RESUMAO BIOLOGIA MOLECULAR - MARCELLA VEIGA.docx

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BIOLOGIA MOLECULAR –– MARCELLA VEIGA
TEMA 2
 
• • • • TEORIAS DA BIOLOGIA MOLECULAR
 
INÍCIO - 1869 com um bioquímico suíço chamado Johannes Friedrich Miescher. Em seus estudos, ele
buscava determinar quais componentes químicos existiam dentro dos glóbulos brancos (leucócitos)
presentes no pus de feridas. Miescher observou uma grande quantidade de um composto ácido com átomos
de nitrogênio e fósforo, nomeando-o de nucleína por estar localizado no núcleo.
 
1880 - Albrecht Kossel, demonstrou que nela havia diferentes bases nitrogenadas.
 
1889 - Richard Altmann, conseguiu purificar a nucleína e chamou o purificado de ácido nucleico.
 
Com o tempo foram descobertas quatro diferentes bases nitrogenadas:
 
Bases púricas
Adenina (A) e guanina (G).
 
Bases pirimídicas
Citosina (C) e timina (T).
 
Essas bases estão ligadas entre si, sempre obedecendo a um padrão, em que a adenina se associa à timina
por duas ligações de hidrogênio e a guanina se associa à citosina por três ligações, sendo a segunda
interação a mais estável devido à maior quantidade de ligações.
 
Entretanto, havia um fato curioso: a presença de uma base diferente, chamada de uracila, em alguns
desses materiais. Essa base apresentava uma ribose no lugar da desoxirribose e se ligava à timina no lugar
da adenina.
• • • • As moléculas com desoxirribose foram denominadas ácido desoxirribonucleico o famoso DNA.
• • • • As moléculas com ribose como pentose foram nomeadas ácido ribonucleico conhecido como RNA.
Além das ligações de hidrogênio realizadas entre as bases nitrogenadas, também se observou outro tipo de
ligação que ocorria numa outra porção do nucleotídeo. Uma ligação vertical entre as bases, formando uma
longa cadeia chamada de fita, é realizada entre a molécula de açúcar (pentose) de uma ribose para o RNA
ou de uma desoxirribose para o DNA e o grupamento fosfato da base adjacente, realizando uma reação
conhecida como ligação fosfodiéster.
 
1953 - James Watson e Francis Crick publica um artigo na revista Nature denominado Molecular
structure of nucleic acids que apresenta uma nova proposta de estrutura do DNA. Baseados em uma foto
tirada por Rosalind Franklin, propuseram uma nova estrutura para essa molécula. A estrutura era uma
dupla hélice cujas bases nitrogenadas purinas se ligavam às pirimidinas no centro da hélice
espiralada, sendo muito parecida com a que usamos até hoje.
 
A origem da vida é um tema fascinante e complexo na biologia molecular, e várias teorias tentam explicar
como a vida surgiu na Terra. Aqui estão algumas das principais teorias:
 
• • • • Teoria de Oparin e Haldane – MAIS ACEITA HOJE. Sugeriram que a atmosfera da Terra
primitiva era reduzida, composta principalmente por gases como metano (CH₄), amônia (NH₃),
vapor d'água (H₂O) e hidrogênio (H₂). Essa composição permitia reações químicas que
poderiam levar à formação de moléculas orgânicas. Com o tempo, essas moléculas orgânicas
simples poderiam se acumular em "sopa primordial" nos oceanos, onde reações químicas
adicionais poderiam ocorrer, levando à formação de moléculas mais complexas.
 
Em 1953, Stanley Miller e Harold Urey realizaram um experimento famoso que simulou as
condições da Terra primitiva e conseguiram sintetizar aminoácidos a partir dos gases propostos por
Oparin e Haldane. Esse experimento forneceu evidências experimentais para a teoria.
 
Michael Russell - O pesquisador demonstrou a existência de fontes de águas termais no fundo dos
oceanos, as quais, aquecidas pelo manto da Terra, jorram água alcalina. Essas fontes são ricas em
minérios de ferro, níquel e enxofre dissolvidos. A reação de tais minérios com o gás carbônico,
hidrogênio reativo e moléculas de água é capaz de produzir compostos orgânicos, como
hidrocarbonetos, e até mesmo nucleotídeos
 
• • • • Teoria da Panspermia: Essa hipótese propõe que a vida não se originou na Terra, mas foi trazida
de outro lugar no universo, possivelmente por meteoritos ou cometas que continham
microorganismos. O meteorito de Murchison é um dos meteoritos mais famosos e estudados da
história, conhecido por sua rica composição química e por fornecer informações valiosas sobre
a formação do sistema solar e a origem da vida. Os pesquisadores encontraram diversos
aminoácidos responsáveis por formar proteínas e outros compostos orgânicos presentes que
datavam de aproximadamente 7 bilhões de anos.
 
• • • • Hipótese do Mundo de RNA: Propõe que o RNA foi uma das primeiras moléculas a surgir, antes
do DNA e das proteínas. O RNA poderia ter desempenhado funções tanto de armazenamento
de informação genética quanto de catálise, permitindo a evolução das primeiras formas de
vida. Em um mundo no qual existiam alguns nucleotídeos, aminoácidos e hidrocarbonetos,
essas moléculas começariam a interagir entre si, formando cadeias cada vez mais complexas.
Dessa forma, as ligações entre diferentes nucleotídeos formaram os primeiros RNAs.
 
• • • • DNA
 
SURGIMENTO DO DNA - A constante estabilidade adquirida pelas moléculas presentes naquela “sopa
primordial” do mundo RNA deu origem a uma fita dupla contendo timina em vez de uracila. O DNA
possui uma maior confiabilidade para armazenamento de dados e tem as informações responsáveis
pela manutenção da vida. Ele passa por uma série de processos nos quais haverá o fluxo desses dados
armazenados até que eles sejam expressos em forma de proteínas funcionais.
 
Dogma central da biologia molecular é um princípio fundamental que descreve o fluxo de informação
genética dentro de uma célula.
Proposto por Francis Crick em 1957, o dogma central estabelece como a informação genética contida no
DNA é transcrita e traduzida para formar proteínas, que são essenciais para as funções celulares.
 
 
 
 
 
O dogma pode ser resumido nas seguintes etapas:
 
1. *Replicação do DNA* - Antes da divisão celular, o DNA é replicado para garantir que cada
célula filha receba uma cópia completa da informação genética. Este processo envolve a separação
das duas fitas de DNA e a síntese de novas fitas complementares.
2. *Transcrição* - é o processo pelo qual a informação contida em uma sequência específica de
DNA é copiada para uma molécula de RNA mensageiro (mRNA). Durante a transcrição, uma
enzima chamada RNA polimerase liga-se ao DNA e sintetiza o mRNA utilizando uma das fitas de
DNA como molde. Essa molécula de mRNA carrega a informação necessária para a síntese de
proteínas.
3. *Tradução* - A tradução é o processo em que a sequência do mRNA é utilizada para sintetizar
uma proteína. - Isso ocorre nos ribossomos, onde o mRNA é lido em grupos de três
nucleotídeos (códons), e cada códon corresponde a um aminoácido específico. - O RNA
transportador (tRNA) traz os aminoácidos apropriados para os ribossomos, onde eles são
ligados em uma cadeia polipeptídica, formando assim a proteína.
 
Resumido: *DNA → RNA → Proteína*
 
 
• • • • Replicação do DNA
 
 
A replicação do DNA é um processo fundamental que ocorre antes da divisão celular, garantindo que
cada célula filha receba uma cópia idêntica do material genético.
 
# Etapas da Replicação do DNA
 
1. Iniciação:
 
 - A replicação começa em locais específicos no DNA chamados "origens de replicação". Essas regiões
possuem sequências específicas que são reconhecidas por proteínas iniciadoras.
 
 - As enzimas helicases se ligam às origens e desenrolam a dupla hélice do DNA, separando as duas
fitas e criando uma "forquilha de replicação".
 
2. Desdobramento das Fitas:
 
- À medida que as helicases desenrolam o DNA, as fitas separadas são estabilizadas por proteínas
chamadas proteínas de ligação a fita simples (SSB), que evitam que as fitas se reanexam.
 
3. Síntese da Nova Cadeia:
 
- A enzima DNA polimerase é responsável por adicionar nucleotídeos à nova fita de DNA. Ela só pode
adicionar nucleotídeos na extremidade 3' da fita em crescimento, o que significa que a síntese ocorre na
direção 5' para 3'.
 
- Uma fita éprotein =
proteína de ligação ao TATA).
Depois do início da transcrição, inicia-se a fase de alongamento, na qual grande parte dos fatores
de transcrição é liberada e em seu lugar outro conjunto de fatores, os chamados fatores de
alongamento, é adicionado. Ao final do processo de transcrição, é obtido um mRNA primário (pré-
mRNA), que precisa sofrer modificações para se tornar um mRNA maduro e funcional para a síntese de
proteínas. Essas modificações são chamadas de processamento de RNA e iniciam-se com adição de um
grupo 7-metilguanilato à extremidade 5’ do pré-mRNA.
A formação do chamado cap 5’ protege o mRNA da degradação enzimática e auxilia no
transporte para o citoplasma. A extremidade 3’ do pré-mRNA recebe uma fita de nucleotídeos com
base adenina, denominada de cauda poli (A), que auxilia no transporte do mRNA para o citoplasma e
faz parte da sinalização para o reconhecimento pelo ribossomo.
 
Outra etapa do processamento é o splicing do RNA. O gene eucariótico possui múltiplos
íntrons, que são partes não codificadoras, isto é, não possuem a informação para a síntese de
proteínas. As regiões do gene que contêm essa informação são os éxons. O splicing do pré-mRNA
consiste na remoção dos íntrons e na união dos éxons codificadores. Com isso, diferentes proteínas
podem ser obtidas a partir de um mesmo gene, caracterizando o chamado splicing alternativo.
 
• • • • Tradução e código genético:
 
O RNA e a síntese de proteínas:
 
A tradução, também denominada de síntese de proteínas, é o processo no qual proteínas são
formadas a partir da síntese de polipeptídeos realizada pelos ribossomos.
 
Cada aminoácido adicionado à proteína nascente é trazido por um RNA transportador (tRNA),
cujo anticódon é pareado com o códon presente no RNA mensageiro (mRNA).
 
A trinca [FdST1] de nucleotídeos do mRNA, os chamados códons, determinam qual aminoácido
deve ser adicionado à cadeia polipeptídica para a formação da proteína. A informação presente no
mRNA, obtida no DNA, está na forma de nucleotídeos e precisa ser traduzida em aminoácidos, para que a
síntese de proteínas aconteça.
 
 
 
 
RNA mensageiro e RNA transportador:
 
- O RNA mensageiro carrega essa informação que foi transcrita. A leitura do mRNA é feita de
três em três nucleotídeos. O mRNA contém as sequências que serão traduzidas, mas também contém as
sequências de sinalização, que indicam o início e o fim da tradução. Na maior parte dos mRNAs, o códon
de início é o AUG, que especifica o aminoácido metionina. Já os códons UAA, UGA e UAG não
especificam aminoácidos, constituindo códigos de parada.
 
- O RNA transportador ou de transferência é o grande responsável por decifrar uma informação
e transformá-la em outra. Cada aminoácido tem o seu conjunto de tRNAs, os quais se ligam ao
aminoácido e o transportam à cadeia polipeptídica crescente. O tRNA com o seu aminoácido só se dirige
ao ribossomo quando convocado por ele. Os tRNAs são moléculas que possuem o chamado anticódon,
sequência de nucleotídeos que é complementar ao códon presente no mRNA. Também apresentam uma
sequência 5’-CCA-3’, que é por onde os aminoácidos se ligam. As enzimas responsáveis por ligar os
tRNAs aos aminoácidos são as aminoacil-tRNA sintetases.
Ribossomo:
 
O ribossomo é composto por duas subunidades, uma maior e uma menor, e ambas são formadas
por um ou mais RNAs e por várias proteínas. A unidade maior contém o chamado centro da peptidil-
transferase, que é responsável pela formação das ligações peptídicas entre os aminoácidos. Já a
subunidade menor contém o centro de decodificação, no qual os tRNAs carregados com aminoácidos
leem os códons do mRNA. Os ribossomos contêm quatro sítios de ligação, um localizado na subunidade
menor, que é o sítio de ligação ao mRNA, e os outros três, denominados de sítios A, P, E, localizam-se na
subunidade maior. 
 
- O sítio A é o local onde o tRNA se encaixa no ribossomo.
- O sítio de ligação P é onde se associa o tRNA ligado ao polipeptídeo em crescimento.
- O sítio E é por onde o tRNA, livre de aminoácido, sai do ribossomo.
 
 
• • • • Tradução:
 
Como vimos, a síntese de proteínas costuma ser dividida em três etapas: iniciação, alongamento e
término.
 
O sítio de início da síntese no mRNA possui papel importantíssimo, pois a partir dele é determinada
a fase de leitura de toda mensagem. Um códon específico (AUG) e um tRNA especial são necessários
para o início do processo.
 
Esse tRNA, chamado de iniciador, carrega sempre o aminoácido metionina (AUG).
- Nos procariotos, o início do processo de tradução se dá com a ligação da subunidade menor do
ribossomo ao mRNA, que ocorre em uma região específica do mRNA, conhecida como sequência de
Shine-Dalgarno.
 
Essa sequência consiste em seis bases (AGGAGG) e se localiza em torno de sete nucleotídeos
antes do códon de iniciação (AUG).
 
Proteínas auxiliares recrutam o tRNA iniciador já carregado com a metionina formilada, e este
se emparelha com o mRNA por meio de pontes de hidrogênio formadas entre o códon (mRNA) e o
anticódon (tRNa). Esse pareamento recruta a unidade maior do ribossomo, que então se completa.
 
- O início da síntese de proteínas nos eucariotos se dá com a complexação do tRNA iniciador com
a metionina que então se liga à subunidade menor do ribossomo juntamente com proteínas chamadas de
fatores de iniciação eucarióticos. A região cap 5’ do mRNA é reconhecida pela subunidade menor que se
acopla nesse local e move-se no mRNA para frente (sentido 3’) até encontrar a primeira sequência
iniciadora (AUG). A subunidade maior se associa a esse complexo, e a tradução de fato é iniciada.
A etapa de alongamento em eucariotos e procariotos é bastante semelhante.
 
- O primeiro sítio a ser usado pelo tRNA iniciador é o sítio P, e o sítio A fica posicionado no
segundo códon do mRNA, determinando qual o próximo aminoácido deve ser trazido pelo tRNA.
 
- O ribossomo se move sobre o mRNA de forma que o sítio A livre se encaixe no próximo códon,
que determinará qual o próximo aminoácido a ser trazido pelo tRNA. O processo se repete, ao passo que
os tRNAs que se localizam no sítio E vão sendo liberados, o que permite que o sítio A fique disponível
para o próximo aminoacil tRNA (tRNA carregado com um aminoácido).
 
Processo da síntese proteica- Observa-se o ribossomo ligado ao mRNA pela sua subunidade
menor e os três sítios de ligação da subunidade maior (A, P E).
 
 
Imagem os polirribossomos, em que vários ribossomos ligados à molécula de mRNA sintetizam
cadeias polipeptídicas.
O término da tradução ocorre quando o ribossomo encontra um dos códons de parada (UAG,
UAA, UGA) no mRNA. Esses códons não possuem nenhum tRNA correspondente, e serão
responsáveis por liberar a cadeia polipeptídica pronta do tRNA, expulsar o último tRNA do ribossomo
e, por fim, desligar o ribossomo do mRNA.
 
• • • • Código genético:
 
Os RNAs transportadores reconhecem o códon, que é um grupo de três nucleotídeos, no mRNA.
Por meio do reconhecimento do códon, identifica-se qual aminoácido precisa ser adicionado à cadeia
polipeptídica que está sendo formada. Os nucleotídeos do mRNA, por sua vez, foram obtidos por meio da
complementariedade de bases com uma das fitas do DNA, copiando a informação presente no gene. O
gene então constitui-se de uma sequência de nucleotídeos presente no DNA.
 
O código genético permite que as células produzam proteínas a partir de sequências de bases no
DNA.
 
Ao todo, existem 20 aminoácidos que são codificados por quatro nucleotídeos. Como esses
nucleotídeos se encontram em códons, combinações de três nucleotídeos, é possível um total de 64
combinações diferentes (4 x 4 x 4). Desses 64 códons, três deles são códons de parada que não codificam
para nenhum aminoácido, logo, há 61 códons que especificam 20 aminoácidos.
 
O código genético é denominado de degenerado ou redundante, pois mais de um códon podem
determinar o mesmo aminoácido que será inserido na cadeia polipeptídica.
 
Uma das características principaisdo código genético é o fato de ser praticamente o mesmo para
todos os organismos vivos, com pouquíssimas variações, sendo chamado de código “quase” universal.
Por exemplo, o códon ACG especifica para o aminoácido treonina no ser humano, mas também nas aves,
nos vegetais.
 
• • • • Mutações:
 Mutações são definidas como qualquer alteração causada na sequência de DNA e que se
perpetua para a próxima geração.
Os danos causados por algumas mutações podem afetar o funcionamento da célula ou
mesmo causar a sua morte; dessa forma, modificações nas sequências de DNA devem ser evitadas.
É importante ressaltar, porém, que muitas vezes as mutações são valiosas, pois modificações
nos genes permitem variação do material genético em uma população, que é peça-chave na evolução
adaptativa dos seres vivos.
As mutações causadas no DNA podem ser de origem espontânea, caracterizada por mutações
provocadas pelo próprio metabolismo celular, cuja ocorrência é natural, e por interações com o meio
ambiente. Em contrapartida, as chamadas mutações induzidas são provocadas por agentes mutagênicos
físicos e químicos.
• • • • Mutações espontâneas:
 Erros durante a replicação:
 O processo de replicação é extremamente eficiente, apresentando uma taxa de erros
baixíssima (aproximadamente um nucleotídeo a cada 109 a 1010 nucleotídeos incorporados). Um erro que
pode ocorrer durante a replicação é a adição de um nucleotídeo errado. Por exemplo, em vez de ser
incorporada uma timina para parear com uma adenina da fita molde, é adicionada guanina, ocorrendo uma
falha no pareamento das bases. No geral, esse tipo de erro é corrigido pela DNA polimerase com
atividade de exonuclease, que remove a base errada mal pareada, permitindo a continuação da replicação.
Essa revisão (proofreading) da DNA polimerase durante a replicação é uma das grandes responsáveis
pela alta eficiência do processo replicativo. Na figura a seguir, observamos a DNA polimerase
identificando o erro, e a exonuclease retirando o nucleotídeo incorreto.
A adição do nucleotídeo errado pode não ser detectada a tempo por uma DNA polimerase e
o erro acabar sendo replicado. Nesse caso, uma molécula filha permanece com o par de bases correto
em determinado ponto, enquanto a outra molécula recebe o par de bases em que ocorreu o erro,
perpetuando para as próximas gerações.
- Um fato importante que provoca um aumento na ocorrência no mal pareamento é que as
bases do DNA podem assumir diferentes formas, denominadas de tautômeros. Os erros de replicação
gerados por mal pareamento originam as chamadas mutações pontuais.
- O mal pareamento pode induzir a criação de um novo códon, que corresponderá a um
aminoácido diferente na proteína. Essa mutação é denominada mutação com sentido trocado.
- Outro problema que pode surgir com o pareamento errado dos nucleotídeos é a criação de
um códon de parada. A presença desse códon provoca uma interrupção prematura do processo de
tradução. Esse tipo de mutação recebe o nome de mutação sem sentido.
- Há ainda a chamada mutação silenciosa, que é caracterizada por uma mutação pontual,
alterando um códon, porém não afeta o aminoácido que ele especifica.
- Outro tipo de mutação pontual está relacionado com a adição ou deleção de alguns pares
de bases, sendo denominadas de mutações que modificam a leitura, pois alteram a leitura de todos os
códons.
 
