Enumeração de Populações Microbianas

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
Instituto de Biociências – Campus de Rio Claro 
Departamento de Bioquímica e Microbiologia 
1 
 
ENUMERAÇÃO DE POPULAÇÕES MICROBIANAS  
 
Disciplina: Microbiologia Geral e Aplicada                                                                 Prática 06 
Prof. Dr. André Rodrigues 
 
 Objetivos 
 
a) Estimar o número de bactérias em uma amostra por unidade de medida (ex: g ou mL). 
b) Familiarizar‐se com as técnicas de diluição em série e espalhamento em superfície.  
 
 Considerações 
 
É de grande  interesse para o microbiologista saber o número de bactérias e fungos presentes por 
grama de um determinado produto, alimento ou amostra de origem ambiental. Em outras palavras, deseja‐
se conhecer a carga microbiana associada a esses substratos. Uma vez determinado o numero de micro‐
organismos em uma amostra, tal valor pode ser comparado com os valores máximos permitidos definidos 
em legislação especifica (p. ex: normas estabelecidas para controle da qualidade da água potável).   
Uma das maneiras de avaliar a abundância de micro‐organismos é simplesmente semear a amostra 
em um meio de cultivo sólido e enumerar as colônias que aí se desenvolvem.  A tais colônias dá‐se o nome 
de unidade  formadora de colônia  (UFC), conceito muito utilizado em microbiologia. Amostras ambientais 
geralmente  abrigam  uma  grande  quantidade  de  células  microbianas  e,  portanto,  as  amostras 
necessariamente necessitam serem diluídas antes de serem analisadas.  
Nesta aula, veremos duas técnicas muito utilizadas na enumeração de micro‐organismos aplicadas 
a amostras ambientais e alimentos. Técnicas simples como a diluição em série seguida do espalhamento 
em superfície, podem auxiliar o microbiologista a estimar o número de células viáveis em uma amostra de 
origem ambiental. 
 
 Procedimento 
 
Contagem de células viáveis em amostras de solo 
 
1. Preparação da amostra de solo: 
 
a)  Peneirar  a  amostra  de  solo  em  uma  bandeja  limpa  de modo  a  remover  pedras,  galhos,  folhas  ou 
qualquer outro material que permita a formação de agregados de solo. 
b) Pesar 1g de amostra de solo em papel alumínio estéril. 
c) Pesar 1g de amostra de solo em uma base placa de Petri (lembrar de “tarar” a base da placa). Deixar a 
base da placa de Petri em estuda a 60° C durante 12 horas. Essa amostra será utilizada para avaliar o peso 
seco do solo. 
 
2. Diluição em série 
  
a) Marque os tubos de diluição contendo solução salina 0,85%, seguindo as diluições 10‐1 ate 10‐6. 
 2
b) Faça o mesmo para as placas de Petri contendo meio PCA  (plate count agar) e AS suplementado com 
cloranfenicol. Serão utilizadas 2 placas de cada meio por diluição. Atente para as instruções do professor de 
quais diluições serão efetivamente inoculadas. 
c) Suspender 1g de solo no tubo marcado 10‐1 e que contem 9 mL de solução salina. Agitar tubo no vortex 
durante 1 minuto. 
d) Com uma ponteira estéril, pipetar 1000 μL (ou 1 mL ) do tubo 10‐1 para o tubo marcado a 10‐2.  
e) Retirar uma alíquota de 100 μL (ou 0,1 mL) do tubo 10‐1 e transferir no centro de cada uma das placas. 
Em seguida, desprezar as ponteiras. 
f) Atenção: mergulhe a alça de Drygalski no álcool e flambe‐a sempre mantendo a alça virada para baixo 
(para evitar queimar a mão)! 
g) Esfriar a alça na superfície interna da tampa da placa de Petri ou na superfície do ágar, distante do local 
onde foi disposto o inóculo.  
h) Faça movimentos circulares  leves,  sempre girando a base da placa de modo a espalhar a amostra de 
forma homogênea. 
i) Flambar novamente a alça de Drigalski. 
j) Repita a operação (d – i) de forma a terminar a sequência de tubos da diluição seriada. 
 
Contagem de células viáveis em amostras de alimentos 
 
 Preparação das amostras: 
 
a) Pesar 10 g de amostra de solo em papel alumínio estéril. 
b) Homogeneizar 10 g de amostra em  frasco Schott contendo 90 mL de  solução  salina 0,85% estéril. Se 
necessário, utilizar bastão de vidro para auxiliar na quebra dos agregados de alimento. Flambar o bastão 
antes de utilizá‐lo. 
c) Após homogeneizar a amostra, proceder com as diluições seriadas conforme descrito.   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura  1.  Enumeração  de  micro‐organismos 
através  da  técnica  de  diluição  seriada  e 
espalhamento em superfície. Note que na  figura, 
1 mL da amostra foi inoculada nas placas, ou invés 
de 0,1mL mencionados no texto. 
 
Fonte:  Madigan  et  al.  (2004)  Microbiologia  de 
Brock;  10ª  edição,  volume  eletrônico  (CD). 
Pearson Prentice Hall, Inc.  
 
 3
 Incubação  
 
As placas de PCA (meio para determinação de bactérias heterotróficas) serão incubadas a 37º C durante 24 
h; as placas de AS (fungos) serão incubadas a 25º C durante sete dias. 
 
 Resultados 
 
Anote o resultado das contagens na tabela abaixo: 
 
Tipo de 
substrato 
Diluições 
UFC/g 
 Bactérias heterotróficas Bolores e leveduras 
 Réplica 1 Réplica 2 Média Réplica 1 Réplica 2 Média 
 10-1 
 10-2 
 10-3 
 10-4 
 10-5 
 10-6 
 
 
 Questões 
 
1.) Considerando  a  técnica  de  contagem  em  placa,  qual  é  a  principal  limitação  quando  se 
utiliza de tal técnica para enumerar micro‐organismos de amostras ambientais? 
2.) Quais  “tipos  nutricionais”  microbianos  podem  ser  isolados  com  os  meios  de  cultura 
utilizados? 
 
 Referências 
 
ALCÂNTARA,  F.;  CUNHA,  M.  A.;  ALMEIDA,  M.  A.  Microbiologia:  práticas  laboratoriais.  2ª  ed.  Aveiro: 
Universidade de Aveiro, 2001. 297 p.   
LACAZ‐RUIZ, R. Manual Prático de Microbiologia Básica. Edusp: São Paulo, 2000. 129p. 
MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J.  Microbiologia de Brock. 10a. ed. Prentice‐Hall Inc., 2004. 608 
p. 
NEDER, R. N. Microbiologia: Manual de Laboratório. Editora Nobel: São Paulo, 2000. 144p. 
PEPPER,  I.  L.;  GERBA,  C.  P.  Environmental microbiology:  a  laboratory manual.  2nd  ed.  Elsevier  Press: 
Amsterdam, 2004. 209 p. 
RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prática: Roteiro e Manual. Editora Atheneu: São Paulo, 
2000. 112p. 
SEELEY JR., H. W.; VANDERMARK, P. J.; LEE, J. J. Microbes in action: a laboratory manual of microbiology. 
4th ed. W. H. Freeman and Company: New York, 1991. 450 p.