Cromatografia EAD

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Introdução a Cromatografia 
Professora: Ligiane R. Gouvea 
Instituto Federal de Minas Gerais (IFMG) 
Campus Betim 
Classificação dos métodos analíticos 
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS 
Baseados em propriedades físicas 
(químicas em alguns casos ) 
Chamados de métodos de 
via úmida 
Gravimetria Volumetria Eletroanalítico 
Propriedades 
elétricas 
Espectrométrico 
Propriedades 
ópticas 
Cromatográfico 
Propriedades 
mistas* 
*Separação: interações físico-químicas. 
 Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas. 
CROMATOGRAFIA 
• Cromatografia é um processo pelo qual duas 
ou mais substâncias presentes em uma mistura 
podem ser separadas, identificadas e 
quantificadas. 
• Fase estacionária: fase imobilizada em uma 
coluna ou suporte. 
• Fase móvel: fase que é forçada a passar pela 
fase estacionária. 
• Princípio fundamental: A diferença de 
interação dos componentes da mistura com 
cada uma das fases faz com que elas se 
movimentem com velocidades diferentes e se 
separem. 
CROMATOGRAFIA 
• A separação depende da interação dos 
componentes da mistura com a fase móvel e com a 
fase estacionária. 
• A interação dos componentes da mistura com 
estas duas fases é influenciada por diferentes 
forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, 
apolar, e específicos efeitos de afinidade e 
solubilidade. 
• A identificação se dá mediante a comparação da 
interação de padrões com as fases estacionárias. 
• A quantificação é feita também pela comparação 
com padrões de concentrações conhecidas, através 
de curvas analíticas. 
CROMATOGRAFIA 
Princípio Básico 
Separação de misturas por interação diferencial dos seus 
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou 
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). 
Histórico 
• Schönbein (1850): observou que nem todas as 
substâncias atingem a mesma altura quando 
sobem em um papel. 
• Goppelsröder (1861): fez relações entre as 
características químicas de uma substância e a 
altura que elas subiam em um papel. Previu que 
a técnica poderia ser importante no estudo de 
corantes. 
•Michael S. Tswett (1903): a ele é atribuído o 
mérito da proposição da cromatografia 
moderna. Utilizou a técnica no estudo da 
bioquímica de plantas. 
Histórico 
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação 
de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e 
solventes variados. 
éter de 
petróleo 
CaCO3 
mistura de 
pigmentos 
pigmentos 
separados 
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego) 
Classificação das técnicas 
cromatográficas 
 
• De acordo com o sistema cromatográfico 
 
• Em Coluna 
• Cromatografia Líquida 
• Cromatografia Gasosa 
• Cromatografia Supercrítica 
 
• Planar 
• Centrífuga (Chromatotron®) 
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
• Cromatografia em Papel (CP) 
Classificação das técnicas 
cromatográficas 
 
• De acordo com a fase móvel 
 
• Utilização de Gás 
• Cromatografia Gasosa (CG) 
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) 
 
• Utilização de Líquido 
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC) 
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) 
 
• Utilização de Gás Pressurizado 
• Cromatografia Supercrítica (CSC) 
Classificação das técnicas 
cromatográficas 
 
• De acordo com a Fase Estacionária 
 
• Líquida 
• Sólida 
• Quimicamente Ligadas 
 
• De acordo com o modo de separação 
 
• Por Adsorção 
• Por Partição 
• Por Troca Iônica 
• Por Afinidade 
• Exclusão 
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas 
sobrevoando uma certa região. 
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas. 
Fase estacionária Analitos 
Mecanismo de Separação - Analogia 
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente 
para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura. 
Fase estacionária Analitos 
Mecanismo de Separação - Analogia 
Cromatografia de Papel 
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! 
Fase estacionária líquida suportada na celulose. 
Fase móvel 
Separação 
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-
líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a 
separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a 
cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela. 
Cromatografia de Papel 
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! 
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem 
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na 
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis. 
Cromatografia em Camada Delgada 
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser 
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está 
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases 
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. 
Cromatografia em Camada Delgada 
FASES ESTACIONÁRIAS 
Sílica (SiO2) 
Alumina (Al2O3) 
Celulose 
Poliamida 
Ativação de 30 a 60 min 
de 105 a 110 oC 
Ativação de 10 min 
a 105 oC 
Fases Estacionárias 
Fases Estacionárias 
Fases Móveis 
Fator de Retenção (Rf) 
Fator de Retenção (Rf) 
solvente
mancha
f ΔS
ΔS
R 
s
a
R
af