Alterações de nucleotídeos:
Mutações espontâneas no DNA também podem ser causadas por agentes mutagênicos
ambientais. Os tipos de alterações que ocorrem mais frequentemente e que podem ser citados são: 
- Desaminação - É uma lesão hidrolítica na qual a base, principalmente a citosina, perde seu
grupo amino (-NH2). A consequência é a modificação das propriedades de emparelhamento das bases.
Nesse caso, ao perder seu grupo amino, a citosina é transformada em uracila.
- Perda de bases - É promovida pela quebra da ligação Nglicosídica (ligação existente entre a base
nitrogenada e o açúcar). A perda da base permite que qualquer um dos quatro nucleotídeos sejam
incorporados no DNA, já que a base que orientava o processo foi perdida.
- Fotodimerização - Consiste na formação de ligações covalentes entre resíduos de pirimidinas
no DNA. Isso é causado pela ação da luz ultravioleta (UV). A consequência disso é a formação de dímeros
de pirimidina na fita molde do DNA.
 
• Mutações induzidas quimicamente:
 Os agentes mutagênicos aumentam a taxa de mutação de um organismo. Alguns desses
agentes são compostos análogos de base, ou seja, são capazes de substituir as bases normais, levando à
erro na replicação. O problema das bases análogas é que elas são incorporadas ao DNA durante a
replicação, já que são estruturalmente semelhantes às bases, aumentando a frequência das mutações
causadas por pareamento errados.
Existem outros agentes mutagênicos que se inserem entre as bases do DNA, provocando
erros na replicação, são os chamados agentes articulantes.
 
• Reparo do DNA
As mutações nas sequências de DNA precisam ser evitadas. Para isso, o reparo de erros no
pareamento de bases e as lesões no DNA causadas por modificações químicas precisam ser reparadas
antes que a mutação seja replicada para a próxima geração e os mecanismos de reparo não sejam mais
eficazes.
Os tipos de reparo e reversão são:
- Reparo de erros por mal emparelhamento - É necessário quando há um erro de
emparelhamento entre duas bases. A questão é que não há certeza de qual base foi inserida erradamente, pois
o que se detecta é somente o pareamento errado, e não a base que está errada. Dessa forma, se a remoção da
base com erro ocorrer, a reparação será um sucesso. Por outro lado, se a base correta for removida,
ocorrerá a mutação.
- Reversão direta da lesão - É caracterizada pela remoção da lesão. Esse tipo de reparo
ocorre em lesões provocadas pela radiação ultravioleta.
- Reparo por excisão de bases - É feito pela ação das enzimas glicosilases que hidrolisam a
ligação N-glicosídica existente entre a base nitrogenada que está errada e o açúcar do nucleotídeo,
eliminando essa base do DNA. A perda da base gera a formação de um sítio apurínico ou apirimidínico,
que é ocupado pela enzima endonuclease que reconhece o defeito e cliva o DNA que posteriormente é
clivado por uma exonuclease. O preenchimento da lacuna é feito pela DNA polimerase e a DNA ligase faz
a restauração da fita.
- Reparo por excisão de nucleotídeos - Uma variedade de lesões é removida por meio do
reparo por excisão de nucleotídeos, que consiste na remoção da sequência de nucleotídeos que está
danificada. Essa remoção é feita por enzimas nucleases que catalisam as ligações fosfodiéster existentes
entre os nucleotídeos, removendo-os.
- Reparo de quebra de fita dupla - Nesse tipo de lesão, que pode ser causada por
radiação ionizante e alguns fármacos anticancerígenos, há quebra da fita dupla do DNA. O
mecanismo para a reparação consiste na retirada de informações da sequência de DNA da outra fita
que está se replicando na mesma forquilha da fita danificada ou da sequência de fitas presentes em
cromossomos homólogos. Esse reparo é caracterizado por um processo de recombinação. A DNA
polimerase deixa “em branco” um pedaço da fita recém-sintetizada que será preenchido com o DNA
homólogo ou DNA da outra fita, por meio de uma recombinação.
 
 
 
 
TEMA 5
 
• • • • Mecanismos de regulação gênica em procariotos :
Características genéticas dos procariotos:
 Os procariotos são seres vivos unicelulares: tudo de que um procarioto precisa para viver
está presente na sua célula e no seu DNA.
Por possuírem apenas uma célula, os procariotos são mais simples e não possuem tantas
interações. Dessa forma, sua regulação acontece visando à manutenção da vida daquele indivíduo
dentro de determinado ambiente.
Normalmente, a regulação da expressão em procariotos pode acontecer em dois diferentes
pontos.
- Com maior custo energético, um deles ocorre após a síntese da proteína, que é o produto da
fase de tradução. Essa regulação é chamada de pós-traducional, ocorrendo,por exemplo, a partir da
inibição de uma proteína ou da falta de um cofator que a ative.
- No entanto, a maior parte da regulação gênica dos procariotos se dá durante a
transcrição. Ela tem um menor custo de energia, pois ainda não ocorreu a tradução do RNAm (RNA
mensageiro), a chamada regulação transcricional.
 
• Regulação da expressão gênica
 
Nos organismos procariontes, a transcrição ocorre a partir do acoplamento da RNA
polimerase em uma sequência de DNA chamada de região promotora.
 
Todos os genes, sejam eles constitutivos ou induzíveis possuem tal região.
 
- Genes Induzíveis - genes que não são essenciais para a manutenção da vida.
- Genes constitutivos - essenciais para a manutenção da vida do organismo, os genes
constitutivos também possuem regiões promotoras, embora não contem com sistemas de inibição seletivos,
ou seja, eles apenas podem sofrer um bloqueio de sua transcrição mediado por regulações genéricas.
 
A região promotora é responsável por favorecer maior ou menor expressão gênica. A
depender da ligação de determinadas proteínas ou moléculas conhecidas como fatores transcricionais (que
ativam ou inibem a expressão gênica), tal região realiza esse favorecimento por meio de um controle
positivo ou negativo.
 
A imagem adiante ilustra diferentes atuações de um fator transcricional, além de uma
regulação negativa, a partir de um fator repressor que se liga à região promotora e impede que a RNA
polimerase se acople na fita de DNA, inibindo a transcrição.
Além disso, uma molécula chamada de repressor pode se ligar a um fator efetor,
impedindo a sua atuação e, por consequência, inibindo a expressão de um gene que seria ativado por
esse efetor.
 
O mesmo conceito pode ser aplicado de forma inversa, em que um fator efetor se liga a
uma região promotora, favorecendo a transcrição. Outra possibilidade é haver a ligação de um
repressor que impeça a atuação de um fator repressor, impedindo que ocorra a inibição da transcrição
do gene.
 No início da transcrição, um complexo de proteínas chamado RNA polimerase se acopla
à região promotora do gene e começa a construir o RNAm.
 
- Em procariontes, a região codificadora, que é chamada de operon, consiste em múltiplos
genes que geralmente têm uma função final relacionada (mesma via metabólica. Os RNAm oriundos da
transcrição de um operon são formados a partir de vários genes, sendo chamados de RNAm
policistrônicos.
 
- Já em eucariontes, as regiões promotoras estão associadas a apenas um gene; portanto, o
RNAm transcrito possui informações apenas desse gene, sendo chamado de RNAm monocistrônico.
Diferenças no RNAm de eucariontes e procariontes. UTR é uma sigla da expressão , que significa região não
codificante.
 
- Após a síntese e o processamento do RNAm nos eucariotos, ele precisa sair do núcleo
celular para encontrar o ribossomo, que fica no citoplasma.
 
- Nos procariotos, por não possuir carioteca, o RNAm já é traduzido por um ribossomo
assim que termina a transcrição, já que ambos se encontram no citoplasma.
 
A tradução é realizada a partir da leitura de um conjunto de três bases de nucleotídeos
(códon) que correspondem a um aminoácido. A união dos aminoácidos origina uma cadeia
polipeptídica, que é modelada por proteínas conhecidas como chaperonas (presentes em todos os
organismos vivos), dando origem a uma proteína funcional.
 
- O processo de tradução ocorre a partir da leitura de um códon de start, que corresponde ao
aminoácido metionina em eucariotos.
 
- Já nos procariotos, o aminoácido que dá início a todas as cadeias peptídicas é o fornil-
metionina, formado pelo resíduo metionina com a adição de um grupamento fornil. Esse grupamento
inclusive é um marcador celular que indica infecção bacteriana.
 
- A leitura dos códons segue até determinado ponto, onde haverá um códon de parada (stop
códon).
 
• • • • Regulação de operon TRP
 
Os procariotos controlam a expressão do seu DNA durante a etapa de transcrição. Não
existem tantas etapas de controle. A maior necessidade de um ser procarioto se deve à velocidade com que
os processos acontecem e ao fato de ele reduzir os custos energéticos; portanto, apenas um controle
transcricional dá conta da necessidade de regulação.
 
O primeiro exemplo dessa regulação transcricional que veremos é a do operon TRP, que é
responsável pela biossíntese do aminoácido triptofano, essencial na síntese proteica. Para construir o
triptofano, cinco diferentes enzimas são necessárias – e todas elas estão presentes em um mesmo gene
policistrônico. Esse gene será expresso em um RNAm policistrônico.
 
Responsável pela síntese de triptofano, o operon TRP possui estes trechos:
- P (promotor) - Presente em qualquer operon, o P (promotor) se trata da região onde ocorre
o acoplamento da RNA polimerase para dar início à transcrição.
 
- O (operador) - Também é uma região presente em qualquer operon. Nessa parte, acontece
a regulação do operon, que pode ser mediada de diferentes formas:
 - Acoplamento de uma proteína ou de moléculas repressoras.
 - Ligação de um composto efetor.
 
- trpL (região líder) – Também conhecida como região líder, funciona como um regulador
independente da região do operador, que é específica do operon TRP.
 
- trpE (antranilato sintase E) , trpD (antranilato sintase D), trpC
(fosforibosilantranilado isomerase), trpB (triptofano sintase B), trpA (triptofano sintase A)- o mais
importante é entender que todas essas proteínas funcionam em cascata, em que uma depende da outra,
para formar o triptofano.
 
O operon TRP possui duas formas de regulação:
 
- Um repressor se liga à região do operador, impedindo a continuação da transcrição
(forma mais simples de ser entendida). Em operons que sintetizam determinado recurso, é bastante
comum haver uma regulação dada pela quantidade do recurso que já está presente no meio celular, ou
seja, a repressão do operon TRP está diretamente ligada à quantidade de triptofano presente no meio.
 
- Forma mediada pela região líder (específica para esse operon). - os procariotos realizam
a transcrição e a tradução em uma mesma região devido à falta de um núcleo revestido que protege o
material genético. Por isso, um “transporte” do RNAm poderia ser prejudicial e causar danos ao RNA.
 
A região líder é formada por um trecho de RNAm composto por guaninas e citocinas
capazes de formar três diferentes tipos de grampos, conforme a imagem a seguir: grampo 1 e 2,
grampo 3 e 4 ou grampo 2 e 3.
 
 
Quando o ribossomo começa a leitura dos códons, os trp-RNAt precisam participar da
produção da cadeia peptídica da futura proteína a ser sintetizada. Em baixas concentrações de triptofano, a
adição desse resíduo se torna mais lenta – e isso será fundamental para entendermos como funciona a
regulação na região líder.
 
Nos procariotos, à medida que a transcrição começa, a tradução já é feita de forma
concomitante. Logo no começo da transcrição, o RNAm possui um grampo entre as regiões 1 e 2 da figura
anterior. Chamado de “grampo pausa”, esse primeiro grampo é responsável por segurar por um tempo o
ribossomo parado; com isso, a RNA polimerase consegue sintetizar um trecho maior do RNAm.
 
Quando o grampo pausa é desfeito, o ribossomo continua a percorrer o RNAm e passa
por um códon duplo de UGG, correspondente ao resíduo de triptofano. A maquinaria de tradução precisa
então recrutar trp-RNAt para continuar o processo de tradução.
 
Em baixas concentrações de triptofano, essa etapa vai ser mais demorada, a ponto de dar
tempo de formar outro grampo (dessa vez, entre os trechos 2 e 3), que pode ser mais facilmente desfeito.
Ele é chamado de “grampo antiterminação”.
 
Além disso, o grampo antiterminação impossibilita a formação do grampo entre os trechos
3 e 4, cujo nome é grampo de terminação. Ele, porém, não é facilmente desfeito e impede a continuação da
tradução pelo ribossomo.
 
O grampo 2-3 formado em um ambiente com baixa concentração de triptofano possibilita a
continuaçãoda expressão do operon TRP, levando a célula a realizar a biossíntese do resíduo em falta. Já
em altas concentrações, o ribossomo passa mais rápido pela região UGGUGG sem dar tempo de formar
tal grampo, o que possibilita a formação do grampo de terminação 3-4. Dessa forma, ele inibe a
continuação da tradução e, por consequência, bloqueia todo o funcionamento do operon TRP.
Regulação de operon Lac
 
Amplamente utilizado para entender a regulação da expressão gênica em procariontes, o controle do
operon Lac é responsável pelo metabolismo da lactose, um açúcar importante para a nutrição das
bactérias.
 
 
O operon Lac possui diferentes partes, vejamos:
 
P1: Promotor 1 - promotor do gene I - As regiões onde se
encontram os promotores, onde a RNA polimerase se liga, são
responsáveis por iniciar a transcrição dos genes adjacentes.
 
Gene I (gene repressor) - possui uma região promotora única
 
O1: Operador 1 - é o local onde o repressor Lac se liga
 
Gene Z - genes estruturais
 
O2: Operador 2 - operador secundário - têm o objetivo de
ativar ou reprimir a transcrição dos operons
 
P2: Promotor 2 - promotor dos genes Z, Y e A
 
O3: Operador 3 (operador secundário)
 
Gene Y - genes estruturais
 
Gene A - genes estruturais
 
. Os operadores estão sempre localizados perto dos genes que
regulam.
 
Também existem três genes estruturais: LacZ (gene Z),
LacY (Y) e LacA (A). Eles são responsáveis por codificar as enzimas
β-galactosidase, permease e transacetilase, além daquelas que
codificam os inibidores do próprio operon. Veja a representação
abaixo: Representação esquemática do Lac.
 
 
Um recurso muito valioso dessas células é que elas tentam tornar o consumo de energia o
mais eficiente possível. Na ausência de lactose, não há razão para se expressar os genes Z, Y e A, pois
eles estão envolvidos no metabolismo da lactose.
No entanto, a expressão do gene I é constitutiva, ou seja, acontece mesmo na ausência de
lactose intracelular. Esse gene produz uma proteína repressora do promotor 2 (Lac repressor) que se liga
à região O1 e reprime a expressão de Z, Y e A, que não são expressas mesmo quando a RNA polimerase é
acoplada a P2.
 
A lactose não atua diretamente no operon Lac, porém, quando algumas moléculas de
galactose entram na célula, um pequeno número de enzimas β-galactosidase é capaz de converter
galactose em alolactose, que se liga ao repressor Lac e facilita a mudança conformacional da proteína.
Com isso, ocorre uma dissociação entre o repressor e o operon 1, liberando a função da RNA
polimerase para transcrever os genes Z, Y e A.
 
 
Outra forma de regulação é dependente da glicose. Sua presença inibe o operon Lac, porque
as células devem priorizar o metabolismo da glicose em detrimento de outros carboidratos. A ativação
do operon Lac ocorre quando os níveis de glicose estão baixos, sendo induzidos por uma pequena
molécula efetora, a cAMP (AMP cíclico), e uma proteína regulatória denominada CRP.
 
1- Na ausência de glicose, a concentração de cAMP aumenta, e essa molécula se liga à CPR
(CAP) para formar o complexo CRP-cAMP (ou CAP-cAMP).
 
2- Esse complexo se liga ao DNA na região operadora dependente de CAP-cAMP próximo ao
operador 3, ativando a transcrição dos genes Z, Y e A para o metabolismo da lactose.
 
3- Na presença de glicose, os níveis de cAMP são reduzidos e o complexo CAP-cAMP não é
formado; com isso, o operon Lac é inibido.
 
Obs: É importante ressaltar que, quando os níveis de glicose estão elevados, a presença
de lactose não leva à expressão dos genes Z, Y e A devido à falta de indutores de CAP-cAMP. Esse fato
é evidenciado pela necessidade de consumir glicose antes da lactose.
 
A regulação dos genes do metabolismo da lactose nas bactérias Escherichia coli é
essencial para a sobrevivência. Essas bactérias adaptam-se ao ambiente e à presença de diferentes
nutrientes, consumindo os de forma inteligente.
 
• • • • Estrutura e organização gênica dos eucariotos:
 
Considerando a estrutura e a organização gênica dos
procariotos, observa-se que eles são organismos unicelulares com uma
grande parte de material genético codificante. Como vimos, o
processo de transcrição é dado em trechos denominados operons, os
quais, por sua vez, são transcritos para um RNAm policistrônico.
 
O RNAm policistrônico é traduzido em proteínas
interligadas de alguma forma, podendo estar, por exemplo,
relacionadas a uma mesma via metabólica. Essas proteínas são
expressas de forma conjunta e possuem as mesmas regulações,
sejam elas de ativação ou repressão, dadas em regiões operadoras. As
células procariontes se adaptaram muito bem como unidades
individuais, fazendo bom uso dos recursos parar poupar energia.
 
Por outro lado, os organismos multicelulares (eucariotos)
têm uma complexidade maior e uma porcentagem muito menor de
genes codificadores e não codificantes. Em seres humanos, somente
cerca de 2% do DNA é codificado.
 
• • • • Diferenciação celular:
 
O segredo desse paradoxo (procariotos – mais genes
codificantes / eucaritos – menos genes codificantes) é a regulação
gênica e o processamento do RNAm. Dessa forma, há a chamada
diferenciação celular, em que a regulação da maneira com que os
genes são expressos determina como uma célula vai se especializar.
Quando a fecundação ocorre, uma grande massa de células-tronco
(células “virgens” e sem nenhum tipo de especialização) é formada.
 
A massa de células-tronco começa a apresentar um padrão
de expressão gênica, que é oriunda de fatores efetores e repressores
de acordo com a sua orientação espacial, formando diferentes
prototecidos (tecidos em estágios iniciais). Esses padrões se
modificam para cada especialização, dando origem a células cada
vez mais especializadas.
 
Diferentemente dos procariotos, em que a maior parte das
regulações ocorre no nível de transcrição, nos eucariotos elas
acontecem em vários pontos diferentes, conferindo mais
complexidade e uma maior quantidade de pontos de regulação, que
podem ser modificações transcricionais, pós-transcricionais,
traducionais ou pós-traducionais.
 
• • • • Regulação da expressão gênica:
 
Para iniciar o processo de transcrição de uma fita de DNA, a
RNA polimerase primeiramente precisa ser acoplada à fita dupla.
Esse DNA deve ser acessível à maquinaria de transcrição e, portanto,
estar em um estado não empacotado denominado eucromatina.
 
- Histonas - O processo de compactação e descompactação
do DNA em eucariotos é mediado por proteínas cilíndricas chamadas de
histonas. Ao expor ou compactar o DNA, a atuação das histonas é um
tipo de regulação gênica “pré-transcricional”.
 
As histonas ditam a compactação da cromatina e são
moduladas por pequenas alterações químicas em sua estrutura:
 
- Metilação: Ocorre a adição de um grupamento metila
que favorece a compactação do DNA pelas histonas,
impossibilitando a atuação da maquinaria transcricional.
 
- Acetilação: Há a adição de um grupamento acetil,
favorecendo a descompactação do DNA e possibilitando a atuação
da maquinaria de transcrição. Catalisado pelas proteínas histona
acetiltransferases (HAT), tal mecanismo é reversível. Sendo assim,
uma das maneiras de regular o que vai ser expresso é dependente do
padrão de acetilação/metilação de histonas.
 
OBS: O padrão de histonas do seu DNA constitui um dos
fatores para que diferentes células tenham funções diferentes.
 
