GENETICA 3

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ROTEIRO DO LABORATÓRIO 
MORFOFUNCIONAL 
CURSO DE MEDICINA 
Orientadores: 
Profª Arannadia Barbosa 
Prof. Matheus Alves 
Profª Maiara Marques 
Profª Roberta Carvalho 
 
REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO 
 
 
OBJETIVOS: 
● Compreender os processos de replicação, transcrição e tradução. 
● Conhecer ferramentas utilizadas no diagnóstico molecular (PCR). 
 
 
 
 
 
 
 
1) UTILIZANDO O LIVRO DE GENÉTICA, EXPLIQUE SOBRE OS SEGUINTES PROCESSOS: 
A) REPLICAÇÃO 
 
Fonte: GRIFFITHS, Anthony J F.; DOEBLEY, John; PEICHEL, Catherine; et al. Introdução à Genética. Rio de Janeiro: Grupo 
GEN, 2022. E-book. ISBN 9788527738682. 
 
 
O modelo de replicação semiconservativa proposto por Watson e Crick explica que a dupla-
hélice do DNA se desenrola, e cada fita serve como molde para a síntese de uma nova fita 
complementar, resultando em duas moléculas de DNA idênticas, cada uma contendo uma fita 
original e uma nova. Outras hipóteses, como a replicação conservativa (mantendo a dupla-hélice 
original intacta) e dispersiva (fitas formadas por segmentos mistos de DNA original e novo), também 
foram sugeridas. 
O experimento de Meselson e Stahl em 1958 forneceu evidências para a replicação 
semiconservativa. Eles cultivaram bactérias com nitrogênio pesado (^15N) e, depois, transferiram 
para meio com nitrogênio leve (^14N), analisando o DNA por centrifugação em gradiente de cloreto 
de césio para separar as moléculas pelo peso. Após uma e duas gerações, observaram padrões 
que confirmaram o modelo semiconservativo, descartando o modelo conservativo e diferenciando-
se do dispersivo. 
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO: Em 1963, John Cairns investigou o local de início da 
replicação no cromossomo bacteriano usando timidina marcada com trítio (3H). Por 
autorradiografia, ele visualizou que a replicação começa em um único ponto e avança 
bidirecionalmente, formando uma estrutura em forma de theta, com as forquilhas de replicação se 
movendo ao redor do cromossomo circular. Cairns demonstrou ainda que cada molécula filha 
contém uma fita radioativa e uma fita não radioativa, confirmando o modelo semiconservativo e a 
replicação bidirecional simultânea das duas fitas do DNA 
 
 
 
 
 
FRAGMENTOS DE OKAZAKI 
São pequenos pedaços de DNA que são formados durante a replicação do DNA na fita 
descontínua, também chamada de fita tardia ou lagging strand. 
Na replicação, a dupla hélice de DNA é desenrolada e cada fita serve como molde para a síntese 
da nova fita complementar. Como a DNA polimerase só pode sintetizar DNA na direção 5' para 3', 
a replicação ocorre de formas diferentes em cada fita: 
 Na fita líder (leading strand), a síntese ocorre de maneira contínua, acompanhando o 
desenrolamento do DNA. 
 Na fita descontínua, a orientação da fita molde é 3' para 5', o que impede a síntese contínua. 
Para contornar isso, a síntese ocorre em pequenos fragmentos curtos chamados 
fragmentos de Okazaki, sintetizados na direção 5' para 3', mas de forma descontínua. 
Cada fragmento de Okazaki começa com um primer de RNA sintetizado pela primase, que é 
depois removido e substituído por DNA. Os fragmentos são depois ligados entre si pela enzima 
DNA ligase, formando uma fita contínua. 
Em procariotos, os fragmentos têm cerca de 1.000 a 2.000 nucleotídeos; em eucariotos, são 
menores, entre 100 e 200 nucleotídeos. 
Esse processo de síntese descontínua na fita lagging é essencial porque respeita a direção 
química obrigatória da DNA polimerase e permite que a replicação do DNA aconteça de forma 
eficiente e coordenada nos dois filamentos da dupla hélice 
TOPOISOMERASES 
São enzimas que atuam para aliviar as torções e superenrolamentos do DNA durante processos 
como replicação, transcrição e compactação do material genético. 
Elas são classificadas em dois tipos principais: 
Topoisomerase Tipo I 
 Faz cortes temporários em uma única fita da molécula de DNA. 
 Permite que a fita cortada gire livremente para aliviar as tensões, e depois religam a fita. 
 Alteram o número de ligações de giro do DNA em incrementos de um. 
 Normalmente, não dependem de ATP. 
 Subdivididas em: 
 Tipo IA: Exemplo, topoisomerase I e III bacterianas. 
 Tipo IB: Comuns em eucariotos, atuam controlando a rotação da hélice ao redor da 
quebra. 
 Tipo IC: Menos comuns, com mecanismos específicos. 
Topoisomerase Tipo II 
 Promovem cortes temporários em ambas as fitas da molécula de DNA. 
 Passam outra helicoidal de DNA pelo corte antes de religar as fitas, alterando o número de 
giros em múltiplos de dois. 
 São dependentes de ATP para suas funções. 
 Exemplos incluem a DNA girase (bacteriana), a topoisomerase IV (bacteriana), e as 
topoisomerases IIα e IIβ em eucariotos. 
 Podem relaxar tanto superenrolamentos positivos quanto negativos. 
Essas enzimas são essenciais para o funcionamento celular normal, e também são alvos 
importantes de fármacos antibióticos e antitumorais devido ao seu papel crucial no metabolismo 
do DNA. 
 
