Citometria de Fluxo (1)

Prévia do material em texto

Citometria de Fluxo
UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA - GOVERNADOR VALADARES
Prof. Pauline Martins Leite
Gabriel Omar da Silva Ferraz 
Guilherme Rodrigues H. Xavier
Mattheus Ribeiro Natividade
Maycon Lucca Ramos Vasconcellos 
O que é Citometria de Fluxo?
Trata-se de um método utilizado para o
estudo morfológico, fenotípico e
funcional das células. 
 
Analisa as características físicas e
químicas de células isoladas.
Fornece uma visão da heterogeneidade das
populações celulares de forma rápida,
quantitativa e precisa as características celulares.
Separando, examinando e classificando as
partículas microscópicas. 
Citometria de Fluxo
Citômetro de fluxo
Processos Recolhimento da amostra
Processamento da amostra
Marcação com anticorpos
Aplicação do Citômetro
Análise dos dados
Células: seja esta amostra de sangue periférico, de cultura celular, de medula óssea
ou de líquor, as células devem ser dissociadas e de forma a evitar a formação de
grumos na suspensão.
Tecidos: tecidos podem ser analisados, mas devem passar por uma preparação
com enzimas para possibilitar sua análise.
Partículas: outras partículas podem ser analisadas, como interleucinas, enzimas,
microplástico em suspensão no oceano, etc. Tudo depende do protocolo de
preparação aplicado.
Recolhimento e Processamento da amostra
Marcação com
anticorpos
Os anticorpos 
 conjugados 
 a fluorocromos são 
adicionados à solução.
Composto por sistema fluídico e sistema óptico.
 
Sistema fluídico
 
Tubo com o plasma
Câmara de fluxo
Líquido - fluido de invólucro 
Sistema óptico
 
Lasers
Espelhos e prismas
Sistema de captura
Componentes do Citômetro
Sistema para o
manuseio de células. 
Projetado para gerar
um fluxo uniforme de
células individuais. 
Garante uma análise
adequada quando a
célula é iluminada.
Sistema fluídico
Focalização
hidrodinâmica
Citômetro de Fluxo
Sistema óptico
Fonte de iluminação - laser
Filtros
Lentes 
Óptica da coleta
Cada laser emite um
comprimento de onda diferente,
de forma a excitar cada
fluorocromo, que por sua vez
emitem diferentes cores que
serão captadas.
Tanto a luz do laser espalhado
quanto as emissões fluorescentes
são coletadas. 
Parâmetros Avaliados
ssc
FSC
Eventos de espalhamentos de luz
FSC (Forward Scatter) -
Dispersão frontal, resulta da
difração de luz paralela ao feixe
do laser e detecta o tamanho
relativo do objeto. 
SSC (Side Scatter) - Dispersão
lateral, é o resultado da refração
do feixe do laser e é alterado pela
complexidade e a densidade
óptica da célula.
Sistema
óptico
Parâmetro de Intensidade Fluorescente 
São corantes fluorescentes que reagem a um
determinado comprimento de onda, emitindo um
comprimento de onda maior do que o incidido. 
Anticorpos conjugados
a fluorocromos
NEXT
Anticorpos monoclonais ligados a
substância com capacidade de emitir
luz se excitada.
Anticorpos conjugados
a fluorocromos
NEXT
Anticorpos monoclonais ligados ao
fluorocromo com capacidade de
emitir luz se excitada.
Fc
Fab
Fc: liga-se ao fluorocromo
Fab: liga-se ao antígeno (partícula)
NEXT
Detectores de Fluocescência
Os detectores de fluorocromos captam a intensidade de luz
fluorescente maior do que a absorvida, advinda da própria molécula
excitada, de moléculas fluorescentes transduzidas ou de anticorpos
conjugados a marcadores.
Parâmetros Avaliados
NEXT
Tamanho da célula
Complexidade/granulosidade
Quantidade de células
Saudável x Patogênico
Incidência e Coleta
Cell sorting
As células são isoladas em pequenas gotículas de
água eletricamente carregadas. Elas são atraídas ou
repelidas de acordo com a carga que receberam.
Assim, podem ser separadas e distribuídas em
distintos recipientes.
Gráficos
Aplicações
 
