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Sincronização do Estro em Bovinos Definição Permite a aplicação da IA em propriedades Biotecnologia com objetivo de forçar a com deficiência na observação de cio manifestação do estro de um grande número de Melhora na eficiência reprodutiva do fêmeas em um curto intervalo de tempo. rebanho 1 a produção Os métodos de sincronização compreendem uso Concentração do nascimento de bezerros de drogas que agem a nível facilitando o manejo hipofisário e/ou gonadal controlando ciclo Concentração dos partos em épocas estral. específicas do ano com condições Sempre associada a outra nutricionais mais favoráveis A IATE dispensa a observação de cio. Antecipa a entrada dos animais na estação de monta Objetivos Comercialização de lotes de bezerros com Sincronização do cio de matrizes em idades homogêneas programas de Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) e Transferência de desenvolvimento da US e Embriões em Tempo Fixo (TETF) dos métodos de dosagem hormonal permitiram Transferência de Embriões em Tempo conhecimento da dinâmico folicular em bovinos Fixo (TETF): pega um número X de fundamental para a execução da sincronização de receptoras, sincroniza com a estro produção do embrião, para quando o embrião tiver 7/8 dias (tempo ideal para colocar e ovular o embrião no 18 Ovulation P útero da receptora), e a receptora 16 D também esteja no sétimo dia do ciclo 14 D A D estral sincroniza a receptora com 12 D R Recruitment os embriões S 10 Selected 100 receptoras 100 embriões 2nd wave 3rd Dominant Sincronização de e receptoras em 6 Atretic programas de transferência de embriões A e a receptora devem estar 00 00 000 sensitive folicular 00 superovular a doadora (ela libera 20/30 oócitos). A METESTRUS DIESTRUS PROESTRUS ESTRUS 5 10 15 20 22 é inseminada; após 7 dias o útero dela é lavado e remove os embriões que estão lá e passa para A sincronização de cio é a manipulação a folicular da vaca útero da receptora Facilitar a detecção de cio na inseminação convencional Por que utilizá-la? Não faz muito sentido IA - acelera retorno na reprodução Condições para implantação Manejo Inseminador Estrutura física da propriedade (cercas e Nutricional e Sêmen Assistência + detecção de Técnica Sanitário cio currais de manejo) Identificação e escrituração confiáveis Seleção prévia dos animais quanto aos aspectos sanitários, reprodutivos e Resultado do nutricionais. Programa de IA Os animais devem estar com bom escore corporal e/ou ciclando. Pontos de Estrangulamento da IA Detecção de cio eficiente (depende do método de sincronização). Falhas na detecção de cio Cio curto (ppl novilha) Resultados 66% dos sinais entre 18 h e 6 hFalhas na identificação dos animais Quanto mais novo CL, mais demorada é a Falta de condições para manifestação do de 2 a 4 dias estro Clima Vantagens Problemas hormonais: manifestação Baixo custo do observador Facilidade de aplicação Ferramentos no auxílio do diagnóstico do cio Buçal marcador Heat watch Ov Pouco usado Alto custo Dá muito problema Kamar ou Beacon Adesivo de tinta Estrus alert (raspadinha) Adesivo -10 3 6 9 12 15 18 21 0 1 Pedômetro Dias do Ciclo Aparelho que sincroniza com Progesterona Estradiol LH FSH celular/computador que aciona com movimento da vaca A vaca no cio tende a se movimentor Pós palpação/US - presença de CL mais IA PG Métodos de indução e sincronização do cio da 48 96h vaca Observação cio Uso das Prostaglandinas Aplica prostaglandina em um grande número de animais, observa o cio e insemina. Uso do GnRH "Ovsynch" Prostaglandinas Segundo método PG PG Uso dos IA IA Progestágenos ou Progesterona Obs cio Obs cio ou progesterona mais usado. DO D11 Dispositivos intravaginais ou subcutâneos Dia 0: aplica a prostaglandina em 100 vacas, quem A escolha do protocolo depende de: manifestar cio é inseminada. Viabilidade lote que não foi inseminado (que sobrou) recebe eCG encarece protocolo uma segunda dose de prostaglandina e são Estrutura da propriedade inseminadas quando cio (dia 11) Observador de cio? Simples e pouco eficiente Inseminador? Rufiões Fases de um protocolo Necessário MANIPULAÇÃO DO Redução fase - CICLO ESTRAL PGF2a Primeiro método Pré-requisitos Sincronização da Controle da Indução da emergência folicular regressão do CL Ovulação Corpo lúteo responsivo (6 e 17 dias ciclo) luteólise A vaca deve estar ciclando GnRH PGF, Estradiol observação de cio Estradiol Progestágeno/ GnRH Progesterona Progesterona LH A saber: manifestação do estro 48 a 96h Aspiração Estradiol hCG (desvantagem) Folicular**Estradiol + mais usado ovulação quando ovular folículo, oócito estará **Controle da regressão do CL momento em que deve velho diminuir a para induzir pico de LH. **Quando aplica benzoato menor prazo para a Deve-se usar a prostaglandina, retirar o progestágeno, inseminação. Associa-se T4 com benzoato, para e aplicar mais uma dose de estradiol. A prostaglandina provocar atresia folicular, para que se tenha tenha uma vai lisar qualquer eventual CL nova onda folicular após 3-6 dias em todas as vacas **GnRH tem intenção de FSH, para induzir a ovulação **Dia 7, retira-se o dispositivo e aplica a prostaglandina para eliminar qualquer CL que tenha permanecido no GnRH/LH/hCG ovário (se não a sincronização ficará prejudicada) **Dia 9, aplicação de uma fonte de estrogênio (pode Promove a ovulação e/ou luteinização de aplicar GhRH ou qualquer droga ovulatória mas folículos, com subsequente emergência normalmente usa benzoato ou GnRH). No dia seguinte sincronizada de uma nova onda de insemina a vaca crescimento folicular **Quando aplica cipionato maior prazo para a Melhora a eficiência da sincronização por inseminação potencializar pico de LH **Protocolo de 4 ações Principalmente durante a ovulação Menor dispersão na manifestação do estro DIB-Synch Corte Vacas ciclando Estrógenos Promove atresia do folículo dominante Progesterona Sensibilização dos receptores de induzindo luteólise precoce DO D8 D9 D10 Provoca ovulação com manifestação de estro Benz.estr (2ml) Ciosin (1ml) Benz.estr.