alelos 
presentes no filho com o do suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatório materno e 
o outro paterno (Figura 66). O mesmo acontece em inclusão de suspeitos de um crime, no 
qual compara-se o DNA encontrado na vítima, como ocorre com marcas de mordida ou 
presença de sêmen, ou na cena de um crime. Pode ocorrer uma mistura de amostras 
biológicas contendo DNA da vítima e do agressor. Dessa maneira, confronta-se o DNA da 
vítima com o dos suspeitos e, sucessivamente, com o DNA das amostras presentes na 
cena do crime (Figura 67). Tais análises são realizadas em pelo menos 13 STRs distintos 
 
 
 
 
 
99 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
(Jobim et al, 2006; Budowle & Moretti, 1999; INTERPOL, 2001; Secretaria Nacional de 
Segurança Pública - SENASP, 2006). 
 
 Figura 66: Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 
corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da mãe, do filho e do suposto pai, de um STR 
amplificado pela PCR analisados juntamente com marcadores alélicos. 
 
 Figura 67: Esquema representativo da análise de uma eletroforese em gel de poliacrilamida 
corado com prata contendo DNA de amostras biológicas da vítima, do material biológico coletado de uma 
marca de mordida, e de três suspeitos distintos de um STR amplificado pela PCR, analisados juntamente 
com marcadores alélicos. 
 
 
 
 
 
 
100 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Diversos tipos de equipamentos podem ser utilizados para a sua realização, 
podendo ser horizontais e verticais, grande e pequenos, sendo sua indicação própria para 
cada tipo de procedimento que queira realizar. Generaliza-se da seguinte maneira: 
 
- Cubas horizontais: gel de agarose 
- Cubas verticais: gel de poliacrilamida 
 
Géis de agarose e poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade de formas, 
tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um número diferente de configurações. 
As escolhas desses parâmetros dependem primeiramente no tamanho dos fragmentos a 
ser separados. Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos 
fragmentos de DNA (5-500pb), que é o caso da análise do DNA forense. O poder de 
resolução é extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco 
tão pouco quanto 1pb (par de base) em comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser 
separados uns dos outros. Apesar de serem corridos rapidamente e acomodarem 
comparativamente grandes quantidades de DNA, géis de poliacrilamida possuem a 
desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear do que eletroforese capilar. 
Géis de poliacrilamida são corridos em uma configuração vertical de uma corrente elétrica 
constante (Sambrook et al, 2001). 
 
Gel de Agarose 
 
Géis de agarose possuem menor poder de resolução do que géis de 
poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separação. DNAs de 50pb até alguns 
megabases em extensão podem ser separados em géis de agarose de diferentes 
concentrações e configurações. Pequenos fragmentos de DNA (50-20000pb) são 
melhores resolvidos em géis de agarose corridos em conformação horizontal em um 
campo elétrico de força e direção constantes. Os fragmentos de DNA são comparados 
com marcadores de tamanho ou ladders ou padrões (Figura 68) (Sambrook, 2001). 
 
 
 
 
 
 
101 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 68: Diferentes marcadores de tamanho molecular ou Ladders utilizados em eletroforese 
em gel de agarose ou até mesmo de poliacrilamida. 
 
 
No entanto, atualmente, os géis de agarose só são utilizados em DNA forense 
para a checagem do produto amplificado antes da sua eletroforese por capilar (Figura 69). 
 
 
 
 
 
102 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 Figura 69: Gel de agarosea 2% corado por Brometo de Etídeo, fotografado durante exposição 
à luz ultravioleta, contendo um marcador de 100 pares de bases (primeira coluna: cada banda equivale ao 
peso molecular de 100 em 100 pares de bases). Os produtos de PCR de aproximadamente 220 pares de 
bases são visualizados em todas as outras colunas. Na quarta coluna, verifica-se que não existe banda, 
caracterizado pela não-amplificação do controle negativo da PCR (que não possui DNA). 
 
 
De forma generalizada, cubas horizontais são utilizadas em gel de agarose e as 
verticais em gel de poliacrilamida. Sistemas para eletroforese em gel horizontal (Figura 
70) consistem de uma caixa que é dividida em dois compartimentos e contém uma 
plataforma no meio, que servirá de suporte para o gel, que ficará totalmente submergido 
em tampão. Os eletrodos presentes em cada compartimento fornecerão os campos 
elétricos. A corrente resultante atravessará o gel e o tampão que circunda o gel. Com 
isso, a espessura do gel e a quantidade de tampão a ser colocada deverá ser controlada 
para a obtenção de resultados reprodutíveis. O resfriamento é promovido pelo tampão 
que circunda o gel, que fica recirculando para prevenir o desenvolvimento de gradiente de 
pH e também mantém a temperatura controlada e uniforme (Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
 
 
 
103 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
Figura 70: Cubas de eletroforese horizontal de diferentes tamanhos. 
 
 
Para cada sistema de cubas e plataformas há diferentes tipos de pentes para a 
formação de poços no gel de agarose com capacidade volumétrica diferenciada para a 
deposição das amostras. De acordo com a quantidade de agarose colocada na 
plataforma, altera-se a sua altura, possibilitando uma maior capacidade de volume do 
poço (tabela 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Tabela 6: Capacidade de amostragem para Cuba Horizon 58 relativa à espessura do gel 
(Biometra. Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) 
 
 
 
Os cuidados para o preparo do gel de agarose estão dispostos a seguir: 
Protocolo de preparo do gel de agarose em cuba Horizon ® 58 (Biometra. 
Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) 
 
1) Montar as peças do equipamento de acordo com a figura abaixo: 
 
 
Disposição dos componentes da cuba de eletroforese horizontal (Biometra. Instruction 
Manual -Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus) 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 
2) Preparar o gel de agarose: 
 
a) Escolha a porcentagem do gel de agarose, a quantidade de solução que 
colocará na plataforma (Tabela ABAIXO); 
b) O gel de agarose 1% equivale a 1g de agarose para cada 100mL. Calcular a 
quantidade de agarose a ser pesada e volume total de tampão a ser utilizado. 
Coloque a agarose e o tampão 1x ou 0,5x em um Erlenmeyer; 
c) Pese o frasco contendo a solução e anote o valor; 
d) Dissolva a agarose em TBE por aquecimento em forno microondas ou banho 
de água quente, misturando ocasionalmente. Os cristais de agarose devem 
estar totalmente dissolvidos; 
e) Pesar o frasco novamente e acrescentar água deionizada para compensar a 
evaporação; 
f) Pipetar ou verter a quantidade desejada de solução na plataforma; 
g) Assegure que agarose foi distribuída por toda superfície e, se necessário, 
remova as bolhas; 
h) Espere que a solução esfrie até sua total solidificação. 
 
3) Eletroforese do gel de agarose: 
 
a) Adicione de 100 a 150 mL de tampão na cuba sobre o gel polimerizado; 
b) Remova cuidadosamente o pente e o vedador; 
c) Remova as bolhas que eventualmente estejam entre o tampão e o gel; 
d) Pipete as amostras cuidadosamente na parede do casulo. As amostras devem 
conter quantidade suficiente de glicerol ou sucrose para serem mais densos 
que o tampão; 
e) Feche a tampa da cuba de eletroforese; 
f) Conecte a cuba em uma fonte para eletroforese; 
g) Ligue a fonte e selecione a voltagem desejada. Pequenas bolhas formarão 
perto dos eletrodos quando a cuba está corretamente conectada; 
h) A voltagem e o tempo requeridos de acordo com o tampão utilizados estão 
dispostos na tabela abaixo. A corrente e o tempo de eletroforese variam de 
acordo com o volume de tampão, espessura do gel e voltagem aplicada. Para 
voltagens acima de 175V ocorre suficiente aquecimento do gel levando a 
desnaturar o gel de agarose. É necessário o resfriamento a 4°C da unidade 
durante a eletroforese. Géis contendo menos que 0,5 de agarose também 
devem ser resfriados durante a eletroforese por serem muito fracos. 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 
 
 
Tabela: Tempo de eletroforese para géis de agarose 1% a voltagem constante. As 
mensurações foram realizadas com gel submergido de 1 a 2 mm e com corrente 
variando de 5 a 125mA. O tempo requerido para um tampão de corrida migrar 6,5cm 
da origem. Para o gel de 1%, o tampão utilizado pelo fabricante migra 
concomitantemente com fragmentos de DNA de aproximadamente 200bp em TBE 1X 
e 400bp em TAE 1X. 
 
4) Pós-eletroforese: 
 
a) Após desconectar os cabos da fonte de eletroforese, desconecte os cabos da 
cuba, aba a tampa e retire a plataforma contendo gel do tampão; 
b) Remova o gel com cuidado para a coloração; 
c) Remova o tampão da cuba e descarte-o apropriadamente, não reutilizando. 
Enxágue com água destilada; 
d) Remova qualquer tipo de resíduo de agarose das peças utilizadas e enxágue 
com água destilada. 
 
5) Coloração do gel de agarose: brometo de étídeo (Vide a seguir). 
 
Voltagem (V) Tampão (1x) Tempo de eletroforese (a)
25 TBE 5h
TAE 5h
50 TBE 2,25h
TAE 2,25h
75 TBE 1,5h
TAE 1,4h
100 TBE 1h
TAE 56min
125 TBE 45min
TAE 42min
150 TBE 36min
TAE 34min
175 TBE 29min
TAE 27min
200 TBE 24min
TAE 22min
 
 
 
 
 
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Ácidos nucléicos submetidos à eletroforese através de géis de agarose podem ser 
visualizados por coloração e com luz UV a 300nm. Dois métodos são utilizados para essa 
finalidade: a coloração por brometo de etídio e por SYBR gold: 
O brometo de etídio é preparado como uma solução estoque de 10mg/ml em H2O e 
estocado à temperatura ambiente em frascos âmbar ou enrolados em papel alumínio. O 
corante é geralmente incorporado ao gel de agarose e tampões eletroforéticos em 
concentrações de 0,5μg/ml. A vantagem de se acrescentar o brometo de etídio na 
preparação do gel é que pode-se examinar os fragmentos de DNA durante a corrida ou ao 
final dela. A desvantagem é a redução da mobilidade eletroforética em ~15%, além da 
maior contaminação do equipamento pelo brometo. Quando efetua-se a corrida na 
ausência do corante, DNAs com formas de platôs finos são conseguidos (Sharp et al. 
1973; Sambrook et al, 2001). 
O brometo de etídio (Figura 71) contém grupos planares tricíclicos que intercalam 
entre as bases do DNA, com pequena ou nenhuma preferência sequencial. Em soluções 
saturadas de alta força iônica, aproximadamente uma molécula de etídio intercala a cada 
2.5pb (Waring 1965). Após inserção na hélice, o corantefica perpendicular ao eixo 
helicoidal e faz ligações de Van der Waals com as bases acima e abaixo (Figura 72) 
(Lepecq, 1966). A UV é absorvida pelo DNA em 254nm e transmitida para o corante; 
radiação a 302nm e 366nm é absorvida pela própria ligação ao corante. Em ambos os 
casos, a energia é retransmitida a 590nm. O brometo de etídio pode ser usado para 
detecção de RNA e DNA, mas a afinidade é maior para o DNA (Sambrook et al, 2001). 
 
