Imunografia Dengue

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A dengue é causada por um vírus da família dos Flavivirus que possui 4 sorotipos: VDEN1, VDEN 2, VDEN 3 e VDEN 427, 30. A infecção por qualquer um desses tipos desencadeia resposta imunitária no indivíduo e leva à formação de anticorpos e células de memória. Esta sessão do trabalho visa esclarecer como os mecanismos da imunidade humoral estão relacionados com as diferentes manifestações de dengue, enfocando as duas condições vistas na clínica: a dengue em sua forma mais branda, e a dengue hemorrágica, forma mais severa da doença. Será abordado principalmente o papel das células B e dos anticorpos formados para se explicar por que a dengue pode ser letal.
	
O vírus da dengue
O complexo VDEN é composto por quatro tipos distintos, porém relacionados, de vírus. OS VDEN 1-4 possuem epítopos que são únicos para cada sorotipo, mas apresentam também epítopos que são compartilhados por todos os tipos30. O vírus da dengue é um vírus encapsulado de RNA de fita simples positiva31. O envelope proteico desempenha função importante, uma vez que são produzidos anticorpos contra proteínas que estão presentes nele. A principais proteínas do envelope contra as quais são produzidos anticorpos são as chamadas proteína envelope (proteína E) e proteína pré-membrana (preM). Também são formados anticorpos contra proteínas não estruturais (NE), que não estão presentes no envelope, mas dentro da célula infectada27,30. 
	O vírus da dengue possui um estágio imaturo e um estágio maduro. No estágio imaturo, o envelope do vírus apresenta proteína preM e proteínas E, que quando interagem formam espículas, tornando o envelope viral mais rígido. Isso faz com que a forma imatura seja menos infecciosa. A transformação do estágio imaturo para o estágio maduro ocorre no momento da liberação do vírus de dentro da célula infectada. Ao passar pelo complexo de Golgi da célula, o vírus sofre ação da furina, enzima que cliva a proteína preM em proteína madura M24. A proteína M se arranja com a proteína E de modo a deixar o envelope em uma forma mais fluida e, assim, mais infecciosa. Esse mecanismo, no entanto, não parece ser muito eficiente, uma vez que são liberadas das células vírus na forma imatura e ou parcialmente maduros, que ainda apresentam proteína preM em sua superfície30. Embora a proteína M esteja presente na membrana dos vírus maduros, ela é completamente escondida pelos dímeros de proteína E que são formados. Sendo assim, ela é inacessível para a ligação de anticorpos24. 
A proteína E é o principal componente estrutural da parede do virus e, dentre as proteínas, é o principal alvo dos anticospos que são formados. Os anticorpos produzidos contra a proteína E são geralmente protetores e podem fazer reação cruzada com outros sorotipos do virus. A proteína E apresenta um domínio, o domínio III, que possui uma sequência de aminoácidos bastante variada entre os sorotipos. Anticorpos produzidos contra essa região desempenham o maior grau de especifidade para cada sorotipo. Os anticorpos contra a proteinna preM são produzidos devido à frequente saída de virus imaturos ou parcialmente maduros de dentro das células infectadas. Os anticorpos contra essa proteína realizam forte reação cruzada com os outros sorotipos do virus. As proteínas não estruturais são produzidas dentro da célula infectada, mas não são incorporadas na superfície do virus. No entanto, elas são apresentadas na superfície de células infectadas24, 30. 
A célula B
O principal mecanismo que vem sendo associado ao grau de severidade da dengue é o aprimoramento anticorpo-dependente (AAD), nos quais anticorpos específicos para um sorotipo fazem reação cruzada com outros tipos de VDEN e levam a uma piora no quadro. Como a resposta dos linfócitos B se relaciona intimamente com a liberação de anticorpos, pelo menos em teoria, aspectos relacionados às respostas das células B também teriam relação com a manifestação das doenças. E alguns estudos observaram exatamente isso: há um padrão diferente na respostas dessas células na primeira e segunda infecção.