s
b
R
bf

s
c
R
cf

c 
b 
a 
s 
Cromatografia em Camada Delgada 
ANÁLISE QUALITATIVA 
- Comparação com valores de Rf tabelados 
 
- Comparação com padrão eluído em conjunto 
 
- Extração e aplicação de métodos instrumentais 
Cromatografia em Camada Delgada 
A B Após 
 Eluição 
Amostra não contém a espécie B 
Amostra pode conter a espécie A 
Para se certificar da presença, 
eluir em outros solventes 
Conclusões: 
Amostra 
Cromatografia de Placa 
CCD: Cromatografia de camada delgada. 
TLC: Thin layer cromatography. 
É muito usada 
para a escolha da 
fase móvel 
correta no 
processo de 
separação por 
cromatografia 
em coluna. 
Cromatografia de Placa 
Métodos de Revelação 
Quando as amostras não são coloridas é preciso 
utilizar métodos físico-químicos para se 
visualizar a distância percorrida pela amostra. 
Luz ultra-violeta: é absorvida por compostos 
orgânicas que possuem ligações pi, causando 
manchas na placa cromatográfica. 
Vapor de iodo: após a eluição a placa é deixada 
em um recipiente com alguns cristais de iodo, 
como algumas substâncias orgânicas interagem 
com o iodo por interações dipolo instantâneo-
dipolo induzido há a formação de manchas no 
local onde está a substância. 
Cromatografia de Placa 
Cromatografia Planar 
Chromatotron é uma 
cromatografia de camada 
fina preparativa acelerada 
centrifugamente. Pode 
substituir pequenas colunas e 
HPLC. 
Cromatografia de Coluna 
“Assim como raias de luz em 
um espectro, os diferentes 
componentes de uma mistura 
de pigmentos, obedecendo a 
uma lei, são separados por uma 
coluna de carbonato de cálcio 
(CaCO3) e então podem ser 
determinados qualitativa e 
quantitativamente. 
Eu denomino esse padrão de 
cores como sendo um 
cromatograma e a técnica 
correspondente como sendo 
método cromatográfico (Tsweet 
– 1906).” 
Cromatografia de Coluna 
Cromatografia de Coluna 
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO 
Exclusão 
 
 
 
Adsorção 
 
 
Partição 
 
 
 
Troca Iônica 
 
Afinidade 
Absorção X Adsorção 
Absorção X Adsorção 
ADSORÇÃO: o soluto é retido pela superfície da fase 
estacionária através de interações químicas ou físicas. 
 
ADSORÇÃO ≠ ABSORÇÃO 
 Absorção é um fenômeno em que uma substância 
permeia o volume de outra; 
 Adsorção é um fenômeno de superfície. 
Cromatografia de Coluna 
ADSORÇÃO 
- Fase Móvel: Líquida ou Gás 
- Fase Estacionária: Sólida 
Processos de 
Adsorção/Dessorção 
Ligações de hidrogênio; 
Forças de Van der WaalsFases Móveis 
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: 
 