 
- Metilação:
 
Outro mecanismo que inibe a expressão gênica é a metilação
do próprio DNA (mais especificamente, na posição 5 do anel de
citosina). Isso dificulta a interação com a RNA polimerase,
impedindo a transcrição. A metilação é a adição de um grupo metil
(CH3) de forma covalente. A enzima que possui a função de metilação é
a DNA metiltransferase (DNMT).
 
As citosinas metiladas formam as ilhas CpG ou ilhas CG (ilhas citosina-guanina). Essa
metilação não é reparada pela maquinaria de reparo celular; portanto, ela pode ser perpetuada por meio
de diferentes gerações.
A compactação dos trechos de DNA metilados também gera dificuldade na horada
transcrição. Dessa forma, as ilhas CpG não são transcritas nem traduzidas, constituindo, assim,
partes não codificantes do DNA.
 
Até mesmo aqueles enormes pedaços de DNA não codificante – erroneamente chamado
de “DNA lixo” – possuem função.
 
• • • • Splicing alternativo :
 
Uma das chaves para entender por que o DNA codificador é tão pequeno é o splicing
alternativo. Cada célula possui um padrão de splicing, um conjunto de informações sobre como ela
realizará esse processamento que é dado de acordo com sua função para produzir diferentes proteínas de um
mesmo gene.
 
Após a transcrição de um gene, forma-se um pré-RNAm, que é processado por um
complexo de RNA e proteínas chamado spliceossomo.
 
Dependendo do padrão de splicing celular no momento da transcrição, alguns trechos do pré-
RNAm serão considerados éxons e outros, íntrons.
 
Conforme o padrão de splicing celular, os fragmentos de íntrons são removidos do pré-
RNAm. Já os fragmentos de éxons são unidos pelo spliceossomo, resultando em um RNAm alternativo
formado apenas a partir de éxons.
 
Os padrões de splicing celular variam de acordo com a função celular, resultando em
diferentes isoformas alternativas do mesmo RNAm. Vale ressaltar que cada isômero terá uma função ou
característica única.
 
Um mesmo gene pode dar origem a uma enorme quantidade de diferentes RNA
mensageiros e, por consequência, proteínas diferentes.
 
Os trechos que serão considerados éxons ou íntrons também podem ser regulados por
repressores ou ativadores do splicing. Além do splicing alternativo, o pré-RNAm precisa ser processado
para poder sair do núcleo e chegar ao ribossomo onde será traduzido.
 
O pré-RNAm passa por duas etapas:
 
- 1º etapa - Adição de um cap 5' criado pela ligação de nucleotídeos alterados.
 
- 2º etapa - GMP metilado (monofosfato de guanosina metilado) unido por uma ligação
trifosfato na extremidade 5' do RNAm.
 
O cap 5' é essencial para que o RNAm maduro seja reconhecido e, em seguida,
exportado para o citoplasma. Uma vez fora do núcleo, ele é direcionado para o ribossomo. O cap 5’
também possui um efeito protetor, impedindo a degradação do RNAm.
 
A segunda etapa no processamento do RNAm é a adição de uma cauda chamada "poli-A"
à extremidade 3' do RNA. A cauda é assim chamada porque consiste em 80 a 250 resíduos de adenina. Ela
também serve para proteger o RNAm da degradação enzimática ao longo de seu movimento em direção
ao ribossomo, enquanto a cauda poli-A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o ribossomo.
 
Quando o cap 5' e a cauda poli-A são adicionados, o RNAm se torna maduro e pode ser
traduzido pelos ribossomos no citoplasma. Esse processo é regulado pela remoção de um desses
aditivos (cap 5’ ou cauda poli-A).
 
Se a célula não precisa mais de determinada proteína, sinais regulatórios são enviados ao
núcleo, de onde são removidos. O RNAm agora "imaturo" é degradado (processo conhecido como
regulação pós-transcricional).
• • • • Regulação genética por miRNA e siRNA e pós-traducionais
 
- Mirna
 
 Os miRNAs apresentam cerca de 19 a 25pb (pares de base). Endógenos, eles são
formados a partir do pareamento imperfeito de uma fita dupla de RNA, o pri-miRNA. Esse
pareamento gera uma estrutura em forma de grampo de cabelo (hairpin). É na verdade, uma pequena
molécula de RNA que atua na expressão gênica. São responsáveis pelo desenvolvimento celular,
diferenciação, proliferação e apoptose de células.
 
O pri-miRNA é clivado por uma endonuclease chamada Drosha (endonucleases são
proteínas que cortam a fita de RNA ou DNA de forma precisa), formando o pré-miRNA. Nesse processo,
ocorre o alinhamento das porções terminais do hairping, o que permite a saída do núcleo.
 
No citoplasma, o pre-miRNA é clivado por outra endonuclease – dessa vez, uma da classe
Dicer, que remove o loop do hairpin. Resta agora apenas a sequência de fita dupla de RNA (double
stranded RNA, conhecido como ds-miRNA).
 
A fita dupla de miRNA passa por um complexo proteico chamado miRISC, que seleciona
uma das duas fitas para atuar como regulador (miRNA maduro).
 
- siRNA
 
Eles são um pouco maiores, com cerca de 22 a 23pb. Eles são silenciadores gênicos. Esse
mecanismo é importante para defesa celular contra vírus. Os siRNA podem ser exógenos (oriundos do
RNA viral de fita dupla) ou endógenos (oriundos de retrotransposons), sendo formados a partir de um
pareamento perfeito de uma dsRNA sem a formação prévia de um hairpin.
O dsRNA já está presente fora do núcleo celular e não sofre processamento pela Drosha. No
citoplasma, a Dicer cliva o dsRNA, formando, com isso, os fragmentos de siRNA.
 
O miRNA maduro e o siRNA podem regular a produção proteica de duas formas:
 
- 1º forma - Ligar-se ao RNAm, reprimindo a tradução por bloqueio físico e não deixando
o ribossomo atuar.
 
- 2º forma - Degradar o RNAm caso o pareamento de bases seja completo.
 
Na maior parte das vezes, eles impedem a tradução.
Exemplo: Foram encontrados miRNA relacionados a diversos oncogenes, que são genes
responsáveis por ações que promovem a multiplicação celular. O silenciamento dessas proteínas pode
auxiliar na prevenção de tumores ou de desordens oriundas da quebra da homeostase mediada por
tais oncogenes.
 
No futuro, será possível construir siRNAs específicos para inibir a expressão da HMG-CoA
redutase, principal enzima na síntese endógena de colesterol, abrindo a possibilidade de uma nova
terapia gênica. Diversos estudos vêm sendo realizados no silenciamento de genes relacionados a câncer.
 
• • • • Regulações gênicas pós-traducionais :
 
Por fim, existem as regulações gênicas pós-traducionais. Um dos exemplos é aquela mediada
pela quebra da estabilidade proteica, em que, por intermédio de um processo interno, a ubiquitinação
(adição de grupamentos ubiquitina a determinada proteína) marca uma proteína para que ela seja levada
até um complexo proteico chamado de proteassoma e lá ser degradada.
 
Outra regulação pós-traducional relevante é a produção de uma proteína já ligada a um
repressor impedindo a sua atividade, como é o caso da tripsina. Para que essa proteína venha a se tornar
funcional, a célula precisa produzir ou expressar alguma outra molécula capaz de remover tal repressor para
que a tripsina cumpra a sua função.
 
 
• • • • Epigenética:
 
A epigenética estuda as características que vão além dos genes. Essa ciência estuda como
o comportamento das regulações do DNA influenciam a sua expressão a fim de que traços fenotípicos
sejam observados pela ação de fatores externos ou ambientais, afetando a expressão gênica de forma
reversível. A compreensão da epigenética pode nos ajudar a estabelecer relações entre a forma como
vivemos e o surgimento de determinadas doenças.
 
Os fatores de transcrição específicos de cada linhagem celular que fazem com que essas
células se especializem em sua forma final, bem como nas marcas epigenéticas do DNA. Essas marcas são
características do material genético que permitem ou não sua expressão, seja por metilação do DNA,
modificações de histonas (metilação ou acetilação) ou presença de mi e siRNA, que degradam o RNAm. A
epigenética está acima dos genes: ela estuda as alterações na expressão gênica que não alteram a
estrutura primária da sequência de nucleotídeos. Além disso, explora as modificações no DNA
decorrentes da interação do indivíduo com o ambiente.
 
Exemplo: Um indivíduo fumante consome grandes quantidades de nicotina. O mecanismo de
ação dela sobre o DNA ainda não foi totalmente elucidado, mas acredita-se que, por causar grande estresse
oxidativo no corpo, haja maior produção de resíduos de metila e, por consequência, maior metilação do
DNA. A fumaça do cigarro também contém agentes oxidantes capazes de causar danos a macromoléculas
celulares, ativando leucócitos e plaquetas, o que contribui ainda mais para o estresse oxidativo. Por isso, o
hábito de fumar e ficar exposto a nicotina, por si só, é capaz de modificar o padrão de metilação em
determinados genes, o que, em longoprazo, pode auxiliar no desenvolvimento de algumas doenças.
 
Genes que, em condições normais, não estariam sendo expressos passam a sê-lo,
enquanto a homeostase celular é quebrada. Desse modo, genes que deveriam ser expressos podem ficar
reprimidos – e as consequências dessas modificações são imprevisíveis.
 
 
Hereditariedade genética:
 
Não apenas os genes são responsáveis por transmitir as informações dos pais para os filhos.
Os padrões epigenéticos também são fundamentais, podendo ser passados por meio de gerações.
 
Marcações no DNA e nas histonas (acetilações e metilações) modificam o padrão de
expressão genética principalmente no período de desenvolvimento embrionário, causando uma
reprogramação gênica. No caso do cigarro, as alterações epigenéticas podem ser causadas de uma forma
direta no embrião por conta de substâncias tóxicas que atravessem a placenta, embora também possam vir
por herança de padrões epigenéticos.
 
Durante a formação do zigoto, o gameta masculino e o feminino (contendo 23 cromossomos
cada) são combinados. Eles carregam as informações genéticas do pai e da mãe. É formado então um zigoto,
que se desenvolve para um embrião.
Durante a fase adulta, na formação dos gametas, ocorre uma limpeza do padrão epigenético
seguida de uma reprogramação para a formação de um novo padrão que será armazenado no gameta. Esse
padrão pode ter características oriundas das células-mãe, herdando características durante o processo.
 
OBS: As modificações epigenéticas ocorrem não apenas pela exposição recorrente a
determinadas substâncias químicas, mas também devido a fatores ambientais e comportamentais.
 
Acredita-se que traumas sejam internalizados e transmitidos durante a fase de
reprogramação genética da formação dos gametas devido à continuidade dos padrões epigenéticos, já
que os descendentes de guerra tendem a ser mais suscetíveis ao estresse e aos transtornos mentais.
 
Esse evento é conhecido como transmissão transgeracional de trauma (TTT). O TTT
também é descrito na literatura que traz relatos de pessoas abusadas, refugiados, vítimas de tortura etc. A
compreensão do TTT trouxe avanços para a vida de muitas crianças e adultos que vivenciaram eventos
traumáticos, possibilitando o diagnóstico precoce e o tratamento de sequelas pós-traumáticas como uma
forma de medicina epigenética.
 
É possível observar alguns exemplos de tais associações. Destacaremos três deles:
 
- Pessoas que sofrem de fome no início da vida têm menor risco de desenvolver câncer
colorretal.
- Crianças que sofreram traumas frequentemente desenvolvem depressão quando adultos
devido a hipermetilação do gene NR3C1 (responsável pela expressão de receptores ligados ao estresse).
- Associações de metilação de DNA, que formam ilhas CpG em determinadas regiões, são
associadas à maior prevalência de diabetes tipo 2 e de obesidade na população árabe.
 
A modificação desses padrões ou a terapia genética, seja com o uso de miRNA e siRNA ou a
edição genética pela técnica de CRISPR/Cas9, parecem muito promissoras, mas ainda estão em fase de
estudos preliminares.
 
TEMA 6
• • • • Introdução ao isolamento dos ácidos nucleico
Desenho experimental - é um planejamento de um estudo realizado em algumas etapas e é uma
ramificação do método científico, que é a ferramenta mais poderosa de todas para o avanço
tecnológico da humanidade e muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas do dia a dia.
O método científico - foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do aparelho em que
você está lendo este texto até a cadeira em que está sentado(a).
As etapas do método científico são: observação, questionamento, hipótese, experimento, análise
dos resultados e conclusão.
- Observação - A partir da observação de algum evento – por exemplo, a existência do DNA –,
podemos nos perguntar (questionar): “Eu gostaria de purificar o DNA para estudar melhor como ele é
construído, tem alguma forma de fazer isso?”.
- Hipótese - A partir dessa pergunta, estabelecemos uma hipótese: “Se eu aplicar um reagente
específico e fizer um determinado procedimento, será que consigo o DNA purificado?”.
- Experimento - Depois vamos para a bancada, onde o experimento é feito, e a partir da
análise dos resultados, as conclusões são obtidas. 
 A reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da ciência!
Etapas do desenho experimental - Definir a relação causa-efeito. Estabelecer o problema
existente, os objetivos do trabalho e as metas a serem cumpridas.
 
- Planejamento - Com o projeto estabelecido, preparar a instrumentação e avaliar possíveis
problemáticas do experimento.
- Execução - Realizar as medições e técnicas planejadas.
- Análise e interpretação - Após a execução, analisar os dados coletados de forma criteriosa e
científica.
- Formular as conclusões - A partir da análise e interpretação dos resultados, devemos concluir
se a relação causa-efeito se mostrou existente e responder aos objetivos do trabalho definidos na etapa
1, fechando dessa forma o ciclo do desenho experimental.
Entradas do experimento
A palavra entrada corresponde a todos os valores inseridos em determinado modelo, ou seja, em
um modelo experimental em que valores são dados, as entradas são todos estes valores.
- Input será o material coletado, por exemplo, o raspado da face interna da bochecha.
 - Output será o DNA extraído desse material.
* Variáveis dependentes e independentes
- Variáveis independentes - São aquelas que podemos controlar e modificar, e possuem certo
efeito sobre a variável dependente.
- Variáveis dependentes - São aquelas que medem o efeito do que está sendo avaliado e
dependem da variável independente.
Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos estatísticos e testes de
hipóteses para analisar os dados e testar a validade desses resultados. Por meio da inferência estatística, os
testes de hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese estabelecida no
início do desenho experimental.
- Hipótese nula - Indica que não há uma relação causa-efeito.
- Hipótese alternativa - Indica que existe uma relação causa-efeito, ou seja, rejeita a hipótese nula.
 
• Tipos de erros
Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros de interpretação e/ou do
processo realizado. Os erros são causados quando temos uma interpretação errônea dos dados, o que nos
leva a rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma hipótese falsa (falso negativo).
Os erros podem ser classificados como tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que será rejeitada.
EXEMPLO, ao falar para o papagaio a palavra Vasco e ele repetir
Flamengo ou qualquer outra palavra além de Vasco, a hipótese nula é
verdadeira (sem relação causa-efeito). No entanto, quando falamos
Vasco para o papagaio e ele repete outra palavra, enviesados para a
obtenção de uma relação de causa-efeito, rejeitamos a H0, mesmo ela
sendo verdadeira. Temos um erro do tipo 1 ou falso positivo. Nesse
tipo de erro, a hipótese nula é verdadeira (ou seja, ele não repetiu a
palavra Vasco) e nós a rejeitamos (pois entendemos Vasco).
Vimos também que, quando falamos Vasco, e ele repete Vasco, a H0 é falsa. Qualquer outra palavra
dita pelo papagaio torna a H0 verdadeira, pois ele não repetiu a palavra que queríamos (Vasco). No entanto,
se ao falar Vasco ele repetir a exata palavra Vasco e nós entendermos “Asco” por engano, vamos entender
que a H0 é verdadeira, porém, nesse caso, a hipótese nula é falsa, uma vez que ele de fato repete a palavra
Vasco. Esse é um erro do tipo 2 ou falso negativo: aceitamos uma H0 verdadeira (pois entendemos que ele
disse Asco), mas, na verdade, a hipótese nula era falsa (ou seja, ele disse Vasco).
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são muito comuns na área
médica, principalmente em testes de diagnóstico clínico, nos quais kits de diagnóstico demonstram
resultado positivo para uma doença inexistente ou resultado negativo, quando,na verdade, há presença de
doença.
• • • • Seleção de participantes :
A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais representativa possível, para
termos menor chance de errar ao generalizar os resultados.
A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada de amostragem, que pode ser não
probabilística ou probabilística. 
- AMOSTRA - Subconjunto de pessoas, itens ou eventos de uma população selecionados para
analisar e fazer inferências.
- Amostragem não probalística - Ocorre quando a probabilidade da seleção de cada
participante não é conhecida. A seleção da amostra depende do julgamento do pesquisador e esta pode
ser feita pela amostragem por conveniência (o pesquisador escolhe quem está disponível) ou
julgamento (o pesquisador escolhe quem ele acha interessante).
- Amostragem probalística - Ocorre quando cada elemento da população possui a mesma
probabilidade de ser selecionado para compor a amostra. Nesse caso, a probabilidade da seleção de
cada participante é conhecida. Por exemplo, em uma amostra aleatória simples com 10 participantes,
a chance de um deles ser escolhido é 1/10, ou seja, 10%.
- AMOSTRAGEM ALEATÓRIA SIMPLES - Participantes são selecionados aleatoriamente em
uma determinada população. Em uma população de 12 participantes, eu escolho 9 de forma aleatória,
ou seja, ao acaso. Isso poderia ser realizado por sorteio, por exemplo.
- AMOSTRAGEM SISTEMÁTICA - O primeiro participante é selecionado a partir de um
número preestabelecido e os outros participantes são escolhidos seguindo um mesmo coeficiente.
 