(1ml) IATF(28-32hs após Gonadiol) 1 a sincronização do estro pelo 1 do pico de DIB DIB LH (mesmo horário) 1,0 mL ECP 2,5 mL Na segunda dose IATF Progesterona CIDR Prolonga a fase luteal de animais cíclicos 00 D7 D11 Sensibiliza sistema reprodutivo e induz a emergência da onda folicular e ovulação 0,5 mL em animais em anestro 200 UI eCG Estrogênio Gonadotrofina Coriônica Pode provocar atresia de folículos, com consequente emergência de nova onda de Ovsynch IATF crescimento folicular, dependendo do nível protocolo Ovsynch se baseia em uma única sérico de estrogênio aplicação de GnRH (provocar crescimento, uma A queda brusca nos níveis de progesterona nova onda), que terá efeito FSH. Dependendo de provoca manifestação de estro com menor como ovário esteja, ele vai ser impedido de agir. dispersão Se tiver um folículo dominante no ovário, estrogênio fará feedback negativo, ou seja, não deixará FSH agir. PG e ret. P4 GnRH ou BE IATF O problema desse protocolo é início: a sincronização. Não é um método muito eficiente na sincronização do cio (não provoca atresia DO D7 48h D9 12-16h ou 24-30h folicular) **D7: progesterona. Retira dispositivo. Aplicar uma Ovsynch base para outros protocolos dose de prostaglandina. **D9: Aplica GnRH ou benzoato e insemina 12-16 ou 24-30 Fatores que influenciam resultado: horas depois (dependendo do protocolo) Taxa de ovulação **Dispositivo intravaginal Tamanho do folículo no momento da **No primeiro momento, na hora em que coloca indução dispositivo, aplica ou valerato de estradiol Taxa de progesterona circulante ou cipionato, **3 fontes de estrogênio: de estradiol (meia Fertilidade vida mais curta), cipionato de estradiol (ECT; meia vida Qualidade do oócito intermediário) e valerato de estradiol vida longa). Perfil hormonal **Pode-se utilizar valerato no primeiro momento, mas Transporte dos gametas nunca no último momento, pois ele irá retardar muito a Reconhecimento materno da gestaçãoQualidade do CL formado Patologias GnRH PG GnRH IATF Princípios básicos Sincronização da onda folicular 2 a 3 dias DO D7 48h D9 12-16h Luteólise **12-16 h após a aplicação do GnRH faz a IATF Indução da ovulação Limitações da IATF Dinâmica folicular OVSYNCH Boa condição corporal Aplicação dos fármacos no momento certo GnRH GnRH IATF Quantidade de fármaco injetado 16h Qualidade do sêmen Efeito do inseminador 14 Custo 10 Ov: 30h am 6 P4 2 Dia 0 Dia 1/2 Dia 7 Dia 9 Dia 10 Transferência de Embriões em Bovinos Seleção de Isenta de alterações nos sistemas Objetivo locomotor, digestivo, urinário e circulatório Aumentar número de produtos geneticamente (mamário). superiores a partir de doadoras(es) selecionadas Isenta de alterações no trato genital, pelo médico veterinário. principalmente com sede na cérvix, útero, A deve ser compatível fisiologicamente ovários e ovidutos. com processo de superovulação Recursos genéticos Parâmetros observados Preservação de raças que tenham Genéticos: Importância fundamental devido a de interesse, influência que exercerão sobre as próximas tais como: rusticidade, adaptabilidade, gerações. prolificidade, resistência e/ou tolerância a Devem ter produção média superior à da doenças e parasitas. população, bem como corocterísticos Raças que estejam em risco de extinção e da raça. cujo valor genético ainda não foi estudado. Nas raças leiteiras observar conformação de úbere, aptidão para ordenha, massa Origem das corporal, constituição, apetite e assimilação Rebanhos sem qualquer relato de caso de alimentos, fertilidade e produtividade. clínico infecto-contagioso nos últimos 6 Nas raças de corte observar conformação, meses. padrão racial, ausência de defeitos Conhecer histórico reprodutivo hereditários (prognatismo, hipoplasia Com um período de pós-parto não inferior ovariana) a 60 dias, e pelo menos um ciclo prévio de duração normal. Clínico-reprodutivos: Fazer exame clínico geral e Tenha transcorrido pelo menos 35-40 dias ginecológico completo. do último tratamento superovulatório (FSH) A deverá ter tamanho e idade Marketing: dita as regras de mercado, e compatíveis. muitas vezes linhagens que não são Ciclo estral regular (se pós-parto, pelo contempladas poderiam colaborar de menos 1 a 2 ciclos). maneira efetiva para melhoramento Atenção especial para o cérvix daCérvix que dificulte a a a. Ainda não está diagnosticada fazer o lavado b. Já recebeu embrião Observar a condição tanto na 4. Lote de prenhas parte de exames, vacinas e parasitários. Vacas amamentando, ppl primíparas e Critérios de seleção vacas velhas. Ciclicidade (ciclo estral regular). Estado nutricional Saúde reprodutiva. Dar atenção ao bem-estar animal, Porte compatível com o produto a ser minimizando situações de estresse. gestado. Estresse atrapalha a superovulação Habilidade materna. Potencial de produção de leite suficiente. Quando o programa é executado na propriedade, Temperamento. observar: Sanitários. Situação reprodutiva e sanitária do Clínico-reprodutivos: fazer exame clínico rebanho geral geral e ginecológico completo (abrir a Condição de alimentação, aguadas, vulva, observar úbere) mineralização Isenta de alterações nos sistemas Que apresente instalações adequadas locomotor, digestivo, urinário e para realização do trabalho circulatório Isenta de alterações no trato genital, Para os doadores (touros) principalmente no útero, ovários. Mérito genético Atenção especial na identificação, Sêmen de boa qualidade que seja visível e permanente TE regulação de múltiplos oócitos Rigoroso controle sanitário Quando se utilizam receptoras da propriedade, as taxas de prenhez podem ser 10 a 15% superiores A TE é uma atividade comercial, logo, deve que as obtidas com receptoras recentemente proporcionar retorno do capital investido (2 incorporadas ao programa. colheitas com 10 a 12 embriões viáveis e 5 a 6 Novilhas tendem a dar melhores resultados que produtos nascidos garante retorno vacas, principalmente nas taxas de prenhez, mas econômico). os problemas de manejo durante a gestação, Média de embriões/colheito 5, de 3 torna-se parto e lactação podem produzir resultados finais antieconômico inferiores do que os obtidos com vacas. Animais com escore corporal regular, mas Prenhez/colheita 2,6 é considerado muito bom, ganhando peso, dão melhores resultados que 1,8 a 2,3 ainda é econômico animais obesos. Opção para aquisição de receptoras: animais Para se iniciar um programa de TE, o ideal seria leiteiros de descarte por baixa produção. trabalhar com 