Biologia molecular 2

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BIOLOGIA MOLECULAR NP2
DNA recombinante > mistura de DNA de uma espécie com outra espécie
Transgênicos: gene da bactéria que tem no solo e produz uma proteína que funciona como inseticida, diminui agrotóxicos
Recombinar > “cortar’ DNA > enzimas de restrição ou endonuclease > quebra ácido nucleico no meio da molécula
Vírus não é um ser vivo, ele não se multiplica sozinho, precisa de um hospedeiro > célula de alguém 
Enzimas de restrição > restringe multiplicação do vírus
*Alcool gel apenas inativa o vírus
Bactéria tem enzima que quebra DNA viral, utilizando enzimas de restrição para cortá-lo em fragmentos
Vacina de hepatite B > feita com essa técnica 
*Exonuclease > tira nucleotídeos da ponta
Endonuclease > quebra ligação do meio (interior) da molécula
Vírus não entra na célula muitas vezes e sim joga o material genético dele
Bactéria produz as endonucleases que quebram DNA viral, porém o DNA (sequência) da bactéria fica protegido (matilado), DNA fica escondido
Enzimas de restrição: reconhece sequência específica, essas sequências são sítios de restrição (lugar) onde a enzima corta, que tem sequência específica > estão ligadas à moléculas metiladas
Sequência palindrômica: GAATTC / CTTAAG > enzima precisa reconhecer toda essa sequência para cortar, é o sítio de restrição
Enzima de ecoli: EcoR1
Enzima quebra entre G e A
*Para ocorrer a recombinação é necessário cortar os dois DNAs com a mesma enzima de restrição > precisa de sequências iguais (palindrômicas) para que a DNA ligase possa agir. Precisa de partes complementares
*Vetores: transportador, são moléculas de transporte. Responsáveis por transferir a molécula de DNA recombinante para célula hospedeira, que multiplica esses fragmentos.
Plasmídeo: pode sair da bactéria e entrar em outra, são pequenas moléculas de DNA circular, aumentam a sequência > molécula que transporta um trecho de DNA para uma outra bactéria
Insulina > para fabricar > coloca o gene da insulina no plasmídeo (gene da insulina está em todas as células, porém tem íntrons, então é preciso pegar o RNA mensageiro das células beta pancreáticas, que não tem íntron) depois, faz uma RT-PCR, tendo gene da insulina sem íntron na forma de DNA, depois faz uma nova PCR e é preciso colocar o sítio de restrição com primers, para haver os cortes do DNA, o plasmídeo traz o sítio de restrição.
*Primers com sítio de restrição são mais longos
Plasmídeo: carrega genes essenciais para vida da bactéria, passa de uma bactéria para outra, transfere características genéticas entre as células. Veículo ideal para transportar fragmentos de DNA para dentro das bactérias
O que tem no plasmídeo (deixa bactéria resistente a antibiótico)? Sítio múltiplo de clonagem (com enzima de restrição), promotor (controla genes – ativa a produção da transcrição e tradução de genes) e o gene de resistência a antibiotico. SERVE PARA CLONAGEM DE BACTÉRIAS 
-Para colocar plasmídeo na bactéria > dar um choque térmico, ou choque elétrico, que faz abrir poros na superfície da bactéria
VETORES > são meios de transporte, vírus, plasmídeos
Sonda: oligonucleotídeo complementar a sequência que precisa ser vista
*Gel de agarose > usa brometo de etídio (corante fluorescente), não pode ser armazenado, por isso é preciso fazer um decalque do DNA. Eletroforese > bom para ver fragmentos e quantificar, mas não é bom para fornecer informação sobre sequência de bases do fragmento > é preciso “tirar” o DNA do gel
Southern Blotting: para verificar as sequências presentes no DNA. Ocorre hibridização, a sonda se liga ao DNA, isso para detectar um fragmento específico do DNA
Blotting > pegar algo do gel e transferir para membrana de nitrocelulose > serve como decalque
*Pegar o gel e mergulhar na solução de hidróxido de sódio (NAOH), se difundindo pelo gel, desnaturando o DNA (importante para separar as fitas)
Southern > depois, corta se a membrana do tamanho do gel e irá transferir o DNA do gel por conta do fluxo de solução salina (tampão) através do gel que faz esse líquido passar pela membrana até o papel, não deixando o DNA passar, ficando preso na membrana, o DNA se desprende da matriz e vai até a superfície da membrana (princípio do mata borrão)
Uma réplica do gel será obtida na membrana, o DNA será fixado
Assim, esse filtro poderá ser hibridizado com uma sonda específica, sonda que pode ser marcada com material radioativo, que se ligará só na sequência de DNA complementar a ela
Entre o gel e a membrana não pode ter camada de ar, se não o DNA não irá se fixar
*Pegar a membrana e mergulhar onde tenha a sonda presente > vai grudando a sonda na membrana (DNA) no dna complementar, apenas a sonda hibridizada fica na membrana
Para isso, é preciso de um filme fotográfico para revelar os resultados, mas é necessário pegar a membrana e colocar em uma pasta e juntar a membrana com o filme (numa sala toda escura, por conta do material radioativo) revelando os pontos aonde a sonda se ligou (pontos escuros)
Tecnica Southern Blotting > usada para identificação humana, exemplo: dna da cena de crime é o mesmo do suspeito?
