Práticas de Microbiologia Básica

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PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA BÁSICA
Professor: Especialista Jaime Conrado Aragão Neto
Mediador pedagógico- UNINTA
Coordenador SND- Santa Casa de Misericórdia de Sobral
Preceptor Res. Multiprofissional em Oncologia UNINTA/SCMS e Cancerologia ESPCE/SCMS
Nutricionista CRN11: 11063
Bacharel em Nutrição- UNINTA
Especialista em Nutrição em Atenção Primária e Saúde da Família e Comunidade Registro N° ESP/0012-CRN11
Especialização em caráter de Residência Multiprofissional em Urgência e Emergência - SCMS/UNINTA
Especialização em caráter de Residência Multiprofissional em Saúde da Família - ESPVS/UEVA
Pós-graduado em Nutrição Clínica e Esportiva (ênfase em fitoterapia) - FAI
Pós-graduado em Fitoterapia - FAVENI
Habilitado em Fitoterapia Registro N° FITO/0047-CRN11
Habilitado em Aromaterapia Registro N° PICS/0009-CRN11
PRÁTICA 1: PREPARAÇÃO DE MEIO DE 
CULTURA LÍQUIDO
PRÁTICA 1: PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA LÍQUIDO
● Microorganismos cultivadas em uso de materiais e/ou nutrientes: meio de 
cultura;
● Meio de culturas líquidos: Caldo, ex: Caldo lactosado. Distribuídos em 
tubos de ensaio 
● Meio de culturas sólidos: Agar (agente solidificantes , à 1,5% 
polissacarídeo complexo derivado de alga). Distribuídos tubos de ensaio 
ou placa de petri. 
● Meio de culturas são comercializados na forma de pó em frascos de 
500g;
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 1: PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA LÍQUIDO
● Para preparação deve ser pesado o pó, adicionar água, e depois 
esterilizar o meio de cultura; 
● Antes deve ser realizado um cálculo, à partir das informações do rótulo 
(regra de 3), ex.:
13g —-------------- 1000ml 5 x 10ml : 50 ml volume total
x —------------------ 50 ml 
x= 50 x 13/1000 = 650/1000 = 0,65g do pó 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 1: PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA LÍQUIDO
● Materiais:
- Espátula;
- Becker;
- Proveta;
- Bastão de vidro;
- Pipeta com pêra. 
● Pesagem do becker, e depois 0,65g do pó;
● Após adicionar 50ml de água destilada;
● Realizar homogeneização (com bastão), eliminando os grumos.
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 1: PREPARAÇÃO DE MEIO DE CULTURA LÍQUIDO
● Distribuição nos tubos de ensaio, colocando 10ml do meio de cultura no 
tubo de ensaio, acionando a parte “E” da pêra; 
● Cada trio prepara 5 tubos de ensaio com 10ml em cada tubo;
● Tampar os tubos;
● Os meios de culturas devem passar após por um procedimento de 
esterilização, através da autoclave (que elimina a carga microbiana);
● Nem todos os meios devem ser autoclavados, porém o caldo lactosado 
pode;
● Na autoclave fica à 121ºC à 15 minutos;
● Material retirado, resfriado, e pode ser utilizado para uso. 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 2 : INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO - 
TÉCNICA DE SEMEADURA COM ALÇA DE 
PLATINA
PRÁTICA 2: INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO - TÉCNICA DE 
SEMEADURA COM ALÇA DE PLATINA
● Técnicas de inoculação em meio líquido e meio sólidos; 
● Inoculação transferência de um material (inóculo) para meio de cultura;
● Inóculo: material que pode ser derivado de pacientes, alimentos, 
amostras ambientais; 
● Materiais:
- Alça de inoculação (na ponta com alça de platina);
- Alça de Drigalski; 
- Inóculo (iogurte);
- Meio de cultura (caldo lactosado);
- Bico de bunsen.