10 a 12 doadoras e medir os resultados pelo número de produtos nascidos Vantagens num espaço de 2 anos. Manejo mais simples Bom tamanho para gestação e parto Seleção de receptoras Boa produção de leite para a cria As receptoras são parte essencial do programa de Temperamento dócil, menos stress na TE, podendo garantir o sucesso ou fracasso do manipulação durante os procedimentos de programa. Tem custo elevado, manutenção cara e sincronização e inovulação. o estado de saúde é crítico para da TE. Precauções na compra de vacas para receptoras Existe a necessidade de 4 lotes de receptoras: Observar se está prenha ou com cria ao pé 1. Lote de espera sanitário) Se estiver vazia: se foi servida por touro ou a. Exame clínico geral. inseminada, quantos serviços, há quanto b. Exame clínico específico. tempo está vazia. C. Certificar se foram feitas ou fazer as vacinas e testes contra as principais Descarte de receptoras doenças infecto contagiosas (6 e 2 Após a terceira inovulação com embrião de semanas antes de entrarem no boa qualidade. programa). A possibilidade de ficar gestante na d. Atenção especial ao estado primeira e segunda inovulação é nutricional. semelhante, mas diminui na terceira 2. Lote de trabalho oportunidade. 3. Lote inovuladoNúmero de receptoras: Recomendação de 6 a 10 por Principais protocolos I. Protocolo clássico (de superovulação de bovinos) Indução da ovulação múltipla em bovinos Fazer com que as e as receptoros FSH IA Coleta fiquem sincronizadas um modelo de uma M M M M M receptora deve estar com 7 dias que ela deu ciclou T T T T T para ela receber um embrião que saiu do útero de DO D9 D 10 D11 13 14 20/21 uma com 7 dias. Cio base induzido ou não A condição normal da espécie é ter uma ovulação. PGF dose recomendada na Aplicação do FSH Base Fisiológica da SOV D0 ovulação Anotar quantas vacas apresentaram cio em um determinado dia (por exemplo: 4) as 4 vacas servem, de um ponto de vista fisiológico, para começar programa de superovulação pois cio junto (estão na mesma condição). Espera passar 9 dias (para garantir uma produção de progesterona). D9 - a superovulação nas 4 vacas FSH é uma glicoproteína que tem meia 0 5 10 15 Dias do ciclo LH vida curta, muito parecida entre espécies Deve ser aplicada a cada 12h Progesterona aplicação: na manhã do dia 9 FSH Concentração de FSH: começa a Ovario: aplicar muito e termina com pouco. 1 ovulação/ Segunda aplicação: na tarde do dia 9 17.4/ano x15=260 D10 segundo dia de aplicação do FSH ovulação Aplicação de manhã e de tarde **Tem 2, 3 ou 4 ondas de desenvolvimento folicular Concentração menor que a do dia anterior durante um ciclo normal (recrutamento, seleção, dominância, produção de libido, atresia...) **A progesterono deve estar elevada para sucesso D11 terceiro dia de aplicação do FS na superovulação: feedback negativo folículo Aplicação de manhã e de tarde dominante não ovula outra -> até que uma Concentração menor que a do dia anterior prostaglandina lisa CL, fazendo com que a Segura desenvolvimento de folículos progesterona pico de LH ovulação aplicação de prostaglandina também lise deve superovular no dia 0 do CL que está produzindo Principais alternativas/produtos D12 quarto dia de aplicação do FSH HCG (Gonadotrofina Coriônica Humana) Retirada do no terceiro dia eCG (Gonadotrofina Equina) Quando se aplica a prostaglandina, em Dá muito problema muitos cistos, média 48-72h depois, essa prostaglandino degenerações de embriões já agiu no CL e a cai. Cai FSH suficiente para que ocorra pico de LH O ideal é que tenha pico de FSH com pico, vem a ovulação hora de para que a ovulação ocorro inseminar Exógeno O FSH é aplicado do 8° ao 12° dia D13 aproveitamento de eventuais Faz-se a inseminação folículos da primeira onda e pegará 12h depois faz uma segunda inseminação em cheio a segunda onda Se for possível observar as fêmeas que Baseado na de um estão entrando em cio, é melhor ovário normal resultados melhores É o momento que elas entrarão em cio Obs.: Vantagens e desvantagens.48h depois da aplicação da prostaglandina Corresponde ao terceiro dia da e 12h depois do ciclo de inseminação. superovulação deve-se toda a chance de progesterona, logo, retira-se D14 dispositivo intravaginal e aplica a Se for um sêmen menos caro, uma prostaglandina (para garantir). inseminação (12h depois da Retirada a progesterona endógena e segunda). Mas normal é duas exógena (dispositivo) aplicação de FSH A partir primeira inseminação, conta-se 7 dias Com a retirada do progesterona, conta-se vai ocorrer a fecundação na tuba uterina, vai 48h e faz-se a inseminação. formar zigoto, formação da mórula; no quarto aprox, embrião cai no útero e no sétimo dia D10 ele está na extremidade do útero, aí faz lavado FSH de manhã e de tarde (entre D20 e D21) D11 II. Protocolo CIDR Primeiro (manhã) e segunda (tarde) inseminação FSH IA Coleta M M M M M M D12 T T T Segunda inseminação DO D2 D7 D9 D 10 D 11 D 12 D 18 A coleta é feita no D18 CIDR PGF 2a Qualquer dia Estrogin e aplicação de FSH III. CIDR do ciclo 2 ml REMOVER CIDR na aplicação FSH IA A sincronização de cio entre a e a Coleta M M M M M receptora facilita. Escolher que não estejam gestantes. T T T T DO D5 D7 D8 D9 10 D 16 Pega as fêmeas, aplica 2 mL de de estradiol sincronização de fase. CIDR Qualquer dia PGF 2a Aplicação de um dispositivo intravaginal de do ciclo e aplicação de 2 ml Estrogin progesterona. REMOVER CIDR na aplicação Zero ovário (vai um novo crescimento folicular) e dispositivo cria um CL artificial. A Produtos comerciais à base de FSH progesterona se eleva. Pluset (maior "contaminação" com LH) Mais usado em gado europeu D7 Nelore: Novilhas (200 a 220 UI); Vacas Espera passar 5 dias por uma (250 a 280 UI) elevação de não é Simental: Novilhas (300 a 320 UI); necessário esperar uma segunda onda de Vacas (400 a 500 UI) desenvolvimento folicular pois já foi criado Foltropin 5 dias de sensibilização do tem recrutamento e seleção. Mais usado em gado zebuíno FSH de manhã e de tarde Nelore: Novilhas (100 a 120 mg); Vacas (130 a 160 mg) D8 Simental: Novilhas (200 a 260 mg); FSH de manhã e de tarde Vacas (360 a 400 mg) **UI: unidades internacionais D9 FSH de manhã e de tardeReprodução de Equinos Anatomia bloqueia produção do LH e Pregas longitudinais fáceis