UA8- TÉCNICAS DE COLORAÇÃO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA

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<p>Técnicas de coloração em</p><p>bacteriologia clínica</p><p>Apresentação</p><p>A análise de bactérias em microscópio óptico de campo claro é uma etapa fundamental na rotina de</p><p>bacteriologia clínica, para se identificar e diferenciar espécies. Entretanto, normalmente as bactérias</p><p>aparecem incolores quando observadas no microscópio óptico, o que dificulta a observação. Por</p><p>conta disso, diferentes protocolos de coloração foram desenvolvidos para corar as bactérias e</p><p>possibilitar que sua visualização em microscópio tenha mais contraste. A técnica mais utilizada é a</p><p>coloração de Gram, baseada nas diferenças de paredes celulares de dois grupos de bactérias: Gram-</p><p>positivas e Gram-negativas. Outra técnica muito utilizada é a coloração de Ziehl-Neelsen, ideal para</p><p>identificar bactérias álcool-acidorresistentes, as quais não se coram pela coloração de Gram. Ainda,</p><p>existem outras técnicas de coloração para identificação de estruturas celulares como cápsula,</p><p>flagelo e endósporo.</p><p>Nesta Unidade de Aprendizagem, você vai conhecer as características das bactérias Gram-positivas</p><p>e Gram-negativas e como elas são coradas pela coloração de Gram, as propriedades das bactérias</p><p>álcool-acidorresistentes e as técnicas de coloração utilizadas para corar essas bactérias, além de</p><p>outros métodos de colorações de uso na bacteriologia clínica.</p><p>Bons estudos.</p><p>Ao final desta Unidade de Aprendizagem, você deve apresentar os seguintes aprendizados:</p><p>Caracterizar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.•</p><p>Diferenciar propriedades celulares das bactérias álcool-acidorresistentes.•</p><p>Listar as diferentes colorações de uso na bacteriologia clínica.•</p><p>Desafio</p><p>No exame direto em microscópio de campo claro, é difícil visualizar as bactérias, pois elas aparecem</p><p>incolores. Assim, é recomendada uma etapa prévia de coloração das bactérias, para aumentar o</p><p>contraste e facilitar a visualização. A coloração de Gram é a mais utilizada na bacteriologia clínica,</p><p>porque, além de permitir visualizar a morfologia e o arranjo bacterianos, é usada para classificar as</p><p>bactérias como Gram-positivas ou Gram-negativas. Nessa técnica, são utilizados os seguintes</p><p>reagentes: corantes cristal de violeta e safranina (ou fucsina), iodo (um mordente) e solução álcool-</p><p>acetona.</p><p>Veja a seguinte situação:</p><p>Sabendo que o exame do paciente é urgente, responda às seguintes perguntas:</p><p>a) Com os reagentes que você tem no laboratório, como procederia com a coloração da lâmina?</p><p>b) O que seria possível observar no microscópio após a coloração que você realizou?</p><p>c) Seria possível classificar a bactéria como Gram-positiva ou Gram-negativa? Justifique.</p><p>Infográfico</p><p>A coloração de Gram é a técnica mais utilizada em bacteriologia clínica para se corar as bactérias.</p><p>Ela é uma técnica diferencial, já que distingue dois grandes grupos de bactérias: Gram-positivas e</p><p>Gram-negativas. O princípio da técnica está relacionado com as diferenças estruturais observadas</p><p>nas paredes celulares desses dois grupos e ao modo como eles reagem com os diferentes reagentes</p><p>utilizados na coloração.</p><p>No Infográfico a seguir, você verá o passo a passo da coloração de Gram, a explicação do princípio</p><p>da técnica e as cores que as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas adquirem após essa</p><p>coloração.</p><p>Aponte a câmera para o</p><p>código e acesse o link do</p><p>conteúdo ou clique no</p><p>código para acessar.</p><p>https://statics-marketplace.plataforma.grupoa.education/sagah/0bdf6393-5345-4f87-b8a8-5371fe7223fe/afa641f7-58f0-48d1-ad58-bd364822cf9c.png</p><p>Conteúdo do livro</p><p>Existem inúmeras espécies bacterianas, cada uma com características próprias que as diferenciam</p><p>das demais. A maioria das espécies pode ser classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas.</p><p>É importante que o microbiologista conheça as propriedades de cada uma e saiba aplicar a técnica</p><p>de coloração utilizada para se distinguir esses dois grupos, chamada de coloração de Gram. No</p><p>entanto, existem bactérias que não podem ser classificadas como Gram-positivas nem como Gram-</p><p>negativas, devido a particularidades em sua parede celular; nesse caso, é necessário aplicar uma</p><p>coloração adequada. A coloração de Gram também não é capaz de corar algumas estruturas</p><p>bacterianas, o que torna necessário que o microbiologista aplique um protocolo de coloração</p><p>diferente, apropriado a tal situação.