Figura 71: Estrutura molecular do brometo de etídeo com seu respectivo número de registro - RN. 
 
 
 
 
 
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Figura 72: Estrutura molecular do DNA após intercalação do brometo de etídeo. 
 
 
O brometo de etídeo é um potente mutagênico, pode ser absorvido pela pele, 
irritante para os olhos, boca e trato respiratório superior. Deve ser estocado longe de 
agentes oxidantes em um local resfriado, seco e em recipiente indestrutível e fechado. 
Inúmeras precauções para manuseio e descarte devem ser realizadas para reduzir a 
contaminação tanto do pesquisador como ambiental: 
 
 
 
 
 
 
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Cuidados para a manipulação e descarte do Brometo de Etídeo 
 
Equipamentos de Proteção Individual 
 
Luvas: Utilizar luvas de nitrila para prevenir contaminação das mãos. Luvas 
descartáveis (como 4, 6 ou 8 mil azul luvas de nitrila) usadas em operações de 
laboratório suprem apenas uma barreira de contato e devem ser descartadas 
imediatamente quando há suspeitas de contaminação. Luvas descartáveis não podem 
ser usadas para proteção de materiais químicos perigosos sem utilização de duas 
luvas devido ao potencial de formar buracos mínimos. Luvas de látex descartáveis 
são passíveis de apresentar defeitos e buracos mínimos e não são recomendadas. 
 
Óculos: Utilize óculos de proteção aos químicos com escudo lateral. 
 
Trajes de laboratório: Sempre use calças compridas, sapatos fechados e 
aventais quando manusear materiais perigosos. 
 
Procedimentos de Emergência e Primeiros Socorros: Providencie ajuda de 
primeiros socorros até que auxílio apropriado chegue ao local. 
 
Ingestão: Se a pessoa estiver consciente, lave a boca com água. Não induza 
vômito. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio médico 
chegue. 
 
Inalação: Remova a vítima do local de exposição a um local arejado 
imediatamente. Se a respiração cessar, tenha uma pessoa qualificada que possa 
fazer respiração artificial. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que 
auxílio médico chegue. 
 
Contato com a pele: Remova roupas contaminadas (incluindo os sapatos) 
imediatamente. Lave o local afetado com sabão e detergente suave com grande 
quantidade de água até que nenhuma evidência de químico esteja presente (pelo 
menos 10 a 20 minutos). Chame um médico se você notar irritação nos olhos ou no 
trato respiratório. 
 
Contato com os olhos: Lave os olhos imediatamente com grande quantidade 
de água ocasionalmente levantando as pálpebras inferiores e superiores até que não 
haja evidências de remanescentes químicos (no mínimo 15 a 20 minutos). Remova 
lentes de contato. Chame um médico imediatamente. Se você notar irritação de uma 
exposição excessiva, vá imediatamente à avaliação de um oftalmologista. 
 
 
 
 
 
 
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Descontaminação de substâncias tóxicas: brometo de etídio 
 
A prática de processos referentes à biossegurança é essencial para a 
manutenção da saúde das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos e 
substâncias tóxicas para o ser humano. No caso dos microorganismos é fundamental 
o uso de fluxos laminares ou outras técnicas de contenção (como o do bico de 
Bunsen) que impeçam a sua dispersão durante a manipulação. Outra prática muito 
importante é que todos os materiais derivados de cultivos de microorganismos devem 
ser submetidos à esterilização (por exemplo, autoclavagem) antes de serem 
descartados. Por outro lado, é também importante eliminar ou minimizar os riscos de 
contaminação do ambiente, soluções, bancadas, equipamentos, utensílios (pinças, 
espátulas, etc.) ou vidrarias por substâncias tóxicas para o organismo humano. 
 
O processamento de substâncias com alto potencial tóxico ou mutagênico, 
como o Brometo de Etídio (EtBr), tem sido um dos grandes problemas da maioria dos 
laboratórios. O Brometo de Etídio (EtBr) é comumente utilizado nos laboratórios para 
corar ácidos nucléicos submetidos à eletroforese em gel de agarose ou a gradiente de 
Cloreto de césio. A ação do EtBr como corante se deve a sua capacidade de 
intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos e fluorescer sob luz ultravioleta. Este 
caráter intercalante do EtBr também é responsável pelo seu alto potencial 
mutagênico, pois pode gerar alterações na estrutura do DNA as quais poderão ser 
permutadas durante o processo de duplicação. Dessa forma, a leitura errada das 
sequências de bases do DNA pode resultar em mutação. 
 
 
 
 
 
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Tratamento de soluções concentradas de EtBr (até 10mg/ml) 
 
Existem várias técnicas para o tratamento de descontaminação do EtBr. A mais 
simples e fácil de ser aplicada na rotina é baseada no tratamento de soluções de EtBr 
com Permanganato de Potássio em condições de acidez. Durante esse tratamento 
haverá oxidação do EtBr pelo Permanganato resultando na formação de um 
precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta mistura é neutralizada com NaOH e 
descartada (Sambrook et al., 1989). O protocolo, como descrito em Sambrook et al. 
(1989) é o seguinte: adicionar, se necessário, água na solução concentrada até diluir 
a concentração de EtBr para 0,5mg/ml. 
Em seguida adicionar KMnO4 0,5M equivalente a 1 volume da solução que será 
descontaminada. Misturar cuidadosamente e, em seguida, adicionar 1 volume de HCl 
2,5M. Misturar com atenção e deixar descansando por várias horas à temperatura 
ambiente. Para finalizar, neutralizar essa mistura adicionando 1 volume de NaOH 
2,5N. Novamente misturar e a solução poderá ser descartada na pia sob água 
corrente. 
Este método de descontaminação de soluções concentradas de EtBr (10mg/ml) 
é capaz de reduzir a atividade mutagênica em até 3.000 vezes como foi descrito por 
Quillardet & Hofnung (1988). 
Obs.: No caso da água utilizada no descoramento de géis, onde existe uma 
baixa concentração de EtBr, utilizar Hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) na 
proporção de 1:2, antes de descartar na pia. Os resíduos sólidos (géis e papéis) são 
secos à temperatura ambiente e posteriormente incinerados em forno de alta 
temperatura. 
 
Referências Bibliográficas: 
QUILLARDET, P.; HOFNUNG, M. Ethidium bromide and safety – readers 
suggest alternative solutions. Letter to editors. Trends in Genetics, Amsterdam, v.4, 
p.89, 1988. 
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a 
laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989. 3v. 
 
 
 
 
 
 
112 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Atualmente, existem outros tipos de alternativas que estão sendo incorporadas ao 
mercado, como o SYBR gold, que é o nomecomercial para um corante ultrassensível 
com alta afinidade pelo DNA e uma grande ligação fluorescente com o ácido nucléico. 
Esta ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o 
Brometo de Etídio (figura 73). Assim, <20pg de DNA de dupla hélice pode ser detectada 
no gel de agarose e a coloração de géis de poliacrilamida com este corante pode captar 
100pg de DNA de fita única ou 300pg de RNA. SYBR gold apresenta máximo de 
excitação em 495nm e possui um pico secundário em 300nm. A emissão fluorescente 
ocorre em 537nm (Tuma et al, 1999). 
Géis corados com SYBR gold não deixam background na hora da revelação e 
podem ser fotografados diretamente sem descoloração prévia. O SYBR gold não pode ser 
acrescido ao gel antes da eletroforese, pois sua presença no gel endurecido pode causar 
distorção das bandas de DNA e RNA (Sambrook et al, 2001). 
 
 
Figura 73: A sensibilidade do SYBR® Gold é maior do que a do brometo de etídeo, sendo que a 
ligação fluorescente é >1000 vezes maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio. 
 
 
 
 
 
 
113 
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Gel de Poliacrilamida 
 
Os géis de poliacrilamida foram muito utilizados para a análise de regiões 
polimórficas do DNA para o exame do perfil genético em identificação humana. No 
entanto, atualmente os laboratórios utilizam a eletroforese capilar, como será depois 
apresentado e estudado. Mas para que haja melhor compreensão da eletroforese capilar 
existe a necessidade de estudarmos a eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi 
primordial para a sua realização em equipamentos contendo capilares. 
Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos 
fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resolução é extremamente alto e fragmentos 
de DNA que diferem em tamanho por tão pouco quanto 1pb em comprimento ou 0,1% de 
sua massa podem ser separados uns dos outros (por exemplo, 1pb em 1000pb). 
Comparado com o gel de agarose (Figura 68), a separação dos fragmentos menores, 
como de 100 em 100 pares de bases, é maior (Figura 74), melhorando a análise do 
fragmento, principalmente se possuem variação de poucas bases. Outras vantagens em 
relação aos géis de agarose é que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem 
que haja perda na resolução e o DNA recuperado dos géis de poliacrilamida são 
extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Géis de 
poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e manusear 
do que géis de agarose (Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
 
 
 
114 
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Figura 74: Gel de poliacrilamida a 8% corado com prata contendo produto de PCR, cujo tamanho 
varia de 270 a 280 pares de bases. 
 
 
Monômeros de acrilamida são polimerizados em longas cadeias de uma reação 
iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presença de N-N’-
metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligações cruzadas (figura 75). A porosidade 
do gel resultante é determinado pelo tamanho das cadeias e graus de ligações cruzadas 
que ocorrem durante a reação de polimerização. A porcentagem de monômeros de 
acrilamida utilizados na preparação do gel são determinadas pelo tamanho dos 
fragmentos de DNA a serem analisados (Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971; 
Holmes et al, 1991; Sambrook et al, 2001). 
 
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116 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Tabela 7: Utilização do gel de poliacrilamida de acordo com a sua porcentagem de 
monômeros de acrilamida e da razão acrilamida e bis-acrilamida (modificado de 
http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/6). 
 
