AULA 3 - ATIVIDADE ELETROFORESE

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<p>DISCIPLINA DE BIOLOGIA MOLECULAR</p><p>ATIVIDADE COMPLEMENTAR – ELETROFORESE</p><p>a) Este material será utilizado como nota complementar a média de AV1 e só será contemplado com a nota de 0 –</p><p>1,0 o aluno que enviar o material que estiver de acordo com as orientações passadas.</p><p>b) Coloque seu nome e matricula na folha em que a atividade será feita e enviada para a docente.</p><p>c) Enviar via “Tarefas” uma foto ou arquivo em PDF, via Plataforma Teams que ficará disponível diretamente à</p><p>docente.</p><p>d) Este material estará disponível para envio em 05 de março das 8h25 às 21h00. Após o horário informado a</p><p>atividade será encerrada automaticamente pelo sistema e não será possível enviar posteriormente.</p><p>BOM EXERCÍCIO A TODOS!</p><p>ENZIMAS DE RESTRIÇÃO</p><p>As enzimas de restrição (ou endonucleases de restrição) são enzimas que cortam o DNA em locais</p><p>específicos. As enzimas reconhecem determinadas sequências nucleotídicas do DNA e fragmentam a</p><p>molécula sempre que identificam essa sequência, produzindo extremidades coesivas. As enzimas de restrição</p><p>foram descobertas em bactérias que resistiam à infeção dos vírus (bacteriófagos) produzindo enzimas que</p><p>seccionavam o DNA viral, fragmentando-o em porções inofensivas. As enzimas atuam quando identificam</p><p>determinadas sequências específicas – locais de restrição. As enzimas cortam as ligações entre o grupo</p><p>hidroxilo 3’ de um nucleotídeo e o grupo fosfato 5’ do nucleotídeo adjacente. As extremidades das cadeias</p><p>seccionadas – extremidades coesivas – quando contactam com outras resultantes da ação da mesma enzima</p><p>podem emparelhar por complementaridade.</p><p>Aplicações:</p><p>• Fragmentação de DNA para posterior análise em outras técnicas</p><p>• Geração de fragmentos passíveis de serem clonados em vetores apropriados</p><p>• Produção de fragmentos de DNA para serem usados como sondas em diferentes técnicas</p><p>ELETROFORESE</p><p>O termo eletroforese é usado para descrever a migração de uma partícula carregada sob influência de</p><p>um campo elétrico, permitindo a separação dos diferentes tipos de proteínas séricas ou plasmáticas,</p><p>determinando as proporções relativas.</p><p>A eletroforese consiste em separar os componentes do sangue, urina, líquor e outras soluções. Quanto</p><p>maior a corrente, maior será a velocidade com que as moléculas de proteínas se moverão, já que os</p><p>aminoácidos que as compõem possuem em sua composição cargas elétricas positivas ou negativas. Sob</p><p>condições de corrente elétrica constante, a força de deslocamento de uma partícula é resultado da carga</p><p>2</p><p>efetiva, da molaridade do tampão e da resistência do meio usado como suporte (ágar, acetato, gel capilar).</p><p>Dessa maneira, as moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo), as moléculas com</p><p>carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo) e as que apresentam cargas elétricas equilibradas</p><p>permanecerão estáticas.</p><p>As frações separadas são observadas a partir de um corante sensível a proteínas e quantificadas por</p><p>densitometria ou eluição. A taxa de migração das proteínas pode ser afetada pelo pH, força iônica e</p><p>composição do sistema tampão usado.</p><p>CASO CLÍNICO</p><p>Caio é um menino de 5 anos. Sua mãe faleceu e três homens afirmam ser seu pai. Foi realizado um</p><p>teste de paternidade para tirar a prova.</p><p>Em anexo estão os supostos fragmento de DNA dos envolvidos (Filho, mãe, suposto pai 1 (P1),</p><p>suposto pai 2 (P2) e suposto pai 3 (P3).</p><p>1. Completar as fitas de DNA com as respectivas bases complementares dos fragmentos dos DNA dos</p><p>envolvidos (FOLHA 2)</p><p>Os passos da simulação consistem em:</p><p>a. Quebrar o DNA em fragmentos pela enzima de restrição.</p><p>b. Considere agora que a enzima de restrição utilizada reconhece a sequência de bases GG e que “corta” o</p><p>DNA entre o primeiro e o segundo G.</p><p>c. Quando a sequência GG for encontrada, faça um traço vertical separando G de G, como no exemplo da</p><p>figura 1.</p><p>Corte, com uma tesoura (representa a enzima de restrição), a fita de DNA onde foram feitos os traços</p><p>verticais, obtendo, assim, fragmentos de DNA (Figura 2);</p><p>Conte o número de pares de bases nitrogenadas de cada fragmento e marque no verso da fita.</p><p>2. Faça a simulação do gel de eletroforese</p><p>Após cortados os fragmentos, pintar os quadrados (representação das bandas) de acordo com os</p><p>fragmentos originados, na coluna representativa do material de coleta recebido (Tabela 1).</p><p>O DNA possui uma carga negativa, logo, os pares de base se deslocarão no sentido de aproximação do</p><p>cátodo e afastamento do ânodo. Como os fragmentos possuem a mesma carga, eles serão separados por</p><p>tamanho no gel. Quanto menor o fragmento, mais fácil passará nos espaços do gel e migrará mais</p><p>rapidamente.</p><p>4</p>