</p><p>Na obra Bacteriologia clínica, base teórica desta Unidade de Aprendizagem, leia o capítulo Técnicas</p><p>de coloração em bacteriologia clínica e conheça um pouco mais sobre como caracterizar e</p><p>diferenciar as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e distinguir as propriedades das bactérias</p><p>álcool-acidorresistentes. Neste capítulo, você vai conhecer, ainda, diferentes métodos de</p><p>colorações de uso na bacteriologia clínica.</p><p>Boa leitura.</p><p>BACTERIOLOGIA</p><p>CLÍNICA</p><p>Margarida Neves Souza</p><p>Técnicas de coloração em</p><p>Bacteriologia Clínica</p><p>Objetivos de aprendizagem</p><p>Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:</p><p>� Caracterizar bactérias gram-positivas e gram-negativas.</p><p>� Diferenciar propriedades celulares das bactérias álcool-acidorresistentes.</p><p>� Listar as diferentes colorações de uso na Bacteriologia Clínica.</p><p>Introdução</p><p>A identificação de espécies bacterianas faz parte da rotina de laboratórios</p><p>de bacteriologia clínica. Dessa forma, diferentes técnicas de coloração são</p><p>utilizadas para que seja possível observar as bactérias em microscopia</p><p>de campo claro, já que os corantes aumentam o contraste e facilitam a</p><p>visualização.</p><p>Neste capítulo, você vai aprender a caracterizar e diferenciar as bac-</p><p>térias gram-positivas e gram-negativas e entender como elas são cora-</p><p>das pela técnica coloração de Gram, além de saber o que são bactérias</p><p>álcool-acidorresistentes, por que elas não são coradas pela coloração de</p><p>Gram e qual é a técnica de coloração utilizada para essas bactérias. Você</p><p>ainda vai aprender, neste capítulo, outras técnicas de coloração que são</p><p>utilizadas na bacteriologia clínica.</p><p>Bactérias gram-positivas e gram-negativas</p><p>A maioria das bactérias tem uma parede celular, composta por peptidoglicano</p><p>(também chamado de mureína ou mucopeptídeo), que circunda a membrana</p><p>plasmática. Além de conferir rigidez e a forma da célula, a parede celular</p><p>também tem como funções a proteção, o que evita que a célula se rompa (lise</p><p>celular) quando a pressão osmótica dentro da célula é maior que a do meio</p><p>externo, e a ancoragem para os flagelos (LEVINSON, 2016).</p><p>As bactérias podem ser classificadas como gram-positivas ou gram-</p><p>-negativas. Essa classificação é feita de acordo com a resposta à coloração de</p><p>Gram em diferenças estruturais nas paredes celulares (TORTORA; FUNKE;</p><p>CASE, 2017). É muito importante que você saiba as diferenças estruturais entre</p><p>as bactérias gram-negativas e gram-positivas, as quais estão representadas na</p><p>Figura 1 e serão explicadas ao longo do capítulo.</p><p>Figura 1. Diferenças estruturais entre bactérias gram-negativas e gram-positivas. Uma das</p><p>diferenças mais marcantes é a quantidade de camadas de peptidoglicano (uma ou poucas</p><p>nas bactérias gram-negativas e várias nas gram-positivas). Outra diferença importante é que</p><p>somente as bactérias gram-negativas têm uma membrana externa, a qual é constituída</p><p>de lipopolissacarídeos (LPSs).</p><p>Fonte: Adaptada de Designua/Shutterstock.com.</p><p>GRAM-NEGATIVA GRAM-POSITIVA</p><p>Membrana externa</p><p>Lipoproteínas</p><p>Peptidoglicano</p><p>Espaço</p><p>periplásmico</p><p>Membrana</p><p>citoplasmática</p><p>Lipopolissacarídeos Porina Proteína</p><p>Bactérias gram-negativas</p><p>As paredes celulares das bactérias gram-negativas têm uma ou poucas cama-</p><p>das de peptidoglicano, mas são mais complexas estrutural e quimicamente em</p><p>relação às gram-positivas. Somente as gram-negativas têm uma membrana</p><p>externa, que é constituída de LPSs, lipoproteínas e fosfolipídios. As funções</p><p>da membrana externa incluem manter a estrutura bacteriana, conferir defesa</p><p>celular e funcionar como uma barreira de permeabilidade a grandes moléculas</p><p>Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica2</p><p>(p. ex., metais pesados, enzimas digestórias,</p><p>como a lisozima, e antibióticos)</p><p>e moléculas hidrofóbicas (p. ex., detergentes). A membrana externa, porém,</p><p>permite uma permeabilidade seletiva por intermédio das proteínas da mem-</p><p>brana — chamadas de porinas —, as quais formam canais que permitem</p><p>a passagem de determinadas moléculas, como nucleotídeos, dissacarídeos,</p><p>peptídeos, aminoácidos, vitamina B12 e ferro.</p><p>O espaço periplásmico das bactérias gram-negativas compreende a área</p><p>entre a superfície externa da membrana citoplasmática e a superfície interna</p><p>da membrana externa e é constituído pelo periplasma, um fluido semelhante</p><p>a um gel que contém várias enzimas de degradação e proteínas de transporte.