Sequenciamento de DNA

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Sequenciamento 
de DNA
Prof. Luciano Procópio
 
Técnicas
 
Introdução
• Meados do anos 70
• Allan Maxam e Walter Gilbert
• “Método químico”
• Marcação da base com 32P
• Clivagem no nucleotídeo específico
 
Sequenciamento de Maxam-Gilbert
 
Sequenciamento de Maxam-Gilbert
 
Sequenciamento de Sanger
 Frederick Sanger era pesquisador no laboratório de 
biologia molecular da Universidade de Cambridge.
 Ganhador de 2 prêmios Nobel.
 1977: Sanger desenvolve seu método de 
sequenciamento de DNA
 Graças à técnica de PCR
 
Sequenciamento de Sanger
Sanger descobriu que se conseguisse interromper a replicação 
de um mesmo DNA em pontos diferentes ele poderia juntar 
essas fitas menores e formar a sequência completa do DNA.
 
Sequenciamento de Sanger
O método consiste em adicionar didesoxiribonucleotídeos 
(ddNTP’s), que são nucleotídeos modificados que não 
possuem o grupo OH livre no carbono 3’ da pentose.
 
Sequenciamento de Sanger
 
Sequenciamento de Sanger
1. Dentro de cada tubo a replicação acontece e termina em 
lugares diferentes.
2. No final do processo temos fragmentos da fita de DNA de 
diferentes tamanhos.
3. O conteúdo desses tubos é aplicado em gel de poliacrilamida e 
separado por tamanho (eletroforese).
4. Os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores 
mais em cima.
5. Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para 
cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a 
fita completa de DNA.
 
Sequenciamento de Sanger
 
Sequenciamento de Sanger
 Método automatizado
 Capilares com poliacrilamida
 Sistema de auto-injeção
 Emissão de fluorescência em 
determinados comprimentos de luz
 Detecção a laser
 Alto rendimento
 
Sequenciamento de Sanger
 
Sequenciamento de Sanger
 
Sequenciamento de Sanger
 
Estratégias de 
Sequenciamento
 Sequenciamento Shotgun
 Normalmente ~700 pb
 Dois principais tipos: 
 
 Sequenciamento Primer Walker
 Rompe a limitação de 1400 bp
 Consiste em sequenciar DNA clonado em 
várias etapas 
Estratégias de 
Sequenciamento
 
 Sequenciamento de RNAs
 Bibliotecas de cDNA
 Open Reading Frame (ORF) e Expressed Sequence 
Tags (EST)
Estratégias de 
Sequenciamento
 
Sequenciamento de Sanger
 Análises dos sequenciamento
 Basecalling
 Atribui uma identificação a partir de um “sinal” 
traço
 Analisa os pico para chamar as bases (Basecalling)
 Atribuir pontuações de qualidade (Phred scores) 
 
Sequenciamento de Sanger
 
Sequenciamento de Sanger
 
Sequenciamento de Sanger
 O Processo de basecalling sempre existe, independente da 
tecnologia de sequenciamento.
 No temos nenhuma tecnologia que consega ler diretamente 
bases nitrogenadas na sequência de AND.
 Sempre a base nitrogenada que está sendo lida e 
“representada” pela emisão de fotons, mudanca de pH, 
mudanda da corrente eletrica, etc. 
E é esse tipo de sinal que tem que ser transformado nas 
bases nitrogenadas, pelo processo de basecalling
 
Segunda geração - Pirosequenciamento
 Proposto inicialmente 1988 Hyman
 Em 2005 pela Roche (454 GS20)
 Detecção através da Luz
 Dispensa clonagem
 100 vezes mais rápido que Sanger
 Eficiência comprovada
– Resequenciamento de Mycoplasma genitalium
• 96% de cobertura
• 99,96% de precisão
 
Segunda geração - Pirosequenciamento
Preparo da amostra
PCR em emulsão
Sequenciamento
 
Segunda geração - Pirosequenciamento
 Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo
 Ação de 4 diferentes enzimas:
 DNA polimerase
 ATP sulfurilase
 Luciferase
 Apirase
 Substratos utilizados:
 Adenosina 5’ fosfossulfato (APS)
 Luciferina
 
Segunda geração - Pirosequenciamento
 Vantagens:
Processo automatizado
Tempo de análise curta;
Resposta instantânea do sequenciamento;
Alto rendimento;
Preparo rápido da amostra;
 Desvantagens:
Custo elevado;
Grande conhecimento de bioinformática;
Taxa de erro considerada alta (0,0098)
 
Segunda geração - Illumina
 Trabalho conjunto de quatro companhias: Solexa, 
Lynx Therapeutics, Manteia Predictive Medicine e 
Illumina
 Sequenciador Illumina Genome Analyser
 
Segunda geração - Illumina
 
Segunda geração - Illumina
 
Segunda geração - SOLiD
 Trabalho de Mckernan et al. (2006)
 Applied Biosystems
 Atualmente enfrenta problemas na metodologia
 Sequenciamento de genoma
 Ressequenciamento de regiões de interesse,
 Análise de expressão gênica 
 Análise de pequenos RNA
 
Segunda geração - SOLiD
 Adaptadores universais P1e P2
 Tags únicas ou mate-paired (adaptadores internos)
 Fragmentos de 1 a 10 Kb
 
Segunda geração – Ion Torrent
 Detecta a quimioluminescência emitida quando 
 um próton (H+) é liberado
 Um Ion chip com milhões de sensores 
 
Segunda geração – Ion Torrent
 
Terceira geração – PacBio
 Técnica SMRT sequencing (single molecule 
real time sequencing)
 Desenvolvido pela Pacific Bioscience (PacBio)
 Método de síntese em tempo real 
 
Terceira geração – PacBio
 DNA Pol fixa no fundo de Zero Mode Waveguide (ZMW)
 Fita de DNA acoplada a enzima 
 
Terceira geração – PacBio
 Adaptador forma uma fita de DNA circular
 
Terceira geração – PacBio
 A incorporação de cada nucleotídeo emite um 
determinado comprimento de onda
 Devido ao espaço reduzido a emissão de um único 
nucleotídeo é suficiente para sua detecção
 A mesma molécula pode ser sequenciada várias vezes
 
Terceira geração – PacBio
 Vantagens
– Realiza leituras de longo comprimento (até 20 kbp)
– Precisão de 99,999%
– Alta qualidade de sequenciamento
– Comprimento de leitura diminui gastos com outras 
analises
– Análises rápidas (2h)
– Não precisa clonar o DNA
 Desvantagens
– Alto custo do equipamento
– Alto custo de medições
– Requer alta massa de DNA (1μg)
 
Terceira geração – Nanopore
 Sequenciador portátil
 Custo de cerca d $1000,00
 Detecção da sequencia a partir da análise de sinal 
elétrico gerado pela passagem de cada fragmento por 
um poro proteico
 
Terceira geração – Nanopore
 
Terceira geração – Nanopore
 
Segunda geração – Comparação entre 
as plataformas
 
Terceira geração – Evolução
 
Terceira geração – Evolução
 
Terceira geração – Evolução
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