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 2: INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO - TÉCNICA DE 
SEMEADURA COM ALÇA DE PLATINA
● Inoculação ocorre na zona asséptica ou zona livre, próxima ao bico de bunsen 
(30 cm à partir do mesmo);
● Na microbiologia o ideal é a utilização da zona azul da chama (temperaturas 
mais elevadas); 
● As alças serão esterilizadas pela chama; 
● Inoculação em meio líquido:
● Segurar a alça na parte de madeira (deixando 2 dedos livres), mantida na 
vertical, realizando a flambagem, que ocorre até a alça ficar vermelha, assim 
ficando estéril, porém esperar resfriar; 
● Colocar a alça em contato com a amostra até preenchimento da bolha da alça. 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 2: INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO - TÉCNICA DE 
SEMEADURA COM ALÇA DE PLATINA
● Pega com alça atrás da chama, abre o tubo de ensaio, flamba o bocal do tubo 
de ensaio, mergulha a alça e faz um zigue-zague, flamba o bocal do tubo, fecha, 
e esterilizar a alça após procedimento;
● Inoculação em meio sólido;
● Alça deve ser flambada até ficar vermelha, resfria, mergulha mais uma vez no 
inóculo; 
● 1º técnica esgotamento por estria contínua: 
● Preenche a bolha da alça com o inóculo, abre a placa de petri (respeitando a 
zona livre), coloca a amostra no canto da placa e faz levemente estrias na 
superfície do meio de cultura, fecha a placa e flamba a alça. 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 2: INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO - TÉCNICA DE 
SEMEADURA COM ALÇA DE PLATINA
● 2º técnica esgotamento por estria descontínua: 
● 4 movimentos para se fazer estrias;
● Objetivo: após 24h obtenção de culturas isoladas (puras); 
● Flamba a alça até ficar rubra (vermelha), resfria, coloca em contato com a 
amostra, preenche a bolha, abre a placa, faz a estria até 2/3 da placa, 
fecha, flamba a alça, resfria, gira a placa, puxa uma amostra à partir das 
estrias até 2/3 da placa, fecha, flamba a alça, resfria, gira a placa, puxa 
alça do material feito por último, faz estrias até 2/3, fecha, faz o último 
bloco de estrias, flamba, resfria, puxa o último em 2/3, fecha e flamba;
● Placas de petri e tubos de ensaios devem ser encubados na estufa 
bacteriológica em 35 à 38 ºC;
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 2: INOCULAÇÃO EM MEIO SÓLIDO - TÉCNICA DE 
SEMEADURA COM ALÇA DE PLATINA
● São deixados em estufas por 24h;
● observar o indicativo do crescimento microbiano em meio líquido: ocorre alteração da 
turbidez do meio ou turvação do meio, podendo ser visto à olho nu; 
● Técnica de semeadura em superfície (para meio sólido);
● utiliza pipeta automática, coloca a ponta da mesma, retira o volume de 0,1 ml do 
inóculo, coloca o volume no centro da placa, descarta a ponta da pipeta, fecha a placa;
● usa a alça de drigalski (bastão de vidro), espalhar o inóculo que está no centro da 
placa, até sentir que o inóculo está seco (realizando semeadura na superfície), após 
fecha, e flamba a alça de drigalski, e a placa deve ser colocada na estufa bacteriológica 
por 24h, no meio sólido ocorre a formação de colônias microbianas visíveis à olho nu. 
● São bactérias mesófilas (crescem em 35 à 37ºC), heterotróficas (não realizam 
fotossíntese), aeróbicas ( crescem na presença de oxigênio). 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 3 : COLORAÇÃO DE GRAM
PRÁTICA 3: COLORAÇÃO DE GRAM
● Criada no final do século 19, ganhou este nome por seu criador;
● Dar suporte à classificar as bactérias de acordo com sua morfologia, e 
coloração; 
● Caso fique corada com o cristal violeta é gram positiva , e com a safranina 
com a cor vermelha é gram negativa;
● Materiais:
● Cultura bacteriana já crescida no Agar à partir de amostra de alimento 
(iogurte o inóculo) na placa de petri;
● Lâminas para microscopia;
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 3: COLORAÇÃO DE GRAM
● Materiais:
● Alça para inoculação;
● Suporte para lâmina;
● Reagentes: Cristal violeta, lugol, solução de álcool cetona e safranina; 
● Fazer o esfregaço, flambar a alça de inoculação até ficar vermelha, resfria, 
e retira um pouco da colônia na placa de petri.