</p><p>Algumas espécies de bactérias gram-negativas têm enzimas β-lactamases no</p><p>espaço periplásmico, que degradam antibióticos da classe β-lactâmicos, como,</p><p>por exemplo, a penicilina, podendo ser, portanto, naturalmente resistentes</p><p>a essa classe de antibióticos. O LPS, constituinte da membrana externa, é</p><p>uma molécula grande, anfipática (extremidades hidrofóbicas e hidrofílicas) e</p><p>complexa. O LPS é uma endotoxina extremamente tóxica, sendo considerado</p><p>um potente estimulador de respostas imunológicas no hospedeiro, podendo</p><p>causar febre, choque e outros sintomas graves. O LPS é constituído por três</p><p>unidades distintas:</p><p>� lipídio A — responsável pelos efeitos tóxicos;</p><p>� cerne polissacarídeo — formado por cinco açúcares ligados ao lipídio</p><p>A, tem a função estrutural de estabilidade;</p><p>� polissacarídeo O (ou antígeno O) — composto por moléculas de</p><p>açúcar, tem a função de antígeno, sendo útil para diferenciar espécies</p><p>bacterianas gram-negativas, já que existe grande variabilidade entre</p><p>espécies e cepas bacterianas.</p><p>Algumas bactérias gram-negativas, como Neisseria meningitidis, N. go-</p><p>norrhoeae, Haemophilus influenzae e H. ducreyi, não têm LPS na membrana</p><p>externa, mas têm uma molécula semelhante, o lipo-oligossacarídeo, que é um</p><p>importante fator de virulência causador de febre e outros sintomas. Outros</p><p>exemplos de bactérias gram-negativas são Escherichia coli, Salmonella ente-</p><p>rica e Pseudomonas aeruginosa (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016;</p><p>MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>3Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica</p><p>Bactérias gram-positivas</p><p>As paredes celulares das bactérias gram-positivas são mais espessas e rígidas</p><p>em comparação às das gram-negativas, pois têm várias camadas de peptidogli-</p><p>cano. O espaço periplásmico também está presente, porém, nas bactérias gram-</p><p>-positivas, há uma camada granular composta por ácido lipoteicoico. Apenas</p><p>as bactérias gram-positivas contêm ácidos teicoicos (presente na maioria das</p><p>espécies de bactérias gram-positivas), que são polímeros hidrossolúveis de</p><p>poliol fosfatos situados na camada externa da parede celular. Quando estão</p><p>ligados à camada de peptidoglicano, são classificados como ácidos teicoicos</p><p>da parede, porém, quando atravessam a camada de peptidoglicano, ligando-</p><p>-se aos lipídios da membrana citoplasmática, são classificados como ácidos</p><p>lipoteicoicos (têm um ácido graxo).</p><p>Os ácidos teicoicos são antígenos de superfície das bactérias gram-positivas</p><p>que favorecem a ligação com outras bactérias e receptores específicos de</p><p>células de mamíferos (fenômeno patogênico chamado de aderência), podendo</p><p>ser utilizados na diferenciação de sorotipos bacterianos. Além disso, os ácidos</p><p>teicoicos são importantes fatores de virulência, pois são capazes de induzir</p><p>choque séptico no hospedeiro. Alguns exemplos de bactérias gram-positivas</p><p>são: Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Corynebacterium</p><p>diphtheriae e Bacillus anthracis (BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016;</p><p>MURRAY et al., 2004; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>Coloração de Gram</p><p>Agora que já estudou as características e as diferenças estruturais das paredes</p><p>celulares das bactérias gram-positivas e gram-negativas, você irá aprender</p><p>sobre a técnica de coloração de Gram, a qual é amplamente utilizada para</p><p>visualizar e classificar as bactérias nesses dois grupos. A coloração de Gram</p><p>leva o nome do seu descobridor: Hans Christian Gram — um médico his-</p><p>tologista dinamarquês que tentava corar bactérias em tecidos infectados.</p><p>Em 1884, ele desenvolveu a técnica ao perceber que, de acordo com o corante</p><p>utilizado, as bactérias adquiriam cores diferentes, o que permitia classificá-</p><p>-las em dois grupos diferentes: as que se coravam de azul/roxo e as que se</p><p>coravam de vermelho/rosa (gram-positivas e gram-negativas, respectivamente)</p><p>(BROOKS et al., 2014).</p><p>Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica4</p><p>Durante as primeiras etapas da coloração, o corante cristal de violeta e</p><p>o iodo são incorporados ao citoplasma das bactérias, entretanto, ao adicionar</p><p>um descorante, algumas bactérias se tornam incolores, sendo então denomi-</p><p>nadas gram-negativas, enquanto outras permanecem coradas de azul/púrpura,</p><p>sendo estas chamadas de gram-positivas. Tendo em vista que as bactérias</p><p>gram-negativas se tornam incolores depois da descoloração, é necessário que</p><p>elas sejam, então, coradas para que possam ser visualizadas no microscópio de</p><p>campo claro, para isto, utilizam-se os corantes vermelho safranina ou fucsina</p><p>(TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>Para corar as bactérias pelo método de Gram, inicialmente se confecciona um esfregaço</p><p>em lâmina do material clínico, que deve ser fixado pelo calor ou pela utilização de</p><p>metanol ou de etanol, após, realiza-se a técnica de coloração de Gram, que consiste</p><p>nas seguintes etapas:</p><p>1. Adição do corante básico cristal de violeta, que cora as células de azul/púrpura.</p><p>2. Lavagem da lâmina com água de torneira ou solução de iodo.