 
DETERMINAÇÃO DA ORIGEM E ESTRUTURA DA REPLICAÇÃO 
 Em bactérias, a replicação começa em um ponto fixo chamado oriC. 
 O cromossomo é circular e a replicação se dá de forma bidirecional, abrindo duas forquilhas 
que se movem em direções opostas ao redor do cromossomo. 
 Autorradiografias feitas por Cairns mostraram essa estrutura de replicação em forma de letra 
grega theta. 
ABERTURA DA DUPLA HÉLICE E ESTABILIZAÇÃO DAS FITAS SIMPLES 
 Helicases são enzimas que usam energia do ATP para separar as fitas de DNA rompendo 
as ligações de hidrogênio. 
 As fitas simples expostas são estabilizadas por proteínas chamadas SSB (Single-Stranded 
Binding proteins) que evitam que as fitas se enrollarem novamente. 
 A abertura da dupla hélice gera torção e superenrolamento à frente da forquilha de 
replicação, que são aliviados pela ação das topoisomerases (como a DNA girase), que 
cortam e religam as fitas do DNA para aliviar a tensão. 
MONTAGEM DO REPLISSOMO: INICIAÇÃO DA REPLICAÇÃO 
 A replicação começa com a ligação da proteína DnaA às sequências chamadas caixas 
DnaA na origem oriC. 
 Esse complexo promove o desenovelamento do DNA em uma região rica em pares AT (mais 
fácil de separar). 
 A seguir, ocorre o recrutamento da helicase DnaB, que se liga e desliza para desenrolar a 
dupla hélice na forquilha de replicação. 
 Outros componentes do replissomo (complexo multiproteico que realiza replicação) são 
recrutados para formar a máquina replicativa. 
SÍNTESE DO DNA: PAPEL DAS DNA POLIMERASES 
 As DNA polimerases catalisam a adição de nucleotídios à extremidade 3' da cadeia 
crescente, usando a fita molde simples. 
 A reação usa os quatro dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) que se ligam conforme a 
complementaridade das bases (A-T e G-C). 
 A energia proveniente da clivagem do pirofosfato (PPi) é usada para promover a formação 
da ligação fosfodiéster entre nucleotídios. 
SÍNTESE DAS FITAS PRINCIPAL E DESCONTÍNUA (SEMIDESCONTÍNUA) 
 A fita que é sintetizada na mesma direção da abertura da forquilha é chamada de fita 
principal e é produzida de forma contínua. 
 A fita sintetizada na direção oposta é chamada de fita descontínua e é formada por 
pequenos fragmentos chamados fragmentos de Okazaki. 
 A síntese descontínua ocorre porque a DNA polimerase só pode adicionar nucleotídios no 
sentido 5' → 3'. 
NECESSIDADE DE PRIMERS 
 A DNA polimerase não pode iniciar a síntese sozinha, e necessita de um primer de RNA 
sintetizado pela primase. 
 Esses primers fornecem uma extremidade 3' livre para o início da síntese. 
 Cada fragmento de Okazaki começa com um primer. 
REMOÇÃO DOS PRIMERS E UNIÃO DOS FRAGMENTOS 
 A DNA polimerase I remove os primers de RNA e preenche as lacunas com DNA. 
 A DNA ligase então une os fragmentos de Okazaki, formando uma fita contínua na fita 
descontínua. 
 
 
CORREÇÃO DE ERROS E FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO 
 As DNA polimerases I e III possuem atividade de exonuclease 3'→5' que permite a remoção 
de bases pareadas incorretamente após incorporação (atividadede proofreading). 
 A alta precisão da replicação é garantida por essa função de revisão e por mecanismos 
posteriores de reparo do DNA. 
ORGANIZAÇÃO MOLECULAR DO REPLISSOMO 
 O replissomo é um complexo multiproteico que inclui duas unidades de DNA polimerase III 
para sintetizar as fitas principal e descontínua simultaneamente. 
 Proteínas acessórias, como o grampo β e o carregador de grampo (complexo τ), garantem 
que a polimerase fique ligada ao DNA, aumentando a eficiência. 
 A fita descontínua é sintetizada em alças para permitir coordenação com a fita principal. 
REPLICAÇÃO EM EUCARIOTOS 
 O mecanismo básico é semelhante ao bacteriano. 
 Há múltiplas origens de replicação distribuídas pelo genoma (ex: 40.000 a 80.000 em 
humanos). 
 O complexo de reconhecimento de origem é o ORC. 
 Proteínas como Cdc6 e Cdt1 ajudam no recrutamento dos componentes do replissomo. 
 A replicação está estritamente regulada para ocorrer apenas uma vez por ciclo celular. 
REPLICAÇÃO DOS TELÔMEROS E A AÇÃO DA TELOMERASE 
 Em cromossomos lineares, a replicação da fita descontínua não consegue copiar 
completamente as extremidades (problema da lacuna terminal). 
 Os telômeros são sequências repetitivas nas extremidades que protegem os cromossomos 
contra perda de informações. 
 A telomerase, uma ribonucleoproteína com transcriptase reversa, adiciona essas 
sequências repetidas usando um RNA interno como molde. 
 A telomerase previne o encurtamento cromossômico, ligado a processos de envelhecimento 
e câncer. 
 