de serem FSH a taxa de crescimento transpostas folicular diminui a Introduz a mão na vagina, com a mão abre fase de estro reflete na anel cervical e passa aplicador de duração do ciclo estral. sêmen. folículo cresce e para, depois Para coleta de embrião outro cresce e para ovário Passa a sonda de coleta: introduz a fica com aspecto de cacho de mão na vagina, passa a sonda e uva posicionar ela pós-cérvix Citologia e biópsia endometrial -> avaliar Anovulatory season tecido uterino pelo acesso da vagina, Ovulation Ovulation devido a disposição dos anéis cervicais. Ovário: região restrita à parte cortical fossa ovulatória CL não é palpável Tem cio de 5-7 dias, com a ovulação Transitional acontecendo no final do cio period que garante a fertilização do oócito é Receding Inactive Resurging phase phase intervalo da deposição do sêmen à phase ocorrência da ovulação. Oct Nov Dec Jan Feb Mar Apr May (Apr) (May) (Jun) (Jul) (Aug) Protocolos para indução da ovulação (Sep) (Oct) (Nov) permite trabalhar com uma única Northern Hemisphere inseminação garante fertilização (Southern Hemisphere) Éguas com problema uterino **Região sudeste: 15 de outubro a 15 de março Tamanho do folículo, avaliação de útero, sinais de cio, consistência do ovário Regulação Sazonal da Atividade Ovariana na Éguas define momento da aplicação do hormônio Receptores Prega transuretral bem desenvolvida Aumento da nos olhos Diminuição da delimitação da vagina com vestíbulo duração do dia luminosidade vaginal Fissura ventral da vulva bem desenvolvida pineal Melatonina Melatonina +++ Endocrinologia do ciclo estral da égua Hipotálamo Estacionais de dias longos a égua cicla quando GnRH GnRH a luminosidade está alta Hipófise Ciclo estral Anterior Duração: 22 dias (19-25 dias Gonadotropinas +++ Gonadotropinas principalmente do período de Ovários transição) Período de transição do anestro para estação (agosto-setembro), saída da Estro estação para o anestro (março-abril) Duração: 5-6 dias Cios de maior duração a duração Período de transição do dia é captado pelos olhos, Prolongamento do estro traduzido na gl. pineal. Fase de aceitação ao macho Maior luminosidade menor Intervalo início do cio ovulação produção de Variável depende da Primavera/verão folicular Menor luminosidade maior Na égua, aumento do LH, que produção de promove a ocorrência da ovulação, atua no neurônio GnRH tem um padrão de secreçãodiferente, demora a aumentar e embrião deixa de produzir estrógeno e ele vai demora a chegar no seu pico crescendo. Quando tenta passar do corno para máximo e demora a cair padrão corpo, onde o útero tem um menor diâmetro, ele de onda de base larga encalha na região. embrião pode ser Consequência: aumento identificado pela US a partir do dia 11 (11 dias possibilidade da ovulação de depois de inseminar a égua. No dia 7 chega na um segundo folículo na fase tuba uterina, após 4 dias ele fica em um tamanho de diestro, com um intervalo que permite sua identificação). Do dia 11 até o 16 maior da ovulação ele ainda está migrando, por isso deve-se varrer pode levar a concepção os dois cornos e o corpo uterino da égua. A partir gestação gemelar do dia 16, localiza embrião na junção do corpo Pico "pré-ovulatório" de LH com o corno Início: após lise do CL Ovulação 3° dia após a elevação Retorno nível básico 4-5 dias Ovulação 24 horas antes do término do cio Atividade luteínica Duração 14 dias (fêmeas não gestantes) Liberação da 14° dia do ciclo Luteólise Início da síntese 24-36h após a Day 16 ovulação Luteólise -> 14° dia Qualquer enfermidade encontrada no útero da Folículo dominante exposto a um LH égua vai prejudicar a migração e que demora a aumentar e a cair, consequentemente vai comprometer a fertilidade que permite um folículo da égua dominante ter uma ovulação mais a frente faz com que demore a Dia 18 aumentar as [ ] circulantes de Área anecóica/amarelo saco vitelínico (o progesterona (pois é ela que que nutre o embrião) bloqueia o LH) favorece ainda embrião equino não se alonga, pois tem mais a ocorrência a ovulação de um uma cápsula que o mantém esférico até o segundo folículo dia 30 da gestação. Essa cápsula que o Estrógeno permite migrar e evitar aderência na Início da síntese 6-8 dias após a parede do útero ovulação Por isso não se forma a placenta Pico máximo de secreção dia antes do dia 30 do ciclo Mesometrial attachment Myometrial contraction Endometrium LH Two FSH layers Progesterone PGF Three layers Day 18 Amniotic fold Reconhecimento materno da gestação À medida que o embrião vai metabolizando, vai Necessidade da migração do embrião no útero. produzindo excremento que vai para baixo (para a embrião migra, sintetiza uma substância que vai alantoideana). No decorrer do desenvolvimento do contrair a por volta do 15embrião, a vai crescendo (diminui em cima e aumenta embaixo) 175 10 150 9 eCG 125 8 100 7 75 6 50 5 Endometrial cups 25 4 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Days of Gestation P4 Accessory Quando embrião está no meio da vesícula, ele CL está com 30 dias + eCG Primary CL + eCG Primary CL P4 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 Days of Gestation **O eCG atua no CL primário ação de LH ppl na égua aumenta síntese da progesterona forma CL acessórios égua, as células da placenta invadem de forma por 70 dias. Depois e solto. Durante esse período produz eCG, que atua no CL primário **Se colher, purificar e aplicar na faz função A égua deve emprenhar em agosto, quanto Com 40-50 dias o cordão umbilical está formado antes na estação de monta Para cavalos de salto e corrida, é necessário manipular a estação reprodutiva Cio do potro: primeiro cio pós-parto. Acontece rapidamente (2 a 3 semanas) Manejo reprodutivo - estação de monta Estação de monta Período da estação de monta Cavalos de corrida - ano hípico Inicia no 1° de julho Período - diversas situações Manejo reprodutivo pré-estação de monta em setembro e vai até abril Cálices endometriais Células que invadem endométrio para formar os cálices que produzem eCG, que forma mais CL no ovário mantém a alta)Cérvix, útero, ovários palpação transretal Exame da vulva e vagina Coloração da mucosa Rosa pálida Vermelha intensa Ocorrência de secreção vaginal Seca, Levemente úmida Umidade média Muito úmida Acúmulo