● Com a lâmina de microscopia com uma gota de água, deposita o material 
em movimento de zigue zague na gota na lâmina inteira, flamba alça;
● Coloca no suporte (parece um pregador) lâmina bem próximo na chama 
até secar a gota; ao final da fixação tem o esfregaço na lâmina;
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 3: COLORAÇÃO DE GRAM
● Próxima lâmina retirar a 2º colônia (com característica leitosa), flamba a 
alça, puxa o material da colônia, pega a lâmina já com a gota de água 
destilada, e realiza o esfregaço do material na superfície da lâmina; 
● Após, realiza a fixação do esfregaço com calor, flamba a alça, coloca a 
lâmina no suporte, e faz a fixação do esfregaço com o calor;
● Submeteras lâminas à uma sequência de tratamento com os reagentes;
● Deve seguir as sequências e respeitar o tempo de cada etapa;
● 1 etapa cobrir a lâmina com cristal violeta, e esperar 1 minuto marcado 
no cronômetro; 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 3: COLORAÇÃO DE GRAM
● 2º etapa cobrir a lâmina com a solução de lugol, e deve durar 1 minuto; 
● 3º etapa lavagem com a solução de álcool cetona, as gram negativas 
perderam a coloração nesta etapa, as gram positiva não perdem a sua 
coloração do cristal violeta após o álcool cetona (parede mais espessa), 
onde o cristal violeta é fixado nela;
● 4ºetapa a gram positiva não é corada com a safranina, e a negativa é 
corada com a safranina, ambas as lâminas são cobertas, por 30 segundos;
● Após é lavada as lâminas com água destilada, secadas com papel toalha 
(parte de baixo);
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 3: COLORAÇÃO DE GRAM
● Observação no microscópio óptico, em objetiva de 100x (objetiva de 
imersão);
● utiliza o óleo de imersão colocando uma gotinha no centro da lâmina;
● posicionar a lâmina no microscópio;
● Então realiza a análise da lâmina, sendo possível visualizar as bactérias, 
suas formas e coloração; 
● Fazer o mesmo procedimento com a 2º lâmina;
● Violeta (gram positiva) e vermelho (gram positivo). 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 4 : ANTIBIOGRAMA
PRÁTICA 4: ANTIBIOGRAMA
● Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos, classificando em sensíveis 
ou resistentes à antimicrobianos;
● Técnica de disco de fusão;
● Para técnica vai precisar:
- meio de cultura específico já na placa de petri (meio Agar Mueller-Hinton);
- Discos de antibiogramas (contendo penicilina e 1 com ciprofloxacino);
- Pinças;
- Inóculo (amostra de alimento, diluído em solução salina em 0,85%) em 
tubos.
- swab. 
- bico de bunsen. 
Fonte: Albuquerque, 2021..
PRÁTICA 4: ANTIBIOGRAMA
● 1º Pega o swab (respeitando a zona livre);
● Pega-se o tubo de ensaio com o inóculo com a bactéria diluída, flamba o bocal 
do tubo, mergulha o swab no tubo de ensaio, flamba novamente o bocal do 
tubo, fecha o tubo, abre a placa de petri, e realiza as estrias e delicadamente 
transfere o material para a placa de petri (por inteira), descarta o swab. 
● abre o 1º frasco com a penicilina, retira com a pinça um disco, e coloca na 
superfície da placa de petri, fazendo uma pressão delicadamente, sempre 
flambar a pinça antes e depois;
● Após realizar a aplicação do disco de ciprofloxacino, da mesma forma que o 1º;
● Incubar a placa em estufa bacteriológica, se for sensível vai se formar um halo 
de inibição (medido em mm comparado com tabela padrão), caso seja pequeno 
ou não haver halo, a bactéria é resistente ao antibiograma. 
Fonte: Albuquerque, 2021..
REFERÊNCIAS
ALBUQUERQUE, R. Microbiologia básica - Coloração de Gram Aula 4. Disponível 
em:. Acesso em 19 de fev de 2025. 
ALBUQUERQUE, R. Microbiologia básica - Preparação dos meios de cultura Aula 
1.mp4. Disponível em:. Acesso em 19 
de fev de 2025. 
ALBUQUERQUE, R. Microbiologia básica - Técnicas de inoculação Aula 2.mp4. 
Disponível em:. Acesso em 19 de fev de 
2025. 
ALBUQUERQUE, R. Microbiologia básica - Antibiograma Aula 3. Disponível 
em:. Acesso em 19 de fev de 2025. 
BONS ESTUDOS!