A ativação dos linfócitos B se dá de maneira clássica: durante a primeira infecção, células B virgens são estimuladas e desenvolvem-se em células B antígeno-específicas. Essas células B ou se diferenciam em células de memória ou em plasmócitos. As células de memória irão residir em órgãos linfoides secundários e os plasmócitos são responsáveis pela secreção de anticorpos antígeno-específicos33. 
No processo de diferenciação, as células B passam por uma série de ciclos de proliferação e diferenciação até se tornarem células de memória ou plasmócitos. Os plasmócitos podem ser de vida curta, que estão ativos na fase aguda da doença, ou de vida longa, que migram para a medulla óssea e são responsáveis pela imunidade humoral de longo prazo. As células B de memória são as células responsáveis pela a rápida resposta ao antígeno na segunda infecção33. 
	Tem-se observado que na dengue as respostas desse grupo de células são diferentes das que ocorrem em outros tipos de infecções. O número de plasmócitos sobe muito mais rápido em pacientes com dengue do que nos pacientes com febre por outros motivos (grupo controle) – de 4 a 7 dias pós-febre em pacientes com dengue e de 15-25 dias nos pacientes controle. Na segunda infecção o número de plasmócitos é ainda maior, sugerindo a reativação de células B de memória. Essa grande formação de plasmócitos sugere uma larga produção de anticorpos3, 33. 
Tentou-se explicar essa formação de plasmócitos pelo fator ativador de célula B BAFF, que atua na ativação e sobrevivência de células B. Isso porque na dengue há um aumento de IL-10, que por sua vez induz a expressão de BAFF. Mediu-se, então, o BAFF no sangue dos pacientes com dengue na fase aguda, na fase covalescente e em pacientes febris não relacionados à dengue. Embora tenha-se observado um aumento do BAFF nos pacientes com dengue, esse aumento também ocorre em outras infecções, como na influenza. Esse surgimento tão rápido de plasmacitos continua, então, obscuro3. 
Seja como for, o que se sabe é que as células B de memória e plasmócitos de longa duração formados contra o sorotipo da primeira infecção provavelmente são mais ativados na segunda infecção. Isso explicaria por que existem, num segundo contato com a doença, linfócitos B e plasmócitos VDEN-específicos para a infecção atual em bem menos quantidade do que linfócitos B e plasmócitos VDEN-específico que fazem reação cruzada (que tinham sido formados na infecção anterior). A análise de amostras sanguíneas de pacientes com segunda infecção mostrou que há um aumento de plasmócitos VDEN-específicos para o sorotipo infetante, mas que há um aumento ainda maior de plasmacitos que realizam reação cruzada e que são específicos para o sorotipo da infecção anterior. A atividade contra formas heterólogas do VDEN chega a ser maior do que a resposta contra o próprio VDEN homólogo da presente infecção33. 
Parece haver, então, uma ativação e expansão de células B específicas durante a primeira infecção e a formação de células B de memória que fazem reação cruzada. Essas células B de memória e plasmócitos de vida longa induzidos na primeira infecção são capazes de responder mais rapidamente do que células B virgens durante a fase aguda de uma segunda infecção24, 3. O fato de as células B fazeram uma reação cruzada na segunda infecção pode ser explicado porque os antígenos contra os quais elas produzem respostas (principalmente a proteína E da capsula do vírus) possuem um alto grau de reação cruzada com os outros sorotipos de VDEN. [Persistence of Circulating Memory B Cells Clones with Potencial for Dengue Virus Disease Enhancement for dacades following infection] A persistência de células B advindas da resposta ocorrida na primeira infecção, mas que depois passavam a apresentar um caráter reativo a outros sorotipos também foi mostrado no estudo de Mathew et al. que evidenciou que na primeira infecção haviam células B precoces de memória sorotipo-específicas (de 9 a 11 dias pós infecção) e,seis meses depois, as células de memórias presentes no sangue do paciente faziam resposta cruzada. 