 
 
 
Há diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas indicações. Géis 
de poliacrilamida desnaturantes são utilizados para separação e purificação de 
fragmentos de DNA de fita única. São polimerizados na presença de um agente 
(formamida ou uréia) que suprime o pareamento de bases em ácidos nucléicos, saturando 
as pontes de hidrogênio. DNAs desnaturados migram através desses géis em uma razão 
que é praticamente independente da composição de bases e sequência. Entre os usos da 
poliacrilamida desnaturante estão o isolamento e análise de cada fita de DNA, análise de 
produtos de digestão por nuclease S1 e análise de produtos de reações de 
sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001). 
 Géis de poliacrilamida não desnaturantes são utilizados na separação e 
purificação de fragmentos de DNA de dupla-fita, não sendo utilizados, atualmente, para a 
análise do perfil genético. Entretanto, a mobilidade eletroforética também é afetada pela 
composição de bases e sequência, de modo que os dúplices de DNA de mesmo tamanho 
podem diferir na mobilidade em mais do que 10%. Os géis de poliacrilamida não 
desnaturantes são usados frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente 
purificados e para detecção de complexos de proteína-DNA (Sambrook et al, 2001). 
Razão Acrilamida: Bis Gel % DNA / RNA 
nativo (bp) 
DNA / RNA 
desnaturado 
(bp) 
Proteína (kd) 
19: 1 4 100-1500 70-500 100-200 
 6 60-600 40-400 40-150 
 8 40-500 20-200 20-100 
 10 30-300 15-150 15-70 
 12 20-150 10-100 8-60 
20:1 5 200-2000 70-800 >150 
 6 80-800 50-500 50-200 
 8 60-400 30-300 30-125 
 10 50-300 20-200 20-100 
 12 40-200 15-125 10-70 
 20 < 40 < 40 <30 
 
 
 
 
 
 
117 
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São utilizados os mesmos tampões descritos para o gel de agarose. A 
porcentagem de monômero de acrilamida a ser escolhida para utilização estará 
relacionada com a faixa de separação dos ácidos nucléicos a serem analisados. (Tabela 
8). 
 
Tabela 8: Faixaefetiva de separação da eletroforese em gel de poliacrilamida e o valor 
em bp correspondente à migração da coloração xileno cianol e azul de bromofenol 
(Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
O equipamento utilizado para a eletroforese em gel de poliacrilamida é composto 
por duas placas de vidro separadas por espaçadores de até 2 mm, devidamente 
montadas em um sistema composto de uma caixa para tampão que entrará em contato 
com a parte inferior, e outra parte com a superior. A única conexão entre o tampão da 
caixa superior e inferior é o gel (Figura 76 e 77). Quanto mais alta a voltagem para a 
eletroforese, a menor espessura do gel e/ou maior porcentagem de poliacrilamida, há um 
aumento da resistência do gel, aumento demasiadamente a temperatura. Com isso, 
recomenda-se a utilização de placas com sistema de resfriamento ou aquecimento em 
eletroforese desnaturante em poliacrilamida, contendo uma placa de metal para dissipar o 
calor ou para seu aquecimento (Wartell et al, 1990; Sambrook et al, 2001). 
Concentração de 
monômero de 
acrilamida (%) 
Faixa efetiva de 
separação (bp) Xyleno cianol FF Azul de Bromofenol 
3.5 1000-2000 460 100 
5.0 80-500 260 65 
8.0 60-400 160 45 
12.0 40-200 70 20 
15.0 25-150 60 15 
20.0 6-100 45 12 
 
 
 
 
 
 
118 
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Figura 76: Equipamento para eletroforese em gel vertical. Permite voltagens acima de 1500V. 
Fonte: http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/13 
 
 
 
 
 
119 
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Figura 77: Equipamento para eletroforese em gel vertical para voltagens até 250V e 50mA. 
(Biometra. Instruction Manual - Model V-16 and V-16-2 Vertical Gel Electrophoresis Apparatus). Fonte: 
http://www.biometra.de/electrophoresis-native.0.html 
 
 
Existem diferentes tipos de tampões de corrida, como aqueles que contêm Tris-
acetato e EDTA (pH8,0; TAE), Tris-borato (TBE) ou Tris-fosfato (TPE) em concentrações 
de ~50mM (pH7.5-7.8). Segundo Sambrook et al (2001), TAE possui a menor capacidade 
tamponante e TBE e TPE são mais caros do que o TAE, mas possuem maior capacidade 
tamponante. Para fragmentos de baixo peso molecular, entretanto, a resolução é melhor 
nos tampões TBE ou TPE (tabela 9). 
 
Tabela 9: Tampões para eletroforese (Sambrook et al, 2001) 
 
Tampão Solução de trabalho Solução estoque/litro
1X 50X
40mM Tris-acetato 242gTris-base
1mM EDTA 57,1ml ácido acético glacial
100ml EDTA 0,5M (pH8.0)
1X 10X
90mM Tris-fosfato 108g Tris-base
2mM EDTA 15,5ml ácido fosfórico (85%, 1,679g/ml)
40ml de EDTA 0,5M (pH8.0)
0,5X 5X
45mM Tris-borato 54g Tris-base
1mM EDTA 27,5g ácido-bórico
20ml de EDTA 0,5M (pH8.0)
TAE
TPE
TBE
 
 
 
 
 
120 
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Os tampões de corrida ou “loading buffers” (Tabela 10) possuem 3 finalidades: 
9 aumentar a densidade das amostras, assegurando que ela afunde no 
pocinho; 
9 colorir as amostras, facilitando sua visualização; 
9 contém corantes que movem para o ânodo em um campo elétrico em taxas 
previsíveis. 
Azul de Bromofenol migra através do gel de agarose ~2.2 vezes mais rápido do 
que o Xileno Cianol e, corridos em tampão TBE 0,5X, cruza aproximadamente na mesma 
velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em comprimento, enquanto o xileno cianol 
percorre aproximadamente na mesma velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em 
extensão. Esta relação não muda muito para géis de agarose de porcentagem entre 0.5% 
a 1.4% (Sambrook et al, 2001). 
 
Tabela 10: Tipos de tampão de corrida para eletroforese (Sambrook et al, 2001) 
 
 
 
A eletroforese capilar é amplamente utilizada em análise de DNA forense, por 
permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas de maneira 
automatizada, além de necessitar de poucas quantidades de amostra para o processo de 
injeção e podem ser facilmente reinjetadas, se necessário. Separação eletroforética em 
capilar é realizada em menos de 1 hora, se comparado com as muitas horas necessárias 
para àquela realizada em géis de poliacrilamida para identificação humana. Além do 
Tipo do Tampão Tampão 6X Temperatura de Estocagem
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
40%(p/v) sucrose em água
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
15% Ficoll (tipo 400; Pharmacia) em água
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
30% glicerol em água
0,25% azul de bromofenol
40%(p/v) sucrose em águaIV
4° C
temperatura ambiente
4°C
4° C
I
II
III
 
 
 
 
 
121 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
tempo, a quantidade de passos para a elaboração do gel de acrilamida fazem com que 
possa haver uma chance maior de erro durante a manipulação. A desvantagem é o custo 
inicial para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles 
empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a eletroforese capilar é 
a mais empregada nos laboratórios de DNA forense (Butler, 2005) (Figura 78 e 79). 
 
 
 Figura 78: Esquema representativo de eletroforese capilar: o capilar é um tubo de fibra de vidro 
com aproximadamente 50 μm em diâmetro e é completado com uma solução de polímero viscoso 
específico para tal finalidade, que funciona como o gel das eletroforeses descritas anteriormente. As 
amostras são colocadas em uma bandeja e injetadas para o capilar aplicando-se uma voltagem de cerca de 
15000 volts, que separará o DNA em poucos minutos. Os fragmentos de PCR com fluoróforos são 
analisados assim que passam pela janela de detecção e são excitados por um laser específico. Os dados 
são automaticamente computadorizados e permitem um armazenamento e rápida análise. 
 
 
 
 
 
122 
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Figura 79: Manipulação do sequenciador automático, que possui o sistema de eletroforese capilar. 
 
 
 
 
 
 
-----------FIM DO MÓDULO IV----------- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Curso de 
DNA Forense 
 
 
 
 
 
 
MÓDULO V 
 
 
 
 
 
 
Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para 
este Programa de Educação Continuada. É proibida qualquer forma de comercialização do 
mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores 
descritos na Referência Consultada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MÓDULO V 
 
Interpretação dos Resultados 
 
Após a visualização, dá-se a análise dos resultados comparando os fragmentos 
de DNA amplificados das amostras do pai, mãe e filho em caso de paternidade; ou das 
amostras encontradas na cena do crime, em corpos ou vítimas com as de suspeitos 
(INTERPOL, 2001; BUTLER, 2005). No entanto, durante a PCR, um grande número de 
artefatos pode ocorrer e interferir na interpretação e genotipagem dos alelos presentes na 
amostra de DNA, sendo visualizadas somente após a eletroforese. 
Entre esses artefatos (Figura 80) incluem: 
 
→ os produtos stutters (WALSH et al, 1996) 
→ adição de nucleotídeos não pertencentes ao DNA alvo, denominados picos “N” 
– N peaks – ou adenilação(CLARCK, 1988; Clayton et al, 1998). 
 
 
 Figura 80: Artefatos de técnica que podem prejudicar a análise dos alelos após a eletroforese: 
stutters e picos N. 
 
 
 
124 
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→ Produtos de stutters (Figura 81): 
Definição: Picos que se caracterizam pela perda de uma repetição 
consecutiva em relação ao alelo verdadeiro, resultante de um 
“deslizamento” da sequência durante a síntese de DNA, isto é, durante 
a amplificação. A enzima polimerase não amplifica uma sequência, 
aparentando um deslizamento. 
Os picos de stutters dificultam a análise de misturas de DNA. 
 
→ Adição de nucleotídeos que não fazem parte da sequência de DNA - Picos N 
ou adenilação (Figura 82): 
Definição: A enzima Taq polimerase frequentemente adiciona um 
nucleotídeo extra no final do produto de PCR, sendo o mais frequente a 
Adenina (A), denominando-se ADENILAÇÃO. 
Excesso de amostra de DNA na PCR pode resultar em uma incompleta 
adenilação. 
 
Figura 81: Definição de stutter e seus dois tipos. Verifique o “deslizamento” de uma sequência repetitiva. 
125 
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 Figura 82: Adição de nucleotídeos que não fazem parte da sequência de DNA: durante uma 
PCR, a enzima taq polimerase pode acrescentar uma adenina (A) na porção 5´ da dupla fita de DNA que 
está em excesso na reação. Esse artefato resulta na adenilação, que aparece no eletroferograma como dois 
picos bem próximos um do outro sendo um A- e outro A+, que correspondem às fitas da sequência de DNA. 
O eletroferograma em azul mostra a diferença no resultado quando se utiliza uma grande quantidade de 
DNA para a sua amplificação, resultando após a eletroforese em adenilação (para os STRs DES1358 e 
VWA) e picos fora da escala - off-scale (para o STR FGA). 
 
Outros fatores podem estar presentes na análise da STR e devem ser 
criteriosamente analisados, para serem diferenciados de artefatos. Segundo Butler 
(2005), são eles: 
 
microvariações alélicas (Figura 83 e 84) 
126 
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 Figura 83: Microvariação alélica: variações da sequência repetitiva que não fazem parte dos 
alelos incorporados no marcador alélico (allelic ladder), sendo que eles podem ou não estar descritos na 
literatura. A eletroforese do fragmento correspondente a um STR denominado DYS635, é comparado pelo 
programa automaticamente com o marcador ou padrão alélico acima, que possui diversos alelos para o 
mesmo STR. Verifique que o alelo da amostra 1 não está exatamente abaixo do alelo 22, que corresponde 
a 258 pares de bases e sim a 257, que significa que existe uma base a menos na sequência, que poderá 
ser analisada no encadeamento. Após o sequenciamento do DNA (caixa amarela), observa-se a falta de 
uma timina (T) na sequência total (vide abaixo da figura a sequência completa, sendo que [TCTA]4 é igual a 
TCTA TCTA TCTA TCTA; e assim por diante). 
 
