biologia molecular

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�traçã� d� ácid� nucleic�
DNA das células eucarióticas
localizado no núcleo envolto por uma
membrana nuclear, carioteca localizada no
interior da célula, delimitada pela membrana
plasmática, tais membranas são compostas
por fosfolipídeos e proteínas
Nos cromossomos está gravada a nossa
identidade, pode se ligar através de
sequências de bases do DNA, como um
código genético.
extração de ácidos nucleicos
Permite que ocorra o rompimento da
membrana plasmática e do envoltório nuclear,
dessa forma consequentemente, o material
genético extravasa, esse processo permite a
extração das moléculas de DNA através de
centrifugação do composto em presença de
solventes orgânicos.
Razões para se realizar a extração de
ácidos nucléicos
● determinação precisa de todos os detalhes
genéticos da pessoa
●
● identificação e combate de problemas de
saúde considerados genéticos
●
● comprovação de paternidade
Ocorre em 4 etapas:
1° Lise celular: exposição do material genético
(DNA ou RNA)
lise química = detergente
lise mecânica = maceração
11
2° Purificação: remoção de componentes
celulares como proteínas, organelas e restos
celulares
3° Precipitação: concentração do ácido
nucleico
4° Reidratação: ressuspensão do DNA ou
RNA
pode ser extraído da: urina, sangue (mais
comum) FFPE ( tecido fixado em formalina e
embebido em parafina), mucosa bucal.
tampa roxa: EDTA
tubo todo vermelho: sangue total
parte amarela: plasma
Lise das membranas lipídicas
A lise celular ocorre mediante o rompimento
das membranas celulares
(fosfolipídios+proteínas) o que libera o
material contido no núcleo. Para esse
processo é utilizado soluções detergentes
(dodecil sulfato de sódio SDS) que
desestabilizam e quebram os lipídios da
membrana.
Purificação (desproteinização)
remoção de componentes celulares como
proteínas, organelas e restos celulares
separação DNA de proteínas
a) proteinase K: desnaturação das
proteínas
b) fenol: remove proteínas e outros
contaminantes da solução aquosa
c) clorofórmio: ajuda a desnaturar
proteínas e remover o fenol residual
d) NaCl: ajuda a manter a proteínas
dissolvidas no líquido extraído,
impedem que precipitam.
Precipitação
etapa em que o DNA ou RNA é separado do
restante dos componentes celulares
para a precipitação do DNA, utiliza-se etanol
gelado ou isopropanol a 4°C, pois o DNA é
insolúvel em álcool e se torna menos denso do
que a solução obtida
o etanol induz a transição estrutural nas
moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem,
com consequente precipitação
etanol absoluto: concentra o DNA e ajuda na
remoção de resíduos de fenol e de clorofórmio
presentes na amostra
etanol a 70% é utilizado para remover
resíduos de sais
retira-se o álcool para formação de pellat
* quanto mais gelado o etanol, menos solúvel
o DNA vai estar
álcool - cloreto de sódio - absorve o que não é
dna
Reidratação
após a retirada do álcool, o DNA precisa se
solubilizar em algum solvente: água ultra-pura
ou uma solução tampão, esse solvente servirá
para armazenamento do DNA extraído
deve ser livre de contaminantes e enzimas
capazes de destruir o DNA
mantém ph ideal para não ter desnaturação
armazenar o DNA s -20°C = até 6 meses
armazenar o DNA -80 °C = pode ficar muito
tempo
Como visualizo o DNA extraído?
Quando um gel é pigmentado com o corante
que se liga ao DNA e depois colocado sob luz
UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos
permite visualizar o DNA presente em
diferentes locais ao longo da extensão do gel.
quando tem DNA = bilha
transluminador = ilumina com luz ultravioleta
quanto mais grossa a fita + DNA
quanto mais fina a fita - DNA
Eletroforese
eletro = potencial elétrico
forese = movimento = migração
possíveis aplicações da eletroforese =
avaliação da presença de DNA, separação de
acordo com tamanho molecular
é semi - quantitativo = não dá número exato de
moléculas
movimento de partículas dispersas num fluído
(matriz - gel de agarose) sob influência de um
campo elétrico uniforme
DNA é carga negativa - tem tendência a se
dirigir ao polo positivo quando sujeito a um
campo elétrico.
serve para separar moléculas por
tamanho/carga elétrica
- proteína deve ser desnaturada com
detergentes (sds)
técnica utilizado à exaustão em trabalhos de
biologia molecular
unidades de medida: pb (pares de base) ou kb
(kilobase)
DNA sempre migra do POLO NEGATIVO para
POLO POSITIVO.