de líquido Manejo pré-estação de monta da secreção Manejo das éguas Mucosa Potras X éguas Exame ginecológico Muco-sanguinolento Identificação do animal Purulenta Histórico e anamnese Sangue Exame clínico Odor da secreção Porque fazer a US e palpação Outras observações durante a gestação? Acompanhar se houve Grau de abertura do canal cervical gestação gemelar (se Fechado acontecer, deve intervir Aberta para uma palha estresse alimentar) Aberta para um lápis Avaliação dos órgãos sexuais Aberta para um dedo Vulva, períneo e cauda - Aberta para dois dedos inspeção e palpação Aberta para três dedos Avaliação da conformação da vulva Exames complementores Angulação vulvar Citologia uterina Angulação Métodos de coleta vulvar anormal Escova ginecológica de 50-150 graus Swab uterino Angulação Lavagem uterina vulvar anormal: Centrifugação > 150 graus Curetagem Vagina - vaginoscopia Vulva, vagina e A - Flambar o coletor antes de realizar a colheita vestíbulo vaginal do material Sistema de iluminação B - Esfriar material com solução estéril Limpeza e antissepsia da região vulvar Tipos de corante Espéculos Coloração de Panótico Gotze (tubular) Coloração de Leishman Polansky Coloração de Giemsa Espéculo lavado, Biópsia uterina esterilizado e Histeroscopia lubrificado DopplerSincronização de Estro e Ovulação de Ovinos e Caprinos Ciclo estral Definição: Intervalo de um estro ao estro subsequente, sem a ocorrência de gestação, nem de anestro. Consiste em todas as mudanças morfológicas, bioquímicas e fisiológicas que ocorrem nos ovários e trato genital que conduzem a manifestação de estro, ovulação, fecundação, implantação do Sincronização de estro Como induzir os animais a fim de se obter Objetivo: Promover uma resposto fértil e altamente sincronizada em uma grande porcentagem das uma estação de monta e parição mais fêmeas tratadas concentrada Efeito macho Vantagens da sincronização Método natural (limpo, verde e ético) e de Facilidade de detecção do estro baixo custo Indispensável à IATF e TE É preciso de área (instalação) para o macho Programar o acasalamento ficar afastado (distância de 100 m) maior Sincronização de partos custo dessa técnica Manejo de mãe/crias (lotes homogêneos) Princípio: liberação de feromônios Eleva n° de partos/animal durante sua vida Alta dispersão do momento de aparição do produtiva estro Técnica de indução de cio Vantagens da indução assíncrona Parição outono/inverno Pré-requisitos Leite na entressafra (incentivo) Separação "efetiva" entre machos e Programação de partos e vendas (animais, fêmeas (estímulos visuais, auditivo, produtos) olfativo e tátil) alteram o sistema Diminui intervalos de partos reprodutivo e endócrino Na cabra de leite não é que se Com 2 meses afastada do macho, a fêmea procura (o intervalo entre partos manifesta o cio ideal é 12 meses), deve-se trabalhar Não usa o primeiro cio (CL tem vida curta; com dois lotes para ter leite o ano irregular; baixa qualidade) inteiro Na cabra de corte, intervalo de parto ideal é 7,5-8 meses Desvantagens da Fatores econômicos Avaliar custo-benefício Intervalo entre parto de ovinos/caprinos de corte É de 8 meses (3 partos em 2 anos), sendo: 5 meses de gestação Parto 1 mês de involução uterina Programas de luz 2 meses 2-3 ciclos estrais Start: decréscimo do número de horas de luz e aumento de escuro Redução da quantidade de hora do dia estando claroProtocolo: liga a luz 5-6h da manhã e Necessita de visualização de desliga às 22h durante 2 meses (de junho a estro, IATF não recomendada agosto). Após 2 meses, no final de outubro, taxas de gestação (a as fêmeas estão em cio sincronia não é tão 2 meses é o suficiente para Protocolo de 7,5 dias de sensibilizar sistema nervoso da manhã e termina de tarde) cabra para que ela ache que é verão É preciso de área (instalação) para macho ficar afastado (distância de 100 m) PGF2a Vantagens Ovul. Baixo custo (maior implantação) Evita Utilização tanto em machos quanto P4 fêmeas Menor mão-de-obra Desvantagens Relativamente longo Falta de luz Regime intensivo ou semi Progestágenos: aumento da fase luteal Indução de estro não síncrono Ferramento usada na estação reprodutiva (sincronizando) e indução (anestro) 200 LUX Protocolos longos X curtos Longo: 12 a 21 dias Luz Luz Cobertura ou Curto: 6 dias Artificial Artificial IA Vantagens Melhoria do grau de sincronização de estro e Natural ESTRO ovulação momento da 0 60 90 120 ovulação é mais (30/junho) (29/agosto) sincrônico Possibilidade de uso no Protocolos hormonais anestro estacional (requer Semelhantes aos de bovinos, com gonadotrofinas: eCG, hCG) pequenas particularidades Melhor associação com IA Vantagem de protocolo a base de e/ou IATF progesterona: maior sincronia da janela Desvantagens ovulatória; Mais laborioso (mão-de-obra) Se tiver em anestro tem que usar a e custo mais elevado aos fármacos Estrógeno: mais barato (eCG) produção de Prostaglandina: diminui a fase luteal de sincronização (estação reprodutiva) Ovul. Progestágeno Ovul. Almeja diestro Vantagens P4 custo do tratamento Eficiência de sincronização 60% na aplicação 90% na segunda Implantes de aplicação progesterona/ Desvantagens progestágenos Acetato de Não pode induzir estro, somente sincronizar (MAP) 1 variabilidade da resposta Dispositivos intravaginais com (CIDR) Fêmeas respondem de 12h até 5 dias após a Acetato de fluorogestona (FGA) última aplicação Acetato de melengestrol (MGA)Norgestomet Crestar e D12: início do aparecimento de estros Syncro-mate B I.A.: 12 a 24 h após início do estro Protocolos longos (tradicionais) ou curtos Dia Dia Dia 11 Dia 12 CIDR/Esponja 12 a 24 h I.A 200-300 UI eCG Cobertura ou IA ESTRO (48h) Ovinos 0 13 D0: colocação de esponja intra-vaginal D12: retirada da esponja + eCG CIDR/Esponja D14: início do aparecimento de estros I.A.: 12 a 24 h após início do estro 12 a 21 dias - Protocolo longo Dia Dia 12 Dia 14 Caprinos colocação de esponja intra-vaginal D9: injeção i.m. de eCG + luteolítico D11: retirada da esponja Produção In Vivo de Embriões em Ovinos e Caprinos Definição Conservação e multiplicação de raças/ Produção in vivo X MOTE (múltipla ovulação espécies ameaçadas de extinção seguida de transferência de embriões) X TE (transferência de embriões: uma etapa da Desvantagens/entraves técnica