127 
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 Figura 84: Quantidade de microvariações alélicas descritas para cada STR, sendo que existem, 
no total, 476 variantes descritas em todos os STRs dispostos no quadro. Entre parênteses encontra-se a 
quantidade de microvariações alélicas de cada STR. Exemplo: CSF1PO(19) – para o STR denominado 
CSF1PO tem-se 19 microvariações alélicas descritas mundialmente. Dados atualizados pelo site até 06 de 
outubro de 2008. 
 
 
padrão tri-alélico (Figura 85 e 86) 
 
 
 Figura 85: Característica do trialelo das STRs D18S51 (alelos 14, 15 e 22), TPOX (alelos 8, 10 
e 11) e D21S11(alelos 29, 30 e 31). 
 
128 
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 Figura 86: Quantidade de TRIALELOS descritos para cada STR, sendo que existem, no total, 
177 padrões trialélicos diferentes descritos em todos os STRs dispostos no quadro. Entre parênteses 
encontra-se a quantidade de trialelos de cada STR. Exemplo: CSF1PO(7) – para o STR denominado 
CSF1PO tem-se 7 trialelos diferentes descritos mundialmente. Dados atualizados pelo site até 23 de 
outubro de 2008 pelo site STRBase. 
129 
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perda de um alelo (Figura 87 e 88): 
 
 
 
Figura 87: Perda de alelo caracterizado pela pouca quantidade de amostra de DNA na reação de PCR. 
 
130 
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Figura 88: Perda do alelo decorrente da presença de mutação na sequência do DNA, que estão 
localizadas em regiões que hibridizam com os primers durante a PCR. 
 
 
131 
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mutações (Figura 89): 
Ocorre aproximadamente 1 em 1000 meioses; 
Incide mais frequentemente com o alelo paterno do que materno; 
VWA, FGA eD18S51 possuem altas taxas; 
TH01, TPOX e D16S539 possuem menores taxas. 
 
 
 
Figura 89: Mutação observada em um trio (mãe, pai e filho): observe a ausência do alelo paterno 
obrigatório do caso à direita, na qual não há o alelo 14 ou 18 e sim um alelo diferente 13. 
 
132 
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Figura 89: Lista de STRs e taxa de mutação. A mutação dos STRs utilizados em identificação 
humana é baixa. No entanto, deverá ser analisada, principalmente se ocorrer em testes de paternidade, 
devendo ser incorporada ao laudo pericial a taxa de mutação. 
133 
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Havendo uma correlação entre as amostras, verifica-se a significância do 
resultado. A importância da evidência de DNA é dada por meio da probabilidade de que a 
casualidade tenha ocorrido. Para isso, tem-se antecipadamente a frequência dos perfis 
genéticos de uma população (Figura 90). Caso o perfil genético seja extremamente raro 
em uma dada população, pode-se dizer que a evidência é extremamente forte, caso 
contrário, pode consistir em uma mera casualidade. A constância de um perfil genético 
em uma determinada população é calculada com base na multiplicação das frequências 
do genótipo de cada locus (EVETT & WEIR, 1998). 
 
 
 
 
 
 
134 
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 Figura 90: Quadrado de Punnett mostrando a frequencia de dois alelos “A” e “a”, para “p” 
frequência do alelo “A” e q, de “a”. Lembrando que a soma de p e q deve ser sempre 1. A frequência de 
cada combinação alélica será calculada pela fórmula 2pq para heterozigotos ep2, para homozigotos. 
 
 
A constância do perfil genético de cada indivíduo foi calculada com base na razão 
de verossimilhança ou Likelihood Ratio (LR) (Evett & Weir 1998) (Figura 91). A seguir 
foram colocados exemplos de cálculos de perfil genético para treino e fixação. É 
conveniente lembrar que no exemplo inserimos somente 3 loci e não os 13 recomendados 
pelo FBI; somente para servir de exemplo, facilitar o entendimento e compreensão acerca 
da importância de se estabelecer a frequência alélica populacional. 
 
135 
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136 
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LR = 1/P 
 
P é frequência do perfil genético de um indivíduo, calculada a partir da multiplicação 
das constâncias alélicas de N locus: 
P= P1.P2.P3.PN, 
 
A frequência para cada locus PN, sendo “i” e “j” alelos de um genótipo cujas 
constâncias alélicas “q” que são determinadas previamente, é calculada: 
PN = qi2, para i=j 
PN = 2qiqj, para i≠j 
 
 
Figura 91: Demonstração do cálculo da frequência do perfil genético 
 
 
 
 
 
 
EXEMPLOS DE CÁLCULOS DE PERFIL DE DNA UTILIZANDO-SE COMO 
EXEMPLO DUAS POPULAÇÕES DISTINTAS 
 
BASEADO NA FREQUENCIA ALÉLICA DE CAUCASIANOS AMERICANOS 
Perfil de DNA Frequência alélica do
banco de dados 
Fórmula Frequência
Locus Alelos Vezes que o 
alelo foi 
observado 
Tamanho 
do banco 
de dados 
Frequência 
D13S317 11 
14 
205 
29 
604 p = 0,34 
q = 0,05 
2pq 0,03 
TH01 6 
6 
140 604 p = 0,23 
 
p2 0,05 
D18S51 14 
16 
83 
84 
604 p = 0,14 
q = 0,14 
2pq 0,04 
 
Frequência do perfil para a população caucasiana = razão de verossimilhança (LR) = 1/P
P é a multiplicação de todas as frequências alélicas = 0,03 x 0,05 x 0,04 = 0,00006 
OU 
LR = 1/0,00006 = 1 em 16666 
Pode-se dizer que o perfil genético em questão pode ser encontrado em 1 em 16666 
pessoas dentro da população de caucasianos americanos 
 
BASEADO NA FREQUENCIA ALÉLICA DE HISPÂNICOS AMERICANOS 
Perfil de DNA Frequência alélica do
banco de dados 
Fórmula Frequência
Locus Alelos Vezes que o 
alelo foi 
observado 
Tamanho 
do banco 
de dados
Frequência 
D13S317 11 
14 
66 
13 
280 p = 0,24 
q = 0,05 
2pq 0,02 
TH01 6 
6 
60 280 p = 0,21 
 
p2 0,04 
D18S51 14 
16 
39 
38 
280 p = 0,14 
q = 0,14 
2pq 0,04 
 
Frequência do perfil para a população caucasiana = razão de verossimilhança (LR) = 1/P
P é a multiplicação de todas as frequências alélicas = 0,02 x 0,04 x 0,04 = 0,000032 
OU 
LR = 1/0,000032= 1 em 31250 
Pode-se dizer que o perfil genético em questão pode ser encontrado em 1 em 31250 
pessoas dentro da população de hispânicos americanos 
 
 
 
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138 
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Variações nos alelos dos loci mais utilizados na identificação humana já foram 
descritas nas diversas populações (RUITBERG et al, 2001; BUTLER, 2005). Entretanto, a 
determinação da frequência genética em um grupo étnico pode estar sujeita a 
divergências, principalmente na população brasileira, que é fruto de uma grande 
miscigenação (MOURA-NETO & BUDOWLE et al, 1997; SOARES-VIEIRA et al. 
2000,2001 ). 
Whittle et al (2004) analisou a frequência alélica de 19 STRs distintas utilizando o 
perfil genético de 13.000 indivíduos brasileiros. Constatou que a frequência da presença 
de perda de alelos e da taxa de mutação observada podem contribuir significativamente 
para a discriminação genética dessa população. 
Pimenta et al (2006) avaliaram 12 STRs de 752 indivíduos de São Paulo que 
foram divididos em categorias de cor de pele e analisando os dados não houve 
diferenciação genética significativa entre os três grupos. Esse resultado alerta o perigo em 
classificar a população brasileira pela cor de pele com seu ancestral geográfico (PENA, 
2005). 
 
Análise de Outros Perfis Genéticos 
 
Dependendo do tipo e finalidade de análise do perfil genético de um indivíduo, 
além dos STRs descritos anteriormente, alguns outros marcadores são utilizados para a 
investigação do DNA forense (Figura 92): 
→ DNA do cromossomo Y: linhagem paterna 
→ DNA mitocondrial: linhagem materna 
→ SNPs (Polimorfismos de base única): são necessários pelo menos 50 
SNPs diferentes para a análise do perfil genético de uma pessoa. 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 92: Diferença entre os STRs (por exemplo, aqueles recomendados pelo CODIS-FBI), que 
são autossômicos; os STRs do cromossomo Y, que são herdados somente para os filhos do sexo 
masculino; e do DNA mitocondrial, que são herdados pela mãe e repassados aos filhos, sendo idênticos 
entre parentes da linhagem materna. 
 
 
Cromossomo Y 
 
Segundo Butler (2005), os STRs do cromossomo Y são utilizados: 
→ Verificação da linhagem paterna, para analisar migrações populacionais, 
pois são transmitidos de pai para filho sem alteração, a não ser em casos específicos de 
mutação; 
→ Pesquisa histórica e genealógica da linhagem paterna; 
→ Análise do perfil genético em testes de paternidade, aumentando o poder de 
discriminação, principalmente quando o DNA do pai biológico não é obtido; 
→ Em casos de estupro, no qual existe vestígio biológico masculino para a 
análise de DNA em um corpo do sexo feminino; 
139 
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→ Verificação de contaminação da amostra biológica por DNA do sexo 
masculino. 
 
No entanto, existem algumas considerações na sua utilização: 
→ Uma combinação entre o perfil genético da evidência e do suspeito 
significará que qualquer parente do sexo masculino da linhagem paterna, como tios, 
primos, avôs, irmãos, etc possam ter contribuído com a amostra biológica; 
→ A presença de parentes do sexo masculino em acidentes em massa pode 
ser facilmente analisada pelo cromossomo Y (Figura 93). 
 
 
 Figura 93: O DNA do cromossomo Y poderá auxiliar na identificação de pessoas desaparecidas 
que possuem parentesco de linhagem paterna. 
140 
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Diversos STRs do cromossomo Y já foram estudados, conforme demonstra a 
figura 94 e tabela 11. Tais STRs do Y já foram incorporados em dois kits comerciais: 
PowerPlex Y (Figura 95) e Y-filer (Figura 96). 
 
 
 
 Figura 94: Diversos STRs, segundo sua localização no cromossomo Y. 
141 
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142 
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Tabela 11: STRs do cromossomo Y, segundo seu acesso no GenBank , a sequência de 
repetição, seus alelos e o tamanho do fragmento de PCR. Fonte: Butler (2005). 
 
