PCR

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PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
 1. Introdução 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) nada mais é do que a replicação in 
vitro do DNA. Foi desenvolvida na década de 1980 por Karry Mullis, que conseguiu 
pela primeira vez amplificar pequenos fragmentos de DNA. Em 1988, foi 
descoberta uma enzima DNA polimerase termoestável, isolada de Thermus 
aquaticus, permitindo que esse processo ganhasse automação (Saiki et al., 1988). 
O impacto desse método foi enorme, pois possibilitou facilidade, rapidez, 
versatilidade na manipulação de ácidos nucléicos, o que tornou a técnica 
poderosa e imprescindível em grande parte dos procedimentos realizados 
atualmente. É utilizada, por exemplo, na realização de sequenciamento, como 
diagnóstico de doenças, detecção de mutações pontuais, entre outros.
A PCR permite a amplificação de sequências genômicas em amostras 
complexas e molecularmente heterogêneas, oferecendo alta sensibilidade e 
especificidade (TYRELL, 1997). Quando combinada com métodos auxiliares, como 
a extração e purificação de ácidos nucleicos, além da separação dos fragmentos 
genômicos de acordo com o peso molecular, é possível elaborar protocolos 
altamente eficientes e de alto desempenho, atendendo aos objetivos 
estabelecidos.
 2.1. Princípios 
Conforme mencionado, a PCR envolve a amplificação in vitro de uma região 
específica do genoma de qualquer organismo, resultando na produção de milhões 
Técnicas de Biologia
Molecular
Introdução a técnica de PCR- Reação em Cadeia da Polimerase 
e PCR em Tempo Real 
de cópias (TYRRELL, 1997).
Para tanto, a técnica se fundamenta no processo de replicação do genoma que 
ocorre in vivo, utilizando os mesmos elementos essenciais que a célula emprega 
para replicar a molécula de ácido nucleico. Portanto, os componentes básicos para 
a reação em cadeia da polimerase são:
a) A amostra de DNA extraído e purificado, que contenha o segmento a ser 
amplificado.
b) dNTPs: mistura de nucleotídeos (adenina, timina, guanina e citosina) em 
suas formas trifosfatadas livres – ou dNTPs (dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 
respectivamente) - em concentrações iguais, que serão inseridos nas novas 
cópias de DNA replicadas.
c) Cloreto de magnésio, que serve como cofator para a enzima.
d) Solução tampão, que mantém o pH ótimo para a atividade enzimática e 
favorece a hibridização do primer.
e) Par de primers ou iniciadores, que são fragmentos de DNA sintetizados em 
laboratório, contendo sequências conhecidas que flanqueiem a região 
desejada, em ambos os sentidos da fita-alvo e, assim, delimitem a região de 
replicação. O tamanho ideal de um primer é de 18 a 30 bases, não devendo ser 
menor que 15, pelo risco de comprometer a especificidade do anelamento.
f) Enzima Taq polimerase, enzima termoestável responsável pela síntese das 
novas fitas.
Após os protocolos de extração, purificação e quantificação do DNA da 
amostra, prepara-se a mistura de reação (mix da PCR) com os elementos acima 
descritos. A preparação segue um protocolo estabelecido, com cálculos de 
quantidades e concentrações dos reagentes feitos previamente. Após a 
preparação e aliquotagem do mix nos microtubos de 0,5 µL ou de 0,2 µL ou em 
placas é feita a adição da amostra de DNA a ser analisada. 
A reação em cadeia da polimerase se dá em um aparelho chamado 
termociclador. Este consiste em um bloco no qual são posicionados os microtubos 
ou a placa, que é capaz de aquecer ou resfriar de acordo com o sentido da 
corrente elétrica aplicada. Assim, a reação é controlada e orientada pela variação 
da temperatura em dados períodos de tempo. As fases da PCR podem ser 
divididas nas seguintes etapas fundamentais: desnaturação do DNA, 
anelamento de primers à seqüência alvo em fita simples e uma etapa de 
extensão do primers anelados por uma DNA polimerase termoestável (72 a 78°C).
Desnaturação - Consiste no aumento da temperatura, a fim de romper as 
pontes de hidrogênio que unem as fitas de DNA contidas na solução, separando a 
dupla-fita em fitas únicas, conforme ilustrado na Figura 1.
