Aula 8, 9 e 10- enzimologia clínica

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Enzimologia
Clínica
ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL
REAÇÃO ENZIMA­SUBSTRATO
Chave-
fechadura
Encaixe-
induzido
ESPECIFICIDADE
•  Especificidade de Grupo
•  Especificidade absoluta
•  Especificidade relativa
•  Estereoespecificidade
ASPECTOS MOLECULARES
•  Proteínas simples
•  Presença de cofatores
           Coenzimas
           Grupos prostéticos
           Ativadores metálicos
•  Especificidade relativa
•  Estereoespecificidade
•  Zimogênio (Proenzimas)
Proteín
a
AcetilC
oA
M
g
APOENZIM
A
HOLOENZIM
A
COMO AS ENZIMAS
TRABALHAM
• Sob condições biológicas relevantes, as
reações não catalisadas tendem a ser lentas:
Formação de Intermediários Instáveis
Digestão de Alimentos
Transmissão Nervosa
Contração Muscular
• A enzima torna a reação energeticamente
mais favorável.
            E +  S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P
ENERGIA DE ATIVAÇÃO/ESTADO
DE TRANSIÇÃO
VELOCIDADE PROPORCIONAL À
CONCENTRAÇÃO
DAS ESPÉCIES DO ESTADO DE TRANSIÇÃO
Cinética de ordem
zero
Cinética de primeira
ordem
E
E
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Michaelis-
Menten
1
2
1
2
INATIVAÇÃO  ENZIMÁTICA
DESNATURAÇÃO (irreversível)
PRECIPITAÇÃO (reversível)
CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS
(International Union of Biochemistry)
ISOENZIMAS
•  Grupos precedentes de uma  mesma espécie animal
•  Estruturas diferentes
•  Atividades comparáveis frente ao mesmo substrato
 específico
•  Quimicamente diferentes
•  Características de identificação e separação
1. Mobilidade eletroforética
2. Comportamento
cromatográfico
3. Inativação térmica
4. Km
5. Reações imunoquímicas
6. Resposta a inibidores
Diferentes
Padrões
ENZIMOLOGIA NO
DIAGNÓSTICO
CLÍNICO­LABORATORIAL
Distribuição das Enzimas
no Organismo
•  Específicas do plasma
•  Enzimas de glândulas excretoras
•  Específicas de órgãos
•  Intracelulares
BASES BIOLÓGICAS E
BIOQUÍMICAS
Núcleo Citoplasm
a
Mitocôndria
s
PLASM
A
ELIMINAÇÃO DAS
ENZIMAS  CELULARES
PARA O PLASMA
Causas da Liberação das
Enzimas para o Plasma
•  Injúria Celular
•  Renovação Celular
•  Proliferação Celular (Neoplasias)
•  Incremento da Síntese
•  Redução do Clearance
MECANISMOS HIPOTÉTICOS PARA
OS NÍVEIS ANORMAIS DAS ENZIMAS
SÉRICAS
NÍVEIS ELEVADOS
1. Liberação Aumentada
• Necrose (IAM, hepatites, pancreatites)
• Alteração da Permeabilidade da membrana celular
s/ necrose
 (distrofia muscular, delirium tremens,
dermatomiosite)
2. Fonte Tissular Aumentada
• Neoplasias, Anemia megaloblástica, Lesões
osteoblásticas
3. Excreção Danificada
• Úlcera péptica, Icterícia obstrutiva
NÍVEIS SÉRICOS
REDUZIDOS
1. Formação Diminuída
• Genética (Doença de Wilson)
• Adquirida (Hepatite, Inanição - amilase)
2. Inibição Enzimática
• Envenenamento por inseticidas (AST,
Pseudocolinesterase)
• Ausência de Co-fatores (cirrose)
APLICAÇÕES DA
ENZIMOLOGIA NA