 
Nome do 
marcador 
Acesso ao 
GenBank 
Repetição Alelos Tamanho do 
produto de PCR 
DYS19 X77751 TAGA 8-16 178-210 bp 
DYS385 Z93950 GAAA10-22 252-300 bp 
DYS388 G09695 ATT 12-17 128-143 bp 
DYS389 I 
DYS389 II 
G09600 
G09600 
(TCTG) (TCTA) 
(TCTG) (TCTA) 
I: 7-13 
II:23-31 
239-263 bp 
353-385 bp 
DYS390 G09611 (TCTA) (TCTG) 18-27 191-227 bp 
DYS391 G09613 TCTA 8-13 275-295 bp 
DYS392 G09867 TAT 7-16 236-263 bp 
DYS393 G09601 AGAT 9-15 108-132 bp 
YCAIII AC006370 CA 19-25 192-204 bp 
DYS434 AC002992 ATCT 8-11 110-122 bp 
DYS435 AC002992 TGGA 9-13 210-228 bp 
DYS436 AC005820 GTT 10-15 128-143 bp 
DYS437 AC002992 TCTA 8-11 186-202 bp 
DYS438 AC002531 TTTTC 6-12 203-233 bp 
DYS439 AC002992 AGAT 9-14 238-258 bp 
Y-GATA-A4 G42670 AGAT 11-14 242-254 bp 
Y-GATA-A7.1 G42675 ATAG 7-12 161-181 bp 
Y-GATA-A7.2 G42671 TAGA 8-12 174-190 bp 
Y-GATA-A8 G42672 TCTA 8-14 219-244 bp 
Y-GATA-A10 G42674 TATC 11-14 160-172 bp 
Y-GATA-C4 G42673 TATC 11-16 251-271 bp 
Y-GATA-H4 G42676 TAGA 10-13 362-370 bp 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 95: STRs do cromossomo Y contidos no kit multiplex PowerPlex Y®, da Promega 
Corporation, segundo sua região de amplificação e cor de fluorescência. 
 
143 
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 Figura 96: STRs do cromossomo Y contidos no kit multiplex AmpFlSTR® Y-Filer™ da Applied 
Biosystems, segundo sua região de amplificação e cor de fluorescência. 
 
 
No Brasil, frequências alélicas dos STRs do cromossomo Y foram realizados para 
o cálculo do perfil genético. Góis et al (2007) analisou 12 STRs do cromossomo Y 
incluídos no sistema PowerPlex® Y (Promega). A diversidade genética dessas STRs foi 
de 0,6746 e a diversidade haplotípica 0,9996. A comparação entre os resultados obtidos 
demonstrou que a variação dentro de cada grupo é maior que a variação entre os grupos. 
 
 
144 
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145 
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DNA Mitocondrial 
 
O DNA mitocondrial teve suas características descritas no módulo 2 desse curso, 
mas será exposta a metodologia de análise da sua sequência. 
 
O DNA mitocondrial é utilizado para (Butler, 2005): 
→ Verificação da linhagem materna, para analisar migrações populacionais, pois 
são transmitidos pela mãe a todos os filhos; 
→ Pesquisa histórica e genealógica da linhagem materna; 
→ Análise do perfil genético em testes de caracterização de vínculo genético, 
aumentando o poder de discriminação, principalmente quando o DNA do pai 
biológico não é obtido, e sim de parentes da linhagem materna; 
→ Análise de materiais degradados e em ínfima quantidade, como múmias, 
ossadas e material arqueológico, pois o DNA mitocondrial, por ser circular, 
conserva-se melhor do que o DNA genômico. 
 
O mtDNA foi sequenciado pela primeira vez por Anderson et al (1981), que 
tornou-se a referência durante muito tempo, sendo denominada sequência de Anderson 
ou de Cambridge (Figura 97). Atualmente, utiliza-se a fita leve do mtDNA, que possui 
menor peso molecular ao ser comparado com a fita pesada, da sequência de Anderson 
ou Cambridge. A fita pesada ainda possui uma quantidade maior de guanina (Butler, 
2005). 
 
 
 
 
 
 
Figura 97: Sequencia de referência das regiões HV1 e HV2 do mtDNA. 
 
 
O mtDNA possui polimorfismos de base única ou SNPs que variam de indivíduo 
para outro, sendo necessário o sequenciamento de toda a região a ser analisada. Para a 
reação de sequenciamento é necessário: 
146 
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Com isso, iremos abranger um pouco mais sobre a análise da sequência de 
mtDNA, após a realização da PCR. A próxima etapa é a purificação do produto de PCR, 
para a remoção de nucleotídeos não incorporados, primers, enzima polimerase, tampão e 
outros reagentes presentes na PCR que possam interferir na reação de sequenciamento. 
Usualmente, realizam-se purificações a base de etanol e álcool isopropílico, permitindo 
que todo produto de PCR seja precipitado e totalmente utilizado na reação de 
sequenciamento (Butler, 2005). 
A reação de sequenciamento é uma reação de amplificação de fragmentos de 
DNA que correspondem à fita sense ou antissense separadamente, ao contrário da PCR. 
Para tal finalidade, além dos dNTPs utilizados na PCR, utilizam-se 
didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs) que não permitem a incorporação de outros 
nucleotídeos, como demonstra a figura 98: 
147 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 
 
 
 
 Figura 98: processo de seqüenciamento do DNA com ddNTPs marcados com fluoróforos. 
 
 
As sequências posteriormente são alinhadas e analisadas em programas 
específicos, como BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), comparando-
as com a sequência referência de Anderson (Figura 99). Pode também ocorrer 
heteroplasmias que é a presença de mais de um tipo de mtDNA em um único indivíduo 
(Figura 100). Duas ou mais populações de mtDNA podem estar presentes em um único 
indivíduo, seja em diferentes tecidos, regiões do corpo e idades. Com isso, é necessário 
ter cautela ao analisar uma sequência de mtDNA encontrada em amostra referência e 
evidências forenses. 
 
148 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 
 
 
 
 Figura 99: Alinhamento de duas sequências de mtDNA de pessoas distintas (A e B) comparadas 
com a sequência referência, demonstrando a posição da variação e sua nomenclatura. 
 
 
 Figura 100: Heteroplasmia encontrada na posição 16093 contendo o nucleotídeo T (vermelho) e 
C(azul), que é representado pela letra “Y” no eletroferograma. 
 
 
 
 
149 
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150 
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Controle de Qualidade dos Laboratórios 
 
O FBI acrescenta alguns itens para o controle de qualidade dos laboratórios que 
trabalham com evidências de DNA forense, que inclui além desses cuidados a realização 
de periódicos testes de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a 
manutenção da garantia de qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o 
rendimento e para identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados, e a auditoria para 
averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 
2000). 
O grupo espanhol e português da Sociedade Internacional de Genética Forense 
(Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic Genetics), objetivando a 
padronização das metodologias aplicadas e o controle de qualidade, realiza testes anuais 
de controle e de proficiência inclusive para laboratórios brasileiros credenciados. Esses 
testes consistem na análise de amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam 
um caso forense para a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 
2000). 
No teste de vínculo genético familiar, a quantidade de amostra coletada 
normalmente é previsível e constante, não havendomuitos problemas com sua 
quantidade e qualidade. Entretanto, há materiais biológicos utilizados nestes testes que 
são coletados post-mortem oriundos de corpos exumados ou putrefeitos. Nesse caso, o 
material predominante está degradado da mesma maneira que as evidências de material 
biológico encontrado na cena do crime. O produto obtido de provas forenses é único e 
muitas vezes a garantia de sua qualidade só é adquirida através de alguma forma de 
controle independente e indireto (FBI, 2001, INTERPOL, 2001). 
Controles de qualidade internos e externos servem para esse propósito. Os 
laboratórios forenses podem utilizar como controle interno, padrões reconhecidos e 
devidamente testados para tal finalidade. Controles externos devem ser introduzidos por 
programas administrados por organizações certificadas, que, inicialmente, preparam 
padrões de espécimes conhecidas, como sangue, e envia para todos os laboratórios 
credenciados. A metodologia utilizada e os respectivos resultados devem ser informados 
 
 
 
 
 
151 
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para o comitê, que analisará os dados e avaliará as alterações entre os laboratórios 
(THOMPSON, 1974; KLOOSTERMAN, 2001; BLICK & PASSEY, 2003). 
 
Controle de Qualidade Interno 
 
Ao analisar uma amostra biológica destinada à caracterização de vínculo 
genético, seja familiar ou em casos forenses, quaisquer contaminações com DNA 
estranho ou metodologias inadequadamente aplicadas podem resultar na impossibilidade 
de obter o DNA para amplificação, o não estabelecimento dos perfis genéticos e na 
inutilização da amostra. A primeira preocupação no estudo do perfil genético para a 
identificação humana é avaliar o quanto as metodologias de detecção utilizadas pelos 
laboratórios são válidas, assim como seus princípios. Para assegurar resultados, um 
programa de controle de qualidade é fundamental para os laboratórios que realizam 
identificação humana pelo DNA. Todas as metodologias de análise de DNA forense 
devem ser submetidas à validação para assegurar a reprodutibilidade e a robustez da 
técnica (KLOSTERMAN, 2001). 
Procedimentos inadequados que levem à contaminação de amostras pelos 
investigadores e os profissionais do laboratório podem resultar em uma incorreta 
interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de 
normas e procedimentos de boas práticas de laboratórios são imprescindíveis, assim 
como treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se obrigatórios 
(NEUMAYER, 1998; INTERPOL, 2001). 
Desde 1992, a ISFH faz recomendações para a análise de DNA pela PCR. A 
contaminação pode ser evitada atendendo a certos cuidados durante todo o processo de 
análise de DNA. Eles vão desde a coleta e armazenamento do material biológico do qual 
será extraído o DNA até o próprio local de preparação da PCR (ISFG, 1992). 
A preservação do DNA para a amplificação pela PCR também envolve o controle 
da temperatura, da umidade, o valor do pH (BENDER, 2004), a presença de ácido húmico 
e fúlvico e microorganismos. A temperatura baixa pode preservar o DNA, seja ele datado 
de milhares de anos, ou de amostras forenses, assim como o DNA pode ser mais bem 
preservado em ambientes secos e com o mínimo crescimento de microorganismos. A 
 
 
 
 
 