*ordem alfabética para lembrar
lado negativo para APLICAR a amostra = lado
preto
lado vermelho = positivo
quanto menor for a molécula = mais rápida é
quanto maior for a molécula = mais lenta é
primeira linha do fragmento de DNA = régua
molecular
fonte de eletroforese = descarrega potencial
elétrico
a escolha da matriz de separação usada
depende principalmente do tamanho dos
fragmentos analisados
agarose: separar fragmentos de tamanhos
muito distantes (diferentes) - 100-3000 pb
polímero (proteína) linear composto por
resíduos de galactose unidos por ligações
glicosídicas
- forma malhas por onde o DNA vai
passar
quanto + agarose = + fechada a malha
quanto - agarose = - fechada a malha
a agarose não é solúvel em temperatura
ambiente e precisa ser aquecida e resfriada
para a formação do gel (gelificação)
poliacrilamida: maior resolução (tamanhos
parecidos e mais próximas), separa
fragmentos com até 1 pb de diferença.
quanto mais fechada a malha, mais resistência
os fragmentos de diferentes tamanhos sofrem
e mais separados eles ficam.
corantes: EtBr e GelRed
gel loading buffer; aumenta a densidade da
amostra e da cor a amostra
- azul de bromofenol
- xileno cianol
- orange g
- sacarose/glicerol/ficoll
tamanho da molécula influencia a migração no
gel
intensidade da cor vai de acordo com a
concentração da molécula
concentração ≠ tamanho
+ concentração = + intensidade
- concentração = - intensidade
é necessário marcar o DNA com marcadores
para visualizar os fragmentos
- colorimétrico
- fluorescência
-
Quantificação do DNA por espectrofotometria
realizada por medição da quantidade de luz
absorvida pelo DNA em solução no
comprimento de onda de 260 nm. Quanto
maior for a absorção de luz nesse
comprimento de onda, maior a concentração
de DNA na solução
Tecnologi� d� DNA recombinant�
- unir DNA de espécies diferentes
- usado para criar vacinas (ex: covid)
- extrair DNA: urina, lágrimas, suor,
esperma, secreção vaginal.
1- organização estrutural das células
2-organização nuclear e nomenclaturas
3-transferência da informação do DNA para a
proteína
4-endonuclease de restrição (clivar material
genético para isolar)
Engenharia genética
Ato de modificar a constituição genética de um
organismo por meio da biotecnologia.
Modificações podem ser geradas por métodos
que alteram, removem ou introduzem genes
para produzir organismos com características
desejáveis.
Os genes podem ser provenientes da mesma
ou de outras espécies.
plasmídeo: DNA circular, controle do DNA
citoplasmático.
Endonucleases de restrição
- enzima de restrição
- clivagem do DNA
Isolada enzima de restrição de uma bactéria
Bactérias: produzem naturalmente enzimas de
restrição —> proteção contra infecções virais
enzimas cortam o DNA viral em fragmentos
(mecanismo de proteção)
Por que estas enzimas não degradam o DNA
das bactérias?
CH3: grupo metil - metilação
vírus: deposita material genético na bactéria
somente quando tem infecções viral
Enzimas de restrição
- enzimas produzidos por bactérias para
restringir a proliferação de vírus
invasores - várias enzimas diferentes
- diferentes tipos de enzimas clivam
diferentes sequências de bases de DNA
- ajuda a detectar a presença de
diferentes formas de determinados
genes - variadas de acordo com seu
sítio de ligação
As enzimas de restrição são chamadas de
acordo com a bactéria que o produziu
Como elas cortam o DNA
dois tipos de fragmentos:
extremidades simétricas: quando as fitas são
clivadas em posições opostas
extremidades coesivas: quando os cortes
encontram-se deslocados
se tem alguma mutação a enzima não
consegue clivar
Utilidades das enzimas de restrição
Como as enzimas derestrição possuem a
capacidade de cortar o DNA dependendo de
uma sequência específica, elas são muito
utilizadas em biologia molecular para verificar
a variabilidade de indivíduos que diferem
em uma determinada sequência por um
único nucleotídeo (SNP) e para obtenção
de fragmentos para construção de
moléculas de DNA recombinante.