Observa-se, então, que os linfócitos B constituem um componente importante para a explicação de por que existem diferentes manifestações clínicas de dengue, principalmente uma maior severidade da doença na segunda infecção. Embora os trabalhos apresentados tenham adotado metodologias diferentes, todos eles mostraram esse padrão de que as células B mais abundantes na segunda infecção eram células B de reação cruzada, que eram ativadas mesmo por um sorotipo diferente daquele para o qual elas eram específicas. Isso influencia o aspecto functional dos anticorpos que serão produzidos, e a ação dos anticorpos, por sua vez, parece desempenhar papel crucial nos piores quadros de dengue3, 24, 27, 30, 33. 
Os Anticorpos
Os anticorpos têm sido apontado como os principais componentes que medeiam o aumento da severidade da dengue. Os principais alvos dos anticorpos são a proteína E, a proteína preM (ambas presentes no envelope viral) e a proteína NE1, que é não estrutural e está presente na membrana de células infectadas30. São ainda observados anticorpos contra as proteínas não estruturais NE3 e NE5, que estão presentes no interior de células infectadas, mas que se tornam acessíveis para linfócitos B quando a célula infectada sofre lise24. 
Quanto à cinética dos isótipos de anticorpos que são formados em reação a uma infecção pelo vírus da dengue, observou-se que, em uma primeira infecção, as primeiras imunoglobulinas a serem formadas são as IgM, que aparecem de 4 a 5 dias após o início do quadro febril e duram na circulação por até 3 meses. Já a IgG aparece aproximadamente uma semana após o início da febre e perdura no sangue anos após a infecção30. Essas informação vão ao encontro com as observações feitas em outro estudo, que mostraram que IgM e IgG têm um pico de 4 a 7 dias após o início do quadro febril, mostrando um aumento precoce do IgG mesmo nas primeiras infecções3. Um fato interessante observado foi que, na dengue, ao contrário do que ocorre em outras doenças, o principal anticorpo neutralizante é o IgG e não o IgM e essa observaçãoo foi feita a partir do seguinte teste: foi usada uma substância que deixava IgM não-funcionante, mas não alterava a função de IgG. Constatou-se que mesmo sem IgM, nos dias de 4 a 7 pós início da febre, a neutralização diminuiu em aproximadaente 50%, mostrando que IgG, mesmo nos primeiros dias, já é responsável por algo em torno de 50% da neutralização3. 
	As formas pelas quais os anticorpos neutralizam o vírus da dengue variam. Alguns anticorpos anti-flavivirus provavelmente neutralizam o vírus por se ligar a ele e bloquear a fixação com o receptor da célula; outros anticorpos neutralizantes bloqueiam um estágio pós fixação; e outros parecem se ligar a epítopos escondidos que são expostos transitoriamente e acabam alterando a conformação da proteína E. [Persistence of Circulating Memory B Cell with Potencial for Dengue Viral Disease Enhancement for Decades following Infection] Um modelo estabelecido por Piersen e colegas para neutralização é o modelo do patamar, no qual o número de anticorpos ligados ao vírus precisa antingir um patamar mínimo para se conseguir uma neutralização eficaz, conferindo importância tanto à afinidade quanto à quantidade do anticorpo30 
Em experimento realizado por Sabin, em 1952, foi observado que pessoas infectadas por um sorotipo específico de VDEN (VDEN 1 ou VDEN 2) ficaram protegidas contra uma reinfecção pelo mesmo sorotipo por até 18 meses (tempo que durou a pesquisa). Esses indivíduos apresentaram ainda uma reação cruzada que os protegeu contra sorotipos heterologos, porém essa proteção durava apenas de dois a três meses após a primeira infecção30. A explicação para a proteção prolongada contra o sorotipo da primainfecção se baseia na formação de células B de memória capazes de produzir os anticorpos que neutralizem o vírus. Já a proteção contra VDEN heterólogo pode ser explicada pelo fato de haver nesses primeiros meses uma alta concentração de anticorpos que não são bons neutralizantes para tipos heterólogos, mas que são capazes de formar grandes agregados vírus-anticorpo, que se ligam ao receptor inibitório FcγRIIB na superfície de monócitos. Como esses anticorpos de reação cruzada decaem ao longo do tempo, a proteção desaparece6. 