Figura 1. Etapa de desnaturação da PCR. Processo em que ocorre a separação das 
fitas de DNA por aquecimento da temperatura.
Autora: Joane Maíra Cavalcante
A desnaturação se dá entre 91 e 95ºC, dependendo do protocolo utilizado e 
dura geralmente, cerca de dois minutos. Nessa etapa, tanto as moléculas de DNA 
da amostra analisada quanto dos primers, são separadas e têm seus sítios de 
ligação expostos. Após um período de tempo em que uma quantidade ótima de 
moléculas foi separada, o termociclador reduz a temperatura, para iniciar a etapa 
de anelamento. 
Anelamento – Nessa etapa, a temperatura é reduzida para a temperatura ótima 
de religação das pontes de hidrogênio. Assim, os primers podem se ligar às 
sequências-alvo na fita de DNA original, que servirá como molde para a nova fita, 
representado na Figura 2.
Figura 2. Etapa de anelamento da PCR. Fase em que ocorre a redução da 
temperatura para que ocorra o anelamento dos primers e/ou iniciadores.
Autora: Joane Maíra Cavalcante
A temperatura ótima de anelamento varia de acordo com o primer utilizado 
(geralmente entre 40 e 65ºC, por cerca de um minuto e meio), e é informada pelo 
fabricante, bem como o tempo ideal para a duração dessa etapa. Nela, a 
temperatura favorece a religação das pontes de hidrogênio entre as moléculas. 
Um componente do par de primers tem como alvo uma região específica, que 
antecede imediatamente a sequência-alvo na fita de DNA no sentido 5’- 3’ (primer 
forward), enquanto que o outro componente do par tem como alvo a região que 
antecede a mesma sequência, mas na fita complementar, ou seja, no sentido 3’-5’ 
(primer reverse). 
Extensão – Temperatura ótima de atividade da enzima Taq polimerase, 
promovendo, assim, a extensão do fragmento a partir do ponto em que o primer 
anelou na etapa anterior, conforme ilustrado na Figura 3.
Figura 3. Etapa de extensão da PCR. Nessa etapa ocorre a síntese do DNA pela 
atuação da Taq DNA Polimerase através da adição dos oligonucleotídeos.
Autora: Joane Maíra Cavalcante
Em seguida, a temperatura é novamente elevada para, geralmente, 72ºC, que é a 
temperatura ótima para acoplamento e ação da enzima Taq polimerase, que 
caracteriza a fase de extensão das fitas. Essa extensão se dá pela adição das 
moléculas de dNTP disponíveis no meio, de acordo com a base nitrogenada da fita 
molde. A extensão ocorre tanto nas fitas de sentido 5’-3’, quanto nas de sentido 
3’-5’, criando novas fitas na conformação de dupla-hélice, correspondente à 
região-alvo delimitada pelos primers. Os íons de magnésio fornecidos pelo cloreto 
de magnésio adicionado à mistura são utilizados pela enzima como cofator para a 
sua atividade de síntese da nova fita. 
Ao término de um “ciclo” (desnaturação, anelamento e extensão), este é 
repetido várias vezes (de 35 a 40, de acordo com o protocolo), de modo que haja 
um aumento exponencial de moléculas, já que a cada ciclo o número de cópias da 
sequência-alvo é duplicado. Assim, ao final do processo, cada tubo conterá uma 
grande quantidade de DNA dupla-fita correspondente à região-alvo. O produto de 
uma reação de PCR é geralmente chamado de amplicon.
 2.2. Variações da PCR
 2.2.1. PCR em Tempo Real 
A PCR em tempo real (ou qPCR) permite que a reação seja monitorada em 
tempo real (sem necessidade da eletroforese), bem como que a quantidade de 
ácido nucleico produzida seja quantificada, por meio da emissão e da captação de 
radiação fluorescente durante o processo. Para tanto, a qPCR utiliza um 
termociclador com um sistema óptico de captação da emissão de luz fluorescente, 
associado a um computador com um software que analisa e processa os dados 
durante e ao final da reação. Além disso, a qPCR utiliza um sistema de sondas de 
fluorescência, de modo que a quantidade de material gerado é diretamente 
proporcional à emissão de fluorescência, que pode ser quantificada com notável 
precisão. 