a) Função solvente 
• Solubilizar os componentes 
• Ter baixo ponto de ebulição 
 
b) Função eluente 
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna 
•Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) 
Cromatografia de Coluna 
PARTIÇÃO 
- Fase Móvel: Gasosa 
- Fase Estacionária: Líquida 
Processos de Solubilidade 
No processo de partição, a volta de 
cada componente para a fase móvel 
depende da sua volatilidade. 
Cromatografia de Coluna 
PARTIÇÃO 
- Fase Móvel: Líquida 
- Fase Estacionária: Líquida 
Processos de Solubilidade 
No processo de partição, a volta de 
cada componente para a fase móvel 
depende da sua solubilidade. 
Cromatografia de Coluna 
TROCA IÔNICA 
- Fase Móvel: Líquida 
- Fase Estacionária: Sólida 
Processos de Troca Iônica 
Adsorção reversível e diferencial dos 
íons da fase móvel pelo grupo trocador 
da matriz. 
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica 
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de 
extraordinário valor em processos analíticos. 
Maior Interação 
• Íons de alta carga 
• Íons de menor tamanho 
TROCA IÔNICA 
Resinas Catiônicas 
e Aniônicas 
Fase sólida altamente carregada 
F
lu
x
o 
d
a 
F
M
 
A diferença de afinidade entre os íons da FM 
pode ser controlada por pH e força iônica 
Cromatografia de Coluna 
EXCLUSÃO 
- Fase Móvel: Líquida 
- Fase Estacionária em Gel 
Enquanto as partículas menores penetram nas 
cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as 
estruturas moleculares da fase sólida. 
Cromatografia de Coluna 
EXCLUSÃO 
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por 
volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (fase 
sólida) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm 
ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são 
insolúveis. 
- Separação de tamanhos específicos 
- Separação de polímeros e proteínas 
- Determinação de Massa Molar 
Cromatografia de Coluna 
EXCLUSÃO 
Características 
desejáveis para os Géis 
-Inércia Química: 
Não pode haver uma interação 
química entre a matriz e o soluto. 
-Estabilidade: 
O gel deve suportar uso contínuo 
quanto mantido em condições 
brandas de temperatura e pH. 
-Baixo teor de íons: 
Grupos carregados interferem no 
processo de separação. 
Cromatografia de Coluna 
EXCLUSÃO 
Tipos de Géis 
Dextrano (Sephadex) 
Poliacrilamida 
Ágar e Agarose 
F
lu
x
o 
d
a 
F
M
 
Cromatografia de Coluna 
- Fase Móvel: Líquida 
- Fase Estacionária: Sólida 
Propriedades Biológicas e 
Funcionais 
AFINIDADE 
Cromatografia de Coluna 
Mecanismo de Separação 
Se uma mistura das substâncias 
A e B fosse colada em uma 
coluna cromatográfica preparada 
utilizando sílica gel como fase 
estacionária e hexano como fase 
móvel, qual das duas substâncias 
você acha que deve se eluir mais 
rapidamente? Justifique sua 
resposta. 
Mecanismo de Separação 
Como a substância B é 
mais polar que a 
substância A, ela vai 
interagir mais 
intensamente com a fase 
estacionária que também 
é polar e vai demorar 
mais para eluir pela fase 
estacionária. 
Cromatografia 
Cromatografia 
Cromatografia 
Cromatografia 
Atividade 3 
Atividade 4 
Dica: De acordo com a série eluotrópica, o acetato de etila (CH3COOCH2CH3) é 
mais polar que o diclorometano (CH2Cl2). 
Atividade 5 
O esquema a seguir representa o cromatograma 
em papel de dois materiais, A e B, com 
componentes corados. 
a) Qual é a função do 
eluente em uma 
cromatografia? 
 
b) Calcule o fator de 
retenção (Rf) dos 
diversos materiais 
identificados. 
 
c) Os materiais A e B têm 
componentes em comum? 
Justifique sua resposta. 
Atividade 6 
A equação abaixo representa um processo de 
obtenção do álcool benzílico que gera como 
subproduto ácido benzóico. 
A cromatografia em camada fina de sílica gel do 
álcool benzílico impuro apresenta duas manchas 
quando o eluente é tetracloreto de carbono. Qual 
substância deve ter o maior Rf (álcool benzílico 
ou ácido benzóico)? Justifique sua resposta.