Aula - Tecnologia do DNA recombinante FINAL

Prévia do material em texto

<p>Tecnologia do DNA recombinante</p><p>aplicada à Transformação</p><p>Genética de Plantas</p><p>Questões para Discussão</p><p>1. Quais os elementos básicos devem ser incluídos no</p><p>desenho e construção de um eficiente vetor de</p><p>expressão em plantas?</p><p>2. Quais as vantagens e desvantagens das diferentes</p><p>tecnologias de clonagem?</p><p>3. Quais as diferentes aplicações da tecnologia do DNA</p><p>recombinante na transformação de plantas?</p><p>A pareia com T</p><p>G pareia com C</p><p>O pareamento de bases</p><p>nucleotídicas ocorre</p><p>principalmente devido à</p><p>“ligações de H”;</p><p>Fitas apresentam direção 5’ to</p><p>3’ e fitas pareadas apresentam-</p><p>se na orientação “antiparalela”;</p><p>O pareamento de Bases</p><p>Nucleotídicas:</p><p>Modelo Watson-Crick</p><p>Recombinant DNA history</p><p>1966 The genetic code is deciphered when biochemical analysis reveals</p><p>which codons determine which amino acids.</p><p>1970 Hamilton Smith, at Johns Hopkins Medical School, isolates the first</p><p>restriction enzyme, an enzyme that cuts DNA at a very specific</p><p>nucleotide sequence. Over the next few years, several more restriction</p><p>enzymes will be isolated.</p><p>1972 Stanley Cohen and Herbert Boyer combine their efforts to create</p><p>recombinant DNA. This technology will be the beginning of the</p><p>biotechnology industry.</p><p>1976 Herbert Boyer cofounds Genentech, the first firm founded in the</p><p>United States to apply recombinant DNA technology</p><p>1978 Somatostatin, which regulates human growth hormones, is the first</p><p>human protein made using recombinant technology.</p><p>1983 Kary Mullis does PCR. 1985 Kary Mullis publishes method. Patents</p><p>follow.</p><p>2000 Gateway cloning</p><p>http://www.accessexcellence.org/RC/AB/WYW/wkbooks/SFTS/sidebarmilestone.html</p><p>Passos essenciais para produção de</p><p>qualquer planta transgênica</p><p>• Produzir o plasmídeo (ou vetor de clonagem) para a</p><p>transformação genética;</p><p>• Transformar a espécie de bactéria (normalmente</p><p>Escherichia coli) de manutenção dos “clones”;</p><p>• Caracterizar os plasmídeos (via restrição e</p><p>sequenciamento);</p><p>• Transformar Agrobacterium (se utilizar Agrobacterium)</p><p>e caracterizar os plasmídeos novamente;</p><p>• Transformar plantas (métodos diretos e indiretos);</p><p>Características necessárias de</p><p>vetores de transformação:</p><p>• Origem de Replicação;</p><p>• Marcador de Seleção (próximas aulas…);</p><p>• Gene de interesse;</p><p>• Regiões flanqueadoras de T-DNA e outros</p><p>genes de Agrobacterium, se</p><p>Agrobacterium for utilizada;</p><p>• Compatibilidade com plasmídeo auxiliar,</p><p>se Agrobacterium for utilizada;</p><p>Componentes típicos de vetores de transformação:</p><p>construindo um plasmídeo de expressão</p><p>• “Cassete” com marcador de seleção</p><p>(contendo promotor e terminador);</p><p>• “Cassete” com gene de interesse</p><p>(contendo promotor e terminador);</p><p>• “Cassete” com gene repórter (contendo</p><p>promotor e terminador);</p><p>O que acontece se não colocarmos o</p><p>promotor? E o terminador?</p><p>Principais enzimas utilizadas</p><p>em Clonagem</p><p>• Endonuclease de Restrição;</p><p>• DNA ligase;</p><p>• Taq DNA polimerase;</p><p>• Atualmente: Topoisomerases; Recombinases;</p><p>Plataformas de Clonagem</p><p>• Enzimas de Restrição/ Ligase;</p><p>• Métodos baseados em PCR;</p><p>• Gateway, e outros métodos de</p><p>recombinação sítio-específicos;</p><p>Enzimas de Restrição/</p><p>Ligase</p><p>http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/66/Scissors.sv</p><p>g/540px-Scissors.svg.png</p><p>Quais as</p><p>condições</p><p>da ligação?