152 
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presença de ácido fúlvico e húmico inibe a enzima Taq DNA polimerase. O pH neutro ou 
levemente alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os 
microorganismos em grande quantidade podem degradar o DNA por completo (BURGER 
et al., 1999). 
O FBI e a INTERPOL estabeleceram normas para os laboratórios forenses que 
participam da construção dos bancos de DNA internacional. Relacionam-se, 
principalmente, com procedimentos de coleta de amostras biológicas para análise do DNA 
que podem ser consideradas evidências, assim como vários aspectos importantes para o 
treinamento técnico. No Brasil, a Secretaria de Segurança Pública do Estado de São 
Paulo e a Secretaria Nacional de Segurança Pública – SENASP elaboraram documentos 
na tentativa de padronizar métodos e cuidados de coleta e manutenção das amostras 
pelos peritos criminais. 
Sucintamente, a coleta do material deve ser realizada em condições assépticas e 
o indivíduo responsável pela coleta estar devidamente paramentado para se evitar 
contaminação em ambos os sentidos, como, por exemplo, utilização de hastes com 
algodão, tubos, frascos e envelopes plásticos ou de papel. Para a coleta de amostras 
biológicas umedecidas é aconselhável a posterior secagem em ambiente estéril para o 
seu acondicionamento. No entanto, se isso não for possível, transporta-se imediatamente 
para o laboratório e congela-se a -20°C, no mínimo (SÃO PAULO, 1999; FBI, 1999 e 
2001; INTERPOL, 2001; SENASP, 2006). Não se deve descongelar e congelar as 
amostras repetidamente, pois causaria a degradação do DNA. 
A escolha de métodos de extração de DNA está relacionada ao tipo de material e 
é importante para que se obtenha sucesso no estudo das STRs. Dessa maneira, cada 
laboratório deve realizar testes e otimizações de técnicas específicas para cada tipo de 
amostra forense (FBI, 2001; INTERPOL 2001; BUTLER, 2005; BONACCORSO, 2005). 
Em 1996, a maioria dos laboratórios entrevistados por uma filial da Sociedade 
Internacional de Genética Forense (53%) realiza a purificação do DNA pelo método 
orgânico (67%) seguido por não orgânico (33%). 
Hoff-Olsen et al (1999) avaliaram cinco métodos de extração de DNA de tecidos 
humanos em estado de decomposição, que normalmente encontram-se altamente 
degradados, para análise das STRs. Os métodos empregados foram: extração orgânica 
 
 
 
 
 
153 
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com fenol-clorofórmio, sílica, filtro de fibra de vidro, Insta Gene Matrix™ e Chelex. O 
método da sílica, além de ser mais econômico, obteve melhores resultados ao comparar 
com método fenol-clorofórmio e resultou em um perfil genético completo em 90% dos 
casos contra 60%. Isso torna a sílica o método mais indicado pelos autores para a 
extração de DNA de amostras degradadas. O método de Chelex não foi satisfatório para 
dentes, demonstrando que ele deve ser indicado principalmente para saliva, como 
descreveu Sweet et al. Em casos como esse, emprega-se controle positivo constituído de 
amostra conhecida, para verificar se o método foi eficaz (FBI, 2001; INTERPOL, 2001). 
Kwok & Higuchi (1989) e Neumaier (1998) descreveram várias recomendações 
para assegurar a qualidade dos métodos de biologia molecular em diagnósticos clínicos 
referentes às fases pré-analíticas e analíticas, principalmente para a realização da PCR. 
Objetivando evitar a contaminação das amostras, recomenda-se o isolamento físico da 
área de preparação da PCR, de seus reagentes e todos os materiais descartáveis 
utilizados na reação que devem ser previamente esterilizados. Outros cuidados são 
fundamentais: os reagentes devem ser aliquotados; a utilização de luvas descartáveis é 
obrigatória e devem ser constantemente trocadas; deve-se ter cuidado ao abrir os tubos, 
pois parte do produto da PCR pode estar na sua tampa, possibilitando o seu desperdício; 
a mistura dos reagentes da PCR deve ser feita em um único tubo para posteriormente 
aliquotá-los em tubos individuais; deve-se adicionar o DNA individualmente em cada tubo 
e, finalmente, a inclusãoobrigatória de controles negativos e positivos que auxiliam na 
detecção de contaminantes. 
Atualmente utiliza-se a linhagem de célula comercial K562 como controle positivo 
(BJERRE et al, 1997; FBI, 2001; INTERPOL, 2001) ou uma amostra de DNA previamente 
validada pelo próprio laboratório ou externamente, como ocorre em kits de identificação 
humana (LAFOUNTAIN et al, 2001; KRENKE et al, 2002; LEVEDAKOU et al, 2002; 
SCHLENK et al, 2004). Com o intuito de unificar os loci a serem utilizados em 
identificação humana para a incorporação de perfis genéticos de criminosos em seu 
banco de dados (CODIS), o FBI indicou a utilização de 13 loci para a sua análise; a saber, 
CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 
D16S539, D18S51, e D21S11 (BUDOWLE & MORETTI, 1999) (Tabela 12). 
 
 
 
 
 
 
154 
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Tabela 12 – Informação das 13 STRs recomendadas pelo CODIS. 
 
Nome do 
Locus 
Localização no 
cromossomo 
Unidade 
de 
repetição 
Acesso de 
GenBank 
Variação 
dos 
alelos 
Número de 
alelos 
observados 
CSF1PO 5q33.1 
c-fms pronto-
oncogene, 
6° intron 
TAGA X14720 6-16 15 
FGA 4q31.3 
fibrinogênio 
3° intron 
CTTT M64982 15-51,2 69 
TH01 11p15.5 
Tirosina 
hidroxilase 
1° intron 
TC|AT D00269 3-14 20 
TPOX 2p25.3 
Tiróide peroxidase 
10° intron 
GAAT M68651 6-13 10 
VWA 12p13.31 
von Willebrand 
factor 
40° intron 
[TCTG] 
[TCTA] 
M25858 10-24 28 
D3S1358 3q21.31 [TCTG] 
[TCTA] 
NT_00599
7 
9-20 20 
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10 
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22 
D8S1179 8q24.13 [TCTA] 
[TCTG] 
G08710 8-19 13 
D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14 
D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10 
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43 
D21S11 21q21.1 [TCTA] 
[TCTG] 
complexo 
AP000433 24-38 70 
Adaptado de Butler, 2005 
 
 
 
 
 
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Esse conjunto de loci tornou-se referência para todos os países no que se refere 
à ciência forense (SUN et al, 2003). Essa normatização permitiu estudos de frequências 
alélicas populacionais comparativas mais adequadas, possibilitando a universalização dos 
dados genéticos com critérios homogêneos. Com o objetivo futuro de implantar um banco 
de perfis genéticos de criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou 
as STRs sugeridas pelo CODIS como referência em seu Manual de Padronização de 
Exames de DNA em Perícias Criminais (SECRETARIA NACIONAL DE SEGURANÇA 
PÚBLICA - SENASP, 2005). 
Esses loci contêm repetições bem caracterizadas que podem ser facilmente 
determinados com uso de uma referência de tamanho de fragmento de DNA. As 
vantagens da utilização de marcadores de tamanho em análise de DNA têm sido 
observadas desde o início das análises de VNTRs (WYMAN & WHITE, 1980). 
A reprodutibilidade do método de detecção é confirmada observando a 
intensidade dos fragmentos do marcador podendo fornecer informações relativas à 
possível variação linha a linha na migração eletroforética de um mesmo material. O 
marcador é aplicado em linhas dispostas em regiões distintas, destinado a abranger uma 
maior região do gel. A separação eletroforética depende não somente do tamanho dos 
fragmentos, mas também da sequência do nucleotídeo (FRANK & KOSTER, 1979). 
Dessa maneira, os marcadores de tamanho só garantem a eficácia da leitura do 
comprimento do DNA quando o marcador e o fragmento de DNA desconhecido têm a 
mesma continuação e o mesmo tamanho. 
Se as sequências do marcador e dos fragmentos das amostras não são os 
mesmos, a migração das amostras em relação os fragmentos do marcador podem ser 
diferentes. Isso se deve a parâmetros ambientais como porcentagem de agarose ou 
poliacrilamida, a quantidade de sais no tampão de corrida, a voltagem da eletroforese 
(BUDOWLE et al, 1995; MISCICKA-SLIWKA, 1997; SULLIVAN, 1992) ou mesmo a 
detecção da emissão de fluorescência presente no fragmento amplificado, como ocorre 
na utilização de iniciadores marcados com fluorescência (GRIFFITHS et al; 1998; 
WATSON et al, 2001). 
Inúmeros marcadores de tamanho de fragmentos de DNA para eletroforese são 
disponibilizados comercialmente: 10, 50, 100 bp e 1Kb (INVITROGEN, 2007), ILS600 
 
 
 
 
 
CXR presente no PowerPlex®16 (PROMEGA, 2007) e GS500 LIZ, no AmpFlSTRS® 
Identifilier™ (APPLIED BIOSYSTEMS, 2005); marcadores de peso molecular, como o 
Low DNA Mass Ladder (INVITROGEN, 2005-2); marcadores ou padrões alélicos que 
possuem os diversos alelos de um determinado locus (PUERS et al, 1993; SULLIVAN et 
al, 1992). 
O marcador alélico é uma mistura artificial de alelos presentes em uma população 
de uma determinada STR (SAJANTILLA et al, 1992, SULLIVAN et al, 1992). Esses 
marcadores alélicos servem como padrão de migração para cada STR. Eles devem ser 
ajustados para os diferentes tamanhos de mensuração presente em instrumentos e 
condições de cada laboratório (BUTLER, 2005) (Figura 101). 
 
 
 
 Figura 101: Marcador alélico presente no Kit AmpSlTR® Identifiler™, da Applied Biosystems. 
Verifique a presença de diversos alelos em uma mesma amostra e a sua separação eletrofóretica. Os 
marcadores são utilizados para a comparação com os produtos de amplificação. 
 
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Liu et al (1997) sugeriu a importância da análise do polimorfismo populacional que 
encontraram após o estudo da frequência alélica na população japonesa e chinesa e a 
construção do respectivo marcador alélico para a STR ACTBP2. Além de observarem 
alelos raros dentro de cada população, analisaram dois alelos que só foram encontrados 
na população japonesa, enquanto outros dois, somente na chinesa. Esse fato demonstra 
a variação dos polimorfismos em populações diferentes. Os autores encontraram também 
algumas microvariações alélicas raras. Todas essas variações foram incorporadas no 
marcador alélico construído pelos autores, possibilitando uma maior discriminação alélica. 
Uma mistura de diversos marcadores alélicos foi desenvolvida para a sua 
utilização em sistemas multiplex, e possuíam as seguintes STRs: HUMTH01, D21S11, 
D18S51, D8S1179, HUMVWA, HUMFIBRA/FGA e amelogenina. Os produtos da PCR 
possuindo os alelos amplificados foram sequenciados e posteriormente agrupados para a 
sua análise em um sistema automático (GRIFFITHS et al; 1998; WATSON et al, 2001). 
Outro marcador alélico multiplex foi desenvolvido por Fujii et al (2000) para as STRs 
HUMTH01, D9S304 e D3S1744, e também homogeneizaram os produtos da PCR. 
Outro fator que pode interferir na caracterização dos alelos é a quantidade de 
DNA utilizada na PCR, podendo ser um fator crucial para sua amplificação correta. 
Kobayashi et al (2004) ao analisar os produtos de DNA obtidos pela PCR da STR TH01 
de amostras de DNA de diferentes concentrações constataram a perda de um alelo com 
quantidades de DNA muito baixas. De 100pg a 10ng, o DNA foi corretamente amplificado, 
mas quando analisou utilizou 10pg ou 1pg de DNA houve a perda de um dos alelos ou 
não foi possível detectá-los, sendo que o indivíduo era heterozigoto. Esse dado nos 
fornece justificativas para analisar cuidadosamente a quantidade de DNAa ser colocada 
para PCR, evitando a amplificação errônea dos fragmentos. 
 