O aprimoramento anticorpo-dependente ocorre quando um anticorpo feito contra o sorotipo de VDEN da primeira infecção se liga – mas não neutraliza – o sorotipo da infecção subsequente. Essa ligação do anticorpo de forma ineficaz acaba, então, por aumentar a entrada do vírus nas células que apresentam os receptores de Fc, que normalmente seriam menos infectadas na ausência de AAD33. Esses anticorpos, então, não atingem o patamar mínimo para conseguir realizar uma neutralização eficiente. O AAD pode ser mediado por anticorpos contra a proteína E, que são semelhantes entre os tipos de vírus (VDEN 1-4, lembrando que o domínio III é bastante sorotipo específico) ou por anticorpos anti proteína preM. Algo curioso a respeito dos anticorpos anti-preM é que existe a hipótese de que os vírus que apresentam alta densidade de preM em sua membrana (vírus imaturos ou parcialmente maduros) não seriam – ou pelo menos seriam menos - infecciosos normalmente, uma vez que preM deixa o envelope mais rígido e, teoricamente, dificultaria a entrada na célula. No entanto, esses vírus se tornam infecciosos sob o AAD10. 
	Foi observado que AAD tem ações quantitativas e qualitativas em diferentes tipos de células, influenciando a taxa de infecção, a depleção do vírus e as respostas da imunidade celular. Células que passam por AAD têm uma alta taxa de liberação de IL6 e de ftor de necrose tumoral alfa (FNTα). Outras citocinas como interferon do tipo I (IFN) e IL10, no entanto, tiveram um padrão de liberação diferente dependendo da célula: das células observadas (células dentríticas imaturas e maduras, monócito, macrófago), somente monócitos que passaram por AAD secretaram IL10 - embora tenham havido variaões entre os pacientes. Ao se investigar essas variações na secreção de IL10, foi identificada uma associação entre polimorfimos no gene promotor dessa interleucina e o nível de IL10 produzido nessas células sob AAD in vitro. Isso sugere que existe um componente genético que pode estar ligado à progressão do quadro clínico da dengue. As células dendríticas imaturas não apresentaram efeito do AAD. Nas células dentríticas maduras, macrófagos e monócitos houve influência do AAD, que, dependendo do tipo celular, aumentou a infectividade do vírus de 2,5 a até 10 vezes - embora não em todas as células analisadas. Além disso, houve um aumento no número de cópias virais liberadas nessas células (menos na célula dentrítica imatura)4.
	Para testar a influência do polimorfismo do promotor da IL10 no AAD, amostras de células de cada um dos três tipos de polimorfismos que acredita-se modular a produção de IL10 foram submetidas a AAD usando um mesmo tipo de vírus e um mesmo soro imunzado. Todas as células mostraram o mesmo grau de infecção, mas mostraram graus diferentes de produção IL10, confirmando o a influência genética na produção dessa citocina. Ao se analisar a influência do tipo de receptor Fc, observou-se que quando FcϒRI e FcϒRIIa eram inibidos, a infecção e a produção de IL10 foram significativamente reduzidas, o que não aconteceu quando se inibiu os recepptores FcϒRIII4. 