Mutação: alteração de um nucleotídeo pode ocorrer no sítio de restrição(corte)
Sonda: oligonucleotídeo que hibridiza com uma sequência de DNA entre os sítios de restrição, detecta fragmentos entre os sítios
Dot Blot > Para saber se a sequência que precisa ser identificada foi hidrolisada > ex.: sonda que detecta gene normal e gene mutado e compara com DNA controle e DNA do paciente
Blotting > imobiliza DNA no filtro
Microarray > microarranjo > usado para estudar gene
· Chip de dna, um Dot Blot invertido
· Incubar DNA marcado com a pastilha > onde hibridizar o DNA fica preso
· Permite que o genoma inteiro seja pesquisado de forma rápida em um único experimento, usa suporte de vidro e não se faz manualmente, só automaticamente
· Para que usa? Para saber quais genes estão sendo expressos em células normais e em células tumorais
· Pode identificar doenças genéticas, chances de desenvolver doenças
DNA NA IDENTIFICAÇÃO
- Impressão digital: DNA fingerprint > impressão é deixada nos lugares que tocamos, sangue, saliva, sêmen, cabelo, unha, todos contém DNA
*O que faz o DNA ser diferente do de outra pessoa?
R.: O DNA não codificado, DNA satélite. Pois tem sequências repetidas em tandem, diversas sequências repetidas em sequência, impossível todos terem as sequências repetitivas iguais
Isso possibilita saber ou excluir evidências
*Tipagem de DNA > é possível alcançar resultados a partir de uma única célula
POLIMORFISMOS > variação de sequência, não é mutação, e sim variações do DNA em indivíduos normais, alteração de sequência, alteração no comprimento
SNP > Single Nucleotyde Polymorphism > polimorfismo de alteração de um único nucleotídeo, pode criar/abolir sítios de restrição
RFLP > polimorfismo no comprimento do fragmento da restrição > enzima corta DNA que gera tamanhos diferentes e a sonda se liga a eles
Região hipervariavel > constituída por sequências de 9 a 80 nucleotídeos repetidas em tandem, região minissatélite, varia muito de pessoa pra pessoa (essa região não é gene), mais importantes que SNP no quesito de identificação
VNTR > Variable number of tandem repeats > variação de número das sequências tandem
- EX.: se alguém tiver variação no número dessas sequências, isso será entendido como polimorfismo a partir da variação do número > MT importante para identificação. Classe especial de fragmento de enzima de restrição, varia número de restrição de pessoa para pessoa
*Sondas que detectam locos múltiplos
*Amplificação de microssatélite por PCR > STR
Teste de paternidade: atinge probabilidade de 99,99%, metade tem que bater com pai e outra metade com a mãe
Técnicas também servem para identificação de vítimas de acidentes, como por exemplo no 11 de setembro
SILENCIAMENTO DE GENES: contrário de expressar genes, ex.: desligar um gene
*RNA de interferência (RNAi): corta RNAm do gene perigoso (destrói ele) sem perturbar expressão de genes
> Mecanismo de proteção contra infecção viral, inibe expressão de um gene perigoso escolhido, contra por exemploa AIDS, hepatite, câncer
RNAi: Richard Jorgensen introduz cópias de genes de síntese de pigmento para intensificar cor, porém gene tem mecanismo de expressões, causando o efeito inverso (diminui cor) > ISSO COMPROVA que o RNA fita dupla provoca degradação de RNAm que tenha sequência de base complementar
RNA fita dupla: participa da regulação gênica, crítico no processo de silenciamento de genes, protege célula de vírus
Mecanismo RNA dupla fita: enzima Dicer > persegue RNA fita dupla (dsRNA) e corta a molécula gerando sequência de 21 a 23 pares de base de comprimento > com essa característica ele passa a ser siRNA, que tem duas bases livres em cada uma das extremidades 3’, e representa o sinal que desencadeia o mecanismo.