</p><p>Então, cortamos nosso gene… E agora?</p><p>Gene de Flores azuis</p><p>Plasmídeo</p><p>Os</p><p>componentes</p><p>essenciais do</p><p>vetor de</p><p>clonagem estão</p><p>presentes?</p><p>Quais</p><p>enzimas de</p><p>restrição</p><p>usar?</p><p>Como você amplificou</p><p>este gene?</p><p>Extração do DNA plasmidial</p><p>Transformação</p><p>Problemas frequentes da</p><p>clonagem convencional</p><p>• Sítios de Restrição Inconvenientes;</p><p>• A construção do vetor é trabalhosa;</p><p>• Reações que duram longos períodos de</p><p>tempo;</p><p>Exemplos: Ligação de</p><p>Extremidades Cegas</p><p>ACGTC</p><p>G</p><p>PstI</p><p>G</p><p>CTTAA</p><p>EcoRI</p><p>C</p><p>G</p><p>PstI</p><p>G</p><p>C</p><p>EcoRI</p><p>C</p><p>G</p><p>G</p><p>C</p><p>Klenow</p><p>Fragment</p><p>Ligase</p><p>Clonagem utilizando</p><p>produtos de PCR</p><p>Clonagem a partir de produtos de PCR</p><p>(Tecnologia TOPO™)</p><p>Problemas da clonagem direta de</p><p>produtos de PCR (TOPO™):</p><p>• Instabilidade da ligação covalente da</p><p>Topoisomerase com o vetor TOPO;</p><p>• Necessidade de etapas de restrição ou</p><p>recombinaçao subsequêntes;</p><p>Recombinação Sítio-Específica:</p><p>Sistema de Clonagem Gateway™</p><p>Bacteriófago λ</p><p>Fago λ</p><p>Sistema Gateway™</p><p>Transformação</p><p>em E. coli</p><p>http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/presentations/gateway/index.html?icid=fr-gwcloning-7</p><p>Transformação</p><p>em E. coli</p><p>http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/presentations/gateway/index.html?icid=fr-gwcloning-7</p><p>Sistemas “Multi-sítios” Gateway permitem que vários</p><p>fragmentos de DNA sejam clonados em uma única</p><p>construção</p><p>Gebert et al., The Plant Cell,</p><p>Vol. 21: 4018–4030, December</p><p>2009</p><p>Multiple promoters</p><p>from the MRS2/MGT</p><p>gene family fused to</p><p>the GUS gene and</p><p>expressed in</p><p>Arabidopsis thaliana</p><p>Vetores derivados de sequências</p><p>de plantas</p><p>• Aceitação pública de OGMs está ligada à</p><p>preocupação sobre a origem do DNA</p><p>empregado na produção;</p><p>• Ironicamente, células de plantas encontradas na</p><p>natureza (“wild-type”) já apresentam DNA de</p><p>bactérias em seus genomas;</p><p>• T-DNA pode ser substituído muitas vezes por P-</p><p>DNA;</p><p>• Repor promotores virais com promotores de</p><p>plantas;</p><p>Pollen-specific</p><p>promoter LAT52</p><p>activates</p><p>recombinase in</p><p>tobacco pollen</p><p>excision</p><p>LBRB</p><p>Pollen</p><p>genome</p><p>LAT52 FLP Recombinase NOS GUS:NPTII35S p NOS</p><p>loxP-FRT loxP-FRT</p><p>LBRB Pollen genome</p><p>loxP-FRT</p><p>LAT52 FLP Recombinase NOS 35S p NOS</p><p>FRT loxP</p><p>GUS:NPTII</p><p>Luo et al. 2007. Plant Biotechnology Journal</p><p>5(2): 263 - 274. (Courtesy of Moon’s poster)</p><p>A</p><p>B</p><p>Por que precisamos de diferentes típos de vetores?</p><p>Quais são as diferentes aplicações em plantas?</p><p>• Análise funcional de ORFs (Janelas Abertas de</p><p>Leitura);</p><p>• Super-expressão ou silenciamento (RNAi) de</p><p>genes específicos;</p><p>• Introdução de características multigênicas para o</p><p>melhoramento de plantas;</p><p>• Análise de promotores: nível de expressão</p><p>/especificidade/ induzibilidade;</p>