</p><p>3. Adição de solução de iodo (mordente), que forma um complexo cristal violeta-</p><p>-iodo, mantendo as células coradas de azul.</p><p>4. Descoloração da lâmina com um solvente orgânico (álcool ou solução álcool-</p><p>-acetona), que remove a coloração azul das bactérias gram-negativas (as quais</p><p>ficam incolores), mas mantém a coloração azul nas bactérias gram-positivas.</p><p>5. Lavagem da lâmina com água de torneira.</p><p>6. Adição do corante básico vermelho safranina ou fucsina, que cora as bactérias</p><p>gram-negativas de rosa/vermelho.</p><p>7. Lavagem com água de torneira e secagem da lâmina.</p><p>Fonte: Brasil (2013) e Levinson (2016).</p><p>A retenção, ou não, do corante cristal de violeta é explicada devido a algu-</p><p>mas diferenças estruturais das paredes celulares das bactérias gram-positivas</p><p>e gram-negativas. As bactérias gram-positivas têm uma parede celular mais</p><p>espessa em relação às gram-negativas, a qual é composta por várias camadas</p><p>de peptidoglicano, enquanto somente as bactérias gram-negativas têm LPSs</p><p>na parede celular. O cristal de violeta e o iodo penetram facilmente nas cé-</p><p>lulas das bactérias, formando um complexo insolúvel de cristal violeta-iodo,</p><p>que é maior do que a molécula de cristal que entrou na célula (TORTORA;</p><p>5Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica</p><p>FUNKE; CASE, 2017). Quando as células são lavadas com álcool ou solução</p><p>álcool-acetona, podem ocorrer duas situações:</p><p>� as bactérias gram-negativas conseguem eliminar o complexo cristal</p><p>violeta-iodo, que atravessa uma camada fina de peptidoglicano, uma</p><p>vez que o álcool penetra e rompe a camada externa de LPSs;</p><p>� as bactérias gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo,</p><p>já que esse complexo não consegue ultrapassar a espessa camada de</p><p>peptidoglicano.</p><p>A coloração de Gram é, portanto, considerada uma técnica diferencial, haja</p><p>vista que as bactérias gram-positivas são coradas de azul/púrpura, enquanto</p><p>as gram-negativas ficam na tonalidade rosa/vermelho (LEVINSON, 2016;</p><p>MADIGAN et al., 2016).</p><p>Bactérias álcool-acidorresistentes</p><p>Algumas bactérias, como as dos gêneros Mycobacterium, Corynebacterium</p><p>e Nocardia (este último gênero compreendendo somente as espécies patogê-</p><p>nicas), têm algumas peculiaridades em suas paredes celulares. As paredes</p><p>celulares dessas bactérias contêm alta concentração (60%) de um lipídio céreo</p><p>hidrofóbico, denominado ácido micólico, o qual é unido ao peptidoglicano</p><p>por um polissacarídeo (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017). A micobactéria</p><p>causadora da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) tem grandes quanti-</p><p>dades de ácido micólico, e sua parede celular está representada na Figura 2.</p><p>A consistência cerosa e com propriedade hidrofóbica causada pelo ácido</p><p>micólico torna essas bactérias resistentes a muitos produtos químicos, como</p><p>detergentes, ácidos fortes e alguns corantes, por essa razão, os corantes utili-</p><p>zados na coloração de Gram não conseguem penetrar e corar essas bactérias</p><p>(a não ser que a parede de ácido micólico seja removida, corando-se, então,</p><p>pelo método de Gram como gram-positivas). Apesar disso, elas podem ser</p><p>coradas por carbol-fucsina, um corante de cor vermelha que penetra facilmente</p><p>na parede celular depois do aquecimento. Após a penetração do corante carbol-</p><p>-fucsina, essas bactérias não são descoloradas por adição de álcool-ácido,</p><p>já que esse corante tem mais solubilidade no ácido micólico. Devido a essa pro-</p><p>priedade, essas bactérias são chamadas de bactérias álcool-acidorresistentes</p><p>(BROOKS et al., 2014; LEVINSON, 2016).</p><p>Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica6</p><p>Figura 2. Estrutura da parede celular da Mycobacterium tuberculosis. Uma das principais</p><p>peculiaridades é a presença de ácido micólico.</p><p>Fonte: Barros, Machado e Sprinz (2013, p. 67).</p><p>As micobactérias (p. ex., M. tuberculosis e M. leprae) têm forma de ba-</p><p>cilo, sendo comumente denominadas como bacilos álcool-acidorresistentes</p><p>(BAARs). As micobactérias crescem lentamente, duplicando-se a cada 18 h.</p><p>O crescimento lento das micobactérias dificulta a cultura de amostras clínicas,</p><p>pois é necessário que elas sejam incubadas em meio especial (p. ex., meio</p><p>de Löwenstein-Jensen) por 6 a 8 semanas, para só então serem consideradas</p><p>negativas, se não houver crescimento bacteriano durante esse tempo. Dessa</p><p>forma, é essencial realizar um esfregaço da amostra clínica (exame direto) antes</p><p>de esperar as bactérias crescerem e, em seguida, corar a lâmina para observar</p><p>a presença e contar os BAARs em microscópio óptico (exame chamado de</p><p>baciloscopia), pois isto auxilia o diagnóstico clínico de micobactérias de forma</p><p>mais rápida, o que demonstra a importância da etapa de coloração (BROOKS</p><p>et al., 2014; LEVINSON, 2016).