• • • • Coleta, transporte e armazenamento de amostras biológicas destinadas aos testes moleculares:
Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes moleculares, como sangue,
escarro, amostra de tecidos, um fio de cabelo, dentre outras. A partir dessas amostras, podemos
detectar a presença tanto do nosso material genético (DNA/RNA) quanto o de microrganismos,
conseguindo verificar e quantificar a presença de vírus, bactérias, protozoários; analisar a
predisposição ou o estado de doenças genéticas; e fazer os famosos testes de paternidade. Além disso, é
amplamente utilizado em perícias médicas: o jornalista Tim Lopes foi identificado com auxílio dos
testes moleculares.
Atenção: é essencial os cuidados com a fase pré-analítica, para um resultado de qualidade. A
coleta e manipulação de todas essas amostras, assim como na coleta de qualquer material biológico,
deve ser realizada seguindo todas as normas de biossegurança, com utilização dos equipamentos de
proteção individual, para evitar contaminação.
As amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do paciente e data da coleta,
assinatura de quem coletou e um código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem
identificadas corretamente ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a
presença de hemólise (Extravasamento de componentes intracelulares das hemácias para o meio
extracelular, por conta de um rompimento das membranas celulares) no tubo de sangue, devem ser
descartadas.
Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de acordo com o procedimento realizado. É
obrigação do laboratório deixar evidente para os pacientes os critérios de aceitação e exclusão de
amostras para cada tipo de ensaio.
Vamos conferir alguns cuidados para extração de amostras de DNA e RNA:
- Extração de DNA - A coleta deve seguir alguns cuidados, pois, no nosso organismo, existem
moléculas capazes de degradar o DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de íons
metal para a sua atividade. Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de
agentes quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 minutos a 65°C.
- Extração de RNA - A coleta de amostras para a extração de RNA requer mais cuidados. O
RNA é uma molécula altamente instável e que apresenta grande fragilidade e se degrada rapidamente
pela ação de ribonucleases (RNase). Essas enzimas não precisam de cofator para se ativar, são
estáveis, ficando ativas mesmo após a fervura e autoclavagem, e estão presentes em uma série
materiais biológicos e na nossa pele. É muito importante a adição de agentes estabilizadores (Os
agentes estabilizadores de RNA são reagentes que visam inativar enzimas capazes de degradar o
RNA.) de RNA o mais rápido possível e que o recipiente utilizado seja certificado como Ribonucleases
(RNase) free, ou seja, livre de agentes degradantes de RNA, estéril, e sempre deve ser manipulado com
luvas!
- Sangue e aspirado de medula óssea - Amostras de sangue e aspirado de medula óssea
precisam ser armazenados junto a agentes anticoagulantes para manter a estabilidade da amostra,
impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto, a heparina (agente anticoagulante amplamente
utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas moleculares, dentre elas o
famoso PCR (Polymerase Chain Reaction - técnica utilizada para amplificar a quantidade de material
genético e que é fundamental para as análises posteriores ou até pode ser utilizada como ferramenta
principal de diagnóstico.).
A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes fossem preferíveis,
sendo normalmente utilizados o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de
dextrose) para essas amostras.
- Amostra de tecidos - As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos estão
alojados no tecido e/ou o diagnóstico das possíveis infecções seja difícil por meio da simples coleta de
sangue. Além disso, essas amostras são as de escolha durante as autópsias e para a análise de tecidos
tumorais para comparar o DNA das células tumorais com as normais. Para tecidos, o ideal, após a coleta por
biópsia, é o rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C) ou manter esse tecido em solução de
preservação de ácidos nucleicos.
OBS: Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados para a preservação de tecidos para
exame histopatológico não devem ser empregados para os exames de biologia molecular.
- Células bucais - pode ser realizada por meio de um raspado de células da parte interna da
boca utilizando um swab (cotonete estéril, específico para coleta de exames microbiológicos) ou a
partir do bochecho. Para extração de RNA, essa amostra deve ser inserida em um tubo contendo
solução estabilizante de RNA/DNA. De forma diferente, amostras para extração de DNA podem ser
secas ou estabilizadas e transportadas à temperatura ambiente. As amostras estabilizadas dentro do
tubo possuem validade de até uma semana em temperatura ambiente, podendo ser transportadas sem
maiores cuidados.
Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar material presente na orofaringe
e na nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, em que o agente infectante colonize as vias
respiratórias, como o novo coronavírus e o vírus influenza.
- Coleta de líquido cefalorraquidiano (líquor ou LCR) - O LCR quando coletado para análise
do DNA deve ser coletado em frascos estéreis, transportado na temperatura de 2°C a 8°C e, caso não
seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de -20°C. Para análise de RNA, se o
processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser congelada. No entanto, caso a
amostra tenha eritrócitos, esses devem ser removidos antes do congelamento.
* Extração e quantificação do material genético:
- Extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas - No laboratório, chamamos a
receita de POP (procedimento operacional padrão) e temos que ter os ingredientes (os reagentes) e os
utensílios para fazer o bolo (os materiais e instrumentos). Assim como fazer um bolo, é de suma
importância primeiro entender os conceitos teóricos da extração do DNA e depois ver como funciona o
passo a passo da técnica.
- Procedimentos de extração de DNA - Para a extração do DNA, todos os outros elementos são
considerados contaminantes, até mesmo o RNA. Assim, a estratégia básica da extração deDNA é,
então, separar o DNA de todos esses outros elementos que não são DNA.
Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de detergentes específicos de
desestabilizar a membrana celular e nuclear, abrasão física, ação de enzimas capazes de degradar a
membrana e/ou parede celular, pressão osmótica, aquecimento, entre outras.
Quando a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das membranas, é importante adicionar
uma enzima capaz de destruir outras proteínas (proteinases), principalmente para inativar todas as DNases,
impedindo a degradação do DNA. Em seguida, para remover o RNA, que neste caso é um contaminante,
basta adicionar RNase no meio. Nessa etapa, já removemos lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda faltam
os carboidratos e os elementos minerais.
Existem algumas formas de se realizar essa etapa, vamos conhecer as 3 principais.
* Adição de solvente orgânico - Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio, que
tornam essas moléculas insolúveis, assim como os carboidratos e todos os elementos minerais. Após a
adição dos solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases: 
1) Fase aquosa: DNA - Nesta fase superior, o DNA, que não é solubilizado nos solventes (fenol
ou clorofórmio), vai permanecer na fase aquosa.
2) Fase orgânica - Nesta fase, todos os outros elementos irão para a fase orgânica (inferior),
como proteínas, lipídeos, RNA degradados, carboidratos e outros elementos minerais solúveis em
fenol/clorofórmio.
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA para
outro tubo. O RNA degradado se torna insolúvel, pois forma reações de complexação com outros
elementos do citoplasma. Se estiver íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente
orgânico.
• • • • Solução concentrada de NaCl - O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos
degradados do citoplasma, deixando o DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar e
remover a fase aquosa do pellet ((Pequena porção precipitada de uma solução) precipitado, ou
seja, recuperar apenas o sobrenadante, pois nele estão nossas substâncias de interesse.
 
• • • • Coluna de adsorção do DNA - O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato.
Assim, podemos adicionar uma coluna com carga positiva (normalmente é utilizada uma
coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar. Dessa forma, o DNA vai ficar retido na coluna
devido à sua carga negativa e os outros elementos irão passar direto pela coluna, ficando no
fundo do tubo. Para remover o DNA da coluna, usamos um tampão de eluição carregado
negativamente em grande quantidade. Normalmente, são usados os tampões Tris-HCl ou o
EDTA. Eles irão competir com o DNA pela ligação na coluna de adsorção e, como estão em
grande quantidade, ganham a competição e se aderem à coluna expulsando o DNA. O
procedimento é feito também por centrifugação, porém o material que sairá da coluna será
rico em DNA.
Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos supracitados, precisamos eliminar
qualquer resíduo que por um acaso ainda esteja misturado ao DNA. Para isso, adicionamos
isopropanol, que precipita apenas o DNA. Após centrifugação, como o DNA encontra-se precipitado,
nosso DNA puro encontra-se no pellet.
Curiosidade - O pellet (Pequena porção precipitada de uma solução) fica bem aderido no fundo
do tubo, podemos lavar o tubo com etanol 70%, por exemplo, para remover todos os reagentes e secar
o tubo, que o DNA continua aderido ao tubo.
O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo geral de extração de
DNA. No entanto, depois da lise da membrana e precipitação das proteínas citoplasmáticas, é
adicionada uma solução de NaOH com pH bastante básico a ponto de desnaturar o DNA cromossomal
e o também o próprio DNA plasmidial. Em seguida, é adicionada uma solução ácida neutralizadora que
regenera o DNA plasmidial, mas não o cromossomal. Assim, podemos então separar por centrifugação,
pois o DNA do plasmídeo fica em suspensão enquanto o DNA cromossomal precipita.
• • • • Procedimentos de extração de RNA:
O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração de DNA, mesmo o
RNA sendo mais frágil e demandando mais cuidados. Todo material que entra em contato com a amostra
deve ser tratado com soluções neutralizadoras de RNase e possuir a característica de ser RNase free.
Além disso, a amostra deve sempre ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de
alguma RNase remanescente.
Vamos agora rever as três etapas do protocolo de extração de DNA, ressaltando quais são as
diferenças entre a extração do DNA e RNA.
- FASE1 - Quebra da membrana - A quebra pode ser feita de forma mecânica ao invés de
utilizar o tampão de digestão, usando um pistilo, bastão ou sonicador, aparelho capaz de
utilizar energia das ondas sonoras para agitar partículas. Esta técnica apresenta uma
vantagem: por ser mais rápida, diminui a chance de degradação do RNA.
 
- FASE2 - Extração do RNA - Não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na
extração de RNA deve ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o
DNA fique na interface (essa fase intermediária só é formada durante a extração do RNA devido ao
pH ácido).
 
- FASE3 - Purificação do RNA - A purificação do RNA é muito parecida com a do DNA, a
diferença está no armazenamento: para RNA é preferível utilizar nitrogênio líquido.
1) Extração de DNA/RNA
Amostra inicial com as células digeridas.
2) Adição de solução fenol/clorofórmio
Centrifugação da amostra, formando duas fases: orgânica (em amarelo no fundo do tubo) e
aquosa (em azul acima da fase orgânica). No tubo A, temos DNA e RNA dissolvidos na fase aquosa e no
tubo B o DNA degradado fica na interface.
3) Separação da fase orgânica por centrifugação
A fase orgânica é descartada, permanecendo apenas a fase aquosa no tubo.
4) Adição de acetato de amônio e etanol absoluto
Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no fundo do tubo. Todo o líquido restante é
descartado.
5) Ressuspensão e armazenamento do material genético extraído
O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o DNA ou RNA pode ser armazenado.
• • • • Armazenamento do DNA e do RNA purificados:
- Pós-isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber cuidados imediatos.
- Para o DNA, devemos armazená-lo em um tubo de plástico (DNA tem afinidade por vidro, por
isso o uso de tubos de plástico), preferencialmente de propileno, vedado a fim de evitar evaporação, em uma
temperatura abaixo de 0°C. Dessa forma, diminuímos a atividade biológica das DNases.
- O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A validade do DNA
nessas condições, é bastante alta.
Temperatura ambiente - 26 semanas.
Temperatura 2º a 8º - 1 ano
Temperatura -20 º - 7 anos
Temperatura -70º - + de 7 anos
 
Atenção: O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não contenha
água, pois a água quando congela forma cristais que podem danificar os materiais orgânicos.
 
Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado em etanol a 70%
congelado na temperatura de -70°C. Alguns estudos mostram que, após 2 meses, mantido na
temperatura de -20°C, o RNA não perde sua integridade. No entanto, é importante destacar que, na
temperatura de -20°C, ainda temos uma atividade RNases, sendo assim mais recomendado o
congelamento em temperaturas de -70°C ou inferior. Assim como no DNA, os tubos devem ser de
plástico estéril e manuseados com luvas limpas por uma solução de água com dietilpirocarbonato
(composto capaz de eliminar RNases dos tubos) ou então por tubos com garantia de serem RNase-free.
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, o RNA fica menos
suscetível a agentes degradantes.
 
• • • • Quantificação, análise de pureza e integridade do material molecular:
O controle de qualidade da extração é dado pela quantificação, pureza e integridade desses
materiais.- Quantificação - Na quantificação, determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da
amostra inicial. A técnica mais utilizada é a fluorometria. Nesta técnica, uma pequena alíquota da
amostra é transferida para outro tubo, onde é adicionada uma solução e um agente fluorescente capaz
de se ligar entre as bases do DNA e RNA.
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele emite fluorescência e
assim podemos medir, com ajuda de um aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.
A quantidade de fluorescência da amostra é diretamente proporcional, ou seja, quanto maior
for a fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.
- Pureza - Em relação à pureza, podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes. A
pergunta aqui é: será que com o material extraído temos também fenol, álcool, proteínas, RNA (quando o
desejo é DNA) e algum reagente residual?
Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria, que tem como princípio básico
utilizar a capacidade das moléculas orgânicas de absorverem (absorbância) ou transmitir
(transmitância) luz em determinado comprimento de onda, em um equipamento chamado de
espectrofotômetro.
 
Comprimento de onda no espectro da luz. UV e infravermelho não são visíveis
Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. Na prática, a
quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da substância, assim, quanto
maior for a concentração, maior é a absorção de luz (medido pela densidade óptica – OD).
Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos pesquisando (280nm,
260nm ou 230nm). Novamente, aqui, quanto maior for a absorção de luz, maior a quantidade de
determinado material.
Na imagem a seguir, vemos um resultado de uma análise espectrofotométrica, mostrando um pico de
absorção da luz no comprimento de onda 260nm, o que indica a presença de DNA ou RNA.
 
Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão (divisão) da densidade óptica
(OD) no comprimento de onda 260nm pela OD no comprimento de onda 280nm.
Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual a 1,8. Valores
inferiores a esse indicam contaminação com proteínas e que o processo extrativo não foi realizado de
forma correta. Outra forma de verificar essa pureza seria pela razão entre a OD 260nm OD 230nm, com
material genético considerado puro quando estiver na faixa entre 1,8-2,2.
 
- Integridade - Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é feita a
partir da técnica de eletroforese, que é uma técnica com uma enorme quantidade de variações e
desdobramentos e é utilizada para os mais variados objetivos. Aqui iremos nos ater ao princípio
básico da técnica e a sua aplicação no controle da integridade do material que foi extraído.
No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas. O DNA/RNA, devido ao
grupamento fosfato, apresenta carga negativa. Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho.
 
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente é utilizado o
brometo de etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização de bandas de DNA em um
equipamento chamado transiluminador. Se a amostra estiver íntegra, verificamos apenas uma marca
(banda) intensa no gel de eletroforese. No entanto, caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda se
apresenta “espalhada” (arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que existem diversos
fragmentos, ou seja, o DNA/RNA não está íntegro.
 
Bandas bem definidas Bandas com arraste
 
 
• • • • Síntese de cDNA:
Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia Molecular, PCR,
sequenciamento, clonagem e hibridização que são dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria
dos casos). Essas técnicas podem ser utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a simples
extração de DNA/RNA é suficiente para analisar o que se deseja.
Por exemplo, queremos ver se uma pessoa tem uma infecção pelo novo coronavírus (SarsCoV-
2), um vírus de RNA. Nesse caso, a amostra extraída é o RNA viral, mas é inviável a sua detecção, pois
precisamos de grandes quantidades de material, preferencialmente de DNA, por ser mais estável.
Logo, o material precisa ser multiplicado o suficiente para poder ser devidamente analisado. Para
isso, usamos a técnica do PCR, que consiste em amplificar uma amostra de DNA.
Como fazer essa análise? Isso porque, segundo o dogma central da Biologia, o DNA é transcrito
em RNA e o RNA é traduzido em proteína. Essa questão foi resolvida por meio de outro vírus, o vírus
da imunodeficiência humana (HIV), que revolucionou a Biologia Molecular.
Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula-alvo, injeta o RNA viral no citoplasma. Lá,
uma proteína do vírus chamada transcriptase reversa converte o RNA em DNA, esse DNA entra no
núcleo e outra proteína chamada integrase junta o DNA do vírus com o da célula-alvo. Agora, a célula-
alvo é capaz de transcrever o DNA viral (presente no genoma da célula hospedeira) em RNA viral, que
forma outro vírus de HIV, e assim continua o processo de infecção.
OBS: Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do vírus é capaz de
alterar o dogma central da Biologia, transformando o RNA em DNA.
E se usássemos essa polimerase na Biologia Molecular para gerar DNA a partir de, por exemplo, um
RNA mensageiro (RNAm)? E assim foi feito.
O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). Recebe esse nome
pois é complementar ao RNA molde.
 
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:
 
- RNA molde: é a sequência de RNA usada para a construção do cDNA.
- Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA.
- Nucleotídeos (A, T, C, G): são unidades funcionais para a síntese do cDNA.
- Íon bivalente de magnésio (Mg2+): é um cofator essencial para o funcionamento da transcriptase
reversa.
- Primers: são pequenos fragmentos de DNA fita simples que se complementam ao RNA para dar início à
transcrição reversa.
- DNA polimerase: responsável por sintetizar o DNA a partir dos nucleotídeos presentes.
A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo acoplamento da
transcriptase reversa e início da sua atividade, formando o cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma vez formado o
cDNA, o fragmento de RNA usado como molde é degradado pela RNase H, um domínio do próprio
complexo da transcriptase reversa.
• • • • Síntese do cDNA:
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa qualidade é a
construção do primers.
Existem três estratégias gerais de construção de primers:
 
- Oligo dt - É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda
poli-A do RNAm maduro. A cauda tem esse nome por ser formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A
cauda serve para proteger o RNAm de degradação enzimática durante todo o processo de locomoção
em direção ao ribossomo. A cauda poli-A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o
ribossomo. Ele é preferencialmente utilizado quando queremos fazer cDNA de RNAm. Para o oligo
dT é importante que o RNAm esteja íntegro, uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do molde. Se
o RNAm estiver fragmentado, o cDNA vai ser feito apenas de um pequeno trecho e talvez seja não
funcional.
- Randômico - Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer
RNA presente, incluindo rRNA (RNA ribossomal) e tRNA (RNA transportador). Ele é indicado para
amostras de sequência desconhecida ou de difícil manipulação.
- Específico - É o primer construído especificamente para um determinado RNA, sendo
utilizado quando se tem um alvo determinado, por exemplo, diagnosticar um RNA viral. O primer é
desenhado de forma complementar ao RNA viral. Por isso, ao término da reação, só teremos cDNA se
o primer encontrar o seu RNA alvo. Para o primerespecífico, é fundamental que toda a sequência do
DNA/RNA seja conhecida.
Formação da fita dupla de cDNA
É importante ressaltar que os três tipos de primers podem ser combinados, formando um primer
com um trecho oligo dT e outro trecho específico.
Temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada pela transcriptase reversa e uma fita de
RNA ligada ao cDNA parcialmente degradada pela RNase H. Assim, sintetizamos um RNAm maduro,
sem a presença de íntrons. Esses fragmentos de RNA serão utilizados como primers de iniciação pela
DNA polimerase que irá construir o DNA complementar ao cDNA.
 
A construção de cDNA tem como funções principais:
- Possibilitar a construção de uma biblioteca genômica, estabelecendo relações de quais genes
podem expressar determinadas proteínas, o que pode ser aplicado para elaboração de terapias, estudo
de espécies, doenças etc.
- Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR.
- Determinar o nível de expressão gênica de uma determinada proteína no organismo.
- O cDNA pode ser utilizado na clonagem (formação de novos trechos de DNA em outro indivíduo),
criação de bibliotecas (responsáveis por identificação e armazenamento de informação gênica), testes de
microarranjo (coleção de DNAs presos em uma superfície sólida, para estudos de genotipagem, expressão,
entre outros), detecção de SNP (do inglês Single Nucleotide Polymorphism, são variações pontuais
encontradas ao longo do DNA, isto é, são diferenças num único nucleotídeo), etc.
 
TEMA 7
 
 
• • • • Princípios da PCR concencional
Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro relembrar
algumas informações sobre o DNA e o RNA. Tanto o DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos,
que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e, consequentemente, do material genético. A partir da junção
de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses tijolos? Em primeiro lugar, os
nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. É na ribose que reside a principal diferença entre
DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA não
possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.
No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U).
Essas bases são as responsáveis pela informação genética.
A célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar, em sequência, uma informação
preciosa. Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da
(desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico) presente no terceiro
carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é
conhecida como fosfodiéster, sendo considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas
sequências de DNA ou RNA são formadas. É importante manter em mente que o grupamento fosfato
confere carga negativa à molécula de DNA.
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o
fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases
nitrogenadas livres para interação com outras bases nitrogenadas,
normalmente, do tipo oposto.
As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em
dois grupos químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos
que possuem:
Pirimidinas (C, T, U) - Possuem um anel.
Purinas (A, G) - Possuem dois anéis
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos. Essas
interações são chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas
fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a
temperatura, e químicos, como o pH.
No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de
erros e garantem à molécula uma de suas características fundamentais: a complementariedade. É a partir
dessa complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do RNA, as polimerases,
sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo
tempo, é a característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de
replicação semiconservada.
 
• Reação em cadeia pela polimerase: amplificando DNA in vitro:
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para
duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos
utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA e os princípios básicos de sua replicação para
simplificação e adaptação da técnica in vitro
- Complementariedade entre fitas antiparalelas - Primeira característica do DNA importante na
sua replicação in vitro: as bases nitrogenadas de uma fita interagem especificamente com as bases
correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações frágeis que podem ser desfeitas pelo
calor. Ao aquecermos a solução acima de 90ºC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla
em duas fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem e, ao baixarmos a
temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida.
 