Clivagem por endonucleases
cromossomos homólogos: pai e mãe
1- extração de DNA
2- digestão por enzima de restrição
3- eletroforese
Genótipos possíveis
Clonagem de DNA
clonagem de DNA é o processo de fazer
várias cópias idênticas de um pedaço
específico de DNA.
o gene ou outro fragmento de DNA de
interesse é primeiramente inserido numa peça
circular de DNA chamada plasmídeo.
Qual a finalidade de produzir várias cópias de
uma sequência de DNA num plasmídeo?
em alguns casos, precisamos de muitas
cópias de DNA para realizar experimentos ou
construir novos plasmídeos.
O fragmento de DNA codifica uma proteína
útil, e as bactérias são usadas como “fábricas”
para produção dessa proteína.
Etapas da clonagem molecular
1- isolar o gene de interesse
Para que se tenha DNA recombinante, de
duas origens diferentes, é necessário utilizar
as enzimas de restrição. Essas enzimas
reconhecem a sequência alvo e específica e
cortam seletivamente o fragmento que será
utilizado.
plasmídeo recombinante: vetor do gene de
interesse
Enzimas de restrição são nomeadas a partir
das espécies de procariontes dos quais
foram isoladas.
2- Unir o gene ao vetor: DNA recombinante
O fragmento de DNA é inserido em um vetor,
que é uma molécula de DNA na qual um gene
é inserido para construir a molécula de DNA
recombinante.
gene = gene de interesse
DNA ligase = unir o fragmento do gene de
interesse para o DNA circular. Irá formar
ligações fosfodiéster entre o seu DNA e as
duas extremidades dos plasmídeos.
,
Plasmídeos
O vetor de clonagem mais utilizado são
plasmídeos de escherichia coli. Eles são
moléculas de DNA circular compostas por
regiões funcionais:
- uma origem de replicação
- um gene de resistência a determinado
antibiótico
- um gene LacZ (cor azul)
- alguns sítios de restrição (região onde o
inserto será inserido)
sítios de restrição estão dentro do gene
LacZ
3- Transformação - o microrganismo
Molécula de DNA recombinante produzida é
introduzida em um organismo hospedeiro,
podendo então ser replicada.
bactérias e leveduras podem ser
transformadas.
As células hospedeiras copiam o DNA do vetor
juntamente com o próprio DNA, criando
múltiplas cópias do DNA inserido.
4- Semeadura e incubação
- As bactérias são semeadas em ágar
contendo o antibiótico correspondente
ao gene de resistência presente no
plasmídeo, e somente as bactérias
que possuem o plasmídeo (contendo o
gene de resistência dentro delas
conseguirão crescer no meio.
- no meio da cultura também é
adicionado um substrato cromógeno,
como por exemplo a X-Gal (análogo da
lactose —> galactose + indol)
- Enzima beta-galactosidase
(produzida pela LacZ) cliva a X-Gal
em galactose e um composto azul
escuro.
5- Triagem azul-branca
colônias brancas: bactérias em que os
plasmídeos contendo o inserto estão
presentes (gene de interesse). Significa que o
gene LacZ foi interrompido pelo inserto, não
produziu a enzima e não clivou a X-gal. DEU
CERTO!
colônias azuis: bactérias que tem o
plasmídeos, mas eles não têm o inserto (não
foi modificado). Isso significa que o gene LacZ
não foi interrompido (íntegro) pelo inserto e foi
transcrito na enzima e produziu a cor azul.
6- Confirmação se o inserto realmente está no
plasmídeo
Selecionar algumas colônias brancas e
semeá-las novamente, porém em meio líquido
(caldo) e não em ágar
Se tiver dado certo, terá duas bandas: uma de
plasmídeo e outra do seu inserto.
7- Purificação de proteínas
A proteína de interesse é então purificada,
separada dos demais conteúdos das células
(ex: outras proteínas e macromoléculas).
Garantindo que não haja nenhuma impureza,
restando apenas o produto final (ex: insulina)
Aplicações
Biofármacos
Produzir proteínas humanas com aplicações
terapêuticas, como:
- insulina
- hormônio de crescimento humano
- ativador de plasminogênio tecidual
(tPA/APt) - usado para tratar derrames e
prevenir coágulos sanguíneos.
Terapia genética (TG)
Desordens genéticas —> pacientes não
possuem a forma funcional de um gene.
TG —> fornece uma cópia normal do gene
para as células do corpo do paciente
construir plasmídeos com uma versão normal
do gene que é não funcional na fibrose cística.
quando os plasmídeos foram liberados nos
pulmões dos pacientes com fibrose cística, a
função pulmonar deteriorou menos
rapidamente. ,