O siRNA se agrega as proteínas formando o complexo RISC, esse complexo é ativado quando a fita dupla do siRNA passa para fita simples, expondo sua sequência de base. ASSIM, o complexo RISC usa o siRNA para identificar o RNAm complementar, que é destruído provocando o silenciamento pela ajuda da Slicer
· O mRNA reconhecido é cortado pela Slicer, a célula reconhece o mRNA cortado como anormal e é degradado por enzimas, sendo impedido de ser usado na tradução, o complexo RISC se mantém intacto para atacar outras moléculas de mRNA (que perde o cap 5’ e a calda poli-a, não sendo reconhecido para tradução)
Qual fator desencadeia o silenciamento dos genes na célula? Existe genes para produzir moléculas pequenas de RNA, que ativa mecanismo de RNAi e promove ajuste de expressão genica
Micro RNA > semelhante ao siRNA
Na célula humana: se a molécula de dsRNA for muito grande, causa morte celular por conta dos interferons
siRNA sintéticos > tem que ser de 30 nucleotídeo para formar RISC e promover silenciamento através da destruição específica de RNAm
PROJETO GENOMA HUMANO > para sequenciar genes e fazer terapia genica > porém não se sabe a função deles
· A forma mais simples para determinar função > tornar inativo e observar o efeito produzido nas células e estabelecer função
Desenvolvimento de novas drogas através de expressão dos genes > o RNAi tem valor terapêutico por si só
Doença causada por elevada expressão de um gene pode ser tratada pela adição de sequência de siRNA para degradar as sequências complementares
*Problema: introdução segura para o siRNA no organismo
Sequência do DNA: síntese de DNA in vitro (PCR) 
Método enzimático de Sanger > utiliza DNA molde (fitas duplas), Primer iniciador, nucleotídeos que irão compor nova fita (ddNTP) e DNA polimerase que promove a síntese
Fred Sanger: método enzimático > uso de didesoxinucleotídeo (DDNTP) que é parecido com nucleotídeo normal, mas impede progressão da síntese, pois não tem OH na 3’ (três linha)
Primer com isótopo radioativo > permite ver as bandas com os fragmentos com DDNTP
ESSE PROCESSO CAI NA PROVA, ESTUDAR
Nos 4 tubos > os ddNTP diferenciam os tubos, sempre que ele entra na cadeia, faz parar no ddNTP que está no tubo, tubo com ddNTP a, para no a
Estudo dos cromossomos > FISH > hibridização in situ fluorescente 
*Sonda com corante > se liga ao cromossomo do paciente para saber se perdeu ou ganhou material genético e também visualizar rearranjos > usa hibridização com sondas marcadas com material fluorescente 
PRIMER – DESENHO 
· O primer irá se anelar quando a fita simples de DNA desnaturada começa a baixar a temperatura
· Ele deve ser longo para garantir um anelamento estável mais ou menos 20pb
· Não deve se atrelar um ao outro, nem formar grampos
· Se a temperatura for muito baixa, o primer pode se ligar em outras posições, e se for muito alta, pode não se ligar
· Quanto mais Cs e Gs houver, maior será sua temperatura de anelamento, pois o pareamento C-G tem três pontes de hidrogênio
PCR > amplifica trecho de DNA específico, na covid amplifica o trecho do vírus caso esteja presente no material biológico
TERAPIA GÊNICA
O genoma humano > serviu para identificar genes
· Entender funções e interações, estabelecer variações genômicas, decifrar processos metabólicos, caracterizar mutações, planejar estratégias diagnósticas
· O tratamento com terapia gênica ameniza os sintomas, melhora a qualidade de vida, mas não há cura 
Erro inato do metabolismo > ausência de enzima AB, alelos mutados, para isso, na terapia gênica é necessário fornecer proteína que falta, como por exemplo na hemofilia
Problemas> rápida inativação da enzima
Fenilcetonúria> falta de enzima que converte fenilalanina em tirosina, acumulando fenilalanina que vai ao cérebro e é tóxico
Administrar uma cópia funcional do gene no corpo humano para corrigir defeito genético