Os telômeros estabilizam os cromossomos associando-se às proteínas para formar uma estrutura 
que “esconde” as extremidades dos cromossomos do mecanismo de reparo do DNA da célula 
Apesar das células germinativas produzirem muita telomerase, as células somáticas geram pouca 
ou nenhuma, o que faz com que seus cromossomos encurtem a cada divisão celular até a célula 
entrar em senescência. Isso sugere uma ligação entre o encurtamento dos telômeros e o 
envelhecimento. Doenças de envelhecimento prematuro, como a síndrome de Werner e a 
disqueratose congênita, estão associadas a telômeros anormalmente curtos e mutações em genes 
relacionados à manutenção dos telômeros. 
Além disso, cerca de 80% das células cancerosas apresentam atividade elevada da telomerase, o 
que contribui para sua capacidade de crescer indefinidamente, tornando-as "imortais". Por isso, 
fármacos que inibem a telomerase estão sendo desenvolvidos para atacar seletivamente células 
cancerosas, explorando essa diferença entre células normais e tumorais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
. 
TRANSCRIPTASE REVERSA 
A transcriptase reversa é uma enzima que realiza a transcrição reversa, ou seja, ela sintetiza DNA a partir de um 
molde de RNA, ao contrário do processo normal onde o DNA serve de molde para formar RNA. Essa enzima é 
típica dos retrovírus, como o HIV, que usam o RNA viral para produzir DNA viral dentro da célula hospedeira. O 
DNA produzido é então incorporado ao genoma da célula, permitindo a produção dos vírus. 
Após o vírus entrar na célula hospedeira, a transcriptase reversa sintetiza uma fita de DNA complementar ao RNA 
viral. Em seguida, a enzima degrada o RNA original e forma uma segunda fita, resultando em DNA de fita dupla. 
Esse DNA viral é então transportado para o núcleo celular, onde é integrado ao genoma da célula hospedeira pela 
enzima integrase. Uma vez integrado, o DNA viral pode ser transcrito e traduzido para produzir novos vírus, 
permitindo a multiplicação do HIV dentro da célula infectada. 
Além do ciclo viral, a transcriptase reversa é uma ferramenta essencial em biologia molecular para a síntese de 
DNA complementar (cDNA) a partir de RNA, utilizada, por exemplo, na técnica RT-PCR para estudo da expressão 
gênica. 
Enquanto o PCR tradicional amplifica sequências de DNA, a transcriptase reversa permite converter RNA em DNA 
complementar (cDNA), que pode então ser amplificado por PCR. 
Isso é fundamental para o estudo e detecção de RNA, especialmente no caso de vírus de RNA (como HIV e SARS-
CoV-2) e na análise da expressão gênica a partir de RNA mensageiro (mRNA). A transcriptase reversa sintetiza o 
cDNA a partir do RNA molde, possibilitando a amplificação específica do material genético inicialmente em RNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B) TRANSCRIÇÃO 
 
Fonte: BERG, Jeremy M.; TYMOCZKO, John L.; J., Jr. Gatto G.; STRYER, Lubert. Bioquímica. [Digite o Local da Editora]: Grupo GEN, 2021. 
 