</p><p>7Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica</p><p>Coloração de Ziehl-Neelsen</p><p>Você acabou de aprender sobre as peculiaridades das bactérias álcool-acidorre-</p><p>sistentes e entendeu o porquê elas não são usualmente coradas pela coloração</p><p>de Gram, então, a partir de agora, você vai aprender, com mais detalhes,</p><p>como as bactérias álcool-acidorresistentes são coradas para que possam ser</p><p>visualizadas em microscopia de campo claro.</p><p>A técnica mais utilizada em laboratórios de bacteriologia clínica para</p><p>corar as bactérias álcool-acidorresistentes é a coloração de Ziehl-Neelsen.</p><p>A primeira etapa dessa coloração consiste na adição do corante vermelho</p><p>carbol-fucsina na lâmina contendo o esfregaço previamente fixado, sendo ne-</p><p>cessário aplicar calor para aumentar a penetração e a retenção do corante. Após</p><p>a lavagem com água, a lâmina é descolorada com álcool-ácido, nessa etapa, as</p><p>bactérias álcool-acidorresistentes permanecem coradas com o corante verme-</p><p>lho, no entanto, as outras bactérias que não têm o ácido micólico em sua parece</p><p>celular acabam sendo descoloridas. Dessa forma, um contracorante (coloração</p><p>de contraste) deve ser adicionado (geralmente o azul de metileno) para corar</p><p>as bactérias que se não são álcool-acidorresistentes. No microscópio óptico,</p><p>as bactérias álcool-acidorresistentes se apresentam com cor rosa/vermelha,</p><p>enquanto o fundo da lâmina e os outros microrganismos não acidorresistentes</p><p>apresentam a cor do contracorante (geralmente azul) (BROOKS et al., 2014;</p><p>MADIGAN et al., 2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>Para corar as bactérias álcool-acidorresistentes, inicialmente se confecciona um esfre-</p><p>gaço em lâmina do material clínico, que deve ser fixado pelo calor. Após, realiza-se a</p><p>técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, que consiste nas etapas descritas a seguir.</p><p>1. Adição de carbol-fucsina (ou fucsina fenicada) na lâmina e aquecimento em</p><p>chama até a emissão de vapores.</p><p>2. Após a lâmina esfriar, lavagem com água corrente ou deionizada.</p><p>3. Descoloração da lâmina com álcool-ácido 3% (etanol 95% e ácido clorídrico</p><p>3,0%), até que haja uma coloração rosa suave.</p><p>4. Lavagem com água corrente ou deionizada.</p><p>5. Adição do azul de metileno.</p><p>6. Lavagem com água corrente ou deionizada e secagem natural.</p><p>Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica8</p><p>Esta é uma coloração diferencial, já que coram somente as bactérias que contêm</p><p>ácido micólico nas paredes celulares. Os patógenos com maiores demandas laborato-</p><p>riais que necessitam ser corados por essa técnica são as micobactérias M. tuberculosis</p><p>e a M. leprae, que são os agentes causadores das doenças tuberculose e hanseníase,</p><p>respectivamente (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>Fontes: Brasil (2013) e Brooks et al. (2014).</p><p>Outras técnicas de colorações de bactérias</p><p>Além das colorações Gram e Ziehl-Neelsen, que são as mais rotineiramente</p><p>realizadas, existem outras que também são utilizadas para corar bactérias em</p><p>situações específicas.</p><p>A coloração de Kinyoun é usada para diferenciar as espécies álcool-</p><p>-acidorresistentes (Mycobacterium, Corynebacterium e Nocardia) das não</p><p>álcool-acidorresistentes, sendo uma opção quando se coram fracamente pelo</p><p>método de Ziehl-Neelsen. Na realidade, a coloração de Kinyoun é uma modi-</p><p>ficação do teste de Ziehl-Neelsen, no qual se acrescenta uma etapa prévia ao</p><p>adicionar uma fórmula contendo fucsina básica, fenol, etanol e água destilada</p><p>(BROOKS et al., 2014).</p><p>Os corantes podem ser utilizados individualmente em soluções aquosas</p><p>ou alcoólicas para visualizar as bactérias de forma destacada e determinar a</p><p>morfologia e arranjo. Como exemplos, destacamos os corantes azul de metileno,</p><p>carbol-fucsina, cristal violeta e safranina (TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>Algumas bactérias (p. ex., Klebsiella pneumoniae) produzem cápsula</p><p>externamente à parede celular, o que é considerado um fator de virulência.