MEDICINA CLÍNICA E
LABORATORIAL
Fatores que Determinam o Perfil
Enzimático Sérico
• Perfil Enzimático do Órgão Lesado
•  Gravidade e Localização das Lesões Celulares
•  Fluxo Sangüíneo do Órgão
•  Vida Média e Solubilidade no Líquido Extracelular
•  Metodologia
Célula com
contato
direto com o
plasma
Plasma
 Espaço
intersticial
Célula sem contato
direto com o
plasma
Linf
a
CAUSAS DE DISTORÇÕES NO
PERFIL ENZIMÁTICO DO ÓRGÃO
NO SORO
• Diferenças na Localização da enzima na célula
•  Diferentes velocidades de inativação da enzima
 no soro
•  Mudanças permanentes no padrão enzimático do
Órgão , devido à longa duração da lesão
•  Superposição dos perfis enzimáticos de
 diferentes órgãos
ENQUADRAMENTO DAS ENZIMAS
SÉRICAS DE ACORDO COM SUA
ATIVIDADE CLÍNICA
ROTINEIRAMENTE EMPREGADAS
• Fosfatase alcalina (ALP) Hepatopatias, mestástases
• Fosfatase ácida (ACP)
• Lipase
• Amilase
• Lactato desidrogenase (LDH)
• Transaminases (AST e ALT)
• Gamaglutamiltrasnferase (GGT)
• Creatina quinase (CK)
CLINICAMENTE ÚTIL/ POUCO
SOLICITADAS
• Pseudocolinesterase
• Leucinaaminopeptidase (LAP)
• Nucleotidase (5’N)
• Frutose1,6-difosfato aldolase (ALS): hepatite (+++),
cirrose(+),
 IAM (++), distúrbio muscular (+++)
• Fosfohexoisomerase (PHI) : hepatite (+++), cirrose (+),
IAM (++)
 distúrbio muscular (+)
• Isocitrato desidrogenase (ICD): hepatite (+++), IAM (N),
 distúrbio muscular (N)
• Ornitina carbamil transferase (OCT) : hepatite (+++),
cirrose (+)
• Iditol desidrogenase (ID): hepatite (+++), cirrose (+),
IAM (N)
• Aliesterase (pancreatite aguda)
• FrutosePaldolase (aum. Hepatites, N: icterícias
obstrutivas, IAM,
 distúrbios musculares
• Malato desidrogenase (MD) hepatites (+++) cirrose (+)
IAM (++)
• Lipoproteína Lipase (LPL)
• Glutamato desidrogenase (GD) : hepatite (++), cirrose
(+ouN),
 IAM (N)
• Glutationa redutase (GR): hepatite (++), IAM (+)
PRIMARIAMENTE DE INTERESSE
INVESTIGATIVO
CIRCUNSTÂNCIAS ESPECIAIS
• Ceruloplasmina
• Muramidase
(leucemia)
CRITÉRIOS PARA ESCOLHA DOS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS DE
ROTINA
• Alta especificidade
•  Resultados exatos e precisos
•  Simplicidade
•  Sensibilidade
POSSÍVEIS CAUSAS DE ERROS
• Vidraria suja ou contaminada
•  Pureza da água
•  Amostra velhas, hemolisadas ou com metais
•  Inativação
•  Pipetagem
•  Comprimento de onda
•  Soluções
•  Temperatura de incubação incorreta
•  Reagentes gelados
•  pH
•  Falta de perícia técnica
MARCADORES
BIOQUÍMICOS DA
SÍNDROME
CORONARIANA AGUDA
Síndrome Coronariana Aguda
(Doença Miocárdica Isquêmica)
Lesão Miocárdica
reversível
ou pequena
Necrose Tecidual extensa
do Miocárdio
Angina
Instável
Infarto Agudo
do Miocárdio
(IAM)
• Ampla Janela Diagnóstica
•   Especificidade Cardíaca
•   Utilidade Clínica
•   Rendimento Técnico
•   Alta Solubilidade
PROPRIEDADES DE UM
MARCADOR BIOQUÍMICO PARA O
DIAGNÓSTICO PRECOCE DE DANO
CARDÍACO
•   Baixo Peso Molecular
•   Alta Concentração no Miocárdio