- Síntese enzimática pela polimerase - Segunda característica importante para a replicação do DNA
in vitro. Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples como se fosse um molde, e adiciona a
base nitrogenada complementar na fita que está sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo
(na natureza), a polimerase não inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita
dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de replicação ou adicionar os primeiros
nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros
nucleotídeos é feita por outra enzima, chamada primase.
Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction – PCR), a abertura do DNA em fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma
enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos pequenas sequências de
nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas
sequências sintéticas são chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno
de 20 nucleotídeos, conhecidos como primers, em inglês. Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos
por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso,
que se liga à fita no sentido 5’→3’.
 
Etapas da reação em cadeia da polimerase:
Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida
próximo a 100ºC, e sabemos que a reação de síntese de novas fitas de DNA é feita por meio de uma
enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima precisa de
oligonucleotídeos iniciadores (primers) que se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado
em uma fita simples. Agora, podemos entender como essa última se desenvolve.
Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou
reagentes mínimos – para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um
microtubo.
Os reagentes mínimos necessários para a amplificação são:
• O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.
• Os oligonucleotídeos sintéticos (primers) que são complementares à região do DNA molde a ser
amplificado.
• A Taq polimerase, termorresistente.
• Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.
• Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de
que os três fosfatos são usados como fonte de energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq
polimerase aconteça.
• A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.
 
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclossintetizada continuamente (chamada de fita líder), enquanto a outra é sintetizada em
fragmentos (chamada de fita atrasada) devido à direção oposta da replicação.
4. Formação dos Fragmentos de Okazaki:
 
- Na fita atrasada, a síntese ocorre em pequenos segmentos chamados fragmentos de Okazaki. Cada
fragmento é iniciado por um curto segmento de RNA chamado primer, que é sintetizado pela enzima
primase.
 
- Após a síntese dos fragmentos de Okazaki, a DNA polimerase remove os primers de RNA e substitui-
os por nucleotídeos de DNA.
 
5. Ligação dos Fragmentos:
 
 - A enzima DNA ligase conecta os fragmentos de Okazaki, formando uma fita contínua. Essa etapa é
crucial para garantir que as fitas recém-sintetizadas sejam completas.
 
6. Finalização:
 
 - Quando as duas forquilhas de replicação se encontram ou quando todas as regiões do DNA foram
replicadas, o processo termina. O resultado final são duas moléculas de DNA idênticas, cada uma
composta por uma fita parental e uma nova fita (replicação semiconservativa).
 
 
Apesar disso, a existência de erros é comum, mas as células possuem mecanismos de controle para
eliminar os erros: trata-se das verificações e dos reparos do DNA.
 
As polimerases, por exemplo, fazem um trabalho de revisão do pareamento das bases nitrogenadas. Se,
após a formação da molécula de DNA, ainda houver alguma base mal pareada, ela será substituída pelo
reparo por mal pareamento.
 
Porém, se caso o DNA seja danificado, outros mecanismos podem fazer o seu reparo: química reversa,
reparo de excisão e reparo de quebras de fita dupla, são exemplos.
 
Ainda, a célula pode entrar em processo de morte programada (apoptose) em alguns casos, de forma que
o DNA danificado não seja transmitido a novas células que serão formadas.
 
 
 
• • • • Transcrição do DNA em RNA
 
A transcrição é o processo de formação de uma molécula de RNA a partir de uma molécula de DNA.
Em outras palavras, um gene da sequência de DNA é transcrito em uma molécula de RNA, que levará,
por sua vez, à síntese de uma proteína.
 
O RNA é uma molécula de fita simples e é produzida a partir trechos específicos contidos no DNA, que
são chamados de genes.
 
A transcrição ocorre durante a fase intérfase do ciclo celular. É importante porque, por meio dela, ocorre a
transferência de informação genética contida no DNA para o RNA para que possa ocorrer a síntese de
proteínas, conforme as necessidades da célula. Nos eucariotos, a transcrição ocorre no núcleo da célula.
 
A transcrição do DNA em RNA é um passo crucial na síntese de proteínas e ocorre em duas etapas
principais: a iniciação e a elongação, seguidas pela terminação.
 
Na transcrição, a enzima RNA-polimerase se fixa na região promotora de uma das fitas de DNA (fita
molde), no trecho com o gene a ser transcrito, para dar início à produção da fita de RNA, promovendo o
pareamento de bases. Assim como o DNA, a fita de RNA também é formada na direção 5’-3’. Quando a
RNA-polimerase termina a transcrição, chegando ao fim do gene, recebe um “sinal” e se separa da fita de
DNA
Diferentemente do DNA, o RNA possui apenas uma fita, e seu tamanho varia de acordo com a proteína que
produzirá, pois esta fita recém-montada recebe o nome de RNA transcrito primário do gene, que é
processado e acaba deixando o núcleo da célula, migrando para o citoplasma. Lá, participará da síntese de
proteínas, como RNA mensageiro (RNAm), durante o processo que chamamos de tradução.
 
# Etapas da Transcrição:
 
1)Início - Etapa em que ocorre a ligação da RNA polimerase ao DNA.
2) Alongamento - Etapa em que são adicionados nucleotídeos à fita de RNA crescente.
3) Liberação - em que ocorre a liberação do RNA e da RNA polimerase.
4) Maturação - Etapa em que ocorrem os reparos na cadeia de RNA, sendo posterior à transcrição.
 
Durante a transcrição do DNA para o RNA:
 
- São transcritos trechos que serão traduzidos posteriormente em proteínas, denominados éxons;
- E Regiões silenciosas, que NÃO serão transcritas em proteínas, chamadas íntrons.
 
Os íntrons são excluídos da molécula de RNA durante a etapa de maturação, num processo de reparo
chamado splicing. Após o splicing, a molécula de RNA terá apenas os trechos éxons, que são traduzidos
em proteínas.
Em resumo, no decorrer do processo, o RNA que é produzido a partir do DNA é classificado como
transcrito primário, mas ainda dentro do núcleo. Após o processo de maturação, os íntrons são
descartados por clivagem, sobrando os éxons, que, em seguida, serão unidos, formando o RNAm
maduro que dará origem à proteína.
 
 
• • • • TRADUÇÃO DE RNA PARA SÍNTESE DE PROTEÍNA
 
A tradução refere-se ao processo de tradução de uma sequência de nucleotídeos do RNAm em uma
sequência de aminoácidos da proteína. Logo, a tradução é o processo de síntese de proteínas, ou seja, de
formação de proteínas.
 
Uma proteína é um polipeptídeo constituído por diferentes aminoácidos. Como mencionado, na
tradução, a sequência de nucleotídeos é quem determina a sequência de aminoácidos nas proteínas.
Portanto, podemos dizer que o DNA possui as informações genéticas que são transcritas em RNA para
sintetizar as proteínas.
 
Cada aminoácido é codificado por um códon ou mais. O códon presente no RNAm determina o
aminoácido que vai entrar na cadeia proteica e formar a proteína.
 
# Etapas da Tradução:
 
1) Iniciação - A tradução começa quando o ribossomo se liga ao mRNA. A subunidade menor do
ribossomo reconhece a extremidade 5' do mRNA e se liga a ela.
 
 - Um tRNA (RNA transportador) que carrega o aminoácido correspondente ao códon inicial (geralmente
o códon AUG, que codifica a metionina) se liga ao mRNA.
 
 - A subunidade maior do ribossomo se junta à subunidade menor, formando um ribossomo
funcional. A Met sempre será o aminoácido que dará início à tradução, mas NÃO É SEMPRE O
PRIMEIRO aminoácido da cadeia proteica, já que, muitas vezes, a Met é removida após a tradução.
 
2) Alongamento - - Durante essa fase, os tRNAs continuam a se ligar aos códons do mRNA no
ribossomo. Cada tRNA traz um aminoácido específico que corresponde ao códon.
 
- O ribossomo catalisa a formação de ligações peptídicas entre os aminoácidos, formando uma cadeia
polipeptídica em crescimento.
 
- O ribossomo se move ao longo do mRNA, permitindo que novos tRNAs entrem na estrutura e
continuem a adicionar aminoácidos à cadeia.
 
3)Terminação - Fase marcada pelos códons de terminação, que podem ser UAA, UAC, UGA. Esses
códons não codificam aminoácidos nem fazem ligação com o RNAt; em vez disso, eles possuem
estrutura para se ligarem a fatores de liberação de proteínas, fazendo com que a proteína recém-
formada seja considerada completa e se separe do ribossomo.
 
 
• • • • O dogma central da biologia molecular:
 
Os processos de replicação, transcrição e tradução que acabamos de estudar definem o chamado dogma
central da biologia molecular, ou seja, explicam o fluxo da informação genética até a formação da
proteína (DNA -> RNA-> proteína).
 
Postulado por Francis Crick, em 1958, o dogma central da biologia molecular explica tais mecanismos de
transmissão e expressão da informação genética em proteínas, componentes essenciais que atuam nas mais
diversas funções da célula e do organismo, de forma geral.
 
O código genético relaciona a sequência dos nucleotídeos que constituem o DNA com a sequência de
códons do RNAm e os aminoácidos que constituem as proteínas. Foi elaborado com base nas
combinações dos 4 nucleotídeos do RNAm (U, C, A, G), em grupos triplos, obtendo-se 64 combinações,
que codificam aminoácidos específicos.
 
Atualmente, conhecemos 20 aminoácidos, o que nos leva a concluir que existe mais de um códon para o
mesmo aminoácido. Ou seja, um mesmo aminoácido pode ser traduzido por diferentes códons. Em
função disso, dizemos que o código genético é degenerado (ou redundante).
 
Exemplo:
 
TEMA 3
# Funções, estrutura e organização do genoma procariótico:
 
Os organismos procarióticos incluem todas as bactérias e arqueas e sua estrututra celular é
bastante diferente dos organismosde elevação e
redução da temperatura do qual a PCR consiste.
 
Vejamos:
 
- A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas
simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos, 95ºC, por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a
10 minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito
concentradas, superenoveladas e ser muito longas.
 
- Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação,
anelamento e extensão.
 
• • • • Desnaturação - É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por
cerca de 1 minuto. O tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada reação e genoma. Por
exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois C faz
pontes triplas com G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem
ligações duplas.
 
• Anelamento - Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a
65ºC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da temperatura deve ser feita com exatidão para
que os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se a temperatura for baixa demais, a
fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar
inespecificamente e sua reação não funcionará apropriadamente. Se for alta demais, os oligonucleotídeos
se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a eficiência da sua reação será
gravemente comprometida.
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase
reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla.
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as fitas duplas
recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40
vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir que a síntese de
todas as fitas seja concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o
material amplificado.
 
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente:
os termocicladores. Graças a eles, uma PCR convencional média dura de 1 hora e meia a 2h.
 
OBS: A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e
antissenso, conhecida como amplicon (produto amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo,
tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do primeiro ciclo, teremos 2
cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:
 
- PCR qualitativa - Todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de etapas
posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se dá pela constatação da presença ou
ausência do produto alvo da amplificação.
 
- PCR quantitativa - Também conhecida como em tempo real. Os ciclos se dão em um aparelho
capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é capaz de quantificar em tempo real.
Existem dois métodos que são mais comuns para a quantificação. Nesse caso, não há necessidade de
revelação posterior à reação, o que a torna mais rápida.
 
- Eletroforese em gel de agarose:
 
Separando e revelando o resultado - após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase,
temos um microtubo com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é transparente como a
água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário revelá-la.
 
Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho
corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou
um agente revelador especial.
 
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa
chamada de matriz ou gel de agarose.
 
A agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve em líquido aquoso
quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma
malha com pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de modo que moléculas menores de
DNA passarão com maior facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior
dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha. Assim, podemos
separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA
amplificado, poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta simplesmente variando a
concentração da agarose que usamos para fazer o gel.
 
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos
com um pente com pequenos dentes largos. Para podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo
gel de agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de
corrida e faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação
funcione adequadamente.
 
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel
com o corante azul, podemos começar a eletroforese.
 
Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas para
corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável.
 
A eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem
suas moléculas ionizadas migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o
polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo.
 
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o
polo positivo (cátodo) quando em solução submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do
gel de agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa por dentro da agarose
e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel.
 
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho
molecular do DNA que consiste em sequências de DNA de tamanhos conhecidos, como se fosse uma
escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho das
sequências de DNA que amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de
bandas.
 
Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado (ou amplicon)
no gel de agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando
excitada no comprimento de onda correto. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio,
capaz de se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna
potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e as boas
práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.
 
Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA
amplificado de acordo com o marcador de tamanho molecular.
 
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser
uma única banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas bandas.
 
Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e
resolução de possíveis problemas.
 
Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo
é o gel de acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de DNA com alta resolução, de
forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas. No
entanto, exige revelação por sistemas diferentes, mais complexos, que nem todos os laboratórios
possuem estrutura para execução.
 
• • • • Variações da técnica de PCR:
 
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnicaideal para o
nosso objetivo. Então, utilizamos outros métodos.
 
Reação de transcrição reversa - Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma
nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-dependente.
Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar
doenças causadas por vírus que não têm material genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser
detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A Taq polimerase, no entanto, não é capaz de
reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.
 
Como conseguimos resolver esse problema? Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a
partir de RNA!
 
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de genoma
RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela humanidade foram os de genoma RNA chamados de
retrovírus. Esses vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA →
proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA
complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. Isso mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma
como molde para síntese de DNA.
 
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo nome oficial é
DNA polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR,
pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os pesquisadores
conseguiram isolar a TR, ela passou a ser usada para reações in vitro.
 
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT) precisa de alguns
fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o
que requer muito cuidado na manipulação e extração do material. Esse RNA é assim chamado por possuir o
mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro (mRNA), mas expande o
entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como os próprios
retrovírus. Além do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de
cDNA a partir do RNA+.
 
A TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa deve preceder
a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição
reversa (RT) seguida por PCR, vem o termo RT-PCR.
 
A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR
convencional, para iniciar a transcrição. Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por
isso, são chamados de hexâmeros.
 
- Primeiro caso - Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao
qual os hexâmeros se anelam.
 
- Segundo caso - Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui
uma biblioteca de expressão gênica.
 
- Terceiro caso - Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA
correspondente a todos os RNAs da célula, mensageiros ou não. Similar à PCR, uma vez que os
oligonucleotídeos se ligam à fita de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA complementar
usando o quarto reagente, os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).
 
Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de
determinada sequência, a RT (reação de transcrição) é linear: cada etapa acontece apenas uma vez, o
que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros
ao RNA+ por poucos minutos. Na maioria dos casos, não há necessidade de temperaturas altas de
desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo, podem ocorrer estruturas secundárias no
RNA que precisam de temperaturas moderadas para desnaturação.
 
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR.
 
Diferentemente da PCR convencional, a RT (reaç de transcrição) possui diversas TR
(transcrição reversa) de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre
diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas duas temperaturas, de
anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por
meses a anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado imediatamente como molde em uma
PCR – a chamada RT-PCR.
• • • • Nested-PCR
 
Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose
pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o amplicon. Nós chamamos essa capacidade de o
resultado representar a realidade de sensibilidade.
 
A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que
possuem o DNA-alvo na realidade. Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por aumentar
exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional
pode não ser suficiente, pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô
em que não há aumento do número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes.
 
Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode
aumentar as chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a interpretação. Observe no gráfico
que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta exponencialmente até chegar a um
platô, em que não há mais aumento significativo de DNA a cada ciclo.
 
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da
primeira reação como molde para uma segunda PCR, em uma técnica conhecida como nested-PCR (ou
PCR aninhada). Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers para a primeira
reação, chamado de iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR, conhecidos como
internos.
 
Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e
conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional)
para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes.
Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR.
Caso seja utilizada corretamente, a adição de etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a
especificidade da PCR.
 
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da
reação, que deve ser pensada como um conjunto. A primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que,
ao se anelarem a determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon longo e
específico o suficiente para ser usado como DNA-molde na segunda reação.
 
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem
reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar produtos inespecíficos.
 
Outro cuidado recomendável para a segunda reação é a purificação do produto da primeira
reação antes de utilizá-lo na segunda, o que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de
inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR.
 
Note o uso de iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado
como molde de amplificação na segunda reação, que usa iniciadores internos.
 
• • • • PCR quantitativo em tempo real – qPCR
 
Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para
separação dos produtos da PCR e posterior revelação das bandas através de agentes intercalantes do
DNA que emitem fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz ultravioleta.
Esses tipos de PCR são categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o
DNA amplificado for utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR
qualitativa se torna pouco informativa.
 
A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos
resultados, sem necessidadede revelação posterior. Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma
PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz de detectar o
sinal fluorescente.
 
Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da
quantidade de DNA-alvo e da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo
sintetizada naquele ciclo.
 
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que
contenham lasers para excitação do fluoróforo e detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais
sofisticado, mais caro e mais complexo do que um termociclador convencional, porém seus resultados
podem ser igualmente mais informativos e precisos.
Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura única para
anelamento e extensão: todas as duas acontecem a 60 C.
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem
especialmente na forma como a fluorescência é emitida e na especificidade do sinal fluorescente.
 
• SYBR Green - O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas
duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser excitado em comprimento de
onda azul, e então emite fluorescência verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR
tem sua fluorescência drasticamente reduzida. Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao
DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema alternativo na revelação da PCR convencional
em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de etídio.
 
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão,
pois esse é o momento em que há maior número de bases pareadas em fitas duplas. O aparelho
termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa
fluorescência será detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por
ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois maior será a quantidade de
DNA fita dupla sendo sintetizada. Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional
à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, até que a reação atinja sua saturação, e um
platô após a curva de crescimento exponencial será observado.
 
 
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é
controlada:
O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de
fluorescência seja menos específica.
 
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve). Nessa
etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente, para medir em qual temperatura 50% das fitas
duplas de DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da
fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o
tamanho da sequência.
Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em
média. Em uma curva de dissociação boa e específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar
na mesma temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico.
 
Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais de um pico será visto na curva de
dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível de controle de qualidade da
reação que não deverá ser ignorado. A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas
um produto amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR.
 
• • • • TaqMan:
 
Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem do jogo de videogame PacMan. Assim
como na técnica SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e
detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação. 
 
Entretanto, a TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência acontece: Além
de todos os reagentes que uma PCR convencional possui, temos a presença de uma sequência extra,
complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é
curta, com tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui
temperatura de anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma molécula fluorescente na
extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de fluorescência.
 
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se a
molécula fluorescente não for liberada de seu bloqueador.
 
Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela
adiciona nucleotídeos (polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos (função
exonuclease).
 
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima
chega ao nucleotídeo da sonda que contém o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre
de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável.
 
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da
sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. A especificidade dada pela sonda é tamanha
que diferenças de apenas um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas
como single nucleotide polymorphism (SNP).
 
OBS: Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da
especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do que a técnica de SYBR.
Entretanto, as sondas tornam a reação mais cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação
ao SYBR é a capacidade de múltiplas detecções na mesma reação com maior precisão e
confiabilidade.
 
 
• • • • Quantificação :
 
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será
detectada pelo aparelho.
 
- Configuração do aparelho - Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual
laser e quais filtros usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da emissão ele deverá
buscar o sinal para detecção.
 
- Detecção de ruído - Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de
amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza
fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da
reação que não está relacionada com a amplificação da sequência-alvo em si.
 
- Definição do limiar - Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal
de ruído (background). O ruído vai ser utilizado para determinar o limiar de detecção (threshold).
 
O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção
acima do ruído (ou da fluorescência de base) é chamado de valor de Ct.
 
Esse valor é importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da
amostra amplificada. A relação entre concentração inicial de DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente
proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma amostra, maior a quantidade de DNA
que ela originalmente continha.
 
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (ou normalizar) a reação internamente
são a ROX, um fluoróforo passivo (cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do
DNA) usado como referência, e o Rn, que representa um ajuste (ou normalização) entre o sinal do
fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda TaqMan) e a referência ROX.
 
A maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo a nós
apenas a observação para eventual detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma vez, a
qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de qualidade para que diferenças mínimas na quantidade
sejam confiáveis.
 