</p><p>A coloração negativa para cápsulas é um método utilizado para verificar se</p><p>a bactéria em análise tem cápsula. O princípio da técnica é que a maioria dos</p><p>corantes não consegue corar as cápsulas bacterianas, pois estas são solúveis</p><p>em água, mas cora o restante do material, dessa forma, o fundo fica escuro e</p><p>as cápsulas são visualizadas como halos incolores. É possível utilizar o corante</p><p>tinta da Índia, ou nigrosina, mas existem outros protocolos possíveis (p. ex.,</p><p>método de Welch, que utiliza cristal violeta e sulfato de cobre) (BROOKS et</p><p>al., 2014; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>9Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica</p><p>Algumas bactérias (p. ex., Bacillus cereus) produzem endósporos, que</p><p>são estruturas dormentes intracelulares que conferem resistência bacteriana</p><p>em condições ambientais adversas, como calor extremo, radiação, produtos</p><p>químicos fortes, dessecamento e carência nutricional. A maioria dos corantes</p><p>(como os utilizados no Gram) não consegue penetrar na parede dos endóspo-</p><p>ros, não sendo, portanto, corados por eles, porém, existe uma técnica capaz</p><p>de corar e detectar se a bactéria analisada tem endósporo, a qual é chamada</p><p>de coloração de endósporo (Schaeffer-Fulton). Nessa técnica, aplica-se o</p><p>corante verde malaquita com fixação em calor, o que ajuda a sua penetração</p><p>na parede do endósporo, além de um contracorante (safranina) que cora as</p><p>porções celulares que não são endósporos. Assim, o endósporo adquire uma</p><p>cor verde, enquanto o restante adquire cor vermelho/rosa (MADIGAN et al.,</p><p>2016; TORTORA; FUNKE; CASE, 2017).</p><p>Os flagelos, estruturas que conferem motilidade celular, são encontrados</p><p>em algumas bactérias (p. ex., Salmonella enterica). A detecção da presença</p><p>de arranjos flagelares pode auxiliar no diagnóstico, entretanto, os flagelos</p><p>são muitos finos, o que impede que sejam visualizadas no microscópio óp-</p><p>tico sem</p><p>uma coloração adequada. Existe um protocolo para coloração do</p><p>flagelo, no qual se utiliza um mordente (suspensão coloidal de sais de ácido</p><p>tânico) que aumenta o diâmetro do flagelo, seguido da aplicação do corante</p><p>carbol-fucsina, sendo então possível a sua visualização em microscópio óptico</p><p>(BROOKS et al., 2014).</p><p>O Quadro 1 traz um resumo das diferentes técnicas de coloração utilizadas</p><p>na área da Bacteriologia Clínica.</p><p>Leitores do material impresso, para visualizar as figuras</p><p>deste capítulo em cores, acessem o link a seguir ou o</p><p>código QR ao lado.</p><p>https://qrgo.page.link/UM6x3</p><p>Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica10</p><p>Co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çã</p><p>o</p><p>Cl</p><p>as</p><p>si</p><p>fi</p><p>ca</p><p>çã</p><p>o</p><p>Co</p><p>ra</p><p>nt</p><p>es</p><p>u</p><p>ti</p><p>liz</p><p>ad</p><p>os</p><p>Pr</p><p>in</p><p>ci</p><p>pa</p><p>is</p><p>a</p><p>pl</p><p>ic</p><p>aç</p><p>õe</p><p>s</p><p>A</p><p>pa</p><p>rê</p><p>nc</p><p>ia</p><p>d</p><p>a</p><p>co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çã</p><p>o</p><p>G</p><p>ra</p><p>m</p><p>D</p><p>ife</p><p>re</p><p>nc</p><p>ia</p><p>l</p><p>Cr</p><p>ist</p><p>al</p><p>v</p><p>io</p><p>le</p><p>ta</p><p>e</p><p>sa</p><p>fra</p><p>ni</p><p>na</p><p>(o</p><p>u</p><p>fu</p><p>cs</p><p>in</p><p>a)</p><p>D</p><p>ife</p><p>re</p><p>nc</p><p>ia</p><p>r a</p><p>m</p><p>ai</p><p>or</p><p>ia</p><p>d</p><p>as</p><p>es</p><p>pé</p><p>ci</p><p>es</p><p>b</p><p>ac</p><p>te</p><p>ria</p><p>na</p><p>s,</p><p>cl</p><p>as</p><p>sif</p><p>ic</p><p>an</p><p>do</p><p>-a</p><p>s c</p><p>om</p><p>o</p><p>gr</p><p>am</p><p>-p</p><p>os</p><p>iti</p><p>va</p><p>s 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Clínica</p><p>Q</p><p>ua</p><p>dr</p><p>o</p><p>1.</p><p>P</p><p>rin</p><p>ci</p><p>pa</p><p>is</p><p>co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çõ</p><p>es</p><p>u</p><p>til</p><p>iz</p><p>ad</p><p>as</p><p>n</p><p>a</p><p>Ba</p><p>ct</p><p>er</p><p>io</p><p>lo</p><p>gi</p><p>a</p><p>Cl</p><p>ín</p><p>ic</p><p>a</p><p>Co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çã</p><p>o</p><p>Cl</p><p>as</p><p>si</p><p>fi</p><p>ca</p><p>çã</p><p>o</p><p>Co</p><p>ra</p><p>nt</p><p>es</p><p>u</p><p>ti</p><p>liz</p><p>ad</p><p>os</p><p>Pr</p><p>in</p><p>ci</p><p>pa</p><p>is</p><p>a</p><p>pl</p><p>ic</p><p>aç</p><p>õe</p><p>s</p><p>A</p><p>pa</p><p>rê</p><p>nc</p><p>ia</p><p>d</p><p>a</p><p>co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çã</p><p>o</p><p>Ki</p><p>ny</p><p>ou</p><p>n</p><p>D</p><p>ife</p><p>re</p><p>nc</p><p>ia</p><p>l</p><p>Fu</p><p>cs</p><p>in</p><p>a</p><p>e</p><p>az</p><p>ul</p><p>de</p><p>m</p><p>et</p><p>ile</p><p>no</p><p>D</p><p>ife</p><p>re</p><p>nc</p><p>ia</p><p>r e</p><p>sp</p><p>éc</p><p>ie</p><p>s 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Clínica12</p><p>Q</p><p>ua</p><p>dr</p><p>o</p><p>1.</p><p>P</p><p>rin</p><p>ci</p><p>pa</p><p>is</p><p>co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çõ</p><p>es</p><p>u</p><p>til</p><p>iz</p><p>ad</p><p>as</p><p>n</p><p>a</p><p>Ba</p><p>ct</p><p>er</p><p>io</p><p>lo</p><p>gi</p><p>a</p><p>Cl</p><p>ín</p><p>ic</p><p>a</p><p>Co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çã</p><p>o</p><p>Cl</p><p>as</p><p>si</p><p>fi</p><p>ca</p><p>çã</p><p>o</p><p>Co</p><p>ra</p><p>nt</p><p>es</p><p>u</p><p>ti</p><p>liz</p><p>ad</p><p>os</p><p>Pr</p><p>in</p><p>ci</p><p>pa</p><p>is</p><p>a</p><p>pl</p><p>ic</p><p>aç</p><p>õe</p><p>s</p><p>A</p><p>pa</p><p>rê</p><p>nc</p><p>ia</p><p>d</p><p>a</p><p>co</p><p>lo</p><p>ra</p><p>çã</p><p>o</p><p>N</p><p>eg</p><p>at</p><p>iv</p><p>a</p><p>pa</p><p>ra</p><p>cá</p><p>ps</p><p>ul</p><p>as</p><p>Es</p><p>pe</p><p>ci</p><p>al</p><p>N</p><p>or</p><p>m</p><p>al</p><p>m</p><p>en</p><p>te</p><p>ti</p><p>nt</p><p>a</p><p>da</p><p>Ín</p><p>di</p><p>a</p><p>ou</p><p>n</p><p>ig</p><p>ro</p><p>sin</p><p>a</p><p>D</p><p>et</p><p>ec</p><p>ta</p><p>r 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(</p><p>20</p><p>14</p><p>, p</p><p>. 