 Imunofenotipagem na infecção pelo HIV-1
A contagem absoluta usa a estratégia na qual a
população de linfócitos é definida pela
expressão do CD45 vs SSC (granularidade).
Todos os linfócitos expressam CD45, mas em
diferentes intensidades, o que permite a
separação dessas populações e da situação em
que elas se encontram. 
Dessa forma, é possível determinar se o
paciente
teve uma queda real de células T CD4 por 
efeito da infecção pelo HIV ou se ocorreu
uma redução geral dos linfócitos, podendo ser
acarretada por alguma outra patologia
Aplicações
 
 Imunofenotipagem na infecção pelo HIV-1
Aplicações
 
Avaliação da Produção de Citocinas
A citometria de fluxo é capaz de
oferecer uma análise integrada de
variáveis imunológicas a partir de
uma única célula. 
Sendo capaz de identificar várias
populações celulares produtoras
de citocinas, simultaneamente,
permitindo quantificar a
imunogenicidade e facilitar a
comparação destas populações
celulares em situações
particulares, como nos testes para
candidatos vacinais. 
Aplicações
 
 Identificação de anormalidades em células, que podem resultar em
leucemias, linfomas e doenças autoimunes permitindo um diagnóstico
eficiente, rápido, preciso e confiável.
As células mielóides apresentam fenótipo
aberrante, expressando marcadores de
linhagens distintas e uma diferenciação
anormal
As células em vermelho são positivas 
para a mieloperoxidase e negativas para
CD3 citoplasmático, negativas pada CD19 e
positivos para CD34, CD117 e CD33. 
 Estudos de Viabilidade Celular
Microvesículas e podem virar
biomarcadores
Estudos de compatibilidade
Estudo de proliferação celular
Separação de células específicas
desejadas.
Ciclo celular
Outras Aplicações
Caso Clínico
2° Caso Clínico do Bill Grignard
Detecção de Agamaglobulinemia 
 
Foi realizado para a contagem 
dos Leucócitos, averiguando a
baixa de linfócitos B.
Caso Clínico
Leshmaniose Visceral Canina (LVC)
Detecção de patôgeno por citometria de fluxo e
marcação com anticorpos conjugados a
fluorocromos
Figura: representação edquemática das análises dos
dados obtidos por citometria de fluxo. (A) Seleção da
população de formas promastigotas de L. (L.)
chagasi. (B) Histograma individual representando o
percentual de parasitos fluorescentes (PPFP) obtidos
com controle interno da reação; (C) após a
incubação com um soro de um cão não reagente; e
(D) após incubação com soro de um cão reagente. O
posicionamento do marcador M1 segue sempre o
critério de se obter no máximo 2% de PPFP para
controle do conjugado.
Referências
CARVALHO, Amanda Torres de et al. Citometria de fluxo no estudo de doenças infecto-parasitárias. Instituto Oswaldo
Cruz: Cursos de inverno de 2010, Rio de Janeiro, 2010. Anual. Disponível em:
https://www.ioc.fiocruz.br/picf/PROD_LITERAT/Apostilas/ApostilaCMFCurso_Ferias2010.pdf. Acesso em: 01 nov.
2022.
CARVALHO NETA, Alcina Vieira de et al. Citometria de fluxo no diagnóstico da leishmaniose visceral canina. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 58, p. 480-488, 2006. Disponívem em:
https://www.scielo.br/j/abmvz/a/5jtQNq6bHLYTZF6Q4c87BVM/abstract/?lang=pt. Acesso em 01 nov 2022.
Muito 
Obrigado