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal
emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o resultado na tela do computador ao qualele precisa estar
ligado para funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.
 
Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa o valor de limiar de detecção /
quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam a
quantificação das amostras e, como você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com
maior quantidade de DNA é a mais à esquerda no gráfico, com menor Ct.
 
 
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por quantificação
relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt).
 
- Pela curva padrão = Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária.
Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa
curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós
mesmos, através de clonagens e purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma diluição
seriada. Para isso, colocamos uma fração da solução de maior concentração em um tubo contendo apenas
água, e depois deste tubo para outro com apenas água, e assim sucessivamente até termos pelo menos 5
pontos de curva.
 
Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de forma
que o próprio computador calcule os parâmetros de qualidade da curva. Com esses valores, o
computador calcula a quantidade de DNA existente nas nossas amostras de concentração desconhecida.
 
Alguns dos principais valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração
da amostra-teste são a linearidade da curva e a eficiência de amplificação.
 
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em vermelho),
obtidas pela diluição seriada, e três amostras desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi
calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.
 
- Linearidade da curva - Matematicamente conhecida como R2, deve ser superior a 0.985 para que a
reação seja aceitável, e a quantificação de sua amostrateste seja calculada com máximo de precisão. Usando
fórmulas de linearidade, calculamos o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da amplificação
começar, baseado no Ct de cada uma
 
- Eficiência de amplificação - Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo
amplificado dobre, o que significaria uma eficiência de 100% da reação. Porém, devido a pequenos erros,
podemos considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais
robustos com uso de replicatas (repetições da mesma reação em poços diferentes.).
 
 
• • • • Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt):
 
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja
quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de referência. A determinação da quantidade de um DNA-
alvo de interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra
ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a
quantidade do gene de interesse pode variar de acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode
ser devido à quantidade de material usado na extração. Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela
quantidade de cDNA total e, para isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um gene
constitutivo expresso em níveis estáveis nas células.
 
O segundo delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração na
amostra-teste e uma amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará
ter passado pela primeira subtração; ou seja, também terá sido normalizada.
 
ΔCt=Ctgene alvo −Ctgene de referencia 
 
Seguido por:
 
ΔΔCt=(Ctgene alvo −Ctgene de referencia )calibrador −(Ctgene alvo −Ctgene de referencia )amostra 
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo
têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 10% entre si. Por isso, curvas-padrão
iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de
procedermos para a técnica de quantificação relativa.
 
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos
um método especial. A técnica utilizada é RTqPCR: uma reação de transcrição reversa acoplada a
uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.
 
• • • • PCR em multiplex :
 
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-
PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar
as reações separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto
desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é
identificado chamamos de multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.
 
O mais importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os amplicons tenham
tamanhos distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de
ultravioleta não sejam confundidos.
 
Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma reação
é possível ao utilizarmos duas (ou mais) sondas distintas, cada uma capaz de hibridizar
especificamente a sua sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam
fluorescência em comprimentos de onda diferentes.
 
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso porque
a emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas
duplas do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é possível distinguirmos
entre os sinais dos diferentes produtos.
 
Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando
os produtos distintos têm sequências diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de
50%. Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas diferentes. No entanto,
sequências distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas,
pois não veremos diferenças em suas curvas de dissociação.
• • • • Aplicações da PCR
 
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de
DNA até termos milhões e bilhões de cópias da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser
visualizada a partir de técnicas especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a tornam ainda
mais relevante e útil em diversos contextos. Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências
idênticas?
 
• • • • A PCR e as suas variantes em ciências forenses:
 
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já deve ter
entrado em contato com a identificação de um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime,
seja por ter assistido a alguma série policial, seja por ter lido alguma reportagem da vida real. Isso só é
possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a
origem do DNA. Denominadas marcadores moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de
polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre indivíduos sem
causar nenhum tipo de interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.
 
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas
em tandem (ou STRs – short tandem repeats).
 
As STRs (repetições curtas em tandem ) variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e
oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se a detecção de várias STRsfor usada em
conjunto.
 
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser
visualizado por separação das bandas em gel de agarose e coloração por brometo de etídio.
 
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim,
aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR,
lembrando que os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem.
 
Um cientista forense, além de fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a
identificação de indivíduos através do seu perfil genético.
 
• • • • A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas:
 
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao diagnóstico,
acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de doenças.
 
Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de
sequências que deveriam ou não existir em determinado contexto.
 
Seu uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam
desde genéticas a infecciosas.
 
As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis –
autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas.
 
O uso da PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é
a doença e de seu perfil genético.
 
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso, dentre dois alelos
distintos, em uma mesma reação e assim ajudar no reconhecimento de pequenas mutações que
levariam ao desenvolvimento de uma doença genética.
 
Mas temos outras aplicações, usando PCR convencional. Vamos usar a doença de Huntington como
exemplo. Nessa doença genética autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de três
nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina.
Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura que causa perdas motoras, cognitivas
e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil também. A PCR
torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da região
de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognóstico da doença em
si.
 
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de
Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou mais. De modo geral, quanto maior o número de
repetições, maior o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de fenótipo – no
caso da doença de Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.
 
• • • • A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas:
 
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico de
doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso,
podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente
naquela amostra biológica.
 
Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da doença.
 
A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em
cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis, por possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros
casos, a presença do material genético de determinado microrganismo não é suficiente para seu
diagnóstico como agente causador da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários,
assim como técnicas de PCR mais elaboradas que darão maiores informações.
 
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-CoV2 (severe acute respiratory
syndrome coronavirus 2), assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético.
 
Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e o utilizamos em
qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR. Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a
identificação de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material genético viral é
identificado de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair
em algumas horas. Além disso, esse método é muito sensível e específico, conseguindo detectar nas
amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).
 
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A
efetividade do tratamento para HIV pode ser monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções
drásticas na carga viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação de cDNA
obtido por transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em
leucemias e linfomas: o oncologista pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de
determinado marcador gênico do câncer em questão.
 
Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser
cruciais no tratamento e evolução do paciente. A PCR convencional multiplex também pode ser
utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos sintomas, mas
que exigem abordagens clínicas diferentes.
 
• • • • A PCR e as suas variantes em pesquisa científica:
 
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser
utilizada para manipulação genética de organismos simples, como bactérias, leveduras e células em
cultivo. 
 
Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao
amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas
regiões distintas. A primeira região liga-se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou
mutar – no organismo alvo; a segunda é a região que se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual
queremos colocar nosso gene clonado. O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do
genoma do organismo alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando inserido na célula.
 
Um exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes
e transferíveis de uma célula a outra, comuns em bactérias.
 
 
Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a inserção (ou clonagem)
de um gene de origem diferente, que foi amplificado por PCR, ao vetor original.
 
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo
que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o produto amplificado, juntamente com o vetor, para
inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de restrição
para cortar o DNA em pontos específicos, após amplificação por PCR.
 
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene
de interesse com um gene constitutivo de expressão estável) para avaliarmos como o metabolismo
celular pode mudar mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer
aplicação que determinado método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas
não apenas é usada em pesquisa científica, como, provavelmente, foi originada de uma.eucarióticos.
 
Nos procariontes, o material genético (DNA), encontra-se compactado em uma região chamada de
nucleoide, que não possui membranas separando-a do restante do citoplasma. Ou seja, o material genético
não está delimitado por uma membrana nuclear.
 
A maioria das bactérias contém apenas um cromossomo circular de DNA dupla fita
densamente organizado no nucleoide. Alguns gêneros bacterianos, como Borrelia, também podem
apresentar o cromossoma linear.
 
As bactérias e arqueas colonizam praticamente todos os ambientes e formas de vida do nosso
planeta.
 
As arqueas são conhecidas por conseguirem habitar ambientes extremos, como bordas de vulcões
e lagos hipersalinos. Essa habilidade evolutiva é atribuída à plasticidade genética dos procariotos, ou seja,
a capacidade do genoma de sofrer alterações, como mutações ou rearranjo, em condições de pressão
ambiental.
 
 
• • • • Estrutura básica dos genes procarióticos:
 
Um GENE pode ser definido como um segmento de DNA que possui as sequências de
nucleotídeos necessárias para a síntese de pelo menos um produto correspondente: o RNA mensageiro
(que será traduzido em proteína) ou RNA transportador ou RNA ribossomal.
 
Gene - é formado por uma região codificadora, que é uma sequência nucleotídica que codifica o
RNA, e pelas sequências reguladoras que controlam a sua expressão.
Entre as sequências reguladoras, as mais importantes são o promotor e o terminador.
 
O promotor é uma sequência de DNA localizada antes (ou a montante) do gene que regula. Ele é
essencial para iniciar a transcrição do gene, pois é onde a RNA polimerase se liga para começar a
sintetizar o RNA mensageiro (mRNA) a partir do DNA.
O terminador é a sequência de DNA que indica o fim da transcrição. Quando a RNA polimerase
alcança o terminador, ela para de adicionar nucleotídeos ao RNA em formação e a transcrição é
finalizada.
 
A expressão de um gene procariótico abrange a transcrição em um RNA, que pode ser um RNA
transportador, RNA ribossomal ou RNA mensageiro. Caso seja um RNA mensageiro, há a tradução do
transcrito em uma proteína.
 
• • • • Homologia e tamanho dos genes procarióticos:
 
Uma característica típica dos genes procarióticos é a colinearidade entre um gene e seu produto,
ou seja, significa que há uma exata correspondência entre a sequência nucleotídica do DNA e a
sequência de nucleotídeos do RNA ou sequência de aminoácidos da proteína, dependendo se o transcrito
do gene for um tRNA, rRNAa ou mRNA.
 
Embora essa relação pareça bastante simples de se fazer, ela representa uma das diferenças básicas
entre a estrutura da grande maioria dos genes procarióticos e eucarióticos. Isso porque, os genes
eucarióticos normalmente apresentam sequências que interrompem a sequência codificadora.
 
- Genes homólogos - surgem a partir da ocorrência de diversos processos evolutivos. São os que
apresentam semelhanças em suas sequências nucleotídicas, que são genericamente chamadas de
homologias.
 
- Genes parálogos - quando o evento evolutivo é uma duplicação de uma região cromossômica,
uma das cópias pode manter a função original, enquanto a outra pode assumir uma função relacionada.
 
- Pseudogene - Caso um dos genes perca sua funcionalidade após a divergência, mas não a
homologia.
 
O tamanho dos genomas procarióticos variam amplamente, desde cerca de 150.000 pares de base
(150kb ou 0,15Mb) até 13.000.000 pares de base (13.000kb ou 13Mb).
 
Em bactérias, predominam genomas com cerca de 2 a 5Mb.
Já em arqueas, a predominância é de espécies com genoma de 2Mb.
 
OBS: O tamanho do genoma de qualquer espécie procariótica pode variar com facilidade ao
longo da evolução, devido a processos de ganho ou perda de sequências.
 
GENOMA MÍNIMO - descreve o menor genoma capaz de abrigar o mínimo necessário de genes
para a sobrevivência de uma forma de vida celular.
 
 
• • • • Organização dos genes procarióticos:
 
Independentemente do tamanho, todos os genomas procarióticos são constituídos de DNA fita
dupla. Porém, vemos diferenças importantes na forma e no número de cromossomos, que se organizam
em unidades de replicação. A maioria das espécies de bactérias e arqueas possui um único cromossomo,
na forma de uma fita dupla de DNA circular, covalentemente fechada.
 
Existem alguns poucos casos de bactérias que possuem mais de uma molécula de DNA, que
podem ser lineares ao invés de circulares.
 
Em um genoma que é constituído por mais de uma molécula de DNA, podemos denominá-las de
acordo com seu tamanho e conteúdo gênico.
 
• Moléculas maiores- São centenas a milhares de quilobases (Uma quilobase (Kb) corresponde a
1000 bases de nucleotídeos), que apresentam majoritariamente genes essenciais para a célula, são
chamadas de cromossomos.
• Moléculas menores - São dezenas a centenas de quilobases, que NÃO contém genes essenciais,
podem ser chamadas de plasmídeos.
 
Plasmídeos - são elementos genéticos móveis, de DNA circular, encontrados no citoplasma de
bactérias e também de algumas arqueas. Os genes contidos nos plasmídeos não contêm informações
essenciais para a célula, mas conferem vantagens seletivas, como, por exemplo, a resistência contra
antibióticos.
 
O DNA plasmidial se mantém extremamente compactado, consegue se replicar
independentemente do DNA cromossômico e pode existir em número variável.
 
• EPISSOMOS - plasmídeos que podem se integrar no cromossomo. Neste caso, sua replicação é
dependente da replicação do cromossomo. A integração do cromossomo pode ser reversível e, quando o
epissomo se desliga do cromossomo, ele pode levar genes bacterianos.
 
• Existem plasmídeos de resistência, como os que conferem a produção das enzimas β-
lactamases, ou de virulência, como os que codificam proteínas de adesão. Quando a bactéria perde o
plasmídeo, inclusive por ação de algumas drogas, ela só consegue recuperá-lo através de uma nova
infecção, como, por exemplo, através do mecanismo de conjugação.
 
 
Uma questão importante dos genomas procarióticos se refere à organização do cromossomo em
unidades de replicação, bem diferente do que veremos em eucariotos. Essas unidades de replicação, que
também podemos chamar de REPLICONS, são os segmentos cromossômicos que replicam a partir de
uma origem de replicação.
 
OBS: Em bactérias, cada cromossomo possui apenas uma origem de replicação. Em arqueas,
podemos encontrar até três origens de replicação para um cromossomo. A diferença, em eucariotos, é que
cada cromossomo está organizado em centenas ou milhares de replicons.
 
 
Organização em replicons de cromossomos de bactérias, arqueas e eucariotos.
 
(A) Cromossomos bacterianos apresentam uma única origem de replicação (replicon), em
vermelho.
(B) Cromossomos de arqueas podem ter uma, duas ou três origens de replicação.
(C) Cromossomos eucarióticos estão organizados em centenas ou milhares de replicons.
 
Os genomas procarióticos apresentam uma elevada densidade gênica se comparados aos
genomas eucarióticos. Esse fato se deve a aspectos como o tamanho relativamente reduzido dos
genomas, extensão das regiões codificadoras e reguladoras e o número de genes por genoma.
 
 
• Unidades organizacionais dos genomas procarióticos:
 
Os genes são apenas alguns dos componentes presentes em um genoma. Em procariotos, outras
unidades organizacionais de sequências nucleotídicas podem ser identificadas. Apesar de variarem em
complexidade, cada uma delas apresenta importância funcional e/ou evolutiva.
 
- Os MOTIVOS são sequências curtas, de duas ou dezenas de pares de base (pb), que podem ser
encontradas agrupadas em uma parte do genoma ou dispersas. As SEQUÊNCIAS MOTIVO podem
auxiliar no processo de recombinação genética e em processos de translocação gênica.
 
- As SEQUÊNCIAS REPETIDAS são sequências de nucleotídeos, geralmente curtas (menor que
10 pb) que podem ser encontradas espalhadas pelo genoma ou agrupadas uma ao lado da outra. As
sequências repetidas são sempre menos abundantes que as sequências únicas. Em organismos
eucarióticos, por outro lado,as sequências de repetição são encontradas ao longo de todo genoma, podendo
chegar a mais de 50% de frequência. Nos genomas procarióticos, a família mais representada do ponto
de vista do número de unidades de repetição é a dos elementos REP.
 
- Elementos REP (elementos repetitivos ou sequências repetitivas no DNA) - são sequências
palindrômicas, ou seja, sequências de simetria dupla, idênticas quando lidas no sentido 5’-3’ ou 3’-5’ e,
evolutivamente, sua presença pode ser explicada pelos processos de integração e excisão de pedaços do
genoma bacteriano.
 
TÉCNICA CRISPR - usada para edição de genomas. A partir dessa técnica, foi possível editar
genomas bacterianos e, mais recentemente, genomas eucariotos. Por exemplo, pode-se inativar ou
regular a expressão de genes, inserir sequências para expressão de proteínas, além de outras funções. A
técnica de CRISPR revolucionou a engenharia genética e trouxe significativos avanços para a biologia
molecular. Atualmente, existem estudos que utilizam CRISPR para tentar retirar o genoma do HIV de
células infectadas, possibilitando o tratamento por terapia gênica.
 
ILHAS GENÔMICAS - são segmentos de genomas procarióticos que apresentam diferenças no
conteúdo Guanina + Citosina (G+C). Variam de 10 a >200Kb e contêm genes não essenciais, mas que
podem conferir alguma vantagem adaptativa ao organismo. Um excelente exemplo é o das ilhas de
patogenicidade, encontradas nos genomas de bactérias patogênicas como Helicobacter pylori e Vibrio
cholerae. Essas ilhas são compostas por genes cujos produtos estão relacionados à maior infecção, como
toxinas e proteínas imunomoduladoras.
 
 
• • • • Transposons e Integrons :
 
Os transposons ou elementos transponíveis são sequências de DNA móveis que possuem a
capacidade de se integrarem em regiões do genoma e, por esse motivo, também são conhecidos como
“genes saltadores”. Eles podem se inserir em regiões codificantes ou reguladoras, podendo levar à
perda de função ou a geração de mutação.
Os transposons procarióticos apresentam características específicas, como a presença de um gene
codificador da enzima transposase e a duplicação da região da sequência alvo receptora. A transposase
se liga às extremidades do transposon e corta as duas fitas do DNA, podendo inserila em outra região do
genoma.
 
Em procariotos, existem três tipos de transposons:
 
- Elementos IS (elementos de inserção, do inglês Insertion Sequences) - Apresentam repetições
invertidas, sempre adjacentes à sequência que codifica a transposase.
- Transposons compostos (Tn) - Surgem quando dois elementos IS se inserem próximos um ao
outro. Em alguns casos, podem conter genes de resistência a antibióticos, conferindo vantagem seletiva à
bactéria. Os Tn podem ser inseridos no DNA plasmidial ou mesmo no cromossoma bacteriano.
 
- Elementos TnA - Contêm os genes da transpososa (tnpA), resolvase (TnpR) e da β-galactamase
(bla, confere resistência a ampicilina).
 
INTEGRONS - são sistemas de expressão gênica que incorporam sequências abertas de leitura
(ORF) exógenas por meio de recombinação específica do local e as convertem em genes funcionais,
garantindo sua expressão. Os integrons foram originalmente descobertos como um mecanismo usado por
bactérias Gramnegativas para adquirir genes de resistência a antibióticos e expressar múltiplos
fenótipos de resistência. Mais recentemente, seu papel foi ampliado com a descoberta de estruturas
cromossômicas de integron nos genomas de diversas espécies bacterianas.
 
OPERONS - são unidades funcionais gênicas muito importantes na biologia molecular de
procariotos. Um operon é constituído de uma sequência gênica codificadora flanqueada por duas
sequências reguladoras, uma do início da transcrição e uma do término da transcrição. O RNA gerado a
partir da transcrição do gene do óperon é frequentemente policistrônico, ou seja, possui a informação para
a produção de mais de um produto gênico.
 
Um único mRNA policistrônico dará origem a duas ou até mais proteínas durante a fase de
tradução. A organização em operons proporciona uma economia de espaço no DNA, o que é extremamente
importante para os genomas relativamente pequenos e compactos de procariotos.
 
Estrutura de um operon e do mRNA policistrônico
 
 
Um dos exemplos mais comuns para se explicar o funcionamento de um operon é o operon lac.
Bactérias da espécie E. coli podem utilizar a lactose como fonte de energia quando não há glicose
disponível. Para isso, precisam expressar o operon lac, que codifica as enzimas necessárias para a
absorção e metabolismo da lactose. Dessa forma, a expressão do operon lac está condicionada à ausência
da glicose e disponibilidade de lactose no meio.
Para detectar os níveis de glicose e lactose, duas proteínas reguladoras estão envolvidas no
processo:
 
- Repressor lac - Atua como um sensor de lactose.
- Proteína ativadora de catabólito (CAP) - Atua como sensor de glicose.
 