como um todo) a mesma coisa Peculiaridade de pequenos ruminantes transferência de embriões Custo superestimulação Eficiência variável (ampla variabilidade da prod. de dentro dela coleta os resposta super ovulatório, RPCL) embriões coloca em outra Pouco previsível In vivo: produzido dentro da fêmea Alta variabilidade de resposta In vitro: produzido em laboratório e Média mundial: 6 depois vai para a receptora Requer experiência e habilidade do Consiste em obter embriões de uma fêmea profissional e transferí-los para fêmeas receptoras, com a finalidade de Etapas da MOTE o período de gestação 1. Seleção de doadoras Considerada tão importante para as Produtividade fêmeas, quanto a IA é para os machos Leite Carne Vantagens/aplicações Habilidade materna Incremento da capacidade reprodutiva Prolificidade (10/12 crias na vida X 15 a 20 no ano) Caracterização racial Disseminação de genética superior Contagem de folículos antrais, pré- melhoramento genético aprimoramento seleção com eCO, dosagem de AMH mais rápido do rebanho (hormônio anti-mulleriano Sanidade (recomendações técnico- indicador da reserva folicular da sanitárias, reduzido risco de transmissão fêmea maior resposta de doenças, ZP...) superovulatória) e genótipos de Proibida a venda de embriões se a prolificidade ZP não estiver intacta Fêmeas impossibilitadas de gestar 2. Superovulação hormonal (traumas, idade avançada)Fornecimento de hormônios que RPCL estimulam crescimento e a Mais comum em cabras ovulação de vários folículos superovuladas (ovelhas também) Princípio básico: quebra da Grande quantidade de folículos dominância folicular anovulatórios secretando estrógeno, Entrar com FSH na fase de secreção prematura de PGF recrutamento Tratamentos SOV iniciados próximo 3. Sincronização das receptoras à emergência folicular alcançam Sincronia melhores resultados 7 mais ou menos 1 dia Quando inician a SOV evitar a TE ao 5° dia e 9° dia têm menor presença de folículos dominantes eficiência (com diâmetro superior a 4 mm) pois atrapalha a resposta da SOV; 4. Seleção de machos e acasalamento praticamente impossível de se Monta natural predizer este momento A proporção Na ausência de folículos não deve exceder 1:3 dominantes, iniciar na (na estação de acasalamento) onda ou 1:2 (na Pequenos ruminantes tem de 2 a 6 além de previamente: exame ondas intervalo variável entre elas andrológico Quando podemos iniciar uma SOV IA na ausência de folículos grandes São inseminadas mais nos ovários na primeira onda frequentemente e com (ovulação) -> folículos pequenos aumento na dose inseminante Protocolo dia 0: aproveitamento transcervical iniciado na primeira onda folicular cabras Normalmente: laparoscopia eCG ovelhas Muito pouco usado Primeiro gonadotrofina utilizada 5. Avaliação da resposta da Origem: equina Laparoscopia Meia vida longa: 40-72h (10d na Método não invasivo circulação bov) US Dose única elevada, 24/48h antes de retirar a P4. Gera perfis endócrinos 6. Coleta de embriões anormais, folículos anovulatórios e laparotomia reduzida qualidade embrionário Boa recuperação de lavado e Anticorpos (anticorpos anti-eCG embriões foram descontinuados nos anos 90) Demanda anestesia e jejum prévio FSH Maiores riscos ao animal Mais utilizado atualmente Formação de aderências Origem: pFSH ou FSH limita coletas sucessivas Meia vida curta:Caprinos Raro: com laparotomia A exemplo de bovinos, também tem Comum: laparoscopia ou semi deixado de ser realizada por via laparoscopia cirúrgica e passa a ser totalmente Não-cirúrgica não cirúrgica Difícil fazer TE sem prostaglandina Principalmente no BR Coleta cirúrgica Laparotomia Técnica de coleta Ovinos A - anestesia local; B- incisão; C útero exposto. F D - perfuração da parede do útero com ponteira plástica; E - introdução sonda "Foley"; F inflagem do balão. 7. Busca e avaliação dos embriões Rastreamento dos embriões: microscópio G - colocação do cateter; H - circuito de lavagem; J - recolocação do útero na cavidade abdominal - recolocação do útero na cavidade abdominal; Le M suturas Coleta não - cirúrgica - Transcervical Técnica de coleta o grande desafio desta técnica é transposição da barreira cervical ; Cérvix - anatomia; composta de 3 a oito anéis o sucesso na transposição depende de vários fatores; Raça, idade, n° de partos e fatores inerentes ao individuo 8. Inovulação (transferência)/criopreservação Cuidados com a A receptora deve ter um CL viável fazer US, doppler... A Diferentes protocolos hormonais AeC - cérvix de cabra; B e D - cérvix de ovelha (longa e sinuosa, com abertura dos anéis (sincronismo com a doadora) excêntricos não lineares) Cada técnica depende da espécieProdução In Vitro de Introdução Criação de embriões in vitro Biotecnologia animal é um dos campos da ciência Mimetizando as condições naturais que gerou as descobertas mais espetaculares das utilizando incubadora (temperatura, gases, últimas décadas umidade) 38,5 °C PIVE 5% em ar, UR Definição: é a produção de embriões a Esterilização total partir da manipulação de gametas fora do Toxicidade nula organismo materno - em condições Nutrição dos gametas e embriões laboratoriais Gametas em boas condições biológicas Representa aproveitamento de milhares Meios de cultivo de oócitos que jamais seriam ovulados A composição dos meios de cultura e requerimento dos embriões Vantagens das de produção de mudam de acordo com o estágio de embriões -> TE = PIVE desenvolvimento na Incremento da capacidade reprodutiva Equipamentos/materiais - laboratório PIVE Disseminação de superior Incubadoras de CO2 Fêmeas impossibilitadas de gestar Fluxo laminar (traumas, idade avançada) Microscópio Conservação e multiplicação de raças/ espécies ameaçadas de extinção Estereoscópio (lupa) Balança analítica Vantagens da PIVE em relação à TE pHmetro Osmômetro Pode trabalhar com protocolo de estimulação hormonal ou não Centrífuga Maior confiabilidade/reprodutibilidade Refrigerador maior garantia de quantos embriões terá Congelador Doadoras que não respondem à SOV Estufa de esterilização Pré-púberes, senis, gestantes ou post- Sistema ultra-puro de água Vestiário mortem Otimização do sêmen e uso mais eficiente Sala de esterilização do sêmen sexado Sala de meios Essencial para clonagem e transgênese Sala de cultivo ovocyte