Dois sistemas de fluorescência são majoritariamenteutilizados: SYBR Green e 
TaqMan. O corante SYBR Green intercala em qualquer fragmento de DNA dupla-
fita emitindo fluorescência a partir daí, conforme apresentado na Figura 4. A 
discriminação entre os sinais é feita por meio da análise da curva de dissociação 
(calculada a partir do ponto de melting da sonda). 
Figura 4. Etapas da PCR em Tempo Real utilizando o corante de fluorescência 
SYBR Green (agente intercalante de DNA de fita dupla) que se liga ao DNA durante 
a síntese da nova fita.
Autora: Joane Maíra Cavalcante
Já o sistema TaqMan, utiliza sondas que se anelam logo após o local de 
anelamento do primer na sequência alvo, Figura 5. As sondas são pequenas 
sequências de oligonucleotídeos sintética, contendo um corante apresentador 
(reporter), emissor de fluorescência, na extremidade 5’, e um corante silenciador 
(quencher), que inibe a emissão de fluorescência por proximidade, na 
extremidade 3’. Enquanto a sonda está intacta, a proximidade do quencher inibe a 
emissão de fluorescência do reporter. Quando a Taq polimerase se anela ao 
primer e cliva a sonda pela sua atividade endonucleásica, o reporter é separado 
do quencher e liberado no meio, emitindo, assim, sua fluorescência, que é captada 
e analisada pelo sistema óptico. Outros sistemas de detecção têm sido 
desenvolvidos e testados, a fim de obter um equilíbrio entre custo, praticidade e 
eficiência para otimizar a qPCR. Exemplos de uso: Detecção/quantificação de 
patógenos, detecção de mutações, expressão gênica (com RNA/cDNA).
Figura 5. Representação das etapas da PCR em Tempo Real utilizando o sistema 
de sondas de hidrólise (TaqMan). Durante a fase de extensão, a medida que 
ocorre a síntese da fita do DNA a sonda é clivada e então é emitido o sinal de 
fluorescência.
Autora: Joane Maíra Cavalcante
 2.2.2. PCR de transcriptase reversa (Reverse Transcription) – RT-
PCR
A PCR de transcriptase reversa (Reverse Transcription PCR), tal como a técnica 
convencional, tem como objetivo reproduzir in vivo a replicação do genoma 
original que, nesse caso, é RNA. A técnica utiliza a enzima transcriptase reversa 
para converter o RNA em cDNA, conforme representado na Figura 6. O cDNA é 
então usado como modelo para a reação qPCR. RT- qPCR é usado em uma 
variedade de aplicações, incluindo análise de diversos vírus de RNA, análises de 
expressão gênica (RNA mensageiro), validação de RNAi, validação de 
microarranjos, detecção de patógenos, testes genéticos e pesquisa de doenças.
São utilizados primers que se anelarão à fita de RNA, permitindo o 
acoplamento da transcriptase reversa. Após a síntese de cópias de cDNA a partir 
dos moldes de RNA, geralmente se utilizam enzimas que degradem seletivamente 
moléculas de RNA (geralmente RNAse H) e, em seguida, se submete o produto à 
PCR convencional. O bom desempenho de um protocolo de RT-PCR está em 
função da seleção adequada dos diferentes tipos de primers disponíveis e da boa 
conservação da amostra (dado que o RNA é mais instável que o DNA e facilmente 
degradável), e geralmente é associado à técnica de qPCR. 
Figura 6. Representação esquemática da ação da enzima transcriptase reversa 
durante a RT-PCR, e subsequente submissão à PCR convencional 
Autora: Joane Maíra Cavalcante
Questões sobre a aula prática
1) Cite pelo menos 2 aplicações da técnica de PCR e da RT-qPCR.
2) O que é um primer? Ele será o mesmo quando se estuda diferentes regiões 
genômicas? Por que?
3) Qual a função do MgCl2?
4) Por que o DNA deve ser submetido a temperatura de 95º.C durante os ciclos de 
PCR? 
5) Por que a reação tem que ser submetida a 72º.C durante os ciclos de PCR?
6) O que é cDNA?
7) Qual enzima é usada para transforma RNA em DNA?
8) Qual a diferença da PCR, qPCR e RT-PCR?