Controle de Qualidade Externo: Testes de Proficiência em Genética Forense 
 
Atualmente são realizados diversos testes de proficiência: o Serviço Cooperativo 
de Testes (Collaborative Testing Services), o Colégio Americano de Patologistas (College 
of American Pathologists), o Instituto de Pesquisas Sorológicas (Serological Research 
Institute), Grupo de Diagnóstico Cellmark (Cellmark Diagnostic´s Internacional Quality 
 
 
 
 
 
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Assurance Survey) a Associação Americana de Bancos de Sangue (AABB), a Sociedade 
Americana de Diretores de Laboratórios Criminais (ASCLD/LAB), o Grupo Europeu de 
Perfil de DNA (EDNAP) e o Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de 
Genética Forense (GEP-ISFG) (PETERSON et al, 2003). 
O primeiro teste de proficiência em análises clínicas relatado foi realizado em 
1946 quando Belk e Sunderman distribuíram espécies anônimas para laboratórios de 
hospitais para avaliar o desempenho e padronizar os resultados, que variaram entre os 
laboratórios, avaliando-se a causa das discrepâncias dos resultados e a qualidade do 
trabalho realizado (BELK, SUNDERMAN, 1988). 
Em 1974, a Fundação de Ciência Forense (Forensic Science Foundation) 
conduziu um estudo que trouxe diversos problemas na análise e interpretação dos 
resultados. Uma combinação de grandes esforços dos laboratórios resultou no 
aperfeiçoamento na educação e nas oportunidades de treinamento, implementação de 
programas de certificação e creditação, bem como a realização de testes de proficiência e 
implementação de programas de controle de qualidade (PETERSON & MARKHAM, 1995 
a e b). 
A AABB publicou, em 1991, um conjunto de controle de qualidade em teste de 
DNA utilizando-se RFLP. O Grupo de Trabalho Técnico em Métodos Baseados em 
Análise de DNA (TWGDAM) foi criado nos Estados Unidos em 1988 e realizou sua 
primeira publicação de 1991 (PETERSON et al, 2003). Estabeleceu-se, nos EUA, um 
conjunto de padrões em controle de qualidade e testes de proficiência para aplicação em 
laboratórios forenses. Em 1994, criou-se o Conselho de DNA (DAB) cujos membros 
reportam-se diretamente ao diretor do FBI (ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA, 1994). 
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense (ISHF), que 
atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), 
publica recomendações sobre análise de polimorfismos de DNA descrevendo e discutindo 
procedimentos para melhoria na reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. 
O FBI recomenda outros detalhes sobre o controle de qualidade dos laboratórios que 
trabalham com evidências de DNA forense, que inclui além desses cuidados, a realização 
de testes periódicos de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a 
manutenção da garantia de qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o 
 
 
 
 
 
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rendimento e para identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados, e a auditoria para 
averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA ADVISORY 
BOARD, 2000). 
O Instituto Nacional de Padronização e Tecnologia (NIST) desenvolve e certifica 
padrões físicos e químicos para comercialização, manufatura e utilização em pesquisas, 
incluindo os utilizados em análise de ácidos nucléicos. Entre eles, aqueles utilizados em 
diagnóstico molecular de doenças infecciosas, genéticas, câncer e, também, vínculo 
genético. O NIST também conduz um abrangente teste de validação interlaboratorial para 
análises forenses e identificação genética humana (BARKER, 2002). 
A conduta de avaliação proposta para laboratórios que realizam vínculo genético 
normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos mãe, filho e suposto 
pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, seus protocolos metodológicos, 
assim como os resultados obtidos entre os participantes (BJERRE et al, 1997; 
HALLENGERG & MORLING; 2001). 
A avaliação do DNA degradado por diversas condições foi realizada por vários 
laboratórios europeus. Inicialmente, células foram degradadas em condições específicas 
(BENDER, 2004) e encaminhadas para 50 laboratórios europeus, com o objetivo de 
melhorar o entendimento sobre os diferentes parâmetros que influenciam a tipagem pelas 
STRs de DNA degradado. Abrange ainda a tentativa de otimização para minimizar 
problemas. Após a análise dos resultados de 38 laboratórios participantes concluíram que 
para superar os efeitos da degradação do DNA, protocolos da PCR devem ser otimizados 
para todos os parâmetros. Protocolos flexíveis para a interpretação dos perfis alélicos 
devem ser desenvolvidos e, se necessário, elaborados softwares para auxiliar na análise 
(SCHNEIDER et al, 2004). 
Em 2004, O NIST (KLINE et al, 2005) realizou estudo de quantificação de DNA 
entre 80 laboratórios que participaram do 14° Simpósio Internacional de Identificação 
Humana que foi realizado em Phoenix, AZ, EUA. Oito amostras de DNA extraídas foram 
liofilizadas e entregues aos laboratórios objetivando: examinar os resultados avaliando a 
performance dos laboratórios quando se utiliza concentrações baixas de DNA, fato 
frequente em casos forenses, e examinar a consistência das diversas metodologias 
utilizadas entre os laboratórios. Ao final do estudo houve uma variabilidade de 20% nos 
 
 
 
 
 
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resultados utilizando-se 19 metodologias. Desses, 65% derivaram de técnicas 
abrangendo hibridização Slot Blot e 21% da PCR em tempo real. Comparando-se os 
resultados de todos os laboratórios houve uma variação de 20% com emprego de 
técnicas diferentes. Com isso, estabeleceu-se que o controle positivo externo que foi 
gerado deveria ter os seus resultados comparados dentro de cada metodologia utilizada, 
quando o material fosse aproveitado em testes de proficiência. 
Um exercício colaborativo foi realizado em 1989 por 12 laboratórios Europeus 
utilizando-se VNTR pYNH24. Os resultados demonstraram que a correlação entre os 
perfis genéticos adquiridos podem ser alcançados tanto intra como entre os laboratórios, 
sob condições mínimas de padronização (SCHNEIDER et al, 1991). Um dos primeiros 
estudos em controle de qualidade das STRs foi realizado entre laboratórios participantes 
de um encontro do TWGDAM em 1995. Empregou-se, inicialmente, um triplex que 
amplificava as STRs CSF1PO, TPOX, TH01 e posteriormente foi acrescentado vWA, 
tornando-se um quadruplex. Mesmo utilizando-se protocolos idênticos, inúmeros fatores 
contribuíram para a variabilidade de tamanho dos alelos identificados que chegaram a 
uma diferença de acima de 4bp. Entre todos os fatores discutidos, a instabilidade 
eletroforética dos equipamentos pode ser considerado como primordial (MICKA et al, 
1999). 
A análise das STRs não substituiu de imediato os VNTRs. Em 1995 e 1996, um 
grupo filiado à Sociedade Internacional de Genética Forense (BJERRE, 1997) observou 
que as VNTRs eram analisadas por RFLP e seus fragmentos identificados utilizando-se 
sistema de câmera de detecção (57%) e 14% ainda empregavam réguas para 
mensuração. Um estudo semelhante foi realizado em 1997, 1998 e 1999 pelo mesmo 
grupo, no qual houve uma diminuição na análise de VNTR por de sondas de locus eRFLP de 83% em 1997 a 66% em 1999, enquanto mais de 90% dos laboratórios já 
utilizavam sistemas baseados na PCR. O coeficiente de variação foi de 1,3% na análise 
de VNTRs e de menos de 0,3% na análise das STRs. Segundo os autores, esse baixo 
valor se deu pela incorporação de conjuntos comerciais para análise de STR, melhorando 
a qualidade da mesma (HALLENBERG & MORLING 2001). 
No Brasil, os exercícios de controle de qualidade em identificação humana pelo 
DNA são realizados pelo GEP-ISFG e pela SLAGF, não havendo um grupo brasileiro 
 
 
 
 
 
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específico que realize testes de proficiência. Desde 1992, o GEP-ISFG realiza um 
programa de controle de qualidade, sendo relatados como membros: 324 geneticistas 
forenses de 118 laboratórios de 19 países. Espanha, Portugal, Brasil, Argentina e 
Colômbia são os países mais representativos do grupo. A maioria dos laboratórios está 
relacionada com testes de paternidade, sendo 58% envolvidos com casos criminais 
(GOMÉZ et al, 2004). 
As amostras incluídas nos testes de proficiência realizados pelo GEP-ISFG de 
2002 a 2005 (GARCIA-HIRSCHFELD et al, 2005; GÓMEZ et al, 2004), variaram de cinco 
a seis amostras diversificando entre: 100µL de sangue, incluindo casos de teste de 
paternidade; um fio de cabelo de 2 cm, realizado desde 2000; e amostras forenses 
incluindo saliva, em 1997; amostras mistas, em 1998, 2000, 2003, 2004 e 2005; sêmen, 
em 2002 e não humanas em 2001. O número total de erros variou de 0,6% a 2,3% em 
diferentes anos, sendo que esse valor está concentrado principalmente em laboratórios 
que utilizaram sistemas manuais de eletroforese e marcadores alélicos construídos 
internamente. 
A SLSGF observou que a porcentagem dos laboratórios participantes que estão 
obtendo resultados de análise corretos vem crescendo progressivamente, variando de 
48% em 1998 até 84% em 2004-2005 (PENACINO et al, 2005). Isso demonstra uma 
crescente melhoria da análise e de formação de recursos humanos mais adequados. 
Também já foram realizados testes de proficiência para a análise de DNA mitocondrial 
(SCHNEIDER et al, 1999) e DNA do cromossomo Y (CARRACEDO et al, 1998; 
CARRACEDO et al, 2001), observando-se a importância e a crescente incorporação de 
programas de controle de qualidade e testes de proficiência em identificação humana pelo 
DNA pelos laboratórios. 
 
 
Considerações Finais 
 
Os exames de DNA para caracterização de vínculo genético familiar ou análise de 
evidências forenses têm evoluído de forma rápida e constante nos últimos 10 anos. No 
entanto, apesar da incorporação de tecnologias para a análise de SNPs com microchips 
 
 
 
 
 
(Figura 102), por exemplo, a análise do perfil genético dos STRs após eletroforese capilar 
é a mais utilizada no mundo inteiro. 
 
 
Figura 102: Microchip para análise de SNPs, que pode ser utilizado para DNA forense. 
 