Mas como é formado o operon lac?
O operon lac contém três genes (lacZ, lacY e lacA), que são transcritos como um único mRNA
policistrônico e codificam proteínas que auxiliam a célula a utilizar a lactose. Além desses genes, o operon
lac possui sequências reguladoras, nas quais proteínas reguladoras (repressor lac e CAP) se ligam e
controlam a transcrição do operon.
 
São elas:
 
- O promotor, que é o sítio de ligação da RNA polimerase, a enzima que realiza a transcrição.
 
- O operador, que é o sítio de regulação negativa ao qual se liga a proteína repressora lac. O
operador se sobrepõe ao promotor, e quando o repressor lac está ligado, a RNA polimerase não consegue se
ligar ao promotor e dar início à transcrição.
 
- O sítio de ligação da CAP, que é o sítio de regulação positiva no qual se liga a CAP. Quando a
CAP está ligada a esse sítio, ela favorece a transcrição ajudando a RNA polimerase a se ligar ao promotor.
 
Todas essas estruturas pertencem à região reguladora do gene localizada na extremidade 5’.
 
E como o operon funciona?
 
- Quando a lactose não está disponível, o repressor lac se liga ao operador, evitando a transcrição
pela RNA polimerase.
 
- Quando a lactose está presente, o repressor lac perde a capacidade de ligação ao DNA, desliga-
se do operador e abre o caminho para a RNA polimerase fazer a transcrição do operon.
 
- Quando a lactose está disponível, há a ligação de uma molécula de alolactose no repressor lac,
que perde a capacidade de ligar-se ao operador. Dessa forma, a RNA polimerase consegue se ligar ao
promotor e transcrever o operon lac.
 
E a glicose?
 
- A RNA polimerase sozinha não se liga muito bem ao promotor do operon lac, a menos que
tenha auxílio da CAP, que se liga à região do DNA localizada antes do promotor do operon lac e auxilia na
ligação da RNA polimerase, resultando em altos níveis de transcrição.
 
- Porém, a CAP nem sempre é capaz de se ligar ao DNA. Ela é regulada por uma molécula
chamada AMP cíclico, que é produzida pela E. coli quando os níveis de glicose estão baixos. Com a baixa
de glicose, há o aumento do AMP cíclico e ativação da CAP, que nessa situação consegue se ligar ao
DNA.
 
OBS: O operon lac apresenta intensa regulação e só é transcrito em altos níveis quando a
glicose está ausente no meio. Essa regulação permite que o operon lac somente seja ativado e a bactéria
comece a metabolizar a lactose quando toda a fonte de energia preferencial – a glicose – estiver
esgotada.
 
 
# Gene eucariótico e suas funções:
 
As células eucarióticas, em geral, são maiores e mais complexas que as células procarióticas,
podendo apresentar um volume cerca de mil vezes maior.
 
Além da morfologia, o genoma das células eucarióticas também apresenta tamanho e
complexidade maiores que o das células procarióticas.
 
A característica mais marcante e diferencial das células eucarióticas é a presença do núcleo, que é
um compartimento interno que abriga a maior parte do DNA celular, chamada de genoma nuclear, e o
mantém separado do citoplasma.
 
Além disso, as células eucarióticas apresentamoutras organelas além do núcleo, como os retículos
endoplasmáticos liso e rugoso, os ribossomos, o complexo de Golgi e as mitocôndrias. Muitas células
eucarióticas, especialmente as de plantas e algas, possuem outro tipo de organela parecido com as
mitocôndrias – os cloroplastos, que realizam a fotossíntese.
 
 
As mitocôndrias possuem tamanho similar ao de pequenas bactérias, e, assim como essas
bactérias, possuem seu próprio genoma na forma de DNA circular. As análises genômicas sugerem que as
mitocôndrias foram bactérias de vida livre metabolizadoras de oxigênio que foram engolfadas por uma
célula predadora ancestral, incapaz de fazer uso do oxigênio, há aproximadamente 1,5 bilhão de anos.
 
De forma semelhante, sugere-se que os cloroplastos se originaram de uma relação evolutiva
simbiótica entre bactérias fotossintetizantes e células eucarióticas que já possuíam mitocôndrias.
 
A partir dessas informações, é fácil entender por que a informação genética das células
eucarióticas tem origem híbrida. Quando o DNA mitocondrial e do cloroplasto são analisados
separadamente do genoma nuclear, percebe-se que eles são versões curtas de genomas bacterianos.
 
O primeiro genoma eucariótico a ser completamente sequenciado foi o da levedura
Saccharomyces cerevisiae, publicado no final da década de 1990.
 
Uma das primeiras versões das sequências do genoma humano foi publicada no começo dos anos
2000, com o Projeto Genoma Humano. A quantidade disponível de sequências completas de genomas
eucarióticos pode ser considerada pequena, se compararmos com as disponibilizadas de procariotos e
levarmos em consideração a enorme diversidade do domínio Eukarya.
 
• • • • Estrutura básica dos genes eucarióticos
 
Os genes procarióticos e eucarióticos possuem a mesma estrutura básica, associada à região
codificadora e a regiões reguladoras. Porém, em eucariotos, essas regiões apresentam maior
complexidade, que por sua vez determina maiores refinamentos funcionais. Além disso, as regiões
reguladoras geralmente são mais extensas e também apresentam um número maior de elementos
reguladores.
 
No gene eucariótico, os elementos reguladores distais podem ser encontrados a milhares de pares
de base, tanto a montante como a jusante, da sua região codificadora. Já nos genes procarióticos, os
elementos reguladores distais estão geralmente situados a algumas centenas de pares de base a montante
da região codificadora.
 
Montante e jusante se referem a posições de sequências nos ácidos nucleicos, levando em
consideração a direção de 5' para 3' na qual a transcrição de RNA ocorre. A montante é a região voltada
para a extremidade 5' da molécula do ácido nucleico e a jusante voltada para a extremidade 3'.
 
Um outro aspecto importante de genes eucarióticos é a presença de íntrons, que são sequências que
interrompem a região do gene que é transcrita, dividindo-a em vários pedaços, chamados de éxons.
 
As sequências que correspondem aos íntrons estão presentes no DNA genômico, mas são
removidas durante o processamento do RNA maduro.
A presença de genes interrompidos é bastante rara em procariotos, porém é comum em
eucariotos. Em mamíferos, por exemplo, cerca de 94% dos genes apresentam íntrons.
 
Há uma tendência geral de aumento no número de íntrons por gene e no tamanho do íntron, à
medida que avançamos na escala evolutiva dos eucariotos.
 
OBS: Organismos de uma mesma classe, como a dos anfíbios, podem apresentar variações de
mais de 100 vezes no tamanho dos seus genomas. Por outro lado, espécies de grupos com diferenças
fisiológicas e anatômicas muito distintas, como insetos e mamíferos, por exemplo, podem apresentar
genomas de tamanhos similares. Esse fenômeno da frequente falta de associação entre a complexidade
biológica do organismo e o tamanho do seu genoma é conhecido como PARADOXO DO VALOR C.
 
• • • • Cromossomos eucarióticos:
 
O DNA nuclear dos eucariotos organiza-se em cromossomos, cada um composto por uma única
molécula de DNA linear. Essa configuração difere dos procariotos, que apresentam cromossomos
circulares. A maioria dos eucariotos possui dois conjuntos completos de cromossomos em cada célula
somática (diploide), mas existem espécies com 3 ou mais cópias de cada cromossomo em cada célula
(poliploide) e, ainda, aquelas que apresentam um único conjunto de cromossomos por célula (haploides).
O número e o tamanho dos cromossomos apresentam grande variedade, dependendo da espécie.
 
Em alguns microrganismos eucarióticos, podemos encontrar também os plasmídeos nucleares,
que apresentam replicação autônoma e múltiplas cópias. Assim como os plasmídeos de procariotos,
são circulares.
 
• Composição das sequências gênicas de eucariotos:
 
- Sequências gênicas:
 
A fração do genoma de eucariotos ocupada pelos genes varia bastante: 25% nos humanos até
mais de 80% em uma espécie de microsporídio. Considerando apenas os éxons, essa fração (que já é
reduzida) cai para 1% - é chamada fração codificadora do genoma.
 
Definir o número total de genes presentes em uma espécie de eucarioto é uma tarefa complexa,
pois além de serem grandes, os genes apresentam grande variação em tamanho e estrutura.
 
As estimativas gerais têm se limitado à quantificação dos genes codificadores de proteínas.
 
A densidade gênica é a distância média entre genes individuais ao longo do genoma. Ela
geralmente é inversamente proporcional ao número de genes.
 
 
 
Observe a imagem a seguir. As regiões intergênicas estão representadas em branco, enquanto as
regiões codificadoras, em azul.
Megabases – Unidade de medida do DNA - é igual a 1 milhão de bases.
 
Ao longo da evolução, ocorreram muitos eventos de duplicação gênica que determinaram que
muitos genes formassem famílias gênicas ou famílias de parálogos. Esses genes apresentam alta
similaridade em suas sequências nucleotídicas, que varia de 30% até quase 100% ao longo de todo o gene
ou, pelo menos, em um ou mais de seus éxons. Dentro do conjunto de genes organizados em famílias,
existem genes idênticos, presentes em múltiplas cópias. Genes codificadores de rRNAs, tRNAs e das
histonas são exemplos de famílias de genes com cópias múltiplas.
 
Essa multiplicidade de cópias são uma estratégia para responder à alta demanda das células
eucarióticas pelos produtos desses genes.
 
A origem de famílias gênicas por duplicação e pela ocorrência de mutações também resulta na
formação de genes não funcionais, conhecidos por pseudogenes. Por outro lado, existem aqueles genes
que não fazem parte de nenhuma família e são chamados de genes únicos. A proporção desses genes,
assim como aqueles organizados em famílias, varia de espécie para espécie.
 
 
• • • • Sequências intergênicas:
 
As sequências intergênicas aquelas sequências genômicas que não estão associadas diretamente a
um gene. Essa definição torna-se complexa nos genomas de eucariotos, já que os limites físicos dos genes
nem sempre são claros e a quantidade de íntrons é extensa.
 
Em resumo, são aquelas que não fazem parte de éxons ou íntrons de genes funcionais com uma
estrutura típica, que vimos anteriormente. Grande parte dos genomas eucarióticos é formada por
sequências intergênicas.
 
Não seria lixo genômico?
Os primeiros estudos sobre esse tema realmente indicavam que essas sequências poderiam ser
consideradas inúteis. Porém, com o avanço das pesquisas, hoje já é aceito que essa fração do genoma
eucariótico possui diversos elementos importantes para a fisiologia e evolução do próprio genoma.
 
As sequências repetidas simples são sequências intergênicas curtas que podem estar repetidas
cerca de milhares a milhões de vezes nos genomas de espécies eucarióticas mais complexas.
 
Comumente, essas unidades de repetição possuem extensão de 5 a 10pb, e, em sua maioria, estão
organizadas lado a lado, no que chamamos de arranjos em tandem, que podem chegar a centenas de
quilobases de extensão.
 
Geralmente, os arranjos em tandem de sequências repetidas simples apresentam um conteúdo G +
C diferente do restantedo genoma (semelhante ao que estudamos em ilhas genômicas).
 
As sequências repetidas simples também podem ser chamadas de DNA-satélite, porque aparecem
separadas do componente principal, que corresponde à fração gênica.
 
Repetições menores, de 2 ou 3pb, são chamadas de microssatélites e podem ocorrer, inclusive,
dentro de éxons e íntrons.
 
OBS: Variações ocorridas em microssatélites são capazes de determinar alterações no nível de
expressão ou no produto de genes, resultando na mudança de fenótipo. Diversas doenças humanas, por
exemplo, são causadas por variações no número de repetições em microssatélites associadas a determinados
genes.
 
Já os elementos transponíveis são sequências de DNA capazes de se integrarem por transposição
em outros lócus genômicos.
 
Os elementos transponíveis dividem-se em dois tipos principais – o dos transposons de DNA e o
dos retrotransposons. Na maioria das espécies, os elementos transponíveis constituem a maior parte das
sequências intergênicas e, em alguns casos, do próprio genoma.
 
 
Os transposons de DNA são mobilizados por meio de intermediários de DNA e representam uma
parte menor dos elementos transponíveis eucarióticos. Exemplos são o elemento P de Drosophila e os
elementos Ac e Ds do milho.
Já os retrotransposons constituem a maioria dos elementos móveis de eucariotos e sua mobilização
envolve a transcrição reversa de um intermediário de RNA.
 
São divididos em retrotransposons contendo longas repetições terminais (LTR), correspondendo
aos retrotransposons virais (semelhantes a retrovírus), e em retrotransposons sem LTR, que abrange os
retrotransposons não virais.
Atualmente, estima-se que 50 a 100 genes humanos que codificam proteínas evoluíram a partir
de sequências de transposons ou retrotransposons. Realmente, esses elementos podem alterar os
padrões de expressão de alguns genes ou até originar novos genes. Atuam como agentes mutagênicos,
uma vez que podem se inserir em regiões promotoras e alterar o controle da expressão gênica. Por
outro lado, também podem atuar na estruturação do cromossomo e na fisiologia da cromatina.
 
• • • • Sequências reguladoras em procariotos e eucariotos:
 
Tanto os procariotos quanto eucariotos apresentam a mesma estrutura gênica básica, formada pela
região codificadora e pelas regiões reguladoras, que controlam a expressão dos genes.
 
Porém, nos eucariotos, essas sequências reguladoras possuem estruturas mais complexas que as
dos procariotos.
 
A expressão de um gene inclui a sua transcrição em RNA e a tradução (caso seja um RNA
mensageiro) em uma proteína. Em genes que codificam rRNAs e tRNAs, a etapa de tradução não ocorre.
 
A síntese de RNA inicia-se alguns pares de bases antes da região codificadora e termina alguns
pares de base após essa região. As regiões 5’ e 3’ não codificadoras do DNA e RNA são denominadas
regiões 5’ ou 3’ não traduzidas (UTR).
 
Na região 5’-UTR do RNA mensageiro, por exemplo, existem sequências importantes para o início
da etapa de tradução da cadeia polipeptídica.
 
A transcrição é um processo cíclico de síntese de RNA, dividido em 3 fases:
 
- Início - É a fase onde as sequências nucleotídicas específicas no DNA sinalizam o local de início de
transcrição.
- Alongamento - Acontece o alogamento da molécula, na qual a fita de RNA é formada.
- Terminação - Etapa na qual há sinais específicos de elementos terminadores para a finalização da
síntese de RNA.
Na etapa inicial da transcrição, sequências específicas determinam o local de formação do
complexo de transcrição – os promotores. Ou seja, o promotor é o sítio no DNA no qual a RNA
polimerase se liga.
 
O primeiro nucleotídeo da sequência promotora é denominado sítio de início da transcrição.
 
Existem importantes diferenças entre os promotores de procariotos e eucariotos. Como vimos, em
um gene procariótico típico, as sequências reguladoras da transcrição encontram-se ao lado da região
codificadora. Entre essas sequências, as mais importantes são o promotor e o terminador, sequência
nucleotídica que indica o término na transcrição e dissociação da RNA polimerase. O promotor situa-se na
região 5’, a montante da região codificadora e o terminador situa-se na região 3’, a jusante da região
codificadora. Para relembrarmos esses conceitos, vamos olhar novamente a imagem a seguir:
 
Além dessas sequências, podemos encontrar também outros elementos reguladores, como sítios de
ligação de proteínas ativadoras ou repressoras da transcrição. Você se lembra do funcionamento do
operon lac? Após diversas análises moleculares, pesquisadores chegaram à conclusão que existem algumas
regras para os promotores de bactérias. Uma delas, muito importante, é que existem duas sequências
conservadas na maioria dos genes procarióticos: uma na região -10 e a outra na região -35.
 
A região -10 recebe uma denominação especial – TATA box, devido à presença de timina e
adenina.
 
 
 
É importante que você saiba que a atividade dos promotores, de ser o sítio para sinalização do
início da transcrição, pode ser modificada por proteínas ativadoras ou proteínas repressoras, que se
ligam a sequências regulatórias próximas à região promotora.
 
Assim, nos genes procarióticos, o complexo da RNA polimerase liga-se às sequências promotoras
para iniciar a transcrição. Já nos eucariotos, o promotor é primeiro reconhecido por fatores de
transcrição, que posteriormente conduzem a RNA polimerase para iniciar a transcrição.
 
Normalmente, nos promotores eucarióticos, encontramos uma sequência denominada promotor
principal, que é capaz de manter a transcrição em um nível basal.
 
Além do promotor principal, existem ainda outras regiões regulatórias. Elas podem se localizar
próximas aos promotores (50 a poucas centenas de pares de base), a montante do sítio de início da
transcrição – os promotores proximais – ou a milhares de pares de bases a jusante ou a montante do
sítio de início da transcrição – os promotores distais ou enhancers (reforçadores).
 
Os enhancers são sequências de DNA que aumentam a afinidade do complexo de transcrição por
um certo promotor. Alguns deles atuam somente em algumas células, o que provavelmente é regulado pela
ligação de proteínas específicas a eles.
 
Atenção: A célula, tanto a procariótica quanto a eucariótica, é capaz de bloquear ou ativar a
expressão de diferentes genes, dependendo dos estímulos externos ou internos que recebe, é a
regulação da expressão gênica.
 
• Estrutura da cromatina de eucariotos
 
Nas nossas células, o DNA de 1,8 metros de extensão total está contido em um núcleo esférico de 6
µm (micrômetros) de diâmetro. Mas como isso é possível? As moléculas de DNA e RNA devem ser
compactadas para que possam ser acomodadas. Essa compactação se dá pela interação de proteínas
específicas com as moléculas de ácido nucleico e deve acontecer de forma organizada, de modo a
permitir que os vários processos funcionais, como a replicação de cromossomos e a expressão gênica,
ocorram.
 
Em procariotos e eucariotos, o DNA genômico é compactado em um arranjo complexo, cujo grau
de compactação varia de acordo com o estado funcional do DNA.
 
Chamamos essa estrutura nucleoproteica organizada e dinâmica de cromatina. A cromatina
eucariótica é formada por várias moléculas de DNA linear (uma por cromossomo) associada a
proteínas.
 
Podemos ver que as histonas são as proteínas principais da cromatina em quase todos os
eucariotos, cuja massa é similar à do DNA total da cromatina. As histonas canônicas são as formas de
histonas envolvidas na compactação geral da cromatina e são divididas em:
 
- Histonas centrais (H2A, H2B, H3 e H4) - Formam o complexo proteico central dos
nucleossomos e possuem cerca de 100 aminoácidos de extensão. São caracterizadas por um domínio
formado por 3 alfa-hélices separadas por alças curtas, denominado enovelamento de histonas (histone fold,
no inglês).
 
- Histonas de ligação (H1 e H5) - Associam-se externamente aos nucleossomos e participam das
interações entre eles. Possuementre 190 a 250 aminoácidos de extensão e apresentam 3 domínios, sendo o
domínio globular central essencial para a ligação da histona ao nucleossomo.
 
As histonas canônicas apresentam caráter básico acentuado, pois contêm alta proporção de
aminoácidos positivos, a lisina e a arginina. Por esse motivo, a interação com o DNA de fita dupla, que é
carregado negativamente, é favorecida.
 
Além das histonas, a cromatina de eucariotos também possui outras proteínas – as proteínas não
histônicas – que são menos abundantes que as histonas.
 
As histonas, são responsáveis pelos níveis de organização básicos do DNA, enquanto as proteínas
não histônicas estão envolvidas com a estruturação da cromatina em níveis mais complexos.
 
