Aula 5 - Preciptacao de proteinas

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PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
Universidade Estadual de Maringá
Departamento de Bioquímica
SOLUÇÃO SOBRENADANTE
SUSPENSÃO PRECIPITADOAlbumina
Ácido tricloroacético
üAprender sobre as técnicas mais comuns usadas para purificar e concentrar 
proteínas de interesse; 
üReconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas;
üAnalisar a influência do pH sobre as cargas elétricas nas moléculas das 
proteínas;
üReconhecer os grupamentos responsáveis pela solubilidade das proteínas
em água;
üIdentificar os agentes que podem alterar essa solubilidade.
OBJETIVOS
A ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS
A SOLUBILIDADE DAS PROTEÍNAS EM ÁGUA
A solubilidade deve-se, em grande parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da 
superfície externa da proteína. Se a interação entre a proteína e a água for grande, a proteína 
será hidrossolúvel.
A SOLUBILIDADE DAS PROTEÍNAS EM ÁGUA
Se a interação proteína-proteína for grande e a interação proteína-água for pequena, a proteína 
tenderá a ser insolúvel. 
Agente precipitante
PRECIPITAÇÃO E PROTEÍNAS
A precipitação de proteínas é amplamente utilizada no processamento downstream de produtos
biológicos, a fim de concentrar proteínas e purificá-las de vários contaminantes.
O mecanismo subjacente de precipitação é alterar o potencial de solvatação do solvente, mais
especificamente, diminuindo a solubilidade do soluto por adição de um reagente.
AGENTES PRECIPITANTES
Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir 
o pH do seu ponto isoelétrico pela adição de ácidos ou bases metálicos. 
A precipitação isoelétrica não envolve a desnaturação da proteína. 
Ø Ação de ácidos, bases;
Ø Sais neutros e de metais pesados;
Ø Solventes orgânicos;
Ø Temperatura.
 
Os agentes precipitantes são compostos químicos que influem de 
maneira importante na solubilidade das proteínas e podem promover a 
precipitação. O calor também é um agente precipitante. Os diferentes 
agentes precipitantes atuam por diferentes mecanismos e o uso destes 
compostos acarretam na desnaturação da proteína.
AGENTES PRECIPITANTES
+
+
-
-
-
Agente 
precipitante
Alguns compostos eletricamente 
carregados podem interagir com as 
proteínas que possuem carga oposta, 
levando a formação de complexos 
insolúveis e agregados que acabam 
por precipitar.
PRECIPITAÇÃO POR AÇÃO DO CALOR
O calor pode desnaturar a maioria das proteínas, uma vez que a agitação térmica afeta as
interações que estabilizam a estrutura tridimensional das proteínas, como as pontes de
hidrogênio, interações dipolo-dipolo, interações de Van der Vaals, etc.
PRECIPITAÇÃO
PROTEÍNA DESNATURADAFORMA NATIVA
CALOR
PRECIPITAÇÃO POR SAIS DE METAIS PESADOS
Por exemplo, o tratamento de uma solução 
de proteínas com acetato de chumbo leva 
à formação de um proteinato de chumbo 
insolúvel.
Em pH 7,0 ou acima (pH > pI), as proteínas estão normalmente carregadas com cargas negativas. 
Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+, Ag+ e Zn2+ neutralizam estas 
cargas, fazendo com que as proteínas precipitem, formando proteinatos insolúveis. 
Os ânions dos reagentes acídicos podem combinar-se com as proteínas que possuem 
carga positiva, formando sais insolúveis. Dentre estes reagentes tem-se: ácido pícrico, 
ácido tânico, ácido sulfossalicílico e ácido tricloroacético. 
PRECIPITAÇÃO POR REAGENTES ACÍDICOS
Um exemplo deste tipo de precipitação é a reação de 
proteínas com ácido tricloroacético, resultando na formação 
de tricloroacetato de proteína, insolúvel.
+
+
+
+
+
+
+
+
pH polaridade do meio diminui 
–> interações entre polar-água 
diminuem –> interações entre grupo R – 
solvente aumenta -> PROTEÍNAS VIRAM 
DO AVESSO (MEIO MAIS APOLAR)
A força de atração entre dois íons 
de cargas opostas (F), pode ser 
expressa como:
 