Perspectivas
Quando se pensa sobre perspectivas em relação à dengue, um ponto específico logo vem à mente: a vacina. Por ser uma doença de incidência crescente, que acomete tanto crianças quanto adultos, a vacina seria uma ótima alternativa contra a doença. Algumas tentativas já estão sendo feitas, mas alguns desafios, como o fato de que quatro tipos de vacina precisam ser desenvolvidos e combinados em um só, devido aos quatro tipos de vírus causadores de dengue. É preciso também impedir a ocorrência de AAD, que acredita-se aumentar a probabilidade de ocorrênciade forma mais grave de dengue. Outro ponto a ser discutido é que a vacina precisa promover uma imunidade de longa duração, e, para isso, precisa-se ponderar qual forma do vírus usar, se atenuado, inviável ou apenas partículas virais, o que muito provavelmente levará à necessidade de a vacina ser administrada em duas doses, umas vez que essas formas virais não são tão imunogênicas quanto o vírus em sua forma selvagem natural. Conhecer o potencial de replicação das formas tetravalentes atenuadas usadas nas vacinas, conseguir uma forma barata de desenvolvimento e novas e mais aprimoradas técnicas genéticas são pontos que precisam ser esclarecidos e que são vislumbrados no futuro da vacina contra a dengue31. 
No entanto, existem outros pontos nos quais pensar. Na ativação de linfócitos B, o aumento precoce de plasmócitos parece ainda não estar elucidado e essa é uma característica bem típica da infecção por dengue. Nos exames laboratoriais, os médicos deveriam atentar para a contagem de plasmócitos, que aparece alta em torno de sete dias após o paciente se queixar da febre. Esse tempo é relativamente rápido quando comparado com outras infecções, nas quais os plasmócitos só aumentam de 11 a 14 dias após a queixa de febre. [Persistence of Circulating Memory B Cells Clones with Potencial for Dengue Virus Disease Enhancement for dacades following infection] O que é evidenciado em um hemograma, no entanto ainda não foi evidenciado na ciência. Como foi apresentado, foi estudado se o fator estimulante de células B BAFF teria alguma relação com esse aumento precoce de plasmócitos, mas nenhuma informação conclusiva foi obtida. Sabe-se que a diferenciação de células B em plasmócito é dependente da atividade de diferentes fatores transcricionais. A parda da expressão de Pax-5 e repressão de Bcl-6 são responsáveis pelo bloqueio do desenvolvimento de célula B madura e pela expressão de Blimp-1, respectivamente. O Blimp-1, juntamente com o ativador transcricional IRF4 são essenciais para a expressão e recombinação de outro fator de transcrição, o XBP-1. O XBP-1 contribui na maturação dos plasmócitos e aumento na síntese de imunoglobulinas por essas células. Células B que apresentam uma alta quantidade de IRF4 tendem a se diferenciar em plasmócitos1. Um ponto de pesquisa seria investigar se os sorotipos de VDEN causam alguma hiper-expressão de IRF4 nas células B ou se atuam em algum outro momento acelerando essa cascata de reações. Isso explicaria por que os plasmócitos aumentam de número tão rapidamente na dengue. Caso fosse descoberto algo em relação isso, um possível benefício seria o seguinte: poderia ser desenvolvido teste diagnóstico mais rápido e eficaz que detectasse a presença desse(s) possível(is) fator(es) viral(is) que encaminha(m) células B para a diferenciação em plasmócitos. Ou ainda um teste que detectasse proteínas que são expressas pela célula B quando sob ação desse(s) possível(is) fator(es) viral(is). 
No entanto, o novo teste para diagnóstico da dengue, que detecta a presença da proteína NE1 já está sendo utilizada em hospitais no Brasil e pode diagnosticar a doença do primeiro ao nono dia após a febre, com índices de sensibilidade de 64,8% a 85,1% e especificidade de 95,3% a 99,7%17. Então, uma perspectiva mais útil é a criação de uma terapêutica mais eficaz para a doença. Pensando nisso, um possível alvo terapêutico seria o anticorpo anti preM. Esse anticorpo é o principal responsável pelas reações cruzadas que promovem o AAD, havendo ainda a possibilidade de ele tornar infectante aqueles vírus que normalmente não seriam, devido à presença de preM que torna membranas desses vírus menos flexíveis. Uma terapia que bloqueasse a ação desses anticorpos provavelmente diminuiria o AAD e diminuiria o risco de uma manifestações graves – como dengue hemorrágica – em uma segunda infecção. [Persistence of Circulating Memory B Cells Clones with Potencial for Dengue Virus Disease Enhancement for dacades following infection]