Grande desafio: colocar uma quantidade razoável de genes dentro da célula, o gene precisa se integrar no genoma para poder ser expresso por período significativo para observar melhorias
*Gene funcional ativo precisa de > calda polia, cap 5’, promotor, códon de início e fim > precisa ser ativo para células poder expressar esse gene e ser funcional na terapia
Terapia das células somáticas: modificação de tecido alvo
Terapia das células germinativas: gene modificado inserido no gameta, zigoto, primeiras fases do embrião > correção permanente da doença
Problema ético > pode iniciar novas raças, não é aceito em muitos países
Ex-vivo: tira célula da paciente e arruma a célula, depois devolve para o paciente, tratado com transgenes em cultura, retira célula da medula óssea
Adequada para doenças hematológicas > como talassemia e anemia falciforme
In-vivo: única opção para tratar doenças como distrofia muscular de Duchenne, fibrose cística, tecido afetado é pulmão e músculo. Nessa terapia precisa de vetores para entregar o gene modificado, esse gene precisa se integrar no genoma
Ponto crucial: encontrar método seguro eficiente do gene exógeno
Qual é o vetor crucial? Deve ter capacidade de acomodar um transgene grande, deve apresentar baixo custo e fácil manipulação, deve ser possível direcionar para tipos específicos de células, garantir expressão genica a longo prazo, não ser tóxico e não induzir reação imune
Vetores virais > sistema de transferência mais usado para terapia gênica, deve ser geneticamente modificado para evitar danos
Genes virais para replicação > devem ser deletados para o sistema imune não atacar, gene terapêutico substitui gene deletado
Pfizer > RNA no lipossomo
Vírus > adenovírus > fita dupla > fácil multiplicação, expressa genes sem se inserir no genoma, expressão curta, ideal para vacinas
Vírus adenoassociado > na ausência do vírus auxiliar não se replica, ele se integra
Lentivírus > retrovírus, se multiplica muito, precisa ser modificado, integra-se no genoma, expressão por longo tempo, risco de mutação (vírus de RNA que transforma em DNA, transcriptase reversa) > vírus do HIV, vetor perigoso
Vírus da herpes simples > candidato para tratar doença neurológica, infecção latente por toda vida, imunológico
Terapia gênica part2
*Problemas a longo prazo: expressão a longo tempo, inserção do gene ao acaso pode causar danos, pode interromper sequência de gene essencial ou ativar oncogenes
Doença monogênica > alelos perdem função, doença recessiva, talassemia beta > falta de gene da cadeia B, gene pequeno, fácil de ser acomodado no vetor
Terapia de substituição> recombinação homóloga, sequência de gene parecido pode substituir o local do original, tendo uma mutação corrigida, ou destruindo o gene expresso desordenadamente, inibe/bloqueia expressão do gene
DNA: bloqueia transcrição, RNA: destrói transcrito (RNA de interferência), Proteína: inibe produto proteico 
· Gene anti sense: forma RNA fita dupla > não sendo mais traduzido
Câncer: linfócitos infiltrantes de tumores > câncer desliga o linfócito que está combatendo ele, mas continua crescendo, hoje existe anticorpos (desenvolvidos em laboratório) que impedem os linfócitos de serem desligados, assim o linfócito continua combatendo ele (câncer) > assim o sistema imune combate a célula tumoral
Proteína fator de necrose tumoral > transferir esse fator para linfócito matar célula tumoral, porém não funcionou
ADA > DOENÇA > linfócito T não conseguese dividir > insuficiente para dar proteção, compromete imunidade > doença metabólica
Tratamento: transplante de medula óssea, células da medula óssea, essas células tomam lugar da medula original
Problema: rejeição por conta da compatibilidade de proteínas, sempre acontece > paciente convive com o processo de rejeição
Outra opção > auto transplante, correção das células da medula da mesma pessoa