Entre as proteínas não histônicas importantes para a estrutura da cromatina eucariótica, temos duas:
 
- Proteínas HGM (grupo de alta mobilidade) - As proteínas HGM constituem um grupo de
proteínas cromossômicas abundante, de tamanho pequeno (entre 11 e 38kDa). São divididas em 3 famílias,
de acordo com as diferenças nos seus motivos de ligação ao DNA e nos substratos a que se ligam. As
proteínas da família HGMA ligam-se, por exemplo, por meio de um gancho de A-T, trechos curtos ricos em
adenina-timina no DNA. Já as proteínas da família HMGB possuem domínios de ligação ao DNA de
aproximadamente 80 aminoácidos, sem especificidade de sequência. Por último, as proteínas da família
HMGN são as únicas que se ligam especificamente aos nucleossomos, por um domínio de ligação com 30
aminoácidos.
 
- Proteínas SMC (manutenção estrutural de cromossomos)- As proteínas SMC formam uma
família de proteínas que são capazes de se ligar ao DNA, formando complexos envolvidos na organização e
estruturação da cromatina eucariótica. Esses complexos, constituídos por proteínas SMC e proteínas
cleisinas, formam estruturas em anel em torno de uma ou mais fitas duplas do DNA.
 
Além das proteínas HGM e SMC, exemplos de outras proteínas não histônicas são as DNA e RNA
polimerases e as proteínas reguladoras da transcrição e replicação.
 
• • • • O nucleossomo eucariótico:
 
A forma estrutural básica da cromatina eucariótica é uma partícula formada por DNA e
histonas, chamada de nucleossomo.
 
Cada nucleossomo é constituído por uma partícula central, um complexo formado por oito
proteínas (um octâmeto – duas cópias de cada uma das 4 histonas centrais) e por uma extensão de DNA
que dá duas voltas ao redor desse octâmero. Externamente, ainda encontramos uma molécula de histona de
ligação – H1 ou H5.
 
Como é que outras proteínas interagem com a molécula de DNA, já que ele se encontra
compactado na forma de nucleossomo?
O que ocorre é que, no nucleossomo, apenas uma das faces da molécula de DNA que está
associada ao octâmero fica exposta para que outras proteínas possam interagir. Logo, uma proteína
que se liga a uma sequência específica de DNA, como um fator de transcrição, vai depender do
posicionamento do seu sítio de ligação na face exposta do DNA. O posicionamento rotacional depende
de muitos fatores, incluindo certas sequências nucleotídicas.
 
 
• • • • Níveis de organização da cromatina
 
Essa organização é dinâmica e muda conforme a etapa do ciclo celular e atividade da cromatina.
Durante o intervalo entre a mitose/meiose, na interfase, podemos observar ao microscópio óptico dois tipos
básicos de cromatina:
 
- Eucromatina - Representa a cromatina no seu menor estado de compactação e é considerada a
cromatina ativa, em termos de expressão gênica.
 
- Heterocromatina - É a forma da cromatina altamente compactada, inativa.
 
Durante a divisão celular, na mitose ou na meiose, a cromatina condensa-se muito mais, formando
os cromossomos. Tanto a heterocromatina quanto os cromossomos são consideradas formas
transcricionalmente inativas.
 
 
A heterocromatina pode ser classificada de duas formas:
 
- Heterocromatina constitutiva - É a porção da cromatina permanentemente condensada em todas
as células de um mesmo organismo. É formada por uma ou mais sequências curtas de DNA altamente
repetitivas – os microssatélites. Está localizada nas extremidades dos cromossomos, perto dos centrômetros
e nas regiões organizadoras do nucléolo.
 
- Heterocromatina facultativa - É a porção da heterocromatina que, em um mesmo organismo,
se apresenta condensada em algumas células, mas não em outras. Não é transcrita, mas não é formada
por sequências simples de DNA. Sua quantidade depende do tipo celular e do seu estágio, mas é mais
abundante em células diferenciadas, como nos óvulos de mamíferos (cromossomo X).
 
Durante o ciclo celular, há uma transição entre diferentes estados de compactação da cromatina,
desde a sua conformação mais relaxada, na interfase, até a formação de cromossomos metafásicos, que
representam seu estado de condensação máxima. Nessa dinâmica de compactação, as fibras de cromatina
formadas pela sequência linear de nucleossomos condensam-se progressivamente, formando fibras de
maior diâmetro (fibras de 10 nanômetrosDepois da separação das fitas duplas, o que se tem são duas fitas
simples. Depois da abertura da dupla hélice pela helicase, as fitas simples são estabilizadas por meio da
ligação de proteínas específicas (proteínas ligadoras de fita simples) que têm alta afinidade pelo DNA na
forma de fita simples, para que não enovelem novamente. Nas bactérias e outros procariotos essas
proteínas são conhecidas como SSB (de single stranded binding protein, que significa proteína de ligação
à fita simples). Já nos eucariotos é a RPA (replication protein A, que significa proteína de replicação A)
que se liga à fita simples do DNA.
Superenovelamento - À medida em que a fita dupla de DNA vai sendo aberta, a parte do DNA
que se encontra com a dupla hélice formada sofre um enovelamento. Esse supernovelamento que se
forma no decorrer da abertura das fitas precisa ser relaxado para que não interrompa o movimento
da forquilha. O relaxamento é realizado por topoisomerases.
- A topoisomerase I introduz uma quebra de fita simples em uma das fitas, e a topoisomerase II
atua de forma semelhante, a diferença é que a quebra é realizada nas duas fitas. Essas quebras
permitem o relaxamento do DNA.
OBS: Há estratégias terapêuticas para o câncer que interferem na ação das topoisomerases,
impedindo o religamento das fitas de DNA quebradas temporariamente para resolver o problema do
superenovelamento. Assim, esses quimioterápicos atuam de maneira tóxica em células cancerosas que
estão replicando, pois o não religamento das fitas é um sinal para a morte celular.
- DNA polimerases - As suas funções estão ligadas principalmente à síntese e ao reparo de DNA.
As DNA polimerases que atuam na síntese de DNA também recebem a denominação de DNA
replicase.
As DNA polimerases possuem uma atividade de exonuclease, que é uma atividade que degrada
DNA. Essa atividade é fundamental para a fidelidade da replicação do DNA, pois quando um nucleotídeo
é adicionado erroneamente, a atividade de exonuclease da DNA polimerase pode atuar removendo esse
nucleotídeo mal pareado. Ao mesmo tempo, a atividade de polimerização dessa mesma enzima possibilita
a adição do nucleotídeo correto, de maneira que a síntese pode prosseguir fielmente.
• • • • Síntese de DNA:
 
O início do processo se dá nas origens de replicação que, no geral, contêm uma sequência de DNA
específica. Com a origem da replicação estabelecida, proteínas especializadas reconhecem a origem e
uma abertura no DNA é feita, e a forquilha ou bolha de replicação é formada. A primeira enzima a atuar
é a helicase que abre as fitas duplas de DNA, localizando-se à frente da forquilha
 
- Primer- Para que haja o início da síntese de DNA é necessário um primer ou iniciador, que é uma
cadeia curta de nucleotídeos que se liga à fita molde. A enzima DNA-primase é a responsável por sintetizar
os primers que são compostos por um pequeno trecho (8-12 nucleotídeos) de RNA complementar a um
pequeno pedaço da fita molde, no qual a replicação está sendo iniciada.
 
- DNA polimerases - Com a parte inicial da nova fita formada pelo RNA, as DNA polimerases
conseguem agir e dar continuidade à construção da fita. Essa construção, porém, é de apenas um pequeno
fragmento da nova fita, pois as DNA-polimerases tendem a se dissociar rapidamente do DNA.
 
- PCNA - Para resolver isso, há uma proteína acessória (em eucariotos é chamada de PCNA) em
forma de anel, que mantém a DNA-polimerase fortemente associada à fita molde, permitindo o
deslocamento da enzima ao longo do DNA. Essa cinta deslizante, como pode ser chamada, necessita de
um complexo proteico que a carregue para a forquilha de replicação.
 
- O complexo proteico, denominado de montador da cinta, monta a cinta deslizante no local
necessário (junção entre a fita molde e o primer) por meio da hidrólise de ATP. Uma vez ligada à cinta
deslizante, a DNA polimerase permanece associada ao DNA realizando a polimerização de nucleotídeos.
Síntese da fita-filha - a fita filha é sintetizada em pequenos pedacinhos no sentido oposto, para
que a síntese possa ocorrer no sentido 5’ – 3’ como deve ser. Os pedacinhos de fita filha que vão sendo
criados são descontínuos e são chamados de fragmentos de Okasaki. Então há duas fitas de DNA sendo
sintetizadas ao mesmo tempo, porém uma é sintetizada de forma contínua e a outra de forma
descontínua, sendo denominadas de fita-líder e fita descontínua ou tardia respectivamente. Os
fragmentos da fita descontínua também são iniciados por primers de RNA e estendidos por uma DNA
polimerase até que encontre o fragmento de Okasaki sintetizado anteriormente.
Ao final da síntese, os fragmentos de Okasaki precisam ser unidos e para que isso ocorra
primeiramente os primers têm de ser removidos, o que é realizado pela DNA polimerase com
atividade de exonuclease. A remoção dos primers forma pequenos gaps (espaços) entre os fragmentos
de Okasaki que são então completados com nucleotídeos pela ação da DNA polimerase com atividade
de replicação. Mesmo com o preenchimento dos gaps, ainda há o chamado nick, que é uma
descontinuidade da fita dupla caracterizada por uma quebra de ligação fosfodiéster da fita
descontínua. A ligação necessária (entre o grupo 3’-OH da extremidade de um fragmento de Okasaki
e o grupo 5’ fosfato de um fragmento adjacente) é realizada pela DNA ligase, que regenera a fita
descontínua recém-formada do DNA.
- A finalização do processo de replicação do DNA é realizada por meio de análogos de
nucleotídeos que são incorporados por DNA polimerases e funcionam como terminadores de elongação.
Os análogos, uma vez incorporados, inibem a atividade da DNA polimerase havendo a parada da
replicação do DNA.
Para o término da replicação, há mecanismos que permitem a síntese da extremidade das
fitas, no caso de DNA lineares. Em DNA circulares, o término se dá quando duas forquilhas de
replicação se encontram, indicando a síntese completa do DNA.
O DNA dos eucariotos está organizado em cromossomos que são longos e lineares. As
pontas dos cromossomos, chamadas de telômeros, são formadas por sequências repetidas de nucleotídeos e
estão relacionados à estabilidade genômica.
Durante os diversos processos de replicação, os telômeros vão diminuindo de tamanho
levando a senescência (morte) celular. Em células germinativas, que possuem alta atividade de
replicação, o tamanho dos telômeros é mantido, graças à ação da enzima telomerase. A telomerase faz
com que os telômeros não se encurtem ao longo das divisões celulares, prolongando (por meio da adição
de nucleotídeos) as pontas dos cromossomos lineares.
OBS: Após o nosso nascimento, a atividade de telomerase é praticamente nula em todos
os tipos celulares, dessa forma os adultos não sintetizam a telomerase, a não ser que alguma situação
reverta essa condição. Isso pode acontecer em alguns tumores que são capazes de reverter a síntese da
telomerase, o que é uma grande vantagem replicativa, já que a enzima irá atuar na manutenção dos
telômeros. Assim, a telomerase pode ser usada como um alvo interessante em estratégias terapêuticas de
combate ao câncer.
 
2. Transcrição em eucariotos e procariotos:
Dogma central:
O DNA é o material genético transmitido de pai para filho que contém toda a informação
necessária para determinar as nossas características, sejam elas físicas ou metabólicas.
No DNA há sequências específicas de tamanhos limitados que dão origem a um produto
funcional, os chamados genes. A partir da informação contida em cada gene é possível a síntese de
diferentes proteínas que vão ditar como serão as características do indivíduo. Para que aconteça a
produção da proteína, a informação do gene precisa ser transcrita e posteriormente traduzida para que de
fato o produto (proteína) seja formado. Então, a informação do DNA é transcrita em RNA e traduzida em
proteínas. Esse fluxo de informação é conhecido como dogma central da biologia.
• O RNA e suas classes: A C G U
O ácido ribonucleico (RNA), assim como o DNA, é constituído basicamente por quatro tipos de
nucleotídeosque se diferem quanto às bases nitrogenadas. O açúcar que compõe o RNA é a ribose, e suas
bases nitrogenadas são adenina, citocina, guanina e uracila. A uracila é uma base exclusiva e substitui a
timina. São de fita simples (na maioria das vezes) e podem assumir estruturas de dobramento (formando
dupla hélice) mesmo sendo de fita simples.
Basicamente há duas classes de RNA:
- Codificantes - É o RNA mensageiro (mRNA) o responsável por ler e transportar até os
ribossomos as informações contidas nos genes.
- Funcionais - São aqueles que não codificam proteínas. O RNA transportador (tRNA) e o RNA
ribossômico (rRNA) também fazem parte da expressão genética, embora não sejam codificantes. O tRNA
leva os ingredientes necessários (aminoácidos) para a construção das proteínas até rRNA, que é um
componente estrutural dos ribossomos, e quem de fato sintetiza as proteínas. Pequenos RNAs nucleares
(snRNA) participam no processamento de outros RNAs. Os chamados microRNAs, RNAs curtos de
transferência (siRNA) e RNAs longos não codificadores (lncRNA) são importantes no controle da
expressão gênica.
* Mecanismos básicos de transcrição:
A transcrição é o processo de síntese de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) que é
complementar à uma fita de DNA. A síntese ocorre na mesma direção da replicação (5’ – 3’) e a
molécula de RNA formada também é antiparalela, ou seja, está no sentido oposto à polaridade da fita
molde de DNA. A transcrição é a etapa inicial da expressão gênica e onde ocorre grande parte da
regulação da expressão.
Promotores: A região do genoma que define o gene é maior do que a sequência que de
fato codifica a proteína. Isso porque o gene é composto por três regiões:
- Promotora - É a parte inicial do gene, atuando como um marcador desse gene por meio de
sequências específicas de DNA. É ele que sinaliza o local em que deve ser formado o complexo de
transcrição.
- Codificante - É a sequência que de fato será transcrita e que contém a informação
necessária para a síntese da proteína.
- Terminalizadora - Consiste em uma sequência de DNA contendo informações que
promovem o encerramento da transcrição e permite a liberação do RNA transcrito.
As regiões promotoras possuem sequências básicas que se repetem nos genes, sendo
denominadas de sequências consenso. A sequência consenso mais famosa, que está presente nos
procariotos e nos eucariotos, é a chamada TATA box que contém seis pares de bases (TATAAT).
OBS: Nos procariotos, os genes se encontram estruturados de forma diferente dos
eucariotos. Vários genes possuem o controle de um mesmo promotor, o que significa que quando esse
promotor é acionado para dar início à transcrição, todos os genes que ele controla são transcritos.
Esses genes são denominados de policistrônicos. Já nos eucariotos, os genes são denominados de
monocistrônicos, pois cada promotor controla um único gene.
• • • • RNA polimerase:
 
A enzima responsável por catalisar a síntese do RNA é a RNA-polimerase, que diferentemente da
DNA polimerase não necessita de um iniciador (primer) para dar início à transcrição. Os seres
procariotos (bactérias e arqueas) possuem somente um tipo de RNA-polimerase, responsável pela
transcrição de todos os RNA.
 
A RNA-polimerase possui múltiplas subunidades, sendo a bacteriana composta por
cinco subunidades distintas: αI e αII (alfa), β (beta), β’ (beta’) e ω (ômega).
 
O complexo formado por essas cinco proteínas, chamado de complexo central, é suficiente
para a síntese de RNA desde que haja a fita molde e ribonucleotídeos. Porém o complexo central não é
capaz de reconhecer o promotor, logo, é necessária a adição de uma outra proteína (fator sigma σ), que
será responsável por se ligar ao promotor e permitir o início da transcrição.
 
Complexo central + fator sigma = holoenzima
 
Os eucariotos têm três RNA polimerases (RNAPI, RNAPII, RNAPIII) que sintetizam
diferentes classes de RNA.
A RNA polimerase II transcreve os genes para a síntese do RNA mensageiro, que
posteriormente será traduzido em proteínas. Diferentemente do que ocorre nos procariotos, a RNA
polimerase não se liga diretamente ao promotor, e sim ao conjunto de proteínas chamado de fatores
gerais de transcrição. Esses fatores possuem como função primordial atrair a RNA polimerase para a
região da transcrição e a posicionar no local correto.
 
• • • • O processo de transcrição:
 
 A RNA polimerase utiliza etapas bem definidas na transcrição de um gene. Essas etapas são
agrupadas em três fases: início, alongamento e término.
 
- No início da transcrição, a RNA polimerase se liga ao promotor (mas não o reconhece)
ou a proteínas específicas (fatores de transcrição que serão discutidos posteriormente). Assim como na
replicação, a dupla hélice do DNA precisa ser aberta no local onde se inicia a transcrição. O
rompimento das pontes de hidrogênio entre as fitas do DNA forma a chamada bolha de transcrição,
que é uma região de aproximadamente 18 pares de bases. Com a abertura da dupla hélice do DNA, as
fitas ficam acessíveis na bolha de transcrição; uma delas será usada como fita codificadora, e a outra
como fita molde. A fita codificadora é onde se encontra o gene que vai ser transcrito. O RNA
mensageiro que será formado precisa ser igual a região codificante do gene, diferenciando-se somente
pela presença da uracila. Então, para que o mRNA seja igual ao gene (que está na fita codificadora), a
RNA polimerase usa a outra fita de DNA (fita molde) para fazer a síntese. Na transcrição, os
ribonucleotídeos (ATP, UTP, CTP, GTP) são adicionados sequencialmente à cadeia crescente de RNA.
O sentido da transcrição é o mesmo da replicação, ou seja, sempre ocorre na direção 5’ – 3’. Ao final
do processo de transcrição, o mRNA é liberado e direcionado ao citoplasma para ser traduzido.
 
OBS: A transcrição é bem menos precisa que a replicação, ocorrendo um erro a cada 104
ribonucleotídeos adicionados, enquanto na replicação o erro é a cada 107 nucleotídeos.
 
• • • • Transcrição em procariotos:
 
Para o início da transcrição, o fator sigma presente na RNA polimerase reconhece o promotor do
gene que será transcrito e se liga a ele. A RNA polimerase dá início à síntese colocando o primeiro
nucleotídeo (normalmente uma purina – A ou G) sobre a cadeia molde de DNA. Quando a cadeia de
RNA que está sendo formada alcança de 8 a 10 pares de bases, o fator sigma se desprende da RNA
polimerase, que continua a síntese. A fase do alongamento se inicia, na qual a RNA polimerase dá
continuidade à adição de nucleotídeos à cadeia que está sendo formada. Como há complementariedade
entre as bases, um híbrido de DNA/RNA é formado na transcrição. O término do processo pode ocorrer
por meio da chamada terminação intrínseca, na qual se forma um grampo na fita simples do RNA
recém-formado, ou por meio da terminação que é dependente de uma proteína chamada Rho. Sugere-se
que essa proteína aja empurrando a RNA polimerase e com isso libere o RNA transcrito ou interrompa a
ação da RNA polimerase por mudanças conformacionais provocadas na enzima.
 
 
 
• • • • Transcrição em eucariotos:
 
O início da transcrição em eucariotos só ocorre depois que todos os fatores de transcrição
necessários estejam corretamente montados e só então a RNA polimerase se liga a eles para começar a
síntese de RNA. A união dos fatores de transcrição e a RNA polimerase constituem o complexo de pré-
iniciação. Depois da montagem de todos os fatores de transcrição e da chegada da RNA polimerase,
ainda é necessária uma última etapa para que a transcrição propriamente dita ocorra. A RNA
polimerase contém uma cauda proteica que sofre uma fosforilação (adição de fosfato), isso faz com
que a RNA polimerase então dispare a transcrição. Essa cauda é denominada de cauda
carboxiterminal (CDT) e a sua fosforilação é o sinal para o início da transcrição.
 
Um exemplo de fator de transcrição é o TFIID (fator geral de transcrição), que reconhece a
sequência consenso TATA e se liga a ela por meio da sua subunidade TBP (TATA-binding