DOSAGEM DE PROTEÍNAS E ELETROFORESE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI 
CAMPUS ALTO PARAOPEBA 
 
 
 
 
 
RELATÓRIOS DE IMUNOLOGIA APLICADA A BIOPROCESSOS: 
DOSAGEM DE PROTEÍNAS E ELETROFORESE 
 
 
Relatório apresentado como parte das 
exigências da disciplina de Imunologia 
Aplicada a Bioprocessos Experimental sob 
responsabilidade do professor Antônio 
Helvécio Tótola. 
 
 
 
Mariana Maciel Bertolino Diniz – 154200050 
 
 
 
 
 
 
 
OURO BRANCO – MG 
JULHO/2021 
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DOSAGEM DE PROTEÍNAS E ELETROFORESE 
INTRODUÇÃO 
As proteínas são extremamente importantes para o bom funcionamento do organismo, 
sendo estas encontradas em uma variedade de formas, como anticorpos, enzimas entre outras e 
tendo papeis fundamentais no combate a doenças, regulando funções do corpo entre outras 
funções e, para saber se estas estão em equilíbrio podemos dosa-las através da técnica de 
dosagem, onde purifica-se a proteína de interesse e a quantifica. 
Após a realização da técnica de dosagem de proteínas, exe4cuta-se a eletroforese em 
gel, onde ocorre a separação de moléculas carregadas e assim, estas são separadas de acordo 
com suas propriedades físicas e peso molecular, à medida que passam por uma corrente elétrica. 
A eletroforese em gel é uma técnica na qual moléculas carregadas, como as proteínas, são 
separadas de acordo com suas propriedades físicas e peso molecular à medida que passam por 
uma corrente elétrica. 
OBJETIVO 
Purificação de anticorpos IgY a partir da gema do ovo e identificação da concentração 
através da eletroforese em gel. 
MATERIAIS E MÉTODOS 
Quebrou-se a casca de um ovo cuidadosamente retirando todo excesso de clara. A gema 
foi transferida para o papel filtro para remover o restante da clara, rompeu-se a pele da gema 
com um instrumento de ponta fina e o conteúdo foi transferido para um tubo falcon. 
 O volume inicial da amostra de gema foi medido e em seguida adicionou-se a solução 
de precipitado A (PBS/PEG 4000 5,25%), a solução da gema na proporção 1:2. Colocou-se a 
mistura sob agitação mecânica durante 5 minutos em temperatura ambiente. Adicionou-se aos 
tubos PBS e centrifugou-se a solução a 4 ºC durante 10 minutos a 3500 rpm. O sobrenadante 
foi filtrado e em seguida descartou-se o precipitado. 
Mediu-se o volume do filtrado e adicionou-se a solução de precipitação B (PBS/PEG 
4000 42,5%) e agitou-se por 5 minutos e centrifugou-se a 3500 rpm a 4 °C durante 10 minutos. 
O sobrenadante foi descartado e o precipitado suspendido em 5 mL de PBS. Adicionou-
se a solução de precipitação C (PBS/PEG 4000 24%) na proporção 1:1. Colocou-se sob agitação 
por 5 minutos e centrifugou-se a 3500 rpm a 4 °C durante 10 minutos. Descartou-se o 
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sobrenadante e suspendeu-se novamente o precipitado em 3mL de PBS. Em levou-se para 
dialise, usando o Cassete G2 de capacidade de 3ml. No primeiro momento o cassete foi 
colocado em um recipiente contendo NaCl 0,1 molar. Passado um pouco mais de uma hora o 
NaCl foi substituído pelo PBS diluído uma vez, e o cassete então foi colocado em 1800 ml de 
água com 200 ml de PBS. 
Preparou-se a solução do gel de resolução colocando-se em um béquer água mais 
solução de acrilamida-bisacrilamida, Tris 1,5 M pH 8,8 (SDS 10%) e, por último, adicionou- 
persulfato de amônio e TEMED. Verteu-se a solução delicadamente, com o auxílio de uma 
pipeta, para que não houvesse formação de bolhas. Adicionou-se água destilada sobre a 
superfície do gel e aguardou-se, aproximadamente, por cerca de 20 a 30 minutos até sua 
completa polimerização, adicionou sobre o gel de resolução. Retirando-se a água colocada 
sobre o gel de resolução. Em seguida introduziu-se um pente no gel para que fosse formado um 
poço. Transferiu-se o gel para a cuba eletroforética e colocou-se o tampão de corrida conforme 
as especificações do aparelho. 
As amostras foram misturadas a um corante azul de Coomassie para dar coloração, 
servir como indicador do progresso eletrofotoelétrico e aumentar sua densidade evitando que 
saíssem dos poços em forma de dente no gel no qual foram colocados. Aplicou-se cada uma 
das amostras, com cuidado, dentro de cada poço formado. Ligou-se a fonte para corrida sendo 
que, quando o azul de Coomassie atingiu o fim do gel de resolução, desligou-se a fonte e retirou-
se a tampa da câmara despejou-se a solução de eletroforese e removeu-se o gel que a seguir foi 
corado. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
A proteína da gema do ovo, IgY é um tipo de anticorpo solúvel, que forma solução com 
um diluente apropriado. O diluente utilizado foi o tampão PBS 1x, que é uma solução salina 
tamponada, utilizada na purificação com o intuito de evitar variações bruscas de pH durante o 
processo de purificação, para que a proteína não desnature. Esse tipo de purificação por 
precipitação utilizada foi PBS/PEG 4000 em diferentes porcentagens de concentração para que 
tenha uma diferença de densidade significativa entre a solução PBS/PEG e a proteína de 
interesse. A solução PBS/PEG aumenta a solubilidade do anticorpo. O componente PEG do 
sistema reduz a solubilidade da molécula alvo pela modificação da solução e o PBS reduz a 
solubilidade por alterações da molécula alvo, ou seja, alterando-se as propriedades do meio por 
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mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes orgânicos miscíveis e polímeros 
orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas. 
Após adicionar a amostra inicial ao sistema e realizar a agitação, a solução transformou-
se em uma solução bifásica, e o sobrenadante continha a proteína de interesse, anticorpo IgY. 
Na terceira agitação mecânica o sobrenadante passou a ser a solução de PEG 4000 e água e o 
precipitado continha a proteína de interesse, a utilização da água impede que a proteína não 
sofra interação com a solução de PEG. Essa diferença da posição da proteína de interesse na 
solução acontece devido a variação da concentração de PEG 4000 adicionado a cada etapa e 
também ao volume de amostra da gema. A concentração de substâncias do ovo vai diminuindo 
a cada agitação mecânica e com isso os anticorpos ficam cada vez mais concentrados 
aumentando seu grau de pureza. A diálise foi realizada para remoção de PEG e contaminantes 
e o sal adicionado, NaCl (1 mol.L-1), possibilitou a remoção do PBS. Com isso a utilização de 
PBS/PEG 4000 em diferentes porcentagens de concentrações foi essencial para aumentar o grau 
de purificação de IgY. Para encontrar a concentração das proteínas construiu –se a tabela 1 para 
que os gráficos fossem plotados, ao qual pode se ver na imagem 1. 
Tabela 1 – Resultados para a construção da curva de calibração 
Concentração (mg/mL) ABS Replicata 1 ABS Replicata 2 ABS Replicata 3 
1,00 0,494 0,492 0,49 
0,50 0,38 0,378 0,377 
0,25 0,225 0,229 0,227 
0,125 0,151 0,15 0,155 
0,0625 0,07 0,072 0,075 
 