•   Rápida Eliminação para o Plasma
•   Correlação com o Dano Celular
•   Rapidamente Detectável
Schmidt & Schmidt,
1976
CREATINOQUINASE (CK)
ISOENZIMAS E
ISOFORMAS
Estrutura Molecular
 e Localização da CK
B B M B
M M
CK
1
CK
2
CK
3
(PM = 82 kDa)
CKMM CKMB
 Músculos
 Esqueléticos Coraçã
o
Cérebr
o
Isoformas da CKMB (CK2)
•  CKMB1 e CKMB2 (tecido)
•  Detecção mais precoce que CKT
      (Eletroforese em alta voltagem)
•  CKMB2/CKMB1 > 1,5 (12 após IAM)
Isoformas da CKMM
(CK3)
• CKMM1, CKMM2 e CKMM3
•  MM3/MM1 = 0,33 na ausência de
IAM
LACTATO
DESIDROGENASE
(LDH)
E ISOENZIMAS
Estrutura Molecular
 e Localização da LDH
(PM = 136 kDa)
H H
H H
H H
H M
H H
M M
H M
M M
M M
M M
LD1 LD2 LD3
LD4 LD5
Métodos Utilizados para
Medida da
LDH e Isoenzimas
•  Eletroforese
•  Colorimetria
•  Cromatografia
•  Estabilidade térmica
•  Medida da α­hidroxibutirato
Falsas Elevações LD1/LD2
Positiva
s• Amostras Hemolisadas
•  Gravidez e Miopatias
•  Injúria: Rins, pâncreas, estômago e cérebro
Negativo
s• Tempo inadequado
MARCADORES NÃO
ENZIMÁTICOS DE
DANO CARDÍACO
Mioglobina
•  Hemeproteína (PM = 17,8 kDa)
•  Citoplasma de Células Musculares
       (Cardíacas e Esqueléticas)
•  Rapidamente Liberada
•  Excelente Marcador Precoce do IAM
 (valor preditivo  negativo de 100% após
6h)
•  Avaliação da Terapia Trombolítica
Mioglobina como Marcador
Precoce do IAM
Mioglobina para o
Diagnóstico
de Reinfarto
Métodos para Dosagem da
Mioglobina
•   Imunoensaios
•   Pouca Especificidade para o Miocárdio
•   Mioglobina + Anidrase Carbônica III
               ( Fluorescência)
Elevações da Mioglobina
Sérica
•   IAM (2h após a dor)
•  Angina instável
•   Exercício Intenso
•  Desordens  Neuromusculares e
     no Músculo Esquelético
•  Falência Renal
•  Cirurgias Cardíacas
•  Injeções i.m.
•  Toxinas e Drogas
Resultados Falso Negativos
•  Janela Diagnóstica (2 ­ 12 h após a dor)
•   Pequenos infartos (Sem ondas Q)
TROPONINAS
•  TnC
•  TnI
•  TnT
Miosina
Actin
a
Tropomiosina
Tn
TCa+
+
Tn
C Tn
I
Localização das Isoformas
Cardíacas
* Expressão da TnT no músculo esquelético
(injúria)
Utilidade da TnT e TnI no
Diagnósticodo IAM
Tn
T• Curso Temporal : 4 ­ 12 h após a dor
                               1° pico: 14­24 h; 2 °: 4 dias
                                elevação por 7 dias
 Liberação Bifásica
•  Excelente Sensibilidade
•  Especificidade Relativa
                            Elevações
Dano no M.Esquelético       Polimiosites
Exercícios Prolongados      Artrite e Lupus
TnI
• Curso Temporal ( = TnT)
•  Maior Amplitude de Janela Diagnóstica
•  Superior Especificidade Cardíaca
  (única presente somente no
miocárdio)
•  Melhor Controle Clínico do Paciente
Miosina de Cadeia Leve
MCL­1 e MCL­2
• N­terminal da Cadeia Pesada de Miosina
•   Isoformas Musculares: Cardíacas e Esqueléticas
•   Aumenta  3­5 h após a isquemia; permanece
    elevada até 2 semanas
•   Indetectável em pessoas normais
•  Elevações: Dano muscular e Falência Renal