 e+ e-
 F = _______
 D r2
onde e+ e e- são as cargas dos 
íons, D a constante dielétrica e r, 
a distância entre as cargas. 
D H20= 75,56
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
• Enumerar 6 tubos de ensaio e pipetar 2mL de solução de albumina 
10% em cada tubo.
• Colocar o tubo 1 para aquecer em banho-maria
• No tubo 2 pipetar 3 gotas de sulfato de cobre e agitar
• No tubo 3 pipetar 5 gotas de acetato de chumbo e agitar
• No tubo 4 pipetar 6 gotas de TCA 10%
• No tubo 5 pipetar 20 gotas de Etanol (D=24,30)
• No tubo 6 pipetar 10 gotas de Acetona (D=20)
• Adicionar NaOH 2,5M lentamente no tubo 4 e observar a reversão da 
precipitação.
• Anotar e interpretar o que ocorre em cada tubo.
Parte 1: os agentes precipitantes
Reações de precipitação sem 
desnaturação 
Quando pH = pI não existe repulsão eletrostática entre as moléculas 
proteicas vizinhas e elas tendem a precipitar. 
Contudo, em valores de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico, todas 
as moléculas proteicas possuem uma carga efetiva de mesmo sinal e se 
repelem, evitando a coalescência das moléculas isoladas em agregados 
insolúveis. 
A proteína precipitada isoeletricamente permanece na sua 
conformação nativa (não é desnaturada) e pode ser redissolvida em um 
meio que apresente um pH adequado e concentração de sal 
conveniente.
Assim, na precipitação isoelétrica geralmente a proteína não desnatura.
PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA
pH = pI → carga 0pH pI → carga -
pH = pI → carga 0pH pI → carga -
Proteínas sem repulsão eletrostática se agregam 
formando precipitados insolúveis
Parte 2: precipitação isoelétrica
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
• Em um tubo de ensaio pipetar 5mL de solução alcalina de caseína 1% 
(pH = 8)
• Acrescentar 5 gotas de azul de bromofenol (agente de cor)
• Adicionar HCl 0,1 N gota a gota até que ocorra a precipitação
• Agitar o tubo entre cada gota de HCl adicionada
• Solubilizar novamente o precipitado adicionando NaOH
• Anotar o que ocorre em relação ao surgimento de precipitado e a cor 
do indicador de pH
 
Solubilização e precipitação por salificação 
1) Solubilização por salificação 
(sal 
aumenta interação proteína-proteína
 -> precipitação.
Adição de cloreto de sódio-> aumenta 
interação proteína-sal -> proteína 
solúvel (salting-in).
Sais interagem com as cargas positivas e negativas das proteínas
2) Precipitação por salificação 
(sal aumenta 
interação proteína-sal -> proteína 
solúvel (salting-in).
Sulfato de amônio rouba a água da 
proteína para se solubilizar.
A retirada de água -> aumenta a 
interação proteína-proteína -> proteína 
insolúvel (salting-out).
Precisa de muita água para que ele 
fique solúvel no meio (ele rouba a 
água da proteína).
Preparar em um béquer de 250 mL a clara de um ovo. 
Adicionar 200 mL de água desalada e agitar com bastão de 
vidro. As globulinas precipitam e a albumina permanece em 
solução. 
1) Solubilização por salificação (sal• Pipetar 5 mL da solução preparada em um tubo de ensaio. 
• Adicionar cloreto de sódio 2 M, gota a gota, até a 
redissolução do precipitado de proteínas. Esta redissolução 
se deve à restauração da força iônica original. 
Parte 3: Salting-in e salting-out
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
2) Precipitação por salificação (sal