 
1. Iniciação da transcrição 
 A transcrição ocorre no núcleo, onde o DNA está empacotado em cromatina. 
 As três RNA polimerases (I, II e III) não reconhecem o DNA promotor sozinhas e precisam 
de fatores gerais de transcrição (GTFs). 
 Para a RNA polimerase II (que transcreve mRNA), o processo inicia com a ligação do 
complexo TFIID ao promotor, especificamente a proteína TBP (TATA Binding Protein) que 
reconhece a caixa TATA (se presente). 
 Outros GTFs (TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH) são recrutados sequencialmente, formando o 
complexo de pré-iniciação (PIC). 
 TFIIH possui atividade helicase que desenrola a dupla hélice do DNA e também fosforila o 
domínio carboxiterminal (CTD) da RNA polimerase II para ativá-la e iniciar a transcrição. 
2. Alongamento (elongação) 
 A RNA polimerase II faz a síntese de RNA complementar à fita molde do DNA, incorporando 
ribonucleotídeos na direção 5' para 3'. 
 Durante o alongamento, a RNA polimerase desenrola o DNA à frente e permite o pareamento 
complementar das bases (A-U, G-C). 
 O CTD da RNA pol II sofre modificações (fosforilação, desfosforilação) que regulam o 
processamento do RNA em andamento, incluindo splicing, adição de cap e poliadenilação. 
 Fatores de alongamento, como P-TEFb, regulam a progressão da transcrição, liberando a 
polimerase de pausas iniciais causadas por fatores como NELF e DSIF. 
3. Término da transcrição 
 A terminação difere conforme a RNA polimerase. 
 Para a RNA pol II, a terminação envolve clivagem do pré-mRNA num local específico seguido 
da adição de uma cauda poli(A) na extremidade 3'. 
 Dois modelos explicam a terminação: o modelo "torpedo", em que uma éxonuclease degrada 
o RNA remanescente até a dissociação da RNA pol, e o modelo "alostérico", onde 
modificações conformacionais induzem a liberação da polimerase. 
 A RNA pol I termina após elementos terminadores específicos, enquanto a RNA pol III 
termina após a síntese de uma sequência poli(U). 
4. Processamento do RNA 
 O RNA transcrito (pré-RNA) é modificado antes de sair do núcleo. 
 No caso do mRNA produzido pela RNA pol II, acontece: 
 Adição de uma "capa" (cap) na extremidade 5', que protege o RNA e facilita a 
tradução. 
 Splicing, em que íntrons são removidos e éxons são unidos. 
 Poliadenilação na extremidade 3', com adição da cauda poli(A), essencial para 
estabilidade e tradução. 
5. Características das RNA polimerases em eucariotos 
 RNA pol I: Sintetiza rRNAs grandes (18S, 5.8S e 28S) no nucléolo, usando promotores UCE 
e Core ligados por fatores proteicos como UBF e SL1. 
 RNA pol II: Sintetiza mRNAs e certos ncRNAs, reconhece vários elementos do promotor 
(caixa TATA, Inr, DPE, BRE), coordenado por múltiplos GTFs. 
 RNA pol III: Transcreve tRNA, 5S rRNA e outros ncRNAs menores, usando três tipos 
diferentes de promotores e fatores de transcrição específicos (TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC). 
 
 
A informação que 
controla a iniciação da 
transcrição pela RNA 
polimerase I está 
contida nas 
sequências 
promotoras de rDNA 
(UCE e Core) que 
estão localizadas 
ascendentemente em 
relação ao local de 
início da transcrição 
(11) e são ligadas por fatores proteicos (UBF e SL1). Um terceiro fator, TIF-1A, não se liga 
diretamente ao DNA, mas é importante para o recrutamento e a função da RNA polimerase I. UCE 
5 elemento de controle ascendente, UBF 5 fator de ligação ascendente, TBP 5 proteína de ligação 
a TATA, SL1 5 fator de seletividade 1, TIF-1A 5 fatorde iniciação da transcrição 1A. 
 
 A iniciação da transcrição pela 
RNA polimerase II é dirigida por 
uma variedade de elementos 
promotores, incluindo BRE, a 
caixa TATA, Inr e DPE, 
localizados dentro de 100 pares 
de bases ascendente ou 
descendentemente em relação 
ao local de início da transcrição 
(11). A montagem do PIC ocorre 
de forma sequencial, 
começando com TFIID, que 
contém proteínas (TBP e TAFs) 
que se ligam a elementos 
promotores. A montagem de 
TFIID leva ao recrutamento dos outros GTFs e da RNA polimerase II. O TFIIH é necessário durante 
a iniciação para abrir a bolha de transcrição e a fosforilação do CTD. Logo após a iniciação, o pré-
mRNA é capeado e o alongamento é promovido pela P-TEFb quinase, que fosforila a RNA 
polimerase II CTD, DSIF e NELF 
 
 
A RNA polimerase III 
transcreve genes com três 
tipos de promotores, Tipos 1, 2 
e 3 (a–c). Os TFIIIA, TFIIIC e 
SNAPc ligam-se a elementos 
promotores (IE, Box B e PSE, 
respectivamente) que são 
únicos para cada tipo de gene 
da RNA polimerase III e podem 
ser vistos como os fatores de 
especificidade para o tipo de 
gene. A principal função desses fatores é recrutar TFIIIB para o promotor, que então leva ao 
recrutamento da RNA polimerase III e ao início da transcrição. 
TIPOS DE RNA POLIMERASE E RNA PRODUZIDOS 
 Existem três tipos de RNA polimerases: 
 RNA polimerase I: produz rRNA 45S (ribossomal, que faz parte dos ribossomos). 
 RNA polimerase II: produz mRNA (mensageiro), além de alguns RNA nucleares 
pequenos. 
 RNA polimerase III: produz rRNA 5S, tRNA (transportador) e outros RNA pequenos. 
Cada polimerase responde de forma diferente ao veneno α-amanitina, proveniente do fungo 
Amanita phalloides. 
COMO OS FATORES DE TRANSCRIÇÃO RECONHECEM ONDE SE LIGAR NO DNA? 
 O DNA tem duas “faixas” onde as moléculas de proteínas podem se ligar: essas faixas são 
chamadas de sulco maior e sulco menor da dupla hélice do DNA. 
 O sulco maior é mais largo e contém mais informações químicas para que as proteínas 
possam identificar sequências específicas do DNA. 
 O sulco menor é mais estreito e oferece menos informações químicas para ligarem-se com 
especificidade. 
 