Imagem 1 – Curvas de calibração 
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 A partir das curvas, construiu-se as tabelas 4, 5 com as concentrações amostrais e assim 
descobriu-se a concentração da proteína purificada, sendo esta multiplicada por 2 que é seu 
fator de diluição. 
Tabela 4 – Cálculo das concentrações das replicatas 
Absorbâncias 
amostra 8 
Concentração na 
Replicata 1 
Concentração na 
Replicata 2 
Concentração na 
Replicata3 
0,601 1,16 1,17 1,18 
0,611 1,19 1,20 1,20 
0,617 1,20 1,21 1,22 
Média 1,18 1,19 1,20 
 
Tabela 5 – Concentração real da proteína purificada 
 Concentrações reais Média Desvio Padrão Erro % Erro médio % Dispersão % 
1 2,37 2,39 0,02 0,66 0,48 0,70 
2 2,38 0,06 
3 2,40 0,73 
 
 Dessa forma sabe-se que a concentração da proteína purificada é de 2,39±(0,02)mg/mL, 
com um erro de 0,48% e dispersão de 0,70%, muito baixos, considerando o método válido e 
preciso, após descobrir a concentração, para ter certeza da presença da proteína realizou-se a 
eletroforese em gel, obtendo a imagem 2 para a amostra 8. 
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Imagem 2 – Gel de eletroforese 
 
O resultado da eletroforese mostra o aparecimentode duas bandas. A cadeia leve 
(25kDa) e a cadeia pesada (70 kDa). Essas cadeias são mantidas juntas por pontes dissulfeto 
intercadeia e por interações não covalentes. O número de pontes dissulfeto varia entre as 
diferentes moléculas de imunoglobulinas. 
CONCLUSÃO 
Conclui-se assim que a concentração da proteína purificada é de 2,39±(0,02)mg/mL e o 
procedimento foi realizado com sucesso. O anticorpo foi purificado da gema do ovo pelo 
sistema aquoso de duas fases que permite a separação do anticorpo das demais moléculas 
presentes no ovo. O procedimento possibilitou uma maior concentração do anticorpo e um 
maior de grau de pureza. 
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REFERÊNCIAS 
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Disponível em: https://www.tuasaude.com/exame-de-proteinas/. Acesso em 26 Jul. 2021. 
MONTASSIER, H. J. PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES 
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http://revista.oswaldocruz.br/Content/pdf/Edicao_18_Willer_Ferreira.pdf