3</p><p>3)</p><p>.</p><p>En</p><p>dó</p><p>sp</p><p>or</p><p>o</p><p>(S</p><p>ch</p><p>ae</p><p>ff</p><p>er</p><p>-F</p><p>ul</p><p>to</p><p>n)</p><p>Es</p><p>pe</p><p>ci</p><p>al</p><p>Ve</p><p>rd</p><p>e</p><p>m</p><p>al</p><p>aq</p><p>ui</p><p>ta</p><p>e</p><p>sa</p><p>fra</p><p>ni</p><p>na</p><p>D</p><p>et</p><p>ec</p><p>ta</p><p>r a</p><p>p</p><p>re</p><p>se</p><p>nç</p><p>a</p><p>de</p><p>e</p><p>nd</p><p>ós</p><p>po</p><p>ro</p><p>n</p><p>a</p><p>ba</p><p>ct</p><p>ér</p><p>ia</p><p>(c</p><p>or</p><p>v</p><p>er</p><p>de</p><p>)</p><p>Fo</p><p>nt</p><p>e:</p><p>T</p><p>or</p><p>to</p><p>ra</p><p>, F</p><p>un</p><p>ke</p><p>e</p><p>C</p><p>as</p><p>e</p><p>(2</p><p>01</p><p>7,</p><p>p.</p><p>6</p><p>7)</p><p>. 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(org.). Antimicrobianos. 5. ed. Porto Alegre: Artmed,</p><p>2013. (Consulta rápida).</p><p>BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia clínica para o controle</p><p>de infecção relacionada à assistência à saúde: módulo 4: procedimentos laboratoriais:</p><p>da requisição do exame à análise microbiológica e laudo final. Brasília, DF: ANVISA,</p><p>2013. Disponível em: https://www20.anvisa.gov.br/segurancadopaciente/index.php/</p><p>publicacoes/item/procedimentos-laboratoriais-da-requisicao-do-exame-a-analise-</p><p>-microbiologica-e-laudo-final. Acesso em: 28 set. 2019.</p><p>BROOKS, F. et al. Microbiologia médica de Jawetz, Melnick e Adelberg. 26. ed. Porto Alegre:</p><p>AMGH, 2014. (Lange).</p><p>LEVINSON, W. Microbiologia e imunologia médicas. 13. ed. Porto Alegre: AMGH, 2016.</p><p>(Lange).</p><p>MADIGAN, M. T. et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: Artmed, 2016.</p><p>MURRAY, P. R. et al. Microbiologia médica. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.</p><p>TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.</p><p>15Técnicas de coloração em Bacteriologia Clínica</p><p>Dica do professor</p><p>O microscópio de campo escuro pode ser utilizado em substituição ao de campo claro, quando os</p><p>microrganismos não podem ser corados pelos métodos convencionais.</p><p>Nesta Dica do Professor, você verá a diferença entre os microscópios de campos claro e escuro, a</p><p>definição de exame direto e alguns exemplos práticos de bactérias analisadas por exame direto no</p><p>microscópio de campo escuro, sem que passem por etapa prévia de coloração.</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>https://fast.player.liquidplatform.com/pApiv2/embed/cee29914fad5b594d8f5918df1e801fd/199d789a61d3f71052eb6e559fdabd44</p><p>Exercícios</p><p>1) As bactérias podem ser classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, o que é de</p><p>grande importância no auxílio do diagnóstico laboratorial. Em relação às características e às</p><p>diferenças estruturais entre as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, assinale a</p><p>alternativa correta:</p><p>A) As bactérias Gram-negativas apresentam porinas, que são proteínas de membrana.</p><p>B) As bactérias Gram-negativas apresentam várias camadas de peptidoglicano.</p><p>C) As bactérias Gram-positivas apresentam uma membrana externa.</p><p>D) Os lipopolissacarídeos (LPS) são endotoxinas encontradas nas bactérias Gram-positivas.</p><p>E) Os ácidos teicoicos são fatores de virulência encontrados nas bactérias Gram-negativas.</p><p>2) A coloração de Gram é uma técnica amplamente utilizada em bacteriologia clínica para</p><p>classificar as bactérias como Gram-positivas ou Gram-negativas, por meio da visualização</p><p>em microscópio de campo claro.</p><p>A respeito da técnica da coloração de Gram, assinale a alternativa correta:</p><p>A) As bactérias Gram-positivas coram-se de rosa/vermelho, enquanto as Gram-negativas coram-</p><p>se de azul/púrpura.</p><p>B) O iodo é utilizado como descorante, que remove a coloração azul de algumas bactérias.</p><p>C) Após a etapa de descoloração, as bactérias Gram-positivas eliminam o complexo cristal</p><p>violeta-iodo.</p><p>D) O cristal de violeta é um corante ácido que cora as células de azul/roxo-violeta somente.</p><p>E) Para se corar as bactérias Gram-negativas, utilizam-se os corantes safranina ou fucsina.</p><p>3) As bactérias álcool-acidorresistentes apresentam propriedades celulares peculiares. Assinale</p><p>a alternativa correta em relação</p><p>às características das bactérias álcool-acidorresistentes:</p><p>A) O ácido micólico é um lipídeo encontrado nas membranas celulares das bactérias álcool-</p><p>acidorresistentes.