Vantagens da TE em relação à PIVE Sanidade (recomendações técnico- Cellules MIV sanitárias, reduzido risco de transmissão du FIV cumulus de doenças, ZP) 22 h 20 Qualidade maior do embrião embriões mais criotolerantes 48 h DIV Trophectoderme Multiplicação de descendentes DIV DIV IA: 1 Bouton embryonnaire 7 jours Blastocyste TE: 12 Pega os gametas, avalia, seleciona. oócito está em prófase (bloqueado). Fazer a maturação in vitro (só assim ele consegue ser fertilizado) para PIVE: 50 metáfase II; leva 24h, em média. Fertilização in vitro (unir oócito com sptz). dura 16-20h Deixar o embrião se desenvolver (zigoto, embrião de 1 célula, 2 células, 4 células, 8 células, 16 células,mórula, blastocisto...) in vitro. Fazer a Técnica complementar à seleção criopreservação, depois transferir para a Azul cresil brilhante (ABC ou "BCB") marca receptora oócito que ainda está em crescimento Atividade da enzima G6PDH Coleta de oócitos Ovários de abatedouro local ou colheita em Maturação in vitro fêmeas vivas Refere-se a progressão da cromatina Vaca e búfala durante a meiose de germinativa à Técnica de aspiração guiada metáfase II por US Pouco Anestesia epidural Aspiration Marcador que avalia se oócito maturou Rectum recovery ou não: liberação do corpúsculo polar Ovary Algumas espécies têm dificuldade nisso, pois oócito deve estar bem desenvolvido para que Meio básico, hormônios, fonte proteica, Aspiration fonte de energia, fatores de crescimento, for Needle Probe Probe guide guide antioxidantes, antibióticos **A agulha está ligada a um sistema de pressão negativa com uma bomba de vácuo e tubo do meio. Fecundação in vitro Quando faz a aspiração, folículo é sugado para meio Co-cultivo in vitro de oócitos em metáfase II com sptz previamente capacitados Cabra e ovelha Endoscopia Anestesia Tratamento hormonal pode ser feito Fatores que afetam a recuperação dos oócitos Tamanho do folículo Agente capacitante heparina (baixo Agulha e sistema custo) Pressão de aspiração 16-20h Fluxo de aspiração Quando oócito é fecundado, ele para de ser (termina processo meiótico) Após a coleta, triagem e seleção dos CCOs faz a extrusão do segundo corpúsculo polar Classificação oocitária Sêmen fresco ou congelado/descongelado Subjetiva Sêmen convencional ou sexado Número de camadas de células do cumulus Sexado: resultados variáveis na % de Oócito com citoplasma homogêneo blastocisto Apesar da classificação morfológica, estes Seleção Swim-up e Percoll são parâmetros podem não ser suficientes em os mais utilizados. Basicamente os vivos predizer a competência do oócito em se Gradiente de Percoll gradiente, desenvolver após a FIV. adc percoll em quantidades diferentes (mais ou menos concentrado) em um frasco, coloca os sptz em cima e centrifuga. percoll não permite facilmente que os sptz vivos ultrapassem ele; 4 2 3 normalmente ele retém os mortos. Os sptz vivos passam e ficam no 1 pellet do fundo do tuboSwim-up -> coloca os sptz no fundo Ativação do genoma embrionário do frasco e deixa o tubo invertido. Meios com componentes que permitem ao Os vivos nadam para meio zigoto sofrer a transição materno-zigótica específico (de cima) e desenvolver-se até estágio de blastocisto Meio mais utilizado é o SOF, suplementado com fontes proteicas (SFB, BSA, fatores de crescimento) Normalmente em gotas, permitindo confinamento embrionário. Incubação a 38-39 °C por 6-8 dias Meio base, fonte de energia, antibióticos, fonte proteica Fluidos da tuba para simular condições Indução da capacitação espermática fisiológicas Antes da FIV ou adicionar um Após 7 dias, pega os embriões e faz a indutor de capacitação na solução conservação por criopreservação Pega os oócitos maturados e coloca em um meio com sptz Qualidade Meio base, fonte fonte de Como avaliar: transferir o embrião para energia, agente capacitante, uma fêmea e dar uma gestação (resultado antibiótico esperado) Concentração espermático Indicadores confiáveis Se colocar muitos sptz, pode causar Avaliação do nível de expressão de uma poliespermia genes específicos ICSI injeção intracitoplasmática de sptz Metabolismo embrionário Cinética do desenvolvimento Contagem de blastômeros Resistência à criopreservação Seleção dos embriões Câmara de filmagem Desvantagens da PIVE Índices de prenhez abaixo dos 60% Embriões muito sensíveis ao congelamento Desbalance na proporção de machos e fêmeas mais machos que fêmeas Large Offspring Syndrome (LOS) Desenvolvimento in vitro síndrome da cria gigante Cultivo in vitro dos presumíveis zigotos até Devido aos meios de cultivo que eram usados o estágio de blastocisto Hoje em dia é raro Fertilized egg 2-cell stage 4-cell stage 8-cell stage 16-cell stage BlastocystCriopreservação de Embriões e Oócitos Introdução Crioprotetores Criopreservação conservação pelo frio Proteção celular Definição da criopreservação celular formação de cristais de gelo Redução ou mesmo parada de todos ponto crioscópico (ponto de os fenômenos biológicos congelamento) da água (movimentos moleculares, reações 1 estabilidade da celular. Ex: químicas e atividades enzimáticas), a gema de ovo temperatura inferiores a -150°C Botijão de nitrogênio a -196°C 1. Intracelulares (penetrantes): etilenoglicol, Na criopreservação, há perda de células e DMSO, glicerol, propanodiol, butanodiol, impacto no oócito (uma célula) é maior metanol que em um embrião (várias células) Substituem parte da água intracelular (por crioprotetor), Vantagens permitindo desidratação parcial da Manter a viabilidade das células célula, reduzindo a formação de reprodutivas por maior período de tempo cristais de gelo. Reduzem o tamanho (até anos) desses cristais, a temperatura de solidificação da água intracelular e A possibilidade de guardar o material genético, que otimiza as biotecnologias alteram a forma de cristais de gelo. reprodutivas Altas destes compostos são Extinção/produção tóxicos para células Toxicidade Troca internacional de material genético Maior acessibilidade materiais [] Entre: 1 e 2 M genéticos superiores Prevenção de perdas de animais vivos Tempo de exposição antes de ser durante o transporte congelado: 10 a 20 min Adequação a época de parições (se ficar tempo demais Sanidade pode desidratar Alguns microrganismos não demais e se ficar sobrevivem ao frio pouco