 
Pode-se dizer que, mesmo com o desenvolvimento da tecnologia, os princípios 
básicos da análise de DNA serão os mesmos, com a diferença que o equipamento, os 
reagentes ou os métodos podem diferenciar no nome ou no modelo. Por exemplo, 
podemos citar a extração de DNA que possui sempre a mesma “regra” básica: lise celular, 
precipitação de proteínas e isolamento do DNA. A lise celular sempre existirá, mas poderá 
ser feita com diversos reagentes e diversos métodos, que vão depender do tipo de 
amostra a ser analisada, de suas condições físico-químicas ou biológicas e do recurso 
tecnológico que possuir no laboratório. 
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O investimento para construir um laboratório de DNA forense é bastante alto, 
impossibilitando a troca imediata da tecnologia de análise de STRs, mtDNA, Y STRs, 
SNPs e miniSTRs. Para se ter uma idéia, somente o equipamento de eletroforese capilar 
novo – que realiza a análise de fragmentos de STR e de sequências – custa cerca de R$ 
400.000,00 sem contar os reagentes, os kits e todos os outros equipamentos básicos para 
a sua realização, podendo chegar a quase R$ 1.000.000,00 de investimento (informações 
baseadas no ano de 2008). 
 
 
 
 
-----------FIM DO MÓDULO V----------- 
 
 
 
 
 
 
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GLOSSÁRIO 
 
ABI 310 Genetic Analyzer 
Instrumento de eletroforese capilar produzido pela Applied 
Biosystems, introduzido na comunidade científica em 1995. 
Muitos laboratórios adotam, atualmente, o ABI 3100 ou 
ABI3130 ou ABI3130XL. 
ABI 3100 Genetic Analyzer 
Instrumento de eletroforese capilar produzido pela Applied 
Biosystems, que possui todo o sistema computadorizado, 
inclusive de injeção de polímero. 
ABI (Applied Biosystems 
Incorporation) 
Companhia que produz e comercializa instrumentos e 
reagentes utilizados em Biologia Molecular, localizado em 
Foster City, Califórnia. 
Ácido desoxirribonucléico 
(DNA) 
Material genético de organismos, usualmente dupla fita, 
fazendo parte da classe de ácidos nucléicos identificados 
pela presença de desoxirribose, um açúcar e quatro 
nucleobases. 
Alelo (frequência) 
A proporção quantitativa de um determinado alelo entre os 
cromossomos dos indivíduos de uma mesma população. 
Alelo 
Uma forma alternativa de um gene ou de uma parte do DNA 
localizado em uma determinada região genética (locus). Os 
marcadores de STRs frequentemente possuem múltiplos 
alelos. 
 
 
 
 
 
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Amelogenina 
Um marcador utilizado para tipagem sexual, cujo gene 
codifica o esmalte dentário, ocorre em ambos os 
cromossomos X e Y. 
Amostra de referência 
Uma amostra (normalmente sangue ou saliva) obtida de uma 
pessoa conhecida que é utilizada para comparação com a 
evidência. 
Amplicon 
O produto de amplificação do DNA pela Reação em Cadeia 
pela Polimerase (PCR). 
Amplificação 
Um aumento no número de cópias de um fragmento 
específico de DNA, podendo ser in vitro ou in vivo. 
Artefato 
Qualquer produto não relacionado ao alelo que pode ocorrer 
durante o processo de amplificação do DNA. EX: stutters e 
adenilação 
Autossômico 
Um cromossomo não envolvido em determinação do sexo, 
como os 23 pares de cromossomos que possuímos, sendo 
que os outros dois cromossomos X e Y são sexuais. 
Ciência forense 
A aplicação de conhecimento científico para questões civis e 
criminais, tipicamente através da apresentação de resultados 
de evidências. 
CODIS 
Abreviação de Combined DNA Index System ou Sistema de 
Indexação de DNA Combinado, que é um banco nacional de 
dados de perfis genéticos dirigido pelo FBI, Estados Unidos. 
Cromossomo 
A estrutura no qual a informação hereditária é fisicamente 
transmitida de uma geração a outra. 
 
 
 
 
 
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Cromossomos sexuais 
Cromossomos que são diferentes nos dois sexos e estão 
envolvidos na determinação do sexo: cromossomo X e Y. 
Degradação 
A fragmentação,ou a quebra da molécula de DNA, devido a 
agentes químicos ou físicos. 
DNA mitocondrial (mtDNA) 
Molécula de DNA pequena, circular, de herança materna, 
localizada na mitocôndria e contém aproximadamente 16.500 
nucleotídeos. A abundância das mitocôndrias em uma única 
célula facilita a sua amplificação pela PCR, mesmo em 
amostras degradadas ou limitadas. 
Eletroforese capilar 
Uma técnica de eletroforese para separação de moléculas de 
DNA pelo seu tamanho e baseia-se na migração através de 
um tubo capilar preenchido com um polímero viscoso. 
Eletroforese 
É uma técnica na qual as moléculas são separadas pela sua 
velocidade em um campo elétrico. 
Eucarioto Organismo cujas células contêm núcleo. 
Evidência biológica 
Amostra biológica coletada na cena do crime, de pessoas ou 
de objetos associados ao crime. 
Exclusão 
O teste de DNA indica que um indivíduo é excluído (não 
ocorre combinação de alelos em determinados loci), como a 
fonte da evidência de DNA. Em casos criminais, “exclusão” 
não equivale a “inocente”, pois existem outras provas que 
são analisadas. 
 
 
 
 
 
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Fluorescência 
A emissão de luz de uma molécula consequente da sua 
excitação por uma fonte de energia de luz. Na análise de 
DNA, marcadores fluorescentes permitem a detecção 
simultânea de tamanhos similares de produtos de PCR 
através da emissão fluorescente em diferentes cores. 
Gene 
Unidade básica de hereditariedade, uma sequência de DNA 
em um cromossomo. 
Genoma 
Todo material genético em um cromossomo de um 
organismo particular. 
Genótipo 
Constituição genética de um organismo, que é caracterizado 
por particularidades físicas ou fenótipo. 
Hereditariedade A transmissão de características de uma geração para outra. 
Heterozigoto 
Indivíduo que possui diferentes alelos em um locus, em 
cromossomos homólogos. 
Homozigoto 
Indivíduo que possui alelos maternos e paternos idênticos em 
um locus em cromossomos homólogos. 
Identifiler 
Um kit de PCR multiplex da Applied Biosystems que amplifica 
simultaneamente 15 STRs, incluindo os 13 STRs 
recomendados pelo CODIS e o marcador sexual 
amelogenina. 
In vitro Procedimento realizado fora de organismo. 
In vivo Procedimento realizado dentro de organismo. 
 
 
 
 
 
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Inconclusivo 
Situação na qual nenhuma conclusão poderá ser dada em 
um teste sendo resultante de uma entre muitas razões: 
resultados não foram obtidos, resultados não-interpretáveis 
ou falta de amostra de referência para confronto. 
Loci de CODIS 
Um conjunto de 13 STRs recomendados para a inclusão de 
um perfil de DNA no banco de dados do CODIS/FBI. Esse 
conjunto tornou-se referência mundial para a análise de perfil 
genético de seres humanos visando a identificação humana, 
sendo que os laboratórios utilizam no mínimo essas 13 
STRs. 
Loci Plural de Locus (vide Locus). 
Locus 
Localização física específica de um gene em um 
cromossomo. 
Marcador 
Um gene ou sequência específica de DNA de uma região 
conhecida em um cromossomo utilizado como um ponto de 
referência em um mapeamento de outro loci. 
Mutação 
Qualquer mudança não hereditária na sequência do DNA. 
Uma alteração ou troca de um alelo em um locus genético 
resultando em uma inconsistência entre o familiar biológico 
ou evidências. Pode ser considerada também qualquer 
alteração genética com frequência menor que 1% em uma 
população humana. Mas nesse curso adotamos o primeiro 
conceito. 
Núcleo 
Organela celular em eucariotos que contém o material 
genético. 
 
 
 
 
 
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Nucleotídeo 
Uma unidade de acido nucléico composto por fostato, ribose 
ou desoxirribose e uma base purina ou piridina. 
Par de base 
Dois nucleotídeos complementares ligados por ponte de 
hidrogênio. Ex: adenina-timina; citosina-guanina. 
PCR multiplex 
Co-amplificação de múltiplas regiões do genoma com mais 
de um conjunto de primers (ou iniciadores) em uma única 
PCR, diminuindo a quantidade de DNA e reagentes a ser 
empregado em uma PCR singular (que possui somente um 
par de primers para amplificar somente um locus. 
Perfil genético 
A análise completa de no mínimo 13 loci de um único 
indivíduo pode determinar o perfil genético. No entanto, esse 
perfil poderá estar incompleto, principalmente em amostras 
degradadas. 
Poder de discriminação 
O potencial de um marcador genético ou conjunto de 
marcadores em diferenciar duas pessoas escolhidas por 
acaso. 
Polimorfismo 
Diferença na sequência de DNA entre indivíduos. Variação 
genética que ocorre em mais de 1% da população pode ser 
considerada polimorfismo na análise de ligação. 
População 
Um grupo de indivíduos que residem em uma mesma área 
em um mesmo período. 
Power Plex 16 
Kit multiplex da Promega Corporation que co-amplifica 15 
STRs, sendo que 13 recomendados pelo CODIS-FBI, e mais 
o marcador sexual amelogenina. 
 
 
 
 
 
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Primer (ou iniciador) 
Uma cadeia polinucleotídica curta sintetizada artificialmente 
que possui normalmente de 18 a 30 bases, que se hibridiza 
em uma região específica do DNA e permite que a enzima 
DNA polimerase inicie a síntese da fita complementar. 
Probabilidade de exclusão 
(PE) 
Uma porcentagem da população que pode ser excluída como 
potencial contribuidor em um resultado de mistura de DNA. 
Reação em Cadeia pela 
Polimerase (ou da 
Polimerase) – PCR 
Processo in vitro que permite a amplificação de milhões de 
cópias de um DNA específico através de repetidos ciclos 
envolvendo a enzima DNA polimerase. 
Sequências 
complementares 
As sequências de ácidos nucléicos formam uma estrutura de 
dupla fita por pareamento de bases, como adenina-timina, 
citosina-guanina. Por exemplo, a sequência complementar de 
GTACCG é CATGGC. 
SNP 
Polimorfismo de base única. Qualquer variação polimórfica 
de um nucleotídeo. A maioria dos SNPs apresenta-se 
bialélicos com a frequência do menor alelo a menos de 1%. 
STR 
Repetições Consecutivas Curtas. Sequência de DNA 
arranjada em sucessão direta ou consecutivas na qual a 
unidade de repetição varia de 2 a 6 pares de bases. Os STRs 
normalmente ocorrem em regiões não-codificadoras e o 
número de unidades repetitivas pode variar de indivíduo para 
indivíduo. 
Teste de proficiência 
Medidas que visam assegurar a qualidade utilizada para 
monitorar a performance de um analista e identificar áreas 
nos quais melhorias são necessárias. Pode ser interno 
(produzidos pelo próprio laboratório) ou externo (produzidos 
por outros grupos). 
 
 
 
 
 
171 
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Zigoto 
Célula formada quando um DNA nuclear do espermatozóide 
combina com o DNA nuclear do óvulo, resultando em uma 
célula diplóide. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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-----------FIM DO CURSO----------- 
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