</p><p>B) O ácido teicoico é encontrado nas paredes celulares das bactérias álcool-acidorresistentes.</p><p>C) O cristal violeta consegue penetrar facilmente a parede celular das bactérias álcool-</p><p>acidorresistentes.</p><p>D) As bactérias álcool-acidorresistentes impregnadas com o corante carbol-fucsina podem ser</p><p>descoloradas pela adição de um álcool-ácido.</p><p>E) O ácido micólico impede que as bactérias álcool-acidorresistentes sejam coradas pela</p><p>coloração de Gram.</p><p>4) A coloração de Ziehl-Neelsen é umas das técnicas laboratoriais mais utilizadas para a</p><p>identificação de bacilos álcool-acidorresistentes (BAAR), como, por exemplo, a</p><p>Mycobacterium tuberculosis, agente causador da tuberculose. Sobre a coloração de Ziehl-</p><p>Neelsen, assinale a alternativa correta:</p><p>A) A coloração de Ziehl-Neelsen não é considerada uma técnica diferencial, uma vez que não é</p><p>possível diferenciar gêneros bacterianos.</p><p>B) A carbol-fucsina funciona como contracorante (coloração de contraste) na coloração de Ziehl-</p><p>Neelsen.</p><p>C) A coloração de Ziehl-Neelsen não é a ideal para diferenciar as bactérias Gram-positivas das</p><p>Gram-negativas.</p><p>D) Após a etapa de descoloração com álcool-ácido, as bactérias álcool-acidorresistentes tornam-</p><p>se incolores, necessitando-se, então, corá-las com um contracorante.</p><p>E) Na coloração de Ziehl-Neelsen, utilizando-se carbol-fucsina e azul de metileno, as bactérias</p><p>álcool-acidorresistentes coram-se de azul, enquanto outros microrganismos não</p><p>acidorresistentes coram-se de vermelho.</p><p>5) Existem diferentes protocolos de coloração de bactérias utilizados na bacteriologia clínica,</p><p>sendo alguns indicados para situações específicas, em que a coloração de Gram não é</p><p>indicada. A respeito das técnicas de coloração utilizadas para visualização de bactérias em</p><p>microscópio óptico, assinale a alternativa correta:</p><p>A) A coloração negativa, em que se utiliza a tinta da Índia ou nigrosina, é indicada para se</p><p>detectar a presença de flagelos.</p><p>B) A coloração de Kinyoun é utilizada para detectar a presença de endósporo na bactéria.</p><p>C) A técnica de Ziehl-Neelsen é utilizada para detectar a presença de cápsula bacteriana.</p><p>D) Para se visualizar a presença dos flagelos, pode-se aplicar uma técnica especial em que se</p><p>utiliza um mordente e o corante carbol-fucsina.</p><p>E) A coloração de Schaeffer-Fulton é utilizada para diferenciar bactérias álcool-acidorresistentes</p><p>das não álcool-acidorresistentes.</p><p>Na prática</p><p>Um dos principais objetivos de um setor de microbiologia de um laboratório clínico é a identificação</p><p>de espécies bacterianas contidas em amostras de pacientes. A observação das bactérias em</p><p>microscópio óptico é uma etapa rotineira, mas normalmente é necessário que as bactérias sejam</p><p>coradas previamente. O microbiologista deve conhecer as técnicas de coloração mais adequadas</p><p>para cada tipo de bactéria.</p><p>Veja, a seguir, um caso clínico de suspeita de tuberculose, em que foi necessário realizar a técnica</p><p>de coloração de Ziehl-Neelsen para se observar bacilos álcool-acidorresistentes na amostra.</p><p>Aponte a câmera para o</p><p>código e acesse o link do</p><p>conteúdo ou clique no</p><p>código para acessar.</p><p>https://statics-marketplace.plataforma.grupoa.education/sagah/a128a457-a417-44a8-9f40-f112a401808f/f1de7994-cac6-4779-bc02-e21d58df7aef.png</p><p>Saiba +</p><p>Para ampliar o seu conhecimento a respeito desse assunto, veja abaixo as sugestões do professor:</p><p>Bactérias Gram-negativas produtoras de β-lactamases</p><p>Uma particularidade das bactérias Gram-negativas é que algumas delas podem conter enzimas β-</p><p>lactamases no espaço periplásmico da parede celular, que conferem resistência aos antibióticos β-</p><p>lactâmicos. Este artigo faz uma revisão sobre as bactérias Gram-negativas produtoras de β-</p><p>lactamases e explica o que são as bactérias ESBL e a superbactéria KPC. Confira.</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>Entendendo os princípios da coloração de Gram</p><p>Para saber mais, assista a este vídeo, que explica os fundamentos da coloração de Gram, mostrando</p><p>em detalhes o que acontece com as bactérias em cada passo da técnica.</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>Tuberculose — Diagnóstico laboratorial — Baciloscopia</p><p>Neste vídeo, é explicado de forma muito detalhada como funciona o exame de baciloscopia, que é</p><p>realizado para o diagnóstico de tuberculose. Ele mostra a coleta de escarro, o esfregaço, o passo a</p><p>passo da coloração de Ziehl-Neelsen e a contagem de BAAR no microscópio. Confira.</p><p>http://jic-abih.com.br/index.php/jic/article/view/173</p><p>https://www.youtube.com/embed/gMQUsh2c0zQ</p><p>Aponte a câmera para o código e acesse o link do conteúdo ou clique no código para acessar.</p><p>https://www.youtube.com/embed/yCOebdNCTxY</p>