não será suficiente) Princípios da criopreservação Nível de toxicidade (do menos Leis da termodinâmica para mais tóxico): protocolo empregado na etilenoglicol, glicerol, criopreservação de uma célula deve ser propilenoglicol suficientemente lento para prevenir a cristalização da água intracelular e 2. Extracelulares (não penetrantes): Lactose, suficientemente rápido para prevenir a glicose, PVP, manitol, trealose, exposição das células e elevadas ] de BSA osmótico eletrólitos antes da congelação Para que não saia água muito A célula por ser 95% composta por água, rápido. Atua junto com os torna processo difícil crioprotetores intracelulares Promovem desidratação celular Danos causados pela criopreservação controlada durante congelação e Lesões nas impedem a formação de grandes Desnaturação proteica cristais de gelo no interior da célula Desnaturação do citoesqueleto Papel osmótico importante durante Estresse oxidativo aquecimento, na manutenção de Desorganização das organelas maior pressão osmótica no meio extracelular que previne um Proteção contra danos grande afluxo de água nas células Suplementos e substâncias que melhoram a durante o aquecimento eficiência da técnica3. Moleculas protetoras do citoesqueleto Lavar embriões em PBS com 0,4% de despolimerização actina e tubulina BSA Citocalasina B (relaxante) Equilíbrio com 1,5 M de etilenoglicol Efeito benéfico na vitrificação em PBS com 0,4% de BSA por pelo de CCOs ovinos menos 10' Envase durante equilíbrio (mínimo 4. Proteínas anticongelantes (Antifreeze protein, de três colunas, separadas por AFP) bolhas de ar; embrião na coluna do meio) Métodos de criopreservação Bolhas: evitam que a palheta Congelamento lento exploda e ajudam a não Criopreservação pelo método misturar as soluções convencional palhetas ao congelador de Criopreservação pelo método "One embriões (já estabilizado entre -5 e Step" -7°C) Vitrificação Deixar por 5 minutos a -5/-7°C OPS temperatura crítica para que Grade de microscopia eletrônica de embrião congele (temperatura ideal) transmissão Realizar seeding (indução da Cryollop cristalização, formação de gelo) Crytop Confirmar formação do gelo nas Micropipetas de vidro GMP palhetas Deixar mais 10 min. a -5/-7°C Superfície sólida de vitrificação SSV Microgotas Iniciar curva de congelação (-0,3 a Hemi-palhetas (Hemi Straw) -0,6°C/min) Após atingir -35°C, mergulhar palheta em N2 líquido Seeding: indução da cristalização, da congelação da palheta Equipamento a base de aquecimento Descongelamento Reidratação do embrião TE direta: Descongelação: 5" no e 30" em banho-Maria a 20-25°C Palheta é montada diretamente no inovulador ; Recomendado não levar mais Congelamento lento do que 20' entre a Primeiro sistema para embriões mamíferos descongelação e a inovulação; Equilíbrio progressivo entre crioprotetor Não existe avaliação do e compartimento aquoso do embrião embrião. Taxas de resfriamento permitem a troca de água intracelular por crioprotetor, sem Vitrificação grandes efeitos osmóticos ou mudanças na Técnica do não equilíbrio forma celular, prejudiciais à funcionalidade Utiliza muito crioprotetor; quanto maior a das células velocidade de resfriamento melhor, Vantagens e desvantagens (x Vitrificação) Uma grande quantidade de crioprotetor em Vantagens um volume pequeno de meio e uma Meio melhor velocidade de resfriamento muito rápida -> Não tem choque osmótico por lei da física, faz com que embrião vá Menos danos químicos para a temperatura de nitrogênio líquido e Desvantagens fique em uma solução que equivale ao Mais de 3 h estado de "humor vítreo", uma espécie de Maior custo geléia viscosa embrião não congela Volume da amostra é maior (não tem formação de cristais de gelo) Formação de cristais de gelo Normalmente, após aquecer a palheta, (mais danos mecânicos na depois não monta aplicador e transfere célula) direto, pois está cheio de crioprotetor; logo, Somente sistema fechado vai retirando um pouco de crioprotetor Etapasantes e só depois montar a palheta e Volume da amostra é pequeno transferir. Menores danos mecânicos na célula Vai da fase líquida citoplasma para a fase Sistema aberto ou fechado sólida amorfa (estado vítreo) Crioprotetores com alto grau de Fatores que influenciam as taxas de viscosidade (6-7,5M) sobrevivência de embriões Crioprotetores: etilenoglicol e Qualidade do embrião DMSO Estádio de desenvolvimento embrionário Alta velocidade (imersão direta no N2) resiste melhor do que Por OPS a mórula por apresentar mais Palhetas de 0,25 mL esticada aberto células (os blastomas dos (diâmetro interno pequeno) blastocistos são menores) e a Crioprotetores quantidade de água é maior. A Meios cinética do desenvolvimento Solução (VS1) endometrial é importante. TCM Hepes + SFB (20%) Espécie e raça Bos taurus X Bos indicus Etilenoglicol (7,5%) e Espécies zebuínas embora tenham DMSO (7,5%) menor teor de lipídeos, tem menor Solução II (VS2) taxa de sobrevivência TCM Hepes + SFB (20%) Origem do embrião Etilenoglicol (16,5%) e Gado de leite -> maior sobrevivência DMSO (16,5%) + Presença da zona que é uma sacarose (0,5 M) barreira contra a entrada de crioprotetores SM (sacarose 0,5 M): PBS + 5% Momento da clivagem pós-inseminação SFB Poço 1: 800 ul HM, 400 SM Lembrando: Poço 2: 800 HM, 400 1. Não pode congelar eclodido SM - 5 min 2. Não pode comercializar O blastocisto eclodido, pois a ZP é uma barreira contra Poço 3: 800 HM, 200 a entrada de microrganismos e ela deve SM 5 min estar íntegra Poço 4: 800 HM 3. O eclodido pode ser utilizado dentro da própria propriedade Vitrificação X congelamento lento Inconvenientes Estresse osmótico (utiliza muito Criopreservação de oócitos crioprotetor) Mais desafiador: os oócitos apresentam Toxicidade química de crioprotetor número reduzido de células do cumulus, Danos químicos devido aos rompimento da ZP, sinais de degeneração crioprotetores As células do cumulus são células de Vantagens suporte do gameta e mas elas Não de um congelador atrapalham a desidratação programável Método de eleição (para todas as espécies): Técnica muito rápida, simples, menos vitrificação de 10 min De forma geral, quando se vitrifica um Inibe formação de cristais de gelo oócito maturado, os resultados são melhores Menor custo (poucos equipamentos utilizados)