C) TRADUÇÃO 
 
Fonte: BERG, Jeremy M.; TYMOCZKO, John L.; J., Jr. Gatto G.; STRYER, Lubert. Bioquímica. [Digite o Local da Editora]: 
Grupo GEN, 2021. 
 
A tradução é realizada por ribossomos que se movem ao longo do mRNA na direção 59-para-39. 
Os tRNAs trazem aminoácidos para o ribossomo e seu par de bases de anticódons para os códons 
do mRNA. Um aminoácido de entrada se liga à extremidade amino da crescente cadeia 
polipeptídica no ribossomo. O processo de tradução pode ser dividido em três fases: iniciação, 
alongamento e término. Além do ribossomo, mRNA e tRNAs, outras proteínas (fatores) são 
necessárias para cada fase. 
 
INÍCIO 
A principal tarefa da iniciação é colocar o primeiro aminoacil-tRNA no sítio P do ribossomo e, dessa forma, 
estabelecer o quadro de leitura correto do mRNA. Na maioria das bactérias e em todos os eucariotos, o 
primeiro aminoácido em qualquer polipeptídio recém-sintetizado é a metionina (Met), especificada pelo 
códon de iniciação AUG. 
Em bactérias, os códons de iniciação AUG no mRNA são precedidos por uma sequência especial chamada 
sequência Shine-Dalgarno, também conhecida como sítio de ligação ao ribossomo (RBS), que forma pares 
de bases com a extremidade 39 do rRNA 16S na subunidade ribossômica 30S (Figura 9.17). Esse 
pareamento de bases posiciona corretamente o AUG no sítio P ao qual o tRNA iniciador se ligará. O mRNA 
pode interagir apenas com uma subunidade 30S que está dissociada do resto do ribossomo. Observe 
novamente que o rRNA desempenha a função-chave para garantir que o ribossomo esteja no lugar certo 
para iniciar a tradução. Uma vez que o tRNA iniciador é ligado, a subunidade ribossômica 50S se liga para 
formar o complexo de iniciação 70S. 
Em eucariotos, a iniciação da tradução envolve a ligação da subunidade ribossômica 40S à extremidade 59 
capeada de um mRNA, seguida pela varredura da 59 UTR em busca de um códon de iniciação AUG. O 
capuz 59 (m7G) que é adicionado aos 59 mRNA durante a transcrição (descrito no Capítulo 8) é diretamente 
ligado por um fator de iniciação da tradução, que por sua vez se liga a outros fatores de iniciação para 
recrutar a subunidade ribossômica pequena para o mRNA. O ribossomo subsequentemente faz a varredura 
do mRNA na direção de 59-para-39 até encontrar o primeiro códon AUG. Em 5% a 10% dos casos, o 
ribossomo contornará o primeiro AUG e iniciará no segundo, no terceiro ou no AUG subsequente. Marilyn 
Kozak descobriu que o desvio ocorre porque a sequência em torno do códon AUG afeta a eficiência de seu 
uso na iniciação. Kozak descobriu que é comum que a sequência CC(A23/G) CCA11 UGG14, chamada de 
sequência Kozak, envolva os AUGs iniciais, e estudos de mutagênese mostraram que o A em 23 e o G em 
14 são particularmente importantes para especificar o códon de iniciação AUG. 
ALONGAMENTO 
Durante o alongamento da tradução, o ribossomo funciona como uma fábrica, repetindo as mesmas etapas 
indefinidamente. O mRNA atua como um modelo, especificando a entrega de tRNAs, cada um levando como 
carga um aminoácido. Cada aminoácido é adicionado à cadeia polipeptídica em crescimento, enquanto o 
tRNA desacilado é reciclado ao ser carregado com outro aminoácido. 
Um aminoacil-tRNA é formado pela ligação covalente de um aminoácido à extremidade 39 de um RNA que 
contém o anticódon correto. Antes que os aminoacil-tRNAs possam ser usados na síntese de proteínas, eles 
se associam ao fator proteico EF-Tu para formar um complexo ternário composto de EF-Tu, GTP e 
aminoacil-tRNA. O ciclo de alongamento começa com fMet-tRNAfMet no sítio P e com o sítio A pronto para 
aceitar um complexo ternário. 
O reconhecimento de códon-anticódon no centro de decodificação da subunidade pequena determina qual 
dos diferentes complexos ternários aceitar. Quando a combinação correta foi feita, o ribossomo muda de 
forma, EF-Tu hidrolisa GTP em GDP e deixa o complexo ternário, e os dois aminoácidos são justapostos no 
centro de peptidiltransferase da subunidade grande. Lá, uma ligação peptídica é formada com a 
transferência de fMet no sítio P para o aminoácido no sítio A. 
Em eucariotos, os fatores de 
alongamento análogos são eEF1a e 
eEF2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TÉRMINO 
O ciclo de alongamento continua até que o códon no sítio A seja um dos três códons de parada: UGA, UAA 
ou UAG. Os tRNAs não reconhecem esses códons; em vez disso, proteínas chamadas fatores de liberação 
(RFs) reconhecem os códons de parada. 
Assim como a estrutura de EF-G imita a estrutura de um complexo ternário, RF1 e RF2 imitam a estrutura 
de um tRNA. Em bactérias, RF1 reconhece UAA ou UAG, enquanto RF2 reconhece UAA ou UGA. A 
interação entre RF1 ou RF2 e o sítio A difere daquela do complexo ternário de duas maneiras importantes. 
Primeiro, os códons de parada são reconhecidos por tripeptídeos nas proteínas de RF, não por um 
anticódon. Em segundo lugar, os RFs se encaixam no sítio A da subunidade 30S, mas não participam da 
formação da ligação peptídica. Em vez disso, uma molécula de água entra no centro da peptidiltransferase 
e sua presença leva à liberação do polipeptídeo do tRNA no sítio P. Após a liberação da cadeia peptídica, 
RF3 promove a liberação de RF1 ou RF2 do ribossomo. A hidrólise de GTP em GDP está envolvida na 
liberação de RF3 do ribossomo. Em eucariotos, o término da tradução é muito semelhante; eRF1 reconhece 
códons de parada e eRF3 estimula a liberação da cadeia de peptídeo por eRF1. No entanto, ao contrário 
das bactérias, o eRF1 reconhece todos os três códons de parada (UAA, UAG e UGA). 
 
 
 
 
 
 
 
As tecnologias de PCR são “atalhos” para muitas aplicações que necessitam de grande quantidade de uma sequência 
de DNA específica. Esses procedimentos permitem que os cientistas obtenham dados estruturais definitivos sobre 
genes e sequênciasde DNA quando há pouco DNA. Uma aplicação importante é no diagnóstico de doenças humanas 
hereditárias, sobretudo em casos de diagnóstico pré-natal, nos quais o DNA fetal disponível é limitado. Uma 
segunda aplicação importante ocorre em casos forenses de identificação de pessoas pelo DNA isolado de amostras 
muito pequenas de tecido. Poucos critérios oferecem dados mais definitivos sobre a identidade que as sequências de 
DNA. Graças à amplificação por PCR, é possível identificar as sequências de DNA em diminutas quantidades de 
DNA isoladas de algumas gotas de sangue, sêmen ou até mesmo fios de cabelo humanos. Assim, a PCR do perfil de 
DNA (análise da impressão digital do DNA) tem papel importante nos casos jurídicos em que há dúvida sobre a 
identidade de uma pessoa. 
 
2) A AMPLIFICAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE DNA PELA REAÇÃO DA CADEIA DE 
POLIMERASE (PCR) POSSUI TRÊS ETAPAS, UTILIZANDO O LIVRO DE GENÉTICA, 
DESCREVA CADA UMA DELAS. 
 
FIGURA 14.6 Uso da PCR para amplificar as moléculas de DNA in vitro. Cada ciclo de amplificação tem três etapas: (1) 
desnaturação do DNA genômico analisado, (2) anelamento do DNA desnaturado com iniciadores oligonucleotídicos sintetizados 
quimicamente com sequências complementares aos locais em lados opostos da região de DNA de interesse, e (3) replicação 
enzimática da região de interesse por Taq polimerase. 
Fonte: SNUSTAD, D P.; SIMMONS, Michael J. Fundamentos de Genética, 7ª edição. [Digite o Local da Editora]: Grupo 
GEN, 2017. 
 
1. Eletroforese em Gel 
 Objetivo: Separar fragmentos de DNA, RNA ou proteínas com base no tamanho e carga. 
 Funcionamento: 
 O gel (geralmente de agarose para DNA e poliacrilamida para RNA e proteínas) é 
uma matriz que funciona como uma peneira molecular. 
 Aplica-se uma voltagem elétrica: as moléculas carregadas negativamente (DNA e 
RNA) migram em direção ao pólo positivo (ânodo). 
 Fragmentos menores atravessam a matriz mais facilmente e migram mais rápido e 
longe no gel do que os maiores. 
 Após a corrida, utiliza-se corantes específicos (brometo de etídio para DNA) que 
fluorescem sob luz UV para visualizar as bandas, que indicam o tamanho dos 
fragmentos. 
2. Blotting (Southern, Northern e Western) 
 Objetivo: Detectar moléculas específicas de DNA (Southern), RNA (Northern) ou proteínas 
(Western) em uma mistura complexa. 
 Funcionamento: 
 Depois da eletroforese, as moléculas são transferidas para uma membrana de alta 
afinidade mantendo a organização. 
 Uma sonda específica (ácido nucleico marcado radioativamente para Southern e 
Northern; anticorpos marcados para Western) é aplicada para hibridizar (no caso de 
DNA/RNA) ou ligar-se (no caso de proteínas) às moléculas alvo. 
 A detecção ocorre por autorradiografia (para sondas radioativas) ou 
quimioluminescência/fluorescência (para anticorpos). 
 Isso permite visualizar a presença e o tamanho específico da molécula de interesse. 
3. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 
 Objetivo: Amplificar, de forma rápida e específica, uma sequência-alvo de DNA in vitro. 
 Funcionamento: 
 Usa primers curtos complementares às extremidades da região de interesse no DNA 
molde. 
 Três etapas principais por ciclo: 
 Desnaturação (95°C): separação das fitas do DNA molde. 
 Hibridização (50-65°C): primers se ligam às suas sequências 
complementares. 
 Extensão (72°C): a Taq DNA polimerase sintetiza novas fitas estendendo os 
primers. 
 Após vários ciclos (tipicamente 25-30), ocorre amplificação exponencial do 
fragmento-alvo. 
 ETAPAS: 
1. Desnaturação 
 A mistura de reação é aquecida a aproximadamente 95°C por cerca de 20 a 30 
segundos. 
 O calor separa as duas fitas da dupla hélice de DNA, quebrando as ligações de 
hidrogênio entre as bases, resultando em duas fitas simples que servirão como 
moldes para a amplificação. 
2. Anelamento (Hibridização) 
 A temperatura é reduzida para cerca de 50-65°C, permitindo que os primers (curtas 
sequências de DNA projetadas para se ligar a regiões específicas do molde) se fixem 
em suas sequências complementares nas fitas simples de DNA. 
 Essa etapa é crucial para a especificidade da PCR, pois define o início da síntese do 
novo DNA. 
3. Extensão (Polimerização) 
 A temperatura sobe para cerca de 72°C, que é a temperatura ótima para a ação da 
DNA polimerase termoestável (geralmente a Taq polimerase). 
 A DNA polimerase adiciona nucleotídeos complementares à sequência molde, 
estendendo a partir do primer e sintetizando a nova fita de DNA na direção 5' para 3'. 
Cada ciclo duplica a quantidade da sequência de DNA-alvo, levando a uma amplificação 
exponencial. Após 20 a 40 ciclos, bilhões de cópias podem ser produzidas em poucas horas. 
Elementos essenciais da PCR: 
 DNA molde: a sequência de DNA que se deseja amplificar. 
 Primers: oligonucleotídeos curtos que delimitam a região alvo. 
 DNA polimerase termoestável: enzima que resiste às altas temperaturas e sintetiza o DNA. 
 dNTPs (desoxinucleotídeos trifosfatos): os blocos de construção do novo DNA. 
 Tampão e íons: mantêm as condições químicas ideais para a reação 
4. Conversão de mRNA em cDNA (RT-PCR) 
 Objetivo: Converter o mRNA em DNA complementar para permitir amplificação e análise. 
 Funcionamento: 
 Usa-se a transcriptase reversa que sintetiza uma fita de cDNA a partir do molde de 
RNA (mRNA). 
 Um primer oligo-dT se liga à cauda poli-A do mRNA para iniciar a síntese. 
 Depois, a fita de RNA é removida e a DNA polimerase I completa a fita dupla de DNA 
(cDNA). 
 O cDNA pode ser usado como molde para PCR. 
5. Construção de DNA Recombinante (Clonagem) 
 Objetivo: Inserir um fragmento de DNA (inserto) em um vetor para estudo ou expressão. 
 Funcionamento: 
 Fragmentos de DNA e vetores são cortados com enzimas de restrição que geram 
extremidades compatíveis. 
 O inserto e o vetor são misturados, as extremidades adesivas se pareiam e a DNA 
ligase sela as ligações fosfodiéster, formando uma molécula recombinante. 
 A molécula recombinante é então introduzida em bactérias (transformação), onde é 
replicada. 
6. Introdução do DNA Recombinante em Células (Transformação, Transdução, Infecção) 
 Transformação: Células competentes absorvem o DNA desnudo do meio (via cloreto de 
cálcio ou eletroporação). 
 Transdução: Vetores são incorporados em partículas virais que infectam bactérias. 
 Infecção: Bacteriófagos infectam diretamente a célula com DNA recombinante e geram 
novas partículas virais. 
7. Triagem de Bibliotecas Genômicas e de cDNA 
 Objetivo: Encontrar clones que contenham o gene de interesse. 
 Funcionamento: 
 Colônias bacterianas contendo diferentes clones são transferidas para membranas. 
 As células são lisadas e o DNA é desnaturado na membrana. 
 A membrana é incubada com uma sonda marcada que é complementar ao gene de 
interesse. 
 Clones positivos que hibridizam com a sonda são identificados por sinal radioativo ou 
fluorescente. 
8. Sequenciamento de DNA por Método Didesóxi (Sanger) 
 Objetivo: Determinar a sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA. 
 Funcionamento: 
 Uma reação de síntese de DNA em quatro tubos com primer, DNA molde, DNA 
polimerase, e uma mistura de nucleotídeos normais e didesoxinucleotídeos 
(ddNTPs), que terminam a síntese ao serem incorporados. 
 Cada tipo de ddNTP (A, T, C, G) é incorporado em uma reação separada. 
 Resultam fragmentos de diferentes comprimentos terminando em cada base. 
 Os fragmentos são separados por eletroforese em gel, e a sequência é lida a partir 
do menor fragmento (mais próximo ao primer). 
9. Engenharia Genética em Organismos 
 Transgênese: Inserção de um gene de interesse (transgene) em células eucarióticas por 
métodos químicos, físicos (microinjeção, biobalística, eletroporação) e biológicos 
(Agrobacterium, vírus). O transgene pode integrar-se em locais aleatórios ou específicos do 
genoma. 
 Knockout/Knock-in em camundongos: 
 Gene é modificado em células-tronco embrionárias por recombinação homóloga e,depois, essas células são injetadas em embriões para gerar camundongos 
modificados geneticamente. 
 CRISPR-Cas9: 
 Sistema natural bacteriano adaptado para edição genética precisa. 
 Um RNA guia (sgRNA) direciona a enzima Cas9 para um local específico no genoma, 
que sofre uma quebra de fita dupla (DSB). 
 A quebra é reparada pela célula por junção não homóloga (causando mutações) ou 
recombinação homóloga (permitindo inserções precisas com um DNA doador). 
 Pode ser usada para nocaute de genes, inserção de marcadores como GFP ou 
modulação da expressão gênica. 
 
 
3) A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda que o diagnóstico laboratorial seja realizado utilizando testes 
moleculares, que visam à detecção do RNA do SARS-CoV-2 em amostras do trato respiratório por RT-PCR em tempo 
real (reação em cadeia da polimerase em tempo real precedida de transcrição reversa – RT-PCR). Até o momento, 
este permanece sendo o teste laboratorial padrão-ouro para o diagnóstico da COVID-19 em pacientes sintomáticos 
na fase aguda (entre o 3º e 7º dia de doença, preferencialmente). UTILIZANDO O LIVRO DE GENÉTICA 
EXPLIQUE COMO É REALIZADO A ANÁLISE DE RNA POR PCR COM TRANSCRIPTASE 
REVERSA (RT-PCR). 
A análise de RNA por PCR com transcriptase reversa (RT-PCR) é uma técnica utilizada para 
detectar e quantificar mRNA, transformando-o em DNA complementar (cDNA) que pode ser 
amplificado por PCR. O processo básico é o seguinte: 
1. Purificação do mRNA: Primeiramente, o mRNA é purificado a partir de células ou tecidos de 
interesse. O mRNA é selecionado por suas características únicas, como o capuz 5’ m⁷G e a 
cauda poli(A) 3’. 
2. Síntese do cDNA: O mRNA purificado é então incubado com uma enzima chamada 
transcriptase reversa, que sintetiza uma fita de DNA complementar (cDNA) usando o mRNA 
como molde. Para isso, utiliza-se um primer oligo-dT, que se liga à cauda poli(A) do mRNA, 
iniciando a síntese da primeira fita de cDNA. 
3. Remoção do mRNA: Após a síntese da primeira fita de cDNA, a fita de RNA do híbrido RNA-
DNA é removida, geralmente por hidrólise alcalina ou pela enzima RNase H. 
4. Síntese da segunda fita de cDNA: A DNA polimerase I é usada para sintetizar a segunda fita 
de DNA, formando um cDNA de fita dupla que é uma cópia do mRNA original. 
5. Amplificação por PCR: O cDNA de fita dupla é amplificado por PCR usando primers 
específicos para a sequência desejada. A amplificação ocorre através de ciclos de 
desnaturação, hibridização dos primers e extensão, resultando em aumento exponencial do 
DNA alvo. 
6. Quantificação (opcional): Para quantificação, utiliza-se a PCR em tempo real (qPCR), que 
mede a quantidade de produto de DNA durante cada ciclo pela fluorescência de um corante 
que se liga ao DNA de fita dupla. O número de ciclos necessários para detectar fluorescência 
acima do fundo (valor Ct) permite comparar a quantidade relativa de RNA entre amostras. 
Essa técnica torna possível amplificar e quantificar mRNAs específicos, mesmo a partir de 
pequenas quantidades de RNA, facilitando o estudo da